CN110257478A - 一种肿瘤个体化疫苗的有效新抗原肽的快速筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种肿瘤个体化疫苗的抗原肽筛选方法，所述筛选的步骤包括：a)获取患者肿瘤细胞；b)对所述肿瘤细胞进行基因组全外显子测序，得到所述患者的全外显子突变数据集；c)根据所述全外显子突变数据集，预测外显子突变所形成的一批新抗原肽；d)计算各新抗原肽的MHC I亲合力变化度；e)计算该患者外周血淋巴细胞总数存留度，依据淋巴细胞总数存留度与高T细胞活性的新抗原肽MHC I亲合力变化度的相互关系，确定高T细胞活性的新抗原肽MHC I亲合力变化度区间；f)将该患者处于该区间的新抗原肽筛选为对该患者免疫有效的新抗原肽，以制备个体化疫苗。

Description

一种肿瘤个体化疫苗的有效新抗原肽的快速筛选方法
技术领域
本发明属于医学领域，涉及一种肿瘤个体化疫苗的有效新抗原肽的快速筛选技术方法。
背景技术
目前认为，DC、CAR-T、NK细胞等细胞免疫治疗针对实体肿瘤的疗效的制约瓶颈有：肿瘤缺乏理想的靶点、瘤体组织浸润的活化免疫细胞少和肿瘤微环境免疫抑制。CAR-T细胞用于血液肿瘤有惊人的疗效，而在占恶性肿瘤的绝大数的实体肿瘤的目前治疗中，未能很好解决这三个问题而显疗效不佳。PD-1单抗蛋白分子可以进入肿瘤微环境，通过解除T细胞功能的“刹车闸”，使得抗肿瘤特异性T细胞免疫功能释放。这也同时说明一个问题：微环境存在肿瘤新抗原，可以利用来制作肿瘤疫苗(瘤苗)。
近年个体化肿瘤疫苗研究获得极大成功，有效率远高于目前临床上被称为“神药”的PD-1单抗等免疫检查点抑制剂，对各期肿瘤都有效且可预防肿瘤术后复发。个体化瘤苗为针对某种肿瘤的某个患者而研制的瘤苗，即使对同一肿瘤的其它患者也无效。近年，国外个体化瘤苗对多种肿瘤、术后有淋巴结转移黑色素瘤的临床试验获得极大成功[1,2,4,9]。个体化瘤苗有效率远高于PD-1单抗等免疫检查点抑制剂，且可预防肿瘤术后复发，对各期肿瘤都有很好的治疗效果。但是，因为肿瘤细胞不到10％基因突变能形成肿瘤新抗原，其中又不到10％具有高免疫原性，能成功诱导有效的特异性T细胞免疫(主要的抗癌免疫)，即有效新抗原；而另一方面，每个患者的诱导特异性T细胞免疫的肿瘤新抗原并不相同，个体间出现完全相同新抗原的概率很低[10]，即使同一基因不同位点的突变造成新抗原氨基酸序列不一致，也可导致新抗原肽(新抗原激活免疫的分子形式)不同[11]。例如KRAS G12D突变能够产生与HLA-C*08:02高亲和力结合的新抗原肽，免疫原性强，易活化T细胞[17]，但是制约新抗原免疫应答的MHC分子又“个体化”；因此，群体通用的肿瘤疫苗新抗原肽几乎是不存在的。
抗原肽如要活化T细胞，必须与MHC I类分子稳定结合并呈现在细胞膜表面，供T细胞的TCR受体识别。目前国外有研究报道根据抗原肽与MHC I亲和力大小筛选疫苗抗原肽，依据是激活T细胞时抗原肽与MHC I必须稳定结合，但是很显然，不是越稳定牢固就使免疫活化效应越强。根据抗原肽的MHC结合力来筛选抗原肽，仅入选MHC结合力高的新抗原肽，错选漏选率高；有的错选抗原肽还可能有免疫抑制作用。而用免疫效应实验来证实每个患者每一条抗原肽的免疫活化能力，这样做成本大，费时、费力。
