CN110251488A - BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球 - Google Patents

BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。本发明通过Acetobacter xylinum细菌培养合成了具有高结晶度的细菌纤维素，然后利用硫酸水解和过氧化氢辅助氧化的方法制备了富含羧基基团的BCNs。进而将BCNs与APG复配，利用其良好的胶体界面性能成功地制备了负载疏水医药的Pickering乳液；在钙离子的外源交联作用下，将载药Pickering乳液包封于海藻酸盐凝胶基质中。对疏水性药物分子具有很高的负载能力，在钙离子的外源交联作用下形成的凝胶壳，有效地促进了疏水药物的负载，延长了药物的持续释放时间，使其能够展现出良好的药效和药物利用率。

Description

BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释 微球
技术领域
本发明涉及一种凝胶微球，特别涉及一种BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球，属于疏水性药物制剂技术领域。
背景技术
作为一种天然高分子材料，海藻酸钠具有成本低廉、无毒、来源广泛、可生物降解等优点，在药物载体领域具有广泛的应用前景。但是海藻酸盐分子链上含有大量的羟基和羧基等亲水基团，其与有机疏水药物分子的亲和力降低，而且单一的海藻酸钙凝胶微球机械性能差、易降解和遇水大量溶胀会导致不可控制和预测的药物活性成分的释放，严重限制了其在疏水药物载体方面的应用和发展。
在过去的几十年中，海藻酸盐凝胶微球在食品工业、药物制剂和组织工程领域受到了广泛的关注。由于海藻酸盐具有一些独特的优点如水溶性、可再生性、无毒性、生物相容性、生物降解性和非免疫原性，它可以用来高效地包封活细胞、蛋白质药物、酶、食品成分和催化剂在内的各种亲水性材料。然而，由于海藻酸盐分子骨架上含有大量的羟基和羧基亲水基团，它对疏水性药物分子的亲和力较差，致使其对疏水性药物分子的负载率较低。海藻酸盐的这种固有缺陷可以通过化学改性方法将疏水基团引入其亲水主链上，或通过物理共混的方法掺入其它聚合物或黏土而得到改善。但是迄今为止，很少有文献报道利用Pickering乳液的乳化作用来改善海藻酸盐对疏水性药物的负载能力，尤其是使用细菌纤维素纳米晶(BCNs)协同烷基糖苷作为Pickering乳液乳化剂。
发明内容
本发明提供一种BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球，其对疏水性药物分子具有很高的负载能力，在钙离子的外源交联作用下形成的凝胶壳，有效地促进了疏水药物的负载，延长了药物的持续释放时间，使其能够展现出良好的药效和药物利用率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)细菌纤维素的制备：Acetobacter xylinum细菌采用灭菌后的发酵培养基在pH为3.5～5.0的条件下接种培养，静置培养3～4天得到初始的细菌纤维素(BC)凝胶，经纯化，清洗，粉碎，冷冻干燥，得到高纯度的细菌纤维素；
(2)BCNs的制备：将细菌纤维素分散在质量浓度为45％～65％的浓硫酸溶液中，充分搅拌，在40～70℃的温度下水解反应充分后，用水将反应液稀释以终止水解反应，用过氧化氢溶液对反应液进行氧化和漂白，反应液离心分离得到沉淀，沉淀多次水洗和超声处理后装入截留分子量为3500的透析袋中，在超纯水中充分透析，得到的产物冷冻干燥后得到BCNs粉末；
(3)BCNs粉末溶于水制成BCNs悬浮液，BCNs悬浮液和APG溶液混匀后作为水相，疏水药物的二氯甲烷溶液作为油相；按照1:9～3:7的油水体积比将油相和水相混合，经超声剪切作用制得载药O/W型Pickering乳液；
