CN110269849A - 羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用，本发明提供了羟基酪醇的新用途，本发明通过体外细胞实验和动物实验有效证明了羟基酪醇在治疗牙周炎方面的显著效果，为牙周炎治疗提供了一种新方向。
Description
技术领域
本发明涉及药物用途领域，具体涉及到羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用。
背景技术
牙周炎是发生在牙周支持组织的慢性炎症性及破坏性疾病，发生率高，影响严重，治疗难度大。牙周炎不仅影响口腔功能，还可作为糖尿病、动脉粥样硬化和不良妊娠等全身性疾病的危险因素，危害全身健康。因而如何有效防治牙周炎的发生、延缓疾病进展已成为医学中尚未攻克的重大难题之一。
氧化应激是指机体在遭遇各种有害刺激时，活性氧自由基过剩或抗氧化剂缺乏引起的氧化抗氧化系统失衡状态，导致细胞组织损伤。研究证实，当牙周组织受到局部菌斑刺激时会释放以TNF-α、IL－6、IL－1β等为主的炎性细胞因子，引起中性粒细胞和巨噬细胞应答激活，促进ROS产生。过量的ROS可引起生物大分子(DNA、脂质和蛋白质)损伤及功能改变，导致细胞功能异常甚至死亡，促使牙周软硬组织破坏。与此同时，ROS正反馈地促进破骨细胞生成并促使骨吸收，同时诱发成骨细胞的凋亡及成骨功能的损伤，最终导致牙周炎牙槽骨的吸收，牙齿松动脱落。因此，如何降低过度ROS积累、对抗氧化应激环境，抑制破骨细胞分化并预防成骨细胞损伤，保护其成骨分化能力是目前有效防治牙周炎的解决方案。
羟基酪醇，一种天然多酚类化合物，主要存在于初榨的橄榄油或者红葡萄酒中。在市场上，它是唯一被欧洲食品安全局认可的多酚，具有多种有益的药理作用，即抗氧化，抗炎，改善内质网应激，保护线粒体功能和骨组织。但是羟基酪醇是否通过抗氧化，保护线粒体功能抑制氧化应激环境下的破骨细胞分化及成骨细胞凋亡，目前尚未报道。本发明通过探究羟基酪醇的具体作用机制提出一种羟基酪醇的新用途。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的提供羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用。
本发明进一步还提供羟基酪醇在制备羟基酪醇在制备抑制牙槽骨吸收药物中的应用。
本发明进一步还提供羟基酪醇在制备抑制牙周组织细胞凋亡药物中的应用。
作为进一步改进，所述羟基酪醇的有效量为5-25mg/kg。
作为进一步改进，所述羟基酪醇的有效量为20mg/kg。
作为进一步改进，所述药物由作为活性成分的羟基酪醇和药学上可接受的载体和/或添加剂组成。
作为进一步改进，所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型、敷料剂型或者注射剂型。
作为进一步改进，所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、液体剂。
作为进一步改进，所述药物的剂型是药学上可接受的敷料剂型为凝胶剂型。
本发明的有益效果为，本发明提供了羟基酪醇的新用途，本发明通过体外细胞实验和动物实验有效证明了羟基酪醇在治疗牙周炎方面的显著效果，为牙周炎治疗提供了一种新方向。
下面结合发明附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1为羟基酪醇对破骨细胞分化的影响，
A：MTT检测RAW264.7在不同浓度羟基酪醇(1、2.5、5、10、20uM)处理72h后细胞活性；
B、C：在含有50ng/ml RANKL的培养基中分别加入不同浓度羟基酪醇，诱导5天后TRAP染色结果及统计分析(细胞核≥3个为破骨细胞)，与C组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS：差异无统计学意义；
图2为MitoQ对破骨细胞分化的影响，
A、B：在含有50ng/ml RANKL的培养基中分别加入不同浓度MitoQ，诱导5天后TRAP染色结果及统计分析(细胞核≥3为破骨细胞)，与RANKL组比较，##P<0.01；
图3为羟基酪醇对破骨细胞相关基因的影响，
