CN110256454B - Lxr抑制剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种LXR抑制剂，该LXR抑制剂包括光甘草定或其同系物或它们的异构体或药学上可接受的盐。本发明还公开了该LXR抑制剂在治疗非酒精性脂肪性肝病以及制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。本发明利用LXR作为靶点，筛选出光甘草定及其同系物，并通过实验证实光甘草定及其同系物可以与脂质代谢相关基因LXR相互作用，抑制LXR的表达，逆转非酒精性脂肪性肝损伤，有效改善高脂饮食诱导的肝脏损伤和脂肪变性程度，对非酒精性脂肪性肝病具有非常好的治疗和缓解功效。

Description

LXR抑制剂及其用途

技术领域

本发明涉及制药领域，特别是涉及治疗脂肪肝病的药物，具体地说，是涉及可用于治疗非酒精性脂肪性肝病的LXR抑制剂。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史、以肝脏脂肪堆积过多为特征的遗传-环境-代谢应激相关性临床病理综合征。NAFLD的主要致病机制之一是脂代谢紊乱，导致脂质沉积，即肝脏获取的游离脂肪酸超过肝脏自身处理能力，造成甘油三酯淤积。NAFLD的标志性改变是肝细胞的细胞质中甘油三酯的聚积，这是由于脂质获得（即脂肪酸摄取）和从头脂质生成和去除（即线粒体脂肪酸氧化和作为极低密度脂蛋白颗粒的组分输出）之间的不平衡引起的。在西方国家，NAFLD在导致肝相关疾病的病因中已跃居榜首。流行病学调查显示，中国上海、广州和香港等发达地区NAFLD的患病率已达15%，并且在逐年升高。

NAFLD的发病机制复杂，脂代谢异常、胆固醇代谢异常、糖代谢异常都参与其中。NAFLD中，肝X受体(liver X-activated receptor，LXR)表达增加可能是肝脂质沉积的一个关键因子。LXR可以诱导肝脏合成脂肪酸。LXR包括两种亚型——LXRα（NR1H3）及LXRβ（NRlH2）。有研究显示LXRα在NAFLD患者中的表达异常增高，这提示了在NAFLD这样的慢性肝病的发病机制中LXRα的潜在作用，也有研究表明这是LXR和SREBPl-c共同作用的结果。LXRα主要表达在肝、脂肪组织及巨噬细胞内，而LXRβ表达广泛。LXRα的激活对肝内脂肪的生成和发展起着重要的作用，大多数医生认为，增加肝内脂肪的堆积会增加肝内炎症和纤维化发展的可能性。

目前，NAFLD是通过生活方式的改变来治疗的，如减肥和锻炼等。其他治疗NAFLD的重点是治疗相关的代谢合并症。维生素E和吡格列酮常被推荐用于治疗NASH（非酒精性脂肪性肝炎）患者，然而存在一定的副作用。Kalaany等人指出LXR基因敲除小鼠在喂食高脂肪（HF）饮食时对肥胖和肝脏中脂质积聚有抵抗力。Ahn等人报道LXR的表达与肝脂肪积聚、炎症和纤维化的程度直接相关。

光甘草定（Glabridin，GLA）是一种从光果甘草中提取的黄酮类生物活性物质，结构如式Ⅰ所示：

Ⅰ

光甘草定与许多生物学特性相关联，范围包括抗氧化、抗炎、神经保护和抗动脉粥样硬化，此外对能量代谢也有着调节作用。它还参与监管细胞能量消耗，并在预防代谢综合症中显示潜在的作用。有研究表明光甘草定可以通过抑制包括胆固醇调节元件结合蛋白-1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（fattyacid synthase，FAS）、硬脂酰辅酶A去饱和酶-1（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD-1）等脂质生成基因的表达，进而缓解肥胖和高脂血症。此外，光甘草定还可以促进脂肪酸氧化，在肥胖相关的代谢紊乱中发挥作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种LXR抑制剂，它可以抑制LXR的表达。

为解决上述技术问题，本发明的LXR抑制剂主要包括式Ⅱ所示化合物或其异构体或药学上可接受的盐：

Ⅱ

其中：

R1为氢、甲基或C1-3烷氧基中的任一种；

R2为羟基、含有卤素的基团、C1-3烷基或 C1-3烷氧基中的任一种。

较佳的，所述LXR抑制剂的化学结构优选为：

、

、

或

。

本发明要解决的技术问题之二是提供LXR抑制剂的用途，该LXR抑制剂可以用于治疗非酒精性脂肪性肝病或用于制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物。

光甘草定及其同系物可能通过LXR以及其他靶点共同抑制脂质相关表达基因。

所述非酒精性脂肪性肝病包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎和非酒精性脂肪肝诱导的肝纤维化等脂质代谢紊乱引起的肝脏炎症。

所述LXR抑制剂可以作为治疗非酒精性脂肪性肝病的药物的活性成分或药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