(4)将载药O/W型Pickering乳液混入适量海藻酸钠溶液中，混合均匀后得到载药溶液；将载药溶液逐滴滴入交联剂溶液中并恒速搅拌，30±5min后将所得凝胶微球从交联剂中转移出来，过滤，洗净，室温下静置10±2min后，转入真空干燥箱内在60±5℃条件下干燥至二氯甲烷和水分挥发，即得到BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。
本发明利用海南热带资源如椰子水作为培养基，通过Acetobacter xylinum细菌培养合成了具有高结晶度的细菌纤维素，然后利用硫酸水解和过氧化氢辅助氧化的方法制备了富含羧基基团的BCNs。进而将BCNs与APG复配，利用其良好的胶体界面性能成功地制备了负载疏水医药的Pickering乳液。最后在钙离子的外源交联作用下，将载药Pickering乳液包封于海藻酸盐凝胶基质中，从而制得负载疏水性药物的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。由于制备材料均无毒、可生物降解，因此该负载疏水性药物的海藻酸盐复合凝胶缓释微球有望应用于医药制剂领域。
细菌纤维素(BC)是由木醋杆菌(Acetobacter xylinum)在液态培养基中合成的一类天然生物大分子。相比于动物和植物纤维素，BC具有突出的优点，例如高结晶度和纯度、杰出的机械强度、连通的孔隙、优异的溶胀性以及良好的生物相容性和生物降解性。而且BC的形状和一些性能可以在其生物合成过程中进行调整。因此它作为一种良好的生物材料被广泛应用于医药领域。由于纤维素单体的C2、C3和C6处含有三个羟基基团，纤维素的微原纤维中存在分子间和分子内的氢键作用，从而导致了其结晶区域和无定形区域的堆积和排列。这些微原纤维可以通过强酸水解去除无定形区域，获得杆状或棒状的BCNs。通过硫酸水解制备的BCNs可以在其表面上赋予阴离子硫酸酯半酯基团，其可以被过氧化氢进一步氧化，从而得到富含羧基基团的BCNs。由于BCNs较强的氢键作用使其主链显现疏水特性，但是羧基亲水基团的引入使其呈现出良好的两亲性能，因此它可以用来稳定Pickering乳液。Pickering乳液是一种以固体活性微粒代替传统表面活性剂作为乳化剂来降低界面张力，由两种互不相溶的液相组成的热力学不稳定分散体系。与传统乳液相比，Pickering乳液具有许多优点，如更稳定的剂型，减少的发泡问题和更低的毒性，因此它被广泛应用于生物医学、食品和化妆品领域。尤其是对聚并和奥式熟化高度稳定的Pickering乳液能够在高浓度的分散相下保存液滴，因此它能够在海藻酸盐溶液中分散疏水性的药物。
烷基糖苷(APG)是一种由葡萄糖和脂肪醇缩合酯化得到的一种新型非离子表面活性剂。具有良好的生物降解性，对环境友好其对皮肤毒性小，是国际上公认的首选“绿色”功能性表面活性剂。APG有多个优点，如HLB值可调、去污能力好、泡沫丰富细腻、配伍性好、对皮肤毒理性小、生物可降解，可以和任何类型表面活性剂进行复配，且耐硬水、抗盐性强。因此它也被广泛应用于医药制剂领域。
本发明的创新点主要体现在以下两方面：
(1)以Acetobacter xylinum细菌培养合成的具有高结晶度的细菌纤维素为原料，利用硫酸水解和过氧化氢辅助氧化的方法制备了具有胶体界面活性的细菌纤维素纳米晶；
(2)利用BCNs协同APG制备的Pickering乳液实现其对疏水性药物分子的负载，然后利用海藻酸盐的包覆性能，将载药的Pickering乳液固定在凝胶基质中，以提高疏水药物载体的缓释性能和稳定性。
作为优选，步骤(1)中所述发酵培养基的配方为0.2～2.0g蔗糖、0.1～0.6g硫酸铵、0.01～0.1g硫酸镁和0.05～0.3g磷酸二氢钾溶于100mL自然发酵椰子水。
作为优选，步骤(1)的纯化方法是将细菌纤维素凝胶用0.1mol/L的NaOH水溶液于80℃下浸泡。
作为优选，步骤(3)中水相的制备方法是：在超声和搅拌的作用下，分别配制质量分数为1.0％的BCNs悬浮液和质量分数为1.5％的APG溶液，BCNs悬浮液和APG溶液按照1:2～4:1的体积比混合，经超声搅拌混匀后得到水相。
作为优选，步骤(3)中所述APG为己基糖苷、辛基糖苷和癸基糖苷中的一种或多种。
作为优选，步骤(3)中所述疏水药物为布洛芬或环丙沙星，其在油相中的质量分数为0.01％～0.1％。