抗原肽是诱发抗癌特异性免疫的主要抗原。肿瘤细胞内各种突变蛋白被降解成的各种新抗原肽，与伴侣分子结合后转运与MHC分子结合，以抗原肽-MHC递呈在细胞表面，活化T细胞(主要的特异性抗癌免疫)；这过程是MHC限制的，沉默MHC表达则破坏T细胞免疫。不到1％非同义突变可形成与MHC高亲和结合，并能活化T细胞的新抗原肽[5,7]。实体瘤95％的基因突变是点突变。突变与原编码序列差异越明显，产生异常蛋白的免疫原性越强，成为T细胞识别的新抗原的可能性大(图1)[5]。弱免疫性抗原可能形成免疫抑制的肿瘤微环境或慢性、无效的T细胞激活；野生型同源抗原(即正常自身抗原)不能激活T细胞。国内外现有的筛选肿瘤患者疫苗抗原肽的技术方案是根据肿瘤类型，用蛋白或多肽差异表达检测，或弱酸洗MHC I-新抗原肽复合物，或和寻找通用的肿瘤特异性抗原多肽，如MAGE1、MAGE2等，但因种类少、免疫原性弱而实际效果不理想。
二代测序可检测出所有突变蛋白，发现新抗原肽[8]，但不到1％基因突变能形成具有有效免疫效应的新抗原[4,3]。国外新近报道了利用二代测序技术对肿瘤细胞进行全基因组测序，预测突变产生的各种新抗原肽，并根据其与MHC分子的亲和力的大小来筛选高免疫效应的新抗原肽。这种预测的新抗原肽错选漏选率高，以至于每个人的疫苗的各新抗原肽的免疫活性需要再做免疫学实验验证。然而，由于每个患者的诱导特异性T细胞的肿瘤新抗原肽并不相同，疫苗新抗原肽免疫学验证实验复杂、时间长，成本大，因此，这种方法也非常不利于其临床应用。
总之，个体化瘤苗是目前最有前景的肿瘤治疗新技术，但瘤苗在个体间不通用；仅根据基因测序预测的新抗原肽的MHC亲合力；亲和力越强越好，这样进行疫苗抗原筛选，错选漏选率高，故需探索简捷、快速的方法筛选高效疫苗抗原肽。
参考文献：
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发明内容
由于抗原递呈和免疫活化机制是：突变形成的新抗原肽常先与热休克蛋白伴侣分子结合后转运与MHC I类分子结合，再至细胞膜表面，从而识别、活化T细胞。因此，此前的诸多研究，集中研究与热休克蛋白结合的抗原肽，本发明提供了具有较强免疫活性的富伴侣分子-抗原肽复合物的制备方法，确定鼠结肠癌肿瘤干细胞伴侣分子结合的抗原肽谱及其免疫特性的技术方法。但是由于人抗原肽在患者个体间不通用，受到主要组织相容性复合基因MHC分子限制性的控制，而人MHC分子又高度个体化，使得通过热休克蛋白抗原肽筛选人的抗原肽应用受到限制。而且其中有许多弱免疫原性的无免疫活化能力的，甚至引起免疫抑制的抗原肽。
个体化肿瘤抗原肽疫苗是突破性的肿瘤治疗技术，但制备疫苗的肿瘤新生抗原肽(新抗原肽)因高度个体化的MHC分子的限制性，在患者之间不通用。筛选患者的有效新抗原肽(通常需十余种)非常费时费力，阻碍了疫苗的临床应用。本发明根据患者的肿瘤全外显子测序结果及其所预测的新抗原肽的MHC I(即HLA)亲和力变化度，对不同新抗原肽进行主要免疫学效应的实验，明确了新抗原肽的MHC I亲和力变化度和患者血淋巴细胞总数存留度等两者与新抗原肽免疫效应的关系，为快速筛选高效的新抗原肽进而构建个体化瘤苗提供直接依据。在此基础上形成本发明---快速筛选高效的新抗原肽的技术方案：0.4--4.0/淋巴细胞存留度＝免疫有效的新抗原肽的HLA亲和力变化度区间。目前国内外未见到类似研究的报道。新抗原肽及其MHC I亲和力变化是全外显子测序时可以同时获知的，淋巴细胞总数变化可从患者血常规结果中获得，使筛选工作极其简便、快捷，最大限度地筛选免疫效应强的新抗原肽，且新抗原肽种类可满足疫苗制备需求。较好地剔除弱免疫原性的无免疫活化能力的，甚至引起免疫抑制的新抗原肽。
本发明的技术关键点是：本筛选方法的步骤；入选的量化指标(MHC亲和力变化值度)及其所依据的研究数据结果和几个关系曲线图。
较为概括地，本发明第一方面提供了一种肿瘤个体化疫苗的抗原肽筛选方法，所述筛选的步骤包括：
a)获取同一患者的肿瘤细胞与正常细胞；