A-E：在含有50ng/ml RANKL的培养基中加入20uM羟基酪醇，诱导3天后，RT-PCR检测破骨细胞分化相关基因TRAP，CTSK，MMP9，NFATC1和DC-STAMP的mRNA表达水平，与C组比较，***P<0.001，NS：差异无统计学意义；与RANKL组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；
图4为羟基酪醇对H2O2诱导前成骨细胞(MC3T3-E1)细胞损伤的保护作用，A-B：20uM羟基酪醇预培养2h对H2O2(700uM，6h)引起细胞损伤的TUNEL染色结果(x 200)及统计分析，与C组比较，***P<0.001，##P<0.01；
图5为羟基酪醇对H2O2抑制MC3T3-E1细胞成骨相关基因mRNA表达的保护作用，
A-D：H2O2(700uM，6h)处理后诱导分化3天及20uM羟基酪醇预培养2h再加入H2O2(700uM，6h)处理后诱导分化3天的mRNA表达水平(RUNX2，ALP,COL-1和OCN)，与C组比较，***P<0.001；与H2O2组比较，###P<0.001；
图6为羟基酪醇挽救H2O2诱导成骨细胞分化功能损伤的ALP，ARS染色结果，与C组比较，***P<0.001，NS：差异无统计学意义；与RANKL组比较，
##P<0.01，###P<0.001；
图7A-B为分别在含有50ng/ml RANKL的培养基中加入20uM羟基酪醇、1uM MitoQ，诱导3天后，线粒体ROS荧光染色及统计分析；
图8A-B为H2O2(700uM，6h)处理组，羟基酪醇预培养(20uM，2h)加H2O2(700uM，6h)处理组和MitoQ预培养(1uM，2h)加H2O2(700uM，6h)处理组，线粒体ROS荧光染色及统计分析，与C组比较，***P<0.001，###P<0.001；
图9各组大鼠牙槽骨吸收情况，A:C组、P组、P+HT(10mg/kg)组、P+HT(20mg/kg)组牙槽骨吸收情况颊鄂侧观；B：测量釉牙骨质界(ACJ)至牙槽嵴(AC)顶距离，定量分析牙槽骨骨丧失高度(n＝16/每组)。检测值以均数±标准差表示，与C组比较，*p<0.01；与P组比较，#p<0.05；
图10为各组牙龈组织细胞凋亡情况，A:C组、P组、P+HT(10mg/kg)组、P+HT(20mg/kg)组牙龈组织细胞TUNEL染色结果；B：C组、P组、P+HT(10mg/kg)组、P+HT(20mg/kg)组牙龈组织细胞凋亡统计分析，与C组比较，*p<0.01；与P组比较，#p<0.05。
具体实施方式
下面将结合附图以及实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明。
本实施方式文本为了使得书面整洁，将部分名称用缩写代替，本文本中出现缩写指代的中文名称如下表所示
实施例1羟基酪醇对破骨细胞的抑制作用
1.1羟基酪醇抑制破骨细胞分化
1.1.1实验分组
取小鼠破骨细胞系RAW264.7作为破骨前体细胞，通过RANKL诱导破骨细胞分化，在诱导过程中通过分别添加羟基酪醇、线粒体靶向抗氧化剂MitoQ来设定实验组进行体外破骨细胞的培养，其具体实验组的设置包括：RANKL组、RANKL+羟基酪醇组、RANKL+MitoQ组，其实验组的具体设置如表一所示；
表一
实验组设置培养方法为：
将RAW264.7细胞以2000个/孔的密度接种于96孔板，加入DMEM完全培养基，按照实验组的设置依次加入对应的添加剂，并依次置于37℃、体积分数5％CO2培养箱内培养5-6d，3天换液1次。
1.1.2实验步骤
(1)在实验组培养至5天时，镜下观察到破骨细胞为类圆形，体积明显比单核细胞大数倍的多核巨噬细胞进行TRAP染色弃去原培养液，PBS洗2次，1次/2min，加入4％多聚甲醛固定20min，PBS洗3次，1次/5min；
(2)弃去PBS，加入事先预热为37℃的超纯水洗2次/2min，按照TRAP染色试剂盒使用方法进行TRAP染色；
(3)PBS洗3次，1次/5min，使用体视显微镜观察拍摄，并对细胞核大于或等于3个的TRAP染色阳性破骨细胞计数。
TRAP作为其破骨细胞的特异性标志酶，染色后形成明显的紫红色沉淀。如图1B、C所示，单纯RANKL组生成大量体积巨大的多核破骨细胞；羟基酪醇干预后呈浓度依赖性减少了破骨细胞的数量及体积，在20uM处理浓度下观察到最大抑制效果，破骨细胞数量最少，呈零零散散的破骨细胞，其统计结构如图1所示。
RANKL+MitoQ组呈浓度依赖性下调了破骨细胞的分化，如图2A、B所示，同时说明线粒体氧化应激在破骨细胞分化中起到关键作用。