作为优选，步骤(4)中所述的海藻酸盐质均分子量Mw≥100000，其单体古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)的摩尔比G/M≥1.5，海藻酸钠溶液的质量浓度为1.0％-4.0％。
作为优选，步骤(4)中所述交联剂为氯化钙或戊二醛，交联剂的质量浓度为1.0％～5.0％。
作为优选，步骤(4)中过氧化氢溶液的质量浓度是28～32％。
一种所述的制备方法制得的一种BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明利用BCNs协同APG制备的Pickering乳液实现其对疏水性药物分子的负载。然后利用海藻酸盐的包覆性能，将载药的Pickering乳液固定在凝胶基质中，提高了疏水药物载体的缓释性能和稳定性；
2、所制得的海藻酸盐复合凝胶缓释微球对疏水性药物分子具有很高的负载能力，在钙离子的外源交联作用下形成的凝胶壳，有效地促进了疏水药物的负载，延长了药物的持续释放时间，使其能够展现出良好的药效和药物利用率；
3、同时，在产品的制备中选用的原材料如海藻酸钠、BCNs和APG均为生物相容性好、可自然降解的材料，使本技术产品具有良好的生物相容性。这种具有高效和持续释放性能的新型载药技术通过环保型Pickering乳液法将生物相容性BCNs和APG与天然海藻酸盐相结合，在生物医药和生物制药方面具有巨大的应用潜力。
此外，本发明的产品制备过程简单，工艺条件可控，材料结构和性能容易控制，易于实现工业化生产。可以采用本发明方法充分利用热带资源椰子水和海洋海藻资源提取的海藻多糖开发绿色环保型缓释医药新剂型，为再生能源的持续、高效利用提供新的途径。
附图说明
图1(a)为由BC凝胶膜制备BCNs悬浮液的实物图；(b)为细菌纤维素分子水解和氧化合成BCNs路线图；
图2(a)为BCNs的扫描电镜图；(b)为BCNs的透射电镜图；
图3为BCNs的(a)FT-IR谱图、(b)XRD谱图、(c)13C CP/MAS谱图、(d)水动力学粒径分布图、(e)Zeta电位分布图和(f)粘度随剪切速率变化曲线图；
图4为制备的载药Pickering乳液的光学显微镜图和荧光图；
图5(a)、(b)和(c)为海藻酸钙凝胶微球的实物图和扫描电镜图；(d)、(e)和(f)为基于BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球的实物图和扫描电镜图；
图6为布洛芬从海藻酸钙凝胶微球和基于BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球中的释放曲线图；
图7为MC3T3-E1细胞在不同浓度海藻酸盐复合凝胶缓释微球上分别培养2天和5天后的细胞活力比较图，*代表P<0.05，表示有显著性差异。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
Acetobacter xylinum细菌，来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编码为CGMCC5173。
BCNs的微观结构及性能
细菌纤维素(BC)凝胶和BCNs悬浮液的实物图见图1(a)，细菌纤维素分子水解和氧化合成BCNs路线图见图1(b)。BCNs的扫描电镜图和透射电镜图见图2，由图2可知细菌纤维素经硫酸水解后主要生成杆状的BCNs。
BCNs的(a)FT-IR谱图、(b)XRD谱图、(c)13C CP/MAS谱图、(d)水动力学粒径分布图、(e)Zeta电位分布图和(f)粘度随剪切速率变化曲线图如图3所示。由图3可以看出，由于浓硫酸水解和过氧化氢氧化反应给BCNs表面引入了带负电的羧基基团，使BCNs的带电量为-34.8mV，其绝对值高于30mV，因此它可通过粒子间的静电排斥力使其稳定地分散在水溶液中。从上述分析结果说明BCNs具有较小的粒度和良好的界面性能，可以作为Pickering乳液乳化剂应用于疏水药物载体的制备中。
载药Pickering的微观结构