b)对所述肿瘤细胞进行全外显子基因测序，得到所述患者的肿瘤全外显子数据集，对所述正常细胞进行全外显子基因测序，得到所述患者的正常全外显子数据集；
c)对比所述肿瘤全外显子数据集与所述正常全外显子数据集，得到所述患者的所述肿瘤全外显子数据集中特有的外显子数据，形成所述患者的突变全外显子数据集；将所述正常全外显子数据集与所述突变全外显子数据集对应的外显子的集合称作对照全外显子数据集；
d)对比所述突变全外显子数据集与正常人群SNP数据库，得到所述正常人群SNP数据库中不存在的所述突变全外显子数据集的子数据集，形成所述患者的突变外显子数据集；将所述突变外显子数据集翻译成肽，形成突变抗原肽数据集；将所述对照全外显子数据集中与所述突变外显子数据集对应的所有外显子翻译成肽，形成对照野生抗原肽数据集；
e)针对所述突变抗原肽数据集中每一条突变多肽，将所述对照抗原肽数据集中对应的多肽称作对照多肽，比较所述突变多肽的MHCI亲合力与所述对照多肽的MHC I亲合力，得到所述突变多肽的MHC I类分子亲和力变化度得分，得到亲和力变化度得分数据集；
f)计算所述患者外周血淋巴细胞总数变化度，依据淋巴细胞总数变化度与高T细胞活性的突变抗原肽MHC I亲合力变化度得分的关系，确定高T细胞活性的突变抗原肽MHCI亲合力变化度区间；
g)将所述患者处于所述变化度区间的突变抗原肽筛选为对所述患者免疫有效的突变抗原肽，称作新抗原肽，供个体化疫苗制备。
在一些实施方式中，所述筛选的步骤还包括：所述肿瘤选自肺癌、胃癌、结肠癌、恶黑及肉瘤。
在一些实施方式中，步骤c)是通过BWA软件实现的；和/或
步骤d)是采用GATK和VarScan软件联合实现的；和/或
步骤e)中，基于抗原肽的MHC I分子结合属性与结合解离半衰期，用BIMAS程序和NetCTL软件预测抗原肽与MHC I分子结合的新抗原肽：通过肽池测序法获得大量的与某一MHC I类分子结合的多肽的解离半衰期，建立半衰期矩阵，比较各肽段的预测分值，按得分高低列出所有可能作为CTL表位的新抗原肽，即得新抗原肽库。
在一些实施方式中，步骤e)为：
根据多肽序列从网站查询各突变多肽的MHC I类分子亲和力分除以于所述突变多肽对应的对照多肽的MHC I类分子亲和力分，等于所述突变多肽的MHC I类分子亲和力变化度得分，所述网址为：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/。
在一些实施方式中，步骤f)为：
患者外周血淋巴细胞总数变化度是通过ELISPOT方法进行的，淋巴细胞存留度为100％时，选取HLA亲和力变化度在0.4-4区间的新抗原肽。
本发明第二方面一种根据本发明第一方面所述的肿瘤个体化疫苗的抗原肽筛选方法得到的肿瘤个体化疫苗的抗原肽。
本发明第三方面一种肿瘤个体化疫苗的制备方法，所述制备方法为将本发明第二方面所述肿瘤个体化疫苗的抗原肽与免疫佐剂混合，得到所述肿瘤个体化疫苗。
本发明第四方面一种肿瘤个体化疫苗，所述肿瘤个体化疫苗是根据本发明第三方面所述的肿瘤个体化疫苗的制备方法制备得到的所述肿瘤个体化疫苗。
本发明第五方面一种肿瘤个体化疫苗的测试方法，所述测试方法为将本发明第二方面所述的肿瘤个体化疫苗的抗原肽与树突状细胞共培养，得到混合树突状细胞疫苗，用以检测新抗原肽的免疫活性。
本发明第六方面提供了如本发明第二方面所述的肿瘤个体化疫苗的抗原肽或如或本发明第五方面所述的肿瘤个体化疫苗在制备预防或治疗肿瘤的制剂中的用途。
附图说明
图1为突变类型与免疫原性的现有技术附图。
图2为本发明研究技术路线图。
图3为DC细胞培养过程照片。
图4为HLA亲和力变化度与T细胞活性关系曲线图。
图5淋巴细胞总数存留度与峰值区T细胞活性均值的关系图。