1.2羟基酪醇对破骨细胞相关基因CTSK、TRAP、MMP9、NFATC1、DC-STAMP、B-ACTIN表达抑制
1.2.1实验分组
1)对照组：RAW264.7细胞培养于正常培养基中；
2)RANKL组：RAW264.7细胞用50ng/mL RANKL诱导3天；
3)RANKL+羟基酪醇组：RAW264.7细胞在含有50ng/mL RANKL的培养基中加入20μM浓度羟基酪醇诱导3天；
4)每组设3个复孔，单纯培养基为调零孔，实验重复3次。
1.2.2实验步骤
1)RAW264.7细胞以30*104个/孔的密度接种于6孔板，在对应处理下诱导分化3天，弃去原有培养基，加入2mL事先4℃下预冷的PBS，轻轻摇晃洗涤，弃去PBS，重复3次。
2)在冰上操作，每孔加入1mL的Trizol Reagent，静置5min，使用1mL枪头吹打混匀，充分裂解细胞。
3)按照1：5比例即1mL的Trizol Reagent加入200uL氯仿，手动上下颠倒混匀20s之后，静置5min，可见分层。
4)4℃12000rcf离心15min，样品出现明显分层，从下到上为有机相，中间层和无色的水相，RNA集中在水相中，小心吸取水相(约400uL)转移新EP管。
5)加入等体积400uL异丙醇于得到的水相液体中，手动上下颠倒混匀20s之后，静置10min。
6)4℃12000rcf离心10min，小心拿出EP管，底部可见白色胶状沉淀及为RNA，倒去上清。
7)加入DEPC水配制的75％酒精1mL，缓慢摇动EP管洗涤RNA。
8)4℃7500rcf离心5min，倒去上清
9)再重复一次7，8步骤，室温下自然晾干3-5min，加入适量DEPC水30uL，用枪头小心吹打，充分混匀溶解RNA。
10)吸取2uLRNA，使用NanoDrop2000超微量分光光度计检测RNA浓度及纯度，可用指标为RNA浓度值≥50ng/uL,OD260/OD280的比值在1.8～2.0。其RNA可长期储存于-80℃。
11)采用TAKARA反转录试剂RT reagent Kit(Perfect Real Time)将RNA逆转录成稳定的cDNA，使用20μl反应体系，总RNA为1000ng，配成如下体系：
12)震荡离心后，注意液体无气泡，于PCR扩增仪内反应：37℃保温15min，85℃保温5s进行。转录成cDNA后储存于-20℃。
13)将获得的cDNA采用TAKARA实时PCR试剂SYBR Premix Ex Taq配成20uL的反应体系，小心混于PCR8联管，液体无气泡。反应体系如下：
14)放入StepOneTM实时PCR扩增仪进行反应，反应程序如下：
15)每个组别设3个复孔，取各复孔的平均值(复孔间Ct error<0.15为合格)。根据目的基因和管家基因的Ct值结果，通过公式2-ΔΔCt，计算出各组样本的mRNA相对管家基因的表达水平，以B-ACTIN值。
16)本发明中破骨细胞相关基因的引物设计如下：其中CTSK上游引物如SEQID NO:1所示，CTSK下游引物如SEQID NO:2所示，其中TRAP上游引物如SEQID NO:3所示，TRAP下游引物如SEQID NO:4所示，其中MMP9上游引物如SEQID NO:5所示，MMP9下游引物如SEQID NO:6所示，其中NFATC1上游引物如SEQID NO:7所示，NFATC1下游引物如SEQID NO:8所示，DC-STAMP上游引物如SEQID NO:9所示，DC-STAMP下游引物如SEQID NO:10所示，其中B-ACTIN上游引物如SEQID NO:11所示，B-ACTIN下游引物如SEQID NO:12所示，
1.2.3结果与分析
如图3A-E所示，单纯RANKL组与C组相比(除DC-STAMP基因外)均显著上升，特别是TRAP的基因表达水平是C组的77倍。在羟基酪醇干预后，与RANKL组相比其破骨细胞相关基因的mRNA表达水平都有所下调，其中CTSK，NFATC1和DC-STAMP基因水平下调明显，并低于C组基因水平，可以得出羟基酪醇抑制破骨细胞分化。
实施例2羟基酪醇抑制H2O2诱导的成骨细胞损伤
2.1 TUNEL染色检测细胞凋亡率
2.1.1实验分组
1)对照组：MC3T3-E1细胞培养于正常培养基中；
2)H2O2组：MC3T3-E1细胞用700uM H2O2处理6h；
3)H2O2+羟基酪醇组：MC3T3-E1细胞用20μM浓度羟基酪醇预培养2h，加入700uMH2O2处理6h；
4)每组设3个复孔，单纯培养基为调零孔，实验重复3次。
