CN110249049A

CN110249049A - 产生高阶基因组编辑文库的方法

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Publication number: CN110249049A
Application number: CN201780081590.7A
Authority: CN
Inventors: 曼纽尔·考利奇; 安德烈亚斯·恩斯特; 马丁·韦格纳; 瓦伦蒂娜·迪尔; 拉埃尔·德布鲁恩; 斯文贾·威克曼
Original assignee: Goethe Universitaet Frankfurt am Main
Current assignee: Goethe Universitaet Frankfurt am Main
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-09-17
Also published as: AU2017385611A2; EP3562941B1; ES2940619T3; AU2017385611A1; JP2020503044A; JP7142637B2; EP3562941A1; WO2018122248A1; US20190330616A1; CA3048939A1; AU2017385611B2; DK3562941T3

Abstract

本发明涉及产生用于靶标基因敲除、敲低和基因组修饰方法的高度多样化的RNA表达载体和载体文库的新方法。本发明涉及用于产生这样的高阶文库而不需要经典克隆技术的方法。这对基于大型载体的文库特别有用，其中序列不能容易地用经典诱变方法进行突变。根据本发明的方法产生的载体和文库可特别用于RNA辅助的沉默技术如RNA干扰，以及用于使用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统或使用小向导RNA来将CRISPR复合体靶向特定基因组序列的类似的RNA/DNA编码的基因扰动系统的靶标基因组编辑。本发明还提供了试剂盒，其包含用于实施本发明的方法的材料。

Description

产生高阶基因组编辑文库的方法

发明领域

本发明涉及产生用于靶标基因敲除、敲低和基因组修饰方法的高度多样化的RNA表达载体和载体文库的新方法。本发明涉及用于产生这样的高阶文库而无需经典克隆技术的方法。这对于基于大型载体的文库特别有用，其中序列不能容易地用经典诱变方法进行突变。根据本发明的方法产生的载体和文库可特别用于RNA辅助的沉默技术如RNA干扰，以及用于使用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统或使用小向导RNA来将CRISPR复合体靶向特定基因组序列的类似的RNA/DNA编码的基因扰动系统的靶标基因组编辑。本发明还提供了试剂盒，其包含实施本发明的方法的材料。

发明概述

最初在细菌和古菌物种中发现了成簇的规律间隔的短回复重复序列(CRISPR)/Cas系统，其作为抵抗外来遗传物质(例如质粒和噬菌体)的防御机制。天然存在的CRISPR/Cas系统依赖于三个组分的表达：1)与靶标序列互补的向导RNA序列，2)有助于募集第三组分-核酸内切酶至该位点的支架RNA。尽管在许多细菌和古菌物种中，CRISPR/Cas系统用于降解外来遗传物质，但该系统已适用于各种原核和真核生物，并已被用于许多方法，包括基因敲除、诱变和表达激活或抑制(Hsu,et al.Cell(2014)157(6):1262-1278)。在遗传工程改造的CRISPR/Cas系统中，可以通过表达小向导RNA(sgRNA，或简称向导RNA-gRNA)来避免对三个独立组分的需求，所述小向导RNA包含用于结合靶标序列的CRISPR向导RNA序列和支架RNA，二者一起模拟由单独向导RNA序列和支架序列形成的结构，并且足以将核酸内切酶募集到适当的靶标位点(Jinek,et al.Science(2012)337(6096):816-821)。Cas-gRNA复合体成功DNA靶向的另外先决条件是在靶标DNA中存在前间区序列邻近基序(PAM)DNA序列，其准确序列取决于细菌Cas-酶(12-15)。对于最广泛使用的酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9(SpCas9)，该序列具有NGG的形式，其中N可以是任何核苷酸。最显著地，Cas酶可以在人细胞中表达，并且通过提供人DNA导向的gRNA诱导不能修复的高度特异性的DNA双链断裂，导致插入和缺失(