图6患者A的T细胞活性统计图。
图7患者B的T细胞活性统计图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。
实施例1本发明的研发方案与技术路线
核心技术路线参见图2。具体方案参见实施例2-6。
实施例2肿瘤的二代基因测序与新抗原肽预测
1.病例样本采集
经病理确诊的中晚期恶性肿瘤12例患者的肿瘤组织标本(其中肺癌2例、胃癌2例、结肠癌4例、恶性黑色素瘤2例及子宫平滑肌肉瘤2例)，患者签署知情同意书并经杭州师范大学医学伦理委员会批准；每例患者取15张腊块切片或相应量的新鲜活检标本，同时取外周血3ml作为该患者正常组织对照。蜡块标本经脱蜡处理后提取DNA；新鲜活检标本和外周血分别按各自基因组DNA提取试剂盒要求提取DNA；-20℃保存，一周内使用。
2.病例外显子测序
针对12例患者中的每一位分别独立进行如下操作：三种来源提取的DNA送上海慧算生物科技公司，使用Hiseq2500测序系统(Ilumina公司)进行人类全外显子基因组高通量测序。全外显子组双向测序将产生数亿条测序片段，要求针对每一个测序样本的目标捕获区平均测序深度为300×，芯片对目标区域测序覆盖度为99.12％。患者肿瘤全外显子基因测序结果12例患者，记录临床资料。
3.病例新抗原肽库的构建
通过BWA 0.7.17软件比对某患者肿瘤细胞的基因(外显子)和正常细胞的外显子基因高通量测序的原始数据，得到两者差异的数据集；联合使用GATK 4.1.2和VarScan2.4.0软件，处理两者差异的数据集，对照正常人群SNP数据库，进行分析、识别、判断哪些差异(变异)是真实的肿瘤特有的外显子突变：(1)针对每一个测序的外显子，筛选出蜡块标本与新鲜活检标本中都存在，且外周血中不存在的人类SNP，视为该患者肿瘤组织中突变产生的SNP，将相应核酸序列转变成多肽序列，得到新抗原肽库；(2)针对每一个测序的外显子，筛选出蜡块标本与新鲜活检标本中序列一致且相对于外周血中存在突变的外显子突变序列集合，将正常人群SNP数据作为背景数据，扣除后得到该患者肿瘤特异性外显子突变序列集合，将相应核酸序列转变成多肽序列，得到新抗原肽库。共12例患者。
4.病例新抗原肽库的免疫原性分析
新抗原肽的预测基于抗原肽与MHC I分子抗原结合槽结合的属性---结合亲和力(用结合解离半衰期作为衡量亲和力的大小的指标)。使用美国NIH的BIMAS和NetCTL软件程序(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/)预测肿瘤抗原肽；其主要原理：获取与某一MHCI类分子结合的大量的多肽的结合解离半衰期，根据各多肽的半衰期长短建立多肽矩阵(肽池)，计算得出半衰期符合抗原肽标准的多肽；计算、比较各肽段的基于半衰期的预测分值，按得分高低列出所有可作CTL表位(可与TCR结合的)的多肽即新抗原肽库(其中绝大多数为低效或免疫抑制的)。
12例患者共计获得503种新抗原肽。每例患者的一组肿瘤新抗原肽，根据每种新抗原肽序列从网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)查询各新抗原肽(来自肿瘤组织)的MHC I类分子亲和力得分；除以该抗原肽突变前的(来自同一患者外周血)，即野生型抗原肽的MHC I类分子亲和力得分，等于新抗原肽的MHC I类分子亲和力变化度得分(即：突变肽的亲和力/野生肽的亲和力)。
实施例3树突状细胞(DC)疫苗的制备
(一)分离外周血单个核细胞(PBMC)
分别针对每位患者进行操作，取患者的外周血，用EDTA采血管采血，每管约3ml。