2.1.2实验步骤
1)在48孔中放置细胞爬片，将MC3T3-E1细胞以10000个/孔的密度铺板于爬片中，培养24h之后加入相对应处理组；
2)吸弃培养基，PBS小心冲洗细胞爬片2次，室温下4％多聚甲醛固定30min，弃去固定液，PBS冲洗3次，每次5分钟；
3)配制细胞通透液，取0.1％(体积分数)Triton X-100和0.1％(质量分数)柠檬酸钠充分融于ddH2O。混匀后使用于4℃下细胞通透2min，PBS冲洗2次，每次5分钟；
4)配制反应液，取Enzyme Solution和Label Solution按1:9体积混匀。用镊子夹取爬片边缘小心放于湿盒中，注意正面向上，每个细胞爬片滴加50μl反应液，放置37℃恒温中避光反应1h，PBS冲洗3次，每次5分钟；
5)使用滤纸吸干爬片周围多余液体，滴加含有DAPI的封片液，盖上盖玻片，尽量避免气泡，避光反应24h，于正置荧光显微镜观察细胞凋亡并拍照。2.1.3结果与分析
结果如图4A-B所示，通过TUNEL染色检测凋亡情况，700uM H2O2处理后，TUNEL绿色荧光数量较C组明显增多，即H2O2诱导成骨细胞的凋亡发生。在H2O2诱导成骨细胞凋亡模型中，羟基酪醇对细胞有保护作用。药物浓度从0-50uM均有较好的保护作用。低剂量羟基酪醇5uM预处理后，成骨细胞活性显著增至83.64。而加入20μM羟基酪醇预处理组明显抑制H2O2诱导的细胞凋亡。
2.2实时荧光定量PCR(RT-PCR)
2.2.1实验分组
1)对照组：MC3T3-E1细胞培养于正常培养基中；
2)H2O2组：MC3T3-E1细胞用700uM H2O2处理6h后，成骨诱导液培养3天；
3)H2O2+羟基酪醇组：MC3T3-E1细胞用20μM浓度羟基酪醇预培养2h，加入700uMH2O2处理6h后，成骨诱导液培养3天；
4)每组设3个复孔，单纯培养基为调零孔，实验重复3次。
2.2.2实验步骤
具体实验步骤如实施例1中1.2.1相同，不同的本实验中成骨细胞相关基因的引物设计如下：其中RUNX2上游引物如SEQID NO:13所示，RUNX2下游引物如SEQID NO:14所示，其中ALP上游引物如SEQID NO:15所示，ALP下游引物如SEQID NO:16所示，其中COL-1上游引物如SEQID NO:17所示，COL-1下游引物如SEQID NO:18所示，其中OCN上游引物如SEQID NO:19所示，OCN下游引物如SEQID NO:20所示，其中B-ACTIN上游引物如SEQID NO:11所示，B-ACTIN下游引物如SEQID NO:12所示，
2.2.3结果与分析
为了进一步证明羟基酪醇对氧化应激下成骨细胞的保护作用，MC3T3-E1细胞经H2O2和羟基酪醇(20uM)处理培养3天后收样进行PCR检测，测试了成骨细胞相关基因的mRNA表达水平(包括RUNX2，ALP,COL-1和OCN)。如图5A-D所示，H2O2组与C组相比mRNA表达水平显著下降，其中ALP的基因表达水平最为明显，下降至0.1倍。而在羟基酪醇干预后，ALP水平显著恢复至C组的0.8倍，其余基因水平也明显上调。
2.3羟基酪醇逆转骨分化功能损伤能力
实验分组
1)对照组：MC3T3-E1细胞培养于正常培养基中；
2)H2O2组：MC3T3-E1细胞用300uM H2O2处理6h后，成骨诱导液培养7天；
3)H2O2+羟基酪醇组：MC3T3-E1细胞用20μM浓度羟基酪醇预培养2h，加入300uMH2O2处理6h后
4)H2O2+MitoQ组：MC3T3-E1细胞先用1μM浓度的MitoQ预培养1h，再加入300uM H2O2培养6h后，成骨诱导液培养7天；
其中成骨诱导液的配置方法为：取50uM抗坏血酸，10mMβ-甘油磷酸钠溶于α-MEM完全培养基。在成骨细胞诱导培养时，用培养基洗涤细胞2次，更换成骨诱导液，每隔2天更换1次成骨诱导液。
(a)碱性磷酸酶(ALP)染色
2.3.1实验步骤
1)配置碱性磷酸酶(ALP)染液：按照BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒发明配制，取碱性磷酸酶显色缓冲液3mL；BCIP溶液(300X)10μL；NBT溶液(150X)20μL；充分混匀后避光保存于4℃冰箱。
2)室温下使用4％多聚甲醛固定细胞30min后，PBS洗涤，每次5分钟。