所述的载药Pickering，采用光学显微镜观测其乳液液滴形貌。图4为制备的载药Pickering乳液的光学显微镜图和荧光图。从图4中可以看出，在BCNs和APG复配体系的乳化作用下，制备的乳液呈O/W型，其乳液液滴展现出规整的球形形态。
海藻酸盐复合凝胶缓释微球的微观结构
所述负载疏水性药物的海藻酸盐复合凝胶缓释微球经切片和喷金处理后，即可在扫描电镜(SEM)下观察其表观形貌和剖切面形态。海藻酸钙凝胶微球和基于BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球的实物图和扫描电镜图，如图5所示，由图5可知，相比于海藻酸钙微球，基于BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球在干燥过程中，由于二氯甲烷的挥发和BCNs良好的分散性导致其表面呈现粗糙和丝状的形态，并存在一定的间隙。而且，从其剖切面中可以观察到其表面展现出更丰富的孔隙结构，它进一步证实了负载药物的二氯甲烷溶液在钙离子的交联作用下被成功地包封于海藻酸盐的凝胶结构中。
模拟释药试验
所述负载疏水性药物的海藻酸盐复合凝胶缓释微球，以磷酸缓冲液(PBS)作为释药介质，进行模拟释药试验，考察其对抗炎、抗菌类药物的控释性能。
布洛芬从海藻酸钙凝胶微球和基于BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球中的释放曲线图见图6，从图6中可知，海藻酸钙凝胶微球存在明显的突释现象，在1200min内释放了大约73％的药物，说明大部分药物游离于海藻酸钙凝胶微球表面，这是由亲水性的海藻酸盐与疏水药物分子的亲和力低造成的。相比之下，基于BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球，在BCNs/APG的乳化作用下，实现了其对疏水性药物的有效负载，使其能够持续释放药物，且相同时间内释药量只占总药量的38％，极大地减缓了药物的释放。
生物相容性试验
该以小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)作为模型细胞，通过细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)考察细胞在BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球上的活力和增殖情况，从而评价其生物相容性。
MC3T3-E1细胞培养液为90％MEM-α，另外补加10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。应用于细胞培养的基于BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球，使用钴60射线灭菌，照射强度为8kGy。基于BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球在接种细胞前先在细胞培养基中浸泡12小时以上。将复苏的细胞在聚苯乙烯细胞培养皿中传2代后采用胰蛋白酶消化并收集。细胞经计数后以每孔5×104的密度接种到24孔组织培养板的复合凝胶缓释微球上，同时将同样的细胞接种到无复合凝胶缓释微球的组织培养板上作为空白对照。补充细胞培养液，使每孔的培养基总量达到500μL。随后将组织培养板放入含5％CO2的培养箱内，于37℃条件下培养，培养液每2天更换一次。通过细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)考察细胞在该复合凝胶缓释微球上的活力和增殖情况。
MC3T3-E1细胞在不同浓度海藻酸盐复合凝胶缓释微球上分别培养2天和5天后的细胞活力比较数据见图7，由图7可知，细胞在海藻酸盐复合凝胶缓释微球上表现出较好的增殖能力，而且其增殖活力均高于对照组，说明海藻酸盐复合凝胶缓释微球具有较低的细胞毒性。但是通过对比可知，过高浓度的海藻酸盐复合凝胶缓释微球可能会抑制细胞的增殖。
对比例1