1.取一支15ml离心管，加入3ml分离液(人全血单个核细胞分离液(FICOLL配置)，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号：LDS1075，下同)。
2.用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，400-650g，离心20-30min。
3.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴经细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
4.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向所得离心管中加入10ml PBS(磷酸缓冲盐溶液，GIBCO公司，货号：10010023，下同)，混匀细胞。
5.250g，离心10min。
6.弃上清。
7.用吸管以5ml PBS重悬所得细胞。
8.250g，离心10min。
9.重复6、7、8，弃上清后以1ml所配制的培养基(RPMI 1640培养液+10％胎牛血清+hGM—CSF 100ng/ml+hlL-4100ng/ml)重悬细胞。
10、调整细胞密度为3x106/ml的PBMC，加入24孔板。
(二)配制培养基：RPMI 1640培养液+10％胎牛血清+hGM—CSF 100ng/ml+hlL-4100ng/ml。
(三)培养过程：用所配培养基培养步骤(一)所得PBMC细胞于37℃、5％CO2的培养箱中，设取血当天为D0天，约10小时候分离悬浮细胞和贴壁细胞分别继续培养，D3天时半量换液(可根据细胞状态调整换液时间)，约D5天时细胞分化为半悬浮状态时即为未成熟DC，根据培养板每孔DC等的数量，以每1x104个DC分别加入：某同一位患者的一种新抗原肽100μg相应加入非甲基化CpG佐剂(由上海生工合成)100μg及另一佐剂INF-γ50ng/ml，刺激未成熟DC，后继续培养24h，收获悬浮的成熟DC和全部PBMC作为混合DC疫苗。
制备过程的照片参见图3，其中，左图为去悬浮后贴壁单核细胞的照片，中图为呈簇生长的未成熟DC的照片，右图为悬浮生长的成熟DC的照片。
(四)DC疫苗刺激并收集混合细胞
取上述负载了抗原肽和不同佐剂的PBMC细胞1ⅹ106个作为刺激细胞，即混合DC疫苗。在刺激细胞培养孔中加入上述新制备PBMC5ⅹ106个，以含80μg/L rhIL-2的含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液继续培养。每7天应用混合DC疫苗重复刺激淋巴细胞1次，共培养14d。收集所有的细胞为后续检测ELISPOT检测。由新制备PBMC细胞作对照。采用同一患者的细胞。
实施例4 ELISPOT法检测T细胞的活性
常用的细胞毒检测技术包括NK细胞介导的细胞毒试验和特异性CTL活性检测。CTL表位检测法用胞内细胞因子染色和酶联免疫斑点法。酶联免疫斑点技术(enzyme-linkedimmunosPot assay,ELISPOT)是通过检测细胞因子来评价T淋巴细胞功能的特异性新方法，被广泛应用于监测肿瘤疫苗治疗前后抗原特异性T淋巴细胞的数量和功能状态。
(一)使用ELISPOT试剂盒(R&D公司，货号：EL3094)检测T细胞的活性，ELISPOT排板设计，每个细胞悬液设置2个复孔，如下表所示。由某患者某种新抗原肽制备的混合DC疫苗加上该患者新制备的PBMC(详见实施例3)。
(二)试剂准备(以下试剂均为ELISPOT试剂盒中所有)：