3)加入ALP染液避光孵育24h，弃去染液，PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。体式显微镜下观察并拍照。
(b)茜素红(ARS)染色
2.3.2实验步骤
茜素红染色是一种测量成骨分化产生的矿化结节含量的典型方法，茜素红与钙离子螯合，会形成一种红色或紫红色的复合物。
1)配制茜素红染液：取0.1mol/L的tris-Hcl的PH值调至8.3，并量取100mL tris-Hcl加入0.1g茜素红S，充分混匀后于室温下避光保存。
2)室温下使用4％多聚甲醛固定细胞30min后，PBS洗涤，每次5分钟。
3)加入茜素红染液避光孵育24h，弃去染液，PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。体式显微镜下观察并拍照。
2.3.3结果与讨论
过量的ROS产生也会抑制MC3T3-E1的成骨分化，通过在成骨诱导液培养7，14天分别做ALP，ARS染色。两种染色都代表骨向分化染色程度。
如图6所示，在H2O2处理组ALP染色显着抑制，同时，ARS染色显示细胞矿化结节的形成也同样下调，呈散点状分布。羟基酪醇的加入显着增加了ALP活性和矿化结节形成，碱性磷酸酶ALP及茜素红ARS染色结果显示羟基酪醇能维持MC3T3-E1成骨细胞在氧化应激下的分化和细胞外基质的矿化功能。可以得出羟基酪醇具备促进MC3T3-E1的成骨分化的功效。
实施例3羟基酪醇降低破骨细胞mtROS的增加
3.1实验分组
1)对照组：RAW264.7细胞培养于正常培养基中；
2)RANKL组：RAW264.7细胞用50ng/mL RANKL诱导3天；
3)RANKL+羟基酪醇组：RAW264.7细胞在含有50ng/mL RANKL的培养基中加入20μM浓度羟基酪醇诱导3天；
4)RANKL+MitoQ组：RAW264.7细胞在含有50ng/mL RANKL的培养基中加入1μM浓度MitoQ诱导3天；
5)每组设3个复孔，单纯培养基为调零孔，实验重复3次。
将RAW264.7细胞以5000个/孔的密度铺板于48孔中，24h后根据不同实验组进行处理，处理72小时后进行检测；
3.2实验步骤
1)配制Mitosox荧光染料(标记线粒体活性氧)：使用DMSO制备成5mM母液于-20℃储存。配制Mitogreen荧光染料(标记线粒体)：使用DMSO制备成1mM母液于-20℃储存。使用时取出，对加入2％血清的Hanks液37℃预热，稀释Mitosox至2.5μM，稀释Mitogreen至100nM。
2)处理时间结束后，弃去原完全培养基，每孔加入150uL预热的Hanks液轻轻晃洗细胞2次，加入配好的荧光染料每孔100uL，于37℃恒温培养箱孵育30min。
3)弃去荧光染料，每孔加入150uL预热的Hanks液轻轻晃洗细胞2次，加入2％血清的Hanks液每孔100uL。用正置荧光显微镜于543nm波长处检测线粒体活性氧，于488nm波长处检测Mitogreen，在物镜40倍视野下，随机选择至少10个视野下的细胞记录拍照并且统计学分析。
3.3结果与分析
Mitosox是一种特异性靶向线粒体的新型荧光染料，被超氧化物氧化产生红色荧光。同时采用Mitogreen，一种定位线粒体绿色荧光染料，Mitosox和Mitogreen两者结合可以靶向定位线粒体并反映线粒体ROS强度。
如图7A、B所示，我们发现单纯RANKL组出现明显的Mitosox荧光水平，并且在形态上呈巨大的多核细胞。这说明RANKL的加入不仅会诱导破骨细胞分化，同时引起线粒体内ROS的增加。与单纯RANKL组相比，羟基酪醇处理后，细胞内Mitosox荧光水平明显降低，并在形态上体积变小。以上说明羟基酪醇在抑制破骨细胞分化的同时，降低了RANKL引起的的线粒体内ROS的增加。为了进一步说明，我们加入MitoQ，一种靶向抑制线粒体ROS的抗氧化剂，得到与羟基酪醇类似的结果。可以推断羟基酪醇通过降低了RANKL引起的的线粒体内ROS的增加，从而抑制破骨细胞的分化。
实施例4羟基酪醇减低H2O2诱导的成骨细胞的ROS水平
4.1实验分组
1)对照组：MC3T3-E1细胞培养于正常培养基中；
2)H2O2组：MC3T3-E1细胞用700uM H2O2处理6h；
3)H2O2+羟基酪醇组：MC3T3-E1细胞用20μM浓度羟基酪醇预培养2h，加入700uMH2O2处理6h；
4)H2O2+MitoQ组：MC3T3-E1细胞先用1μM浓度的MitoQ预培养1h，再加入0.25mMH2O2培养6h；