将10mg的布洛芬溶于2mL二氯甲烷中。然后将其混入100mL质量分数为2％的海藻酸钠溶液中，在高速搅拌作用下使其混合均匀。最后采用25mL皮下注射器在30cm高处将该混合均匀的载药溶液逐滴滴入质量分数为2.0％的氯化钙溶液中并恒速搅拌。30min后将所得凝胶微球从交联剂中转移出来，过滤，用蒸馏水冲洗。在室温下静置10min后，转入真空干燥箱内在60℃条件下干燥至恒重得到负载疏水性药物的海藻酸钙凝胶微球。所得海藻酸钙凝胶的包封率为53.5％，在PBS中，20小时内持续释放了总药量的73.1％。并且MC3T3-E1细胞在该复合凝胶缓释微球上的存活率高达98.4％，且能够表现出较好的增殖效果。
实施例1
量取100mL自然发酵椰子水，向其中加入1.0g蔗糖、0.5g硫酸铵、0.05g硫酸镁和0.15g磷酸二氢钾，充分混合制成发酵培养基。在接种Acetobacter xylinum细菌之前，上述发酵培养基在120℃高温灭菌30min。在pH＝4.0，室温30℃条件下，静置培养大约3～4天得到初始的细菌纤维素凝胶。随后用0.1mol/L的NaOH水溶液于80℃下纯化细菌纤维素凝胶，最后用二次蒸馏水反复冲洗至中性。得到的膜用粉碎机粉碎之后，经冷冻干燥得到高纯度的细菌纤维素粉末。随后，将10g细菌纤维素粉末分散在100mL质量分数为50％的浓硫酸溶液中，并强力搅拌。在45℃下反应5小时后，采用去离子水将反应溶液稀释5倍以终止水解反应。然后，在磁力搅拌作用下加入8mL质量分数为30％过氧化氢溶液对反应液进行氧化和漂白。30min后，反应液在9000r/min下离心分离得到沉淀。沉淀经反复水洗和超声处理后装入截留分子量为3500的透析袋中。在超纯水中透析1周后，产物经冷冻干燥制得平均水动力学粒径约为261nm，Zeta电位为-30.6mV的BCNs。
在超声和搅拌的作用下，分别配制质量分数为1.0％的BCNs悬浮液和质量分数为1.5％的己基糖苷溶液。两者按照4:1的体积比混合，经超声搅拌混匀后作为水相。将5mg的布洛芬溶于1mL二氯甲烷中，作为油相。按照1:9的油水体积比，将1mL油相和9mL水相混合，最后经超声剪切作用制得载药O/W型Pickering乳液。然后将制备的约10mL载药O/W型Pickering乳液混入100mL质量分数为2％的海藻酸钠溶液中，在高速搅拌作用下使其混合均匀。最后采用25mL皮下注射器在30cm高处将该混合均匀的载药溶液逐滴滴入质量分数为1.0％的氯化钙溶液中并恒速搅拌。30min后将所得凝胶微球从交联剂中转移出来，过滤，用蒸馏水冲洗。在室温下静置10min后，转入真空干燥箱内在60℃条件下干燥至二氯甲烷和水分完全挥发得到负载疏水性药物的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。
所得海藻酸盐复合凝胶缓释微球的包封率为91.4％，在PBS中，20小时内持续释放了总药量的27.2％。并且MC3T3-E1细胞在该复合凝胶缓释微球上的存活率高达94.3％，且能够表现出较好的增殖效果。
实施例2
量取100mL自然发酵椰子水，向其中加入1.5g蔗糖、0.5g硫酸铵、0.03g硫酸镁和0.3g磷酸二氢钾，充分混合制成发酵培养基。在接种Acetobacter xylinum细菌之前，上述发酵培养基在120℃高温灭菌30min。在pH＝4.0，室温30℃条件下，静置培养大约3～4天得到初始的细菌纤维素凝胶。随后用0.1mol/L的NaOH水溶液于80℃下纯化细菌纤维素凝胶，最后用二次蒸馏水反复冲洗至中性。得到的膜用粉碎机粉碎之后，经冷冻干燥得到高纯度的细菌纤维素粉末。随后，将10g细菌纤维素粉末分散在100mL质量分数为60％的浓硫酸溶液中，并强力搅拌。在45℃下反应5小时后，采用去离子水将反应溶液稀释5倍以终止水解反应。然后，在磁力搅拌作用下加入10mL质量分数为30％过氧化氢溶液对反应液进行氧化和漂白。30min后，反应液在9000r/min下离心分离得到沉淀。沉淀经反复水洗和超声处理后装入截留分子量为3500的透析袋中。在超纯水中透析1周后，产物经冷冻干燥制得平均水动力学粒径约为232nm，Zeta电位为-34.5mV的BCNs。