本发明利用LXR作为靶点，筛选出光甘草定，并通过实验证实光甘草定及其同系物可以与脂质代谢相关基因LXR相互作用，抑制LXR的表达，逆转非酒精性脂肪性肝损伤，有效改善高脂饮食诱导的肝脏损伤和脂肪变性程度，对非酒精性脂肪性肝病具有非常好的治疗和缓解功效。

附图说明

图1是光甘草定在酵母双杂交系统中的IC50。

图2是光甘草定（A图）及其同系物（B图）与LXR结合模式图。由该图可知该LXR抑制剂与蛋白活性口袋契合，主要通过氢键与LXR蛋白相互作用。

图3是普通饮食下不加光甘草定、高脂饮食下不加光甘草定，以及高脂饮食下加不同剂量光甘草定，小鼠的体重变化情况。

图4是普通饮食下不加光甘草定、高脂饮食下不加光甘草定，以及高脂饮食下加不同剂量光甘草定，小鼠的血清中丙氨酸氨基转移酶、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇以及肝脏内游离脂肪酸的变化情况。与高脂组相比，*P<0.05。

具体实施方式

为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1 光甘草定对LXR的抑制

光甘草定、LXR激动剂（T0901317）购自上海陶素生化科技有限公司。pGADT7-SRC1、pGBKT7-LXR-LBD等均通过分子克隆手段提前在实验室中制备完成。

采用酵母双杂交系统验证光甘草定对LXR的抑制作用。酵母转化方法如下：取一支无菌的1.5ml EP管，依次加入预冷的目的质粒pGBKT7-LXR-LBD 2.5µg、pGADT7-SRC1 5µg、CarrierDNA 5µl、冰上融化的Y2HGold感受态细胞100µl、PEG/LiAc 500µl，轻轻翻转混匀6-8次。30℃水浴30min，期间每10min轻轻翻转混匀6-8次。加入20µl的二甲基亚砜用于提高转化效率。之后42℃水浴15min，每5min轻轻翻转混匀6-8次；12000rpm瞬时离心弃上清，用100µl 0.9%NaCl溶液重悬，涂于SD/亮氨酸色氨酸缺陷的平板中，以便筛选出成功转化的酵母细胞。约2天后，平板上长出的菌落即可用于活性验证。

采用LXR激动剂（T0901317）验证酵母双杂交系统是否构建成功。在该体系下LXR激动剂的EC₅₀为0.38μM。酵母培养至OD值约为0.6，加9倍体积的选择性SD/亮氨酸色氨酸缺陷培养基以备用。详细验证方法如下：

验证LXR激动剂（T0901317）活性：每组取500μl酵母，分别加入0.5μl DMSO或不同浓度（30 mM、10 mM、3 mM、1 mM、0.3 mM、0.1 mM、0.03 mM、0.01 mM）的LXR激动剂（T0901317），每个浓度设置3组平行；然后把酵母溶液和光甘草定的混合物充分震荡混匀，30˚C摇床孵育24h。孵育后菌液充分混匀。分别取200μl，按顺序加入到干净96孔板中，用酶标仪测其OD600值。剩下的部分以12000rpm离心1 min，取上清液16μl，按顺序加至干净96孔板，在避光条件下每孔再加入48μl底物

（浓度为10mg/ml），把该96孔板避光密封，放于30˚C培养箱孵育2h，然后加入136 µl Na₂CO₃，使底物的反应停止，测定其OD410值。根据以下公式：

结果显示T0901317对LXR的激动倍数约为4，有显著的激动效果。

验证光甘草定对LXR的拮抗活性：预先在除空白组之外的酵母中加入阳性3.5nMLXR激动剂，取500μl分别加入0.5μl DMSO或不同浓度（30 mM、10 mM、3 mM、1 mM、0.3 mM、0.1 mM、0.03 mM、0.01 mM）的光甘草定。活性检测方法同上。根据以下公式计算得到抑制率：

在0.01～30mM的浓度范围，绘制光甘草定在不同浓度下对LXR抑制作用的S型曲线，并得到其IC₅₀，结果如图1所示。从图1中可以看出，光甘草定对LXR的IC₅₀为2.22μM，证实光甘草定对LXR有较好的抑制作用。