5)每组设3个复孔，单纯培养基为调零孔，实验重复3次。
4.2实验步骤如同实施例3中3.2一致
4.3结果与分析
我们通过进一步检测羟基酪醇和线粒体靶向抗氧化剂(MitoQ)预处理后线粒体功能的变化。如图8A、B所示，我们发现H2O2处理成骨细胞后Mitosox染色强度显着增加，而羟基酪醇的加入显着减弱线粒体ROS水平。同时MitoQ确实抑制本身的线粒体ROS水平。
通过实施例3和4我们可以得出羟基酪醇具有良好的抗氧化效果，减少氧化应激产生的ROS，在现有研究中已经证明了ROS通路参与了牙周膜细胞的凋亡过程，羟基酪醇通过减少氧化应激产生的ROS，抑制牙周膜细胞凋亡。
实施例5羟基酪醇治疗牙周炎动物模型的效果
5.1实验分组
将48只大鼠随机分为3组，每组16只。具体如下：
C：正常对照组。
P：实验性牙周炎组；选用雄性清洁级Wistar大鼠，6-8周龄，体重200g-230g，由温州医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号SYXK(浙)2010-0150，伦理审查批准编号wydw2015-0104，用10％的水合氯醛按0.25ml/100g的剂量腹膜下注射麻醉大鼠。将大鼠固定于大鼠固定器中，撑开口腔，使用显微镊将4/0的慕斯线结扎大鼠双侧下颌第一磨牙颈部，于近中舌侧打结。术中保持大鼠体温及呼吸道畅通。此后应定期检查结扎线在位情况，如有脱落需重新结扎。
P+HT(10mg)：实验性牙周炎加羟基酪醇浓度10mg/kg给药组；给药方式为：采用灌胃的方式预先行羟基酪醇全身给药，用生理盐水配制羟基酪醇溶液，每天1次；
P+HT(20mg)：实验性牙周炎加羟基酪醇浓度20mg/kg给药组；给药方式为：采用灌胃的方式预先行羟基酪醇全身给药，用生理盐水配制羟基酪醇溶液，每天1次。
5.2标本收集
1)在实验第4周末本着实验动物福利和伦理的原则，对所有大鼠用10％水合氯醛腹腔注射进行过量麻醉处死，处死前测量体重。
2)处死后迅速分离大鼠下颌骨，剔除肌肉组织，在下颌中线处将其一分为二。
3)干冰上小心轻柔地剥离下颌骨第一磨牙周围牙龈，左侧牙龈冻于-80℃超低温冰箱用于定量反转录聚合酶连锁反应检测，一部分放入4％多聚甲醛固定用于细胞凋亡检测，剥除牙龈的左侧牙槽骨放入4％多聚甲醛固定48h后冲洗检测牙槽骨吸收程度，右侧下颌骨放入4％多聚甲醛固定48h后冲洗EDTA脱钙，用于组织形态及免疫组化染色。
5.3牙槽骨吸收程度
左侧下颌骨放入4％多聚甲醛中固定48h后，取出自来水冲洗过夜，除干净剩余软组织。在体视显微镜(×20)下观察拍摄各组大鼠下颌骨第一磨牙牙槽骨附着丧失(Alveolar Bone Loss，ABL)。分别测量第一磨牙近颊、中颊、远颊、近腭、中腭、远腭6个位点从釉牙骨质界到牙槽嵴顶的高度，取6者的均值作为此牙的ABL值。体视显微镜拍摄各组大鼠釉牙骨质界至牙槽脊顶距离显示，其结果如图9所示，可以从图中得出，与C组相比，P组大鼠牙槽骨吸收度明显增高，羟基酪醇给药组相对牙周炎组大大抑制了牙槽骨吸收程，20mg/kg的给药量效果明显大于10mg/kg的给药量。
5.4牙龈组织细胞凋亡检测
细胞凋亡检测采用罗氏公司的In situ cell death detection kit试剂盒进行TUNEL染色，染色处理后后在荧光显微镜观察凋亡细胞并拍照，其结果图10所示C组大鼠牙龈组织中鲜有观察到细胞凋亡情况，而P组大鼠牙龈成纤维细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。同时，与P组相比，P+HT组牙龈成纤维细胞的凋亡率明显下降(P<0.05)。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 温州医科大学附属口腔医院
<120> 羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用
<160> 20
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cacccagtgg gagctatgga a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tcctgtccaa caccaaagtc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 8
ttcctcccga tgtctgtctc 20