1、洗涤缓冲液：如果浓缩物中已形成晶体，则温热至室温并轻轻混合直至晶体完全溶解。要制备洗涤缓冲液，将50mL洗涤缓冲液浓缩液[Wash Buffer concentrate(Part895308)]加入到450mL去离子水中并充分混合。
2、检测抗体：将100μL检测抗体浓缩物[Detection Antibody Concentrate(Part893005)]转移到小瓶标记的Dilution Buffer 1(Part 895307)中并充分混合。为获得最佳性能，在使用前立即准备检测抗体。
3、链霉抗生物素蛋白-AP：将100μL链霉抗生物素蛋白-AP浓缩物A[Streptavidin-AP Concentrate A(Part 895358)]转移到小瓶标记的Dilution Buffer 2(Part 895354)中并充分混合。为获得最佳性能，在使用前立即制备链霉抗生物素蛋白-AP。
(三)具体步骤：
1.用200μL无菌培养基(RPMI 1640培养液+10％胎牛血清)填充微孔板中的所有孔，并在室温下孵育约20分钟。
2.细胞准备好接种时，从孔中吸出培养基。立即向每孔加入200μL约2×105的细胞。
3.将细胞在37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育24小时。
4.吸出每个孔中的细胞并洗涤，重复该过程三次，总共洗涤四次。使用喷射瓶，歧管分配器或自动洗涤器，用洗涤缓冲液(250-300μl)填充每个孔进行清洗。在每个步骤完全去除液体对于良好的性能是必不可少的。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾析除去任何剩余的洗涤缓冲液。翻转平板并用干净的纸巾擦干。注意：调整歧管分配器或自动装置的尖头高度，以防止损坏膜。
5.向每个孔中加入100μL稀释的检测抗体，并在2-8℃下孵育过夜。
6.重复步骤4。
7.向每个孔中加入100μL稀释的链霉抗生物素蛋白-AP并在室温下孵育2小时。
8.重复步骤4。
9.向每个孔中加入100μLBCIP/NBT色原并在室温下孵育1小时。避光操作。
10.从微孔板中弃去色原溶液，用去离子水冲洗微孔板。翻转微孔板并轻敲以除去多余的水。从微孔板底部取下柔性塑料排水管，用纸巾彻底擦拭底板，并在室温(60-90分钟)或37℃(15-30分钟)内完全干燥
实施例5免疫有效新抗原肽的筛选技术研制
1.筛选指标的确定
ELISPOT直接反映了特异性抗肿瘤免疫效应，但对新抗原肽逐条进行ELISPOT检测非常费时费力，使疫苗临床应用受限。二代测序随着技术的进步和便利化，现在可准确预测各新抗原肽序列；给出其预测的HLA结合的亲和力。通过本发明的对6例外周血淋巴细胞总数正常范围的病人的260种新抗原肽的免疫学实验研究，建立了HLA亲和力变化度(其计算如上文所述)与该新抗原肽抗肿瘤免疫效应的对应关系，建立了相应的HLA亲和力变化度与特异性抗癌免疫效应(ELISPOT实验检测值)的关系曲线(表1、图4)。
表1HLA亲和力变化度与T细胞活性关系(n＝260；淋巴细胞存留度100％)
从表1和图4中可以看出，对于外周血常规检测结果中淋巴细胞总数正常或与其之前相比无明显变化的患者，即淋巴细胞存留度(当前淋巴细胞总数/健康时淋巴细胞总数)为100％时，HLA亲和力变化度在0.4-4区间的新抗原肽具有较高的T细胞免疫活性；HLA亲和力变化度的这个区间称之为T细胞活性峰区。据此确立了HLA亲和力变化度作为新抗原肽的特异抗肿瘤免疫效应的便利而快速的筛选指标。同时，外周血淋巴细胞总数变化被认为反映肿瘤患者的免疫功能状态变化，我们研究发现淋巴细胞存留度也影响上述曲线(图4、5)，从而影响新抗原肽的免疫效应。故血常规结果中的淋巴细胞总数变化度也作为筛选指标。