实施例2 分子对接筛选

从PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中获得LXR的NMR结构（PDBID:3IPQ），选取能量最低的结构并使用Autodock Tools软件对其加氢、计算电荷等预处理。通过Schroadinger软件确定活性口袋，以此设定Grid参数，得到60×60×60ų的格子。使用AutoDock Tools对晶体结构进行优化处理，包括加氢、删除水分子、补全缺失的残基和侧链。设定Grid参数后利用autodock与优化好结构的化合物进行刚性对接。最后采用PyMol软件对光甘草定及其同系物进行可视化分析，根据打分排名、结构相似性等选取能量最低的结构，减少假阳性率，初步筛选出光甘草定的同系物，对利用分子对接筛选出的部分化合物进行酵母双杂交实验进一步测试抑制活性，酵母双杂交实验方法同实施例1，实验结果见表1。光甘草定与同系物的相互作用位置结果见图2。对分子对接的结果进一步进行结构分析后发现（图2），苯环上的羟基可以与LXR蛋白上的Ile336以氢键相结合，能量更低，更加稳定。之后对于光甘草定的该基团及邻近基团进行一系列的取代，得出一系列同系物。从表1可以看出，苯环上的羟基对化合物与LXR的结合起到关键的作用。当将羟基的碳链加长，化合物对LXR的IC₅₀值有着明显的提高，抑制效果相应的也变差。当对羟基进行取代，可以发现，取代为卤素的基团（例如三氟甲基）时对LXR的激动剂的拮抗活性仍然较好。

表1光甘草定及其同系物对LXR的抑制效果

实施例3 动物实验

实验用小鼠为6-8周、体质量20±2 g的健康C57BL/6雌性小鼠(SPF级)。高脂饲料（87.8％普通饲料+10％猪油+2％胆固醇+0.2％胆酸钠）与普通饲料均由上海斯莱克实验动物有限公司提供。

为验证光甘草定（GLA）对非酒精性脂肪肝的治疗作用，将32只健康C57BL/6雌性小鼠在实验室适应性喂养1周，随后依据随机数表法将其分为生理盐水对照组、模型组、光甘草定低剂量组（20ml/kg/d）和光甘草定高剂量组（40mg/kg/d），每组各8只。

对照组使用普通饲料喂养，其余组使用高脂饲料（87.8％普通饲料+10％猪油+2％胆固醇+0.2％胆酸钠）喂养，自由摄取水和食物。16周后，各组小鼠喂养条件不变，对照组和模型组分别给予0.9％生理盐水，按每天20ml/kg灌胃；光甘草定低剂量组按每天20mg/kg给予光甘草定灌胃，光甘草定高剂量组按每天40mg/kg给予光甘草定灌胃。20周末，禁食不禁饮12h后，颈椎脱臼法处死老鼠，眼眶静脉取血，分离血清，放于-80℃保存。小鼠的体重变化如图3所示，从图中可以看出，造模期间，各组小鼠体质量都持续增高。造模16周后，与对照组相比，高脂饮食喂养的各组，小鼠体重均明显增高。经过4周灌胃治疗后，与模型组相比，光甘草定治疗后小鼠的体重有所降低，由此证实光甘草定能控制NAFLD小鼠体质量，对高脂饮食造成的脂肪肝具有显著效果。

血清生物化学指标的检测：将储存的血清通过全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶 (alanine aminotransferase，ALT)、甘油三酯 (triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoproteincholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C) 。结果如图4所示。从图4中可以看出，与对照组相比，模型组小鼠的血清ALT、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平均明显增高；与模型组相比，GLA低剂量组和高剂量组的小鼠血清ALT、TG水平均显著降低，血清TC水平有下降趋势。不同剂量的GLA组之间差异不明显，由此证实不同剂量的GLA均能显著降低NAFLD小鼠血清转氨酶及血脂水平。

肝组织匀浆检测游离脂肪酸：准确称取肝脏重量，按重量(g)：体积 (ml)＝1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，制成10％匀浆，2500转/分离心10分钟，取上清测定。用试剂盒法测肝组织匀浆中游离脂肪酸的含量。结果如图4所示，从图中可以看出，与对照组相比，模型组的肝组织内FFA含量明显增高；与模型组相比，GLA低剂量组和高剂量组的肝组织内FFA含量降低。

上述实验表明，光甘草定能显著的降低高脂饮食诱导的小鼠肝血清中ALT、TG等的水平，降低肝脏中FFA含量，表明光甘草定有较好的改善高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝带来的肝损伤和脂肪变性程度。

本申请中的实验数据来源于至少三次的独立重复实验。采用GraphPad prism7软件进行统计学分析，数据之间用student’s t检验（P<0.05表明有统计学意义）。

Claims (6)

1.LXR抑制剂，其特征在于，所述LXR抑制剂包括式Ⅱ所示化合物或药学上可接受的盐：

其中：

R₁为氢，R₂为卤代甲基或C_1-3烷基。

2.根据权利要求1所述的LXR抑制剂，其特征在于，所述LXR抑制剂的化学结构为：

3.权利要求1或2所述LXR抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物。

4.根据权利要求3所述的LXR抑制剂的用途，其特征在于，所述非酒精性脂肪性肝病包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎和非酒精性脂肪肝诱导的肝纤维化。

5.根据权利要求3所述的LXR抑制剂的用途，其特征在于，所述LXR抑制剂用作所述药物的活性成分。

6.根据权利要求3所述的LXR抑制剂的用途，其特征在于，所述LXR抑制剂用作所述药物的药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

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