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<212> DNA
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<400> 10
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<211> 25
<212> DNA
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<400> 11
catccgtaaa gacctctatg ccaac 25
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<212> DNA
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<400> 12
atggagccac cgatccaca 19
<210> 13
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<212> DNA
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<400> 13
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<210> 14
<211> 23
<212> DNA
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tttcataaca gcggaggcat ttc 23
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<212> DNA
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tgcctacttg tgtggcgtga a 21
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<211> 23
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<400> 20
tcaacagctc tgtcgtgacc 20
Claims (9)
1.羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用，其特征在于：羟基酪醇在制备抑制牙槽骨吸收药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用，其特征在于：羟基酪醇在制备抑制牙周组织细胞凋亡药物中的应用。
4.根据权利要求1或2或3所述的羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用，其特征在于：所述羟基酪醇的有效量为5-25mg/kg。
5.根据权利要求4所述的羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用，其特征在于：所述羟基酪醇的有效量为20mg/kg。
6.根据权利要求4所述的羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用，其特征在于：所述药物由作为活性成分的羟基酪醇和药学上可接受的载体和/或添加剂组成。
7.根据权利要求6所述的羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用，其特征在于：所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型、敷料剂型或者注射剂型。
8.根据权利要求7所述的羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用，其特征在于：所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、液体剂。
9.根据权利要求7所述的羟基酪醇在制备治疗或预防牙周炎药物中的应用，其特征在于：所述药物的剂型是药学上可接受的敷料剂型为凝胶剂型。
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