在超声和搅拌的作用下，分别配制质量分数为1.0％的BCNs悬浮液和质量分数为1.5％的辛基糖苷溶液。两者按照2:1的体积比混合，经超声搅拌混匀后作为水相。将10mg的布洛芬溶于2mL二氯甲烷中，作为油相。按照2:8的油水体积比，将2mL油相和8mL水相混合，最后经超声剪切作用制得载药O/W型Pickering乳液。然后将制备的约10mL载药O/W型Pickering乳液混入100mL质量分数为3％的海藻酸钠溶液中，在高速搅拌作用下使其混合均匀。最后采用25mL皮下注射器在30cm高处将该混合均匀的载药溶液逐滴滴入质量分数为2.0％的氯化钙溶液中并恒速搅拌。30min后将所得凝胶微球从交联剂中转移出来，过滤，用蒸馏水冲洗。在室温下静置10min后，转入真空干燥箱内在60℃条件下干燥至二氯甲烷和水分完全挥发得到负载疏水性药物的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。
所得海藻酸盐复合凝胶缓释微球的包封率为97.0％，在PBS中，20小时内持续释放了总药量的24.1％。并且MC3T3-E1细胞在该复合凝胶缓释微球上的存活率高达96.6％，且能够表现出较好的增殖效果。
实施例3
量取100mL自然发酵椰子水，向其中加入0.5g蔗糖、0.2g硫酸铵、0.03g硫酸镁和0.08g磷酸二氢钾，充分混合制成发酵培养基。在接种Acetobacter xylinum细菌之前，上述发酵培养基在120℃高温灭菌30min。在pH＝5.0，室温30℃条件下，静置培养大约3～4天得到初始的细菌纤维素凝胶。随后用0.1mol/L的NaOH水溶液于80℃下纯化细菌纤维素凝胶，最后用二次蒸馏水反复冲洗至中性。得到的膜用粉碎机粉碎之后，经冷冻干燥得到高纯度的细菌纤维素粉末。随后，将10g细菌纤维素粉末分散在100mL质量分数为45％的浓硫酸溶液中，并强力搅拌。在60℃下反应5小时后，采用去离子水将反应溶液稀释5倍以终止水解反应。然后，在磁力搅拌作用下加入12mL质量分数为30％过氧化氢溶液对反应液进行氧化和漂白。30min后，反应液在9000r/min下离心分离得到沉淀。沉淀经反复水洗和超声处理后装入截留分子量为3500的透析袋中。在超纯水中透析1周后，产物经冷冻干燥制得平均水动力学粒径约为313nm，Zeta电位为-29.8mV的BCNs。
在超声和搅拌的作用下，分别配制质量分数为1.0％的BCNs悬浮液和质量分数为1.5％的癸基糖苷溶液。两者按照1:1的体积比混合，经超声搅拌混匀后作为水相。将10mg的环丙沙星溶于2mL二氯甲烷中，作为油相。按照2:8的油水体积比，将2mL油相和8mL水相混合，最后经超声剪切作用制得载药O/W型Pickering乳液。然后将制备的约10mL载药O/W型Pickering乳液混入100mL质量分数为3％的海藻酸钠溶液中，在高速搅拌作用下使其混合均匀。最后采用25mL皮下注射器在30cm高处将该混合均匀的载药溶液逐滴滴入质量分数为2.5％的氯化钙溶液中并恒速搅拌。30min后将所得凝胶微球从交联剂中转移出来，过滤，用蒸馏水冲洗。在室温下静置10min后，转入真空干燥箱内在60℃条件下干燥至二氯甲烷和水分完全挥发得到负载疏水性药物的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。
所得海藻酸盐复合凝胶缓释微球的包封率为96.4％，在PBS中，20小时内持续释放了总药量的23.9％。并且MC3T3-E1细胞在该复合凝胶缓释微球上的存活率高达95.1％，且能够表现出较好的增殖效果。
实施例4