表2淋巴细胞存留度与峰值区T细胞活性均值的关系实验结果
淋巴细胞存留度 峰值区T细胞活性均值
10％ 6.5
20％ 15.0
30％ 23.0
40％ 31.0
50％ 40.5
60％ 48.0
70％ 56.0
80％ 68.0
100％ 81.5
表3淋巴细胞存留度与T细胞活性峰区的HLA亲和力变化度的关系
从表2-3和图4-5可以看出，外周血淋巴细胞总数变化度反映了肿瘤患者的免疫功能状态变化，如图表所示，淋巴细胞总数下降一半，则峰值区T细胞活性也从81.5降至40.5。同时淋巴细胞总数变化度也影响该患者新抗原肽的HLA亲和力变化度的T细胞活性峰值区间，大致呈现为：0.4—4/淋巴细胞存留度，例如，某患者的外周血淋巴细胞总数降至以前的20％，即淋巴细胞存留度为20％，则该患者具有较高T细胞活性的新抗原肽的HLA亲和力变化度位于2-20之间。
2.筛选方案
每条新抗原肽的HLA亲和力变化度是，相对于突变前的正常抗原肽(野生型抗原肽)，该新抗原肽与HLA的亲和力升高或下降了多少倍数，即：野生型抗原肽亲和力/新抗原肽的亲和力。淋巴细胞存留度是指该患者当时的淋巴细胞总数相对于其健康正常时的淋巴细胞总数的百分值。本研究发现：免疫有效的新抗原肽的HLA亲和力变化度的筛选区间为：0.4--4.0/淋巴细胞存留度，据此筛选有效新抗原肽。
实施例6：具体病例
总体技术路线参照实施例1所述。
根据实施例2的操作，针对所有12位患者总共合成了503条不同新抗原肽，患者A(外周血淋巴细胞总数正常)的测序结果参见表4，患者B(外周血淋巴细胞存留度20％)的测序结果参见表5。其中，
患者A的T细胞活性参见图6，患者B的T细胞活性参见图7。
表4患者A的测序结果统计
图表5患者B的测序结果统计
从表4和表5可以看出，外周血淋巴细胞总数变化度反映了肿瘤患者的免疫功能状态变化，如图表所示，该患者淋巴细胞总数存留度约20％，峰值区T细胞活性均值也从81.5降至16.5。同时淋巴细胞总数变化度也影响该患者新抗原肽的HLA亲和力变化度的T细胞活性峰值区间，大致呈现为：0.4—4/淋巴细胞存留度，例如，某患者的外周血淋巴细胞总数降至以前的20％，即淋巴细胞存留度为20％，则该患者具有较高T细胞活性的新抗原肽的HLA亲和力变化度位于2---20之间。
小结：
本发明公开一种肿瘤个体化疫苗的抗原肽快速、简便的筛选方法，所述筛选的步骤包括：a)获取患者肿瘤细胞；b)对所述肿瘤细胞进行基因组全外显子测序，得到所述患者的全外显子突变数据集；c)根据所述全外显子突变数据集，预测外显子突变所形成的一批新抗原肽；d)计算各新抗原肽的MHC I亲合力变化度；e)计算该患者外周血淋巴细胞总数存留度，依据淋巴细胞总数存留度与高T细胞活性的新抗原肽MHC I亲合力变化度的相互关系，确定高T细胞活性的新抗原肽MHC I亲合力变化度区间；f)将该患者处于该区间的新抗原肽筛选为对该患者免疫有效的新抗原肽，以制备个体化疫苗。
以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种肿瘤个体化疫苗的抗原肽筛选方法，所述筛选的步骤包括：
a)获取同一患者的肿瘤细胞与正常细胞；
b)对所述肿瘤细胞进行全外显子基因测序，得到所述患者的肿瘤全外显子数据集，对所述正常细胞进行全外显子基因测序，得到所述患者的正常全外显子数据集；
c)对比所述肿瘤全外显子数据集与所述正常全外显子数据集，得到所述患者的所述肿瘤全外显子数据集中特有的外显子数据，形成所述患者的突变全外显子数据集；将所述正常全外显子数据集与所述突变全外显子数据集对应的外显子的集合称作对照全外显子数据集；