量取100mL自然发酵椰子水，向其中加入2.0g蔗糖、0.6g硫酸铵、0.1g硫酸镁和0.2g磷酸二氢钾，充分混合制成发酵培养基。在接种Acetobacter xylinum细菌之前，上述发酵培养基在120℃高温灭菌30min。在pH＝4.0，室温30℃条件下，静置培养大约3～4天得到初始的细菌纤维素凝胶。随后用0.1mol/L的NaOH水溶液于80℃下纯化细菌纤维素凝胶，最后用二次蒸馏水反复冲洗至中性。得到的膜用粉碎机粉碎之后，经冷冻干燥得到高纯度的细菌纤维素粉末。随后，将10g细菌纤维素粉末分散在100mL质量分数为50％的浓硫酸溶液中，并强力搅拌。在50℃下反应5小时后，采用去离子水将反应溶液稀释5倍以终止水解反应。然后，在磁力搅拌作用下加入15mL质量分数为30％过氧化氢溶液对反应液进行氧化和漂白。30min后，反应液在9000r/min下离心分离得到沉淀。沉淀经反复水洗和超声处理后装入截留分子量为3500的透析袋中。在超纯水中透析1周后，产物经冷冻干燥制得平均水动力学粒径约为245nm，Zeta电位为-31.7mV的BCNs。
在超声和搅拌的作用下，分别配制质量分数为1.0％的BCNs悬浮液和质量分数为1.5％的辛基糖苷溶液。两者按照1:2的体积比混合，经超声搅拌混匀后作为水相。将10mg的布洛芬溶于2mL二氯甲烷中，作为油相。按照2:8的油水体积比，将2mL油相和8mL水相混合，最后经超声剪切作用制得载药O/W型Pickering乳液。然后将制备的约10mL载药O/W型Pickering乳液混入100mL质量分数为1％的海藻酸钠溶液中，在高速搅拌作用下使其混合均匀。最后采用25mL皮下注射器在30cm高处将该混合均匀的载药溶液逐滴滴入质量分数为1.0％的戊二醛溶液中并恒速搅拌。30min后将所得凝胶微球从交联剂中转移出来，过滤，用蒸馏水冲洗。在室温下静置10min后，转入真空干燥箱内在60℃条件下干燥至二氯甲烷和水分完全挥发得到负载疏水性药物的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。
所得海藻酸盐复合凝胶缓释微球的包封率为89.3％，在PBS中，20小时内持续释放了总药量的41.2％。并且MC3T3-E1细胞在该复合凝胶缓释微球上的存活率高达90.4％，且能够表现出较好的增殖效果。
实施例5
量取100mL自然发酵椰子水，向其中加入0.2g蔗糖、0.2g硫酸铵、0.01g硫酸镁和0.07g磷酸二氢钾，充分混合制成发酵培养基。在接种Acetobacter xylinum细菌之前，上述发酵培养基在120℃高温灭菌30min。在pH＝5.0，室温30℃条件下，静置培养大约3～4天得到初始的细菌纤维素凝胶。随后用0.1mol/L的NaOH水溶液于80℃下纯化细菌纤维素凝胶，最后用二次蒸馏水反复冲洗至中性。得到的膜用粉碎机粉碎之后，经冷冻干燥得到高纯度的细菌纤维素粉末。随后，将10g细菌纤维素粉末分散在100mL质量分数为50％的浓硫酸溶液中，并强力搅拌。在60℃下反应5小时后，采用去离子水将反应溶液稀释5倍以终止水解反应。然后，在磁力搅拌作用下加入10mL质量分数为30％过氧化氢溶液对反应液进行氧化和漂白。30min后，反应液在9000r/min下离心分离得到沉淀。沉淀经反复水洗和超声处理后装入截留分子量为3500的透析袋中。在超纯水中透析1周后，产物经冷冻干燥制得平均水动力学粒径约为255nm，Zeta电位为-32.6mV的BCNs。
在超声和搅拌的作用下，分别配制质量分数为1.0％的BCNs悬浮液和质量分数为1.5％的己基糖苷溶液。两者按照3:1的体积比混合，经超声搅拌混匀后作为水相。将5mg的布洛芬溶于1mL二氯甲烷中，作为油相。按照1:9的油水体积比，将1mL油相和9mL水相混合，最后经超声剪切作用制得载药O/W型Pickering乳液。然后将制备的约10mL载药O/W型Pickering乳液混入100mL质量分数为2％的海藻酸钠溶液中，在高速搅拌作用下使其混合均匀。最后采用25mL皮下注射器在30cm高处将该混合均匀的载药溶液逐滴滴入质量分数为4.0％的戊二醛溶液中并恒速搅拌。30min后将所得凝胶微球从交联剂中转移出来，过滤，用蒸馏水冲洗。在室温下静置10min后，转入真空干燥箱内在60℃条件下干燥至二氯甲烷和水分完全挥发得到负载疏水性药物的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。
所得海藻酸盐复合凝胶缓释微球的包封率为93.4％，在PBS中，20小时内持续释放了总药量的37.6％。并且MC3T3-E1细胞在该复合凝胶缓释微球上的存活率高达88.7％，且能够表现出较好的增殖效果。
综上，本发明制备的海藻酸盐复合凝胶缓释微球对疏水性药物分子具有很高的负载能力，在钙离子的外源交联作用下形成的凝胶壳，有效地促进了疏水药物的负载，延长了药物的持续释放时间，使其能够展现出良好的药效和药物利用率。同时，在产品的制备中选用的原材料如海藻酸钠、BCNs和APG均为生物相容性好、可自然降解的材料，使本技术产品具有良好的生物相容性，使其在生物医药和生物制药方面具有巨大的应用潜力。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)细菌纤维素的制备：Acetobacter xylinum细菌采用灭菌后的发酵培养基在pH为3.5~5.0的条件下接种培养，静置培养3~4天得到初始的细菌纤维素凝胶，经纯化，清洗，粉碎，冷冻干燥，得到高纯度的细菌纤维素；
(2)BCNs的制备：将细菌纤维素分散在质量浓度为45%~65%的浓硫酸溶液中，充分搅拌，在40~70 ℃的温度下水解反应充分后，用水将反应液稀释以终止水解反应，用过氧化氢溶液对反应液进行氧化和漂白，反应液离心分离得到沉淀，沉淀多次水洗和超声处理后装入截留分子量为3500的透析袋中，在超纯水中充分透析，得到的产物冷冻干燥后得到BCNs粉末；
(3) BCNs粉末溶于水制成BCNs悬浮液，BCNs悬浮液和APG溶液混匀后作为水相，疏水药物的二氯甲烷溶液作为油相；按照1:9~3:7的油水体积比将油相和水相混合，经超声剪切作用制得载药O/W型Pickering乳液；
(4)将载药O/W型Pickering乳液混入适量海藻酸钠溶液中，混合均匀后得到载药溶液；
将载药溶液逐滴滴入交联剂溶液中并恒速搅拌，30±5 min后将所得凝胶微球从交联剂中转移出来，过滤，洗净，室温下静置10±2 min后，转入真空干燥箱内在60±5℃条件下干燥至二氯甲烷和水分挥发，即得到BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述发酵培养基的配方为0.2~2.0g蔗糖、0.1~0.6g硫酸铵、0.01~0.1g硫酸镁和0.05~0.3g磷酸二氢钾溶于100 mL自然发酵椰子水。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）的纯化方法是将细菌纤维素凝胶用0.1 mol/L的NaOH水溶液于80 ℃下浸泡。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中水相的制备方法是：在超声和搅拌的作用下，分别配制质量分数为1.0%的BCNs悬浮液和质量分数为1.5%的APG溶液，BCNs悬浮液和APG溶液按照1:2~4:1的体积比混合，经超声搅拌混匀后得到水相。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述APG为己基糖苷、辛基糖苷和癸基糖苷中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述疏水药物为布洛芬或环丙沙星，其在油相中的质量分数为0.01%~0.1%。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的海藻酸盐质均分子量Mw≥100000，其单体古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)的摩尔比G/M≥1.5，海藻酸钠溶液的质量浓度为1.0%-4.0%。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述交联剂为氯化钙或戊二醛，交联剂的质量浓度为1.0%~5.0%。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中过氧化氢溶液的质量浓度是28~32%。
10.一种权利要求1所述的制备方法制得的一种BCNs/APG乳化Pickering乳液构建的海藻酸盐复合凝胶缓释微球。
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