d)对比所述突变全外显子数据集与正常人群SNP数据库，得到所述正常人群SNP数据库中不存在的所述突变全外显子数据集的子数据集，形成所述患者的突变外显子数据集；将所述突变外显子数据集翻译成肽，形成突变抗原肽数据集；将所述对照全外显子数据集中与所述突变外显子数据集对应的所有外显子翻译成肽，形成对照野生抗原肽数据集；
e)针对所述突变抗原肽数据集中每一条突变多肽，将所述对照抗原肽数据集中对应的多肽称作对照多肽，比较所述突变多肽的MHC I亲合力与所述对照多肽的MHC I亲合力，得到所述突变多肽的MHC I类分子亲和力变化度得分，得到亲和力变化度得分数据集；
f)计算所述患者外周血淋巴细胞总数变化度，依据淋巴细胞总数变化度与高T细胞活性的突变抗原肽MHC I亲合力变化度得分的关系，确定高T细胞活性的突变抗原肽MHC I亲合力变化度区间；
g)将所述患者处于所述变化度区间的突变抗原肽筛选为对所述患者免疫有效的突变抗原肽，称作新抗原肽，供个体化疫苗制备。
2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述筛选的步骤还包括：所述肿瘤选自肺癌、胃癌、结肠癌、恶黑及肉瘤。
3.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤c)是通过BWA软件实现的；和/或
步骤d)是采用GATK和VarScan软件联合实现的；和/或
步骤e)中，基于抗原肽的MHC I分子结合属性与结合解离半衰期，用BIMAS程序和NetCTL软件预测抗原肽与MHC I分子结合的新抗原肽：通过肽池测序法获得大量的与某一MHC I类分子结合的多肽的解离半衰期，建立半衰期矩阵，比较各肽段的预测分值，按得分高低列出所有可能作为CTL表位的新抗原肽，即得新抗原肽库。
4.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤e)为：
根据多肽序列从网站查询各突变多肽的MHC I类分子亲和力分除以于所述突变多肽对应的对照多肽的MHC I类分子亲和力分，等于所述突变多肽的MHC I类分子亲和力变化度得分，所述网址为：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/。
5.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤f)为：
患者外周血淋巴细胞总数变化度是通过ELISPOT方法进行的，淋巴细胞存留度为100％时，选取HLA亲和力变化度在0.4-4区间的新抗原肽。
6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的肿瘤个体化疫苗的抗原肽筛选方法得到的肿瘤个体化疫苗的抗原肽。
7.一种肿瘤个体化疫苗的制备方法，所述制备方法为将权利要求6所述肿瘤个体化疫苗的抗原肽与免疫佐剂混合，得到所述肿瘤个体化疫苗。
8.一种肿瘤个体化疫苗，所述肿瘤个体化疫苗是根据权利要求7所述的肿瘤个体化疫苗的制备方法制备得到的所述肿瘤个体化疫苗。
9.一种肿瘤个体化疫苗的测试方法，所述测试方法为将权利要求6所述的肿瘤个体化疫苗的抗原肽与树突状细胞共培养，得到混合树突状细胞疫苗，用以检测新抗原肽的免疫活性。
10.如权利要求6所述的肿瘤个体化疫苗的抗原肽或如权利要求8所述的肿瘤个体化疫苗在制备预防或治疗肿瘤的制剂中的用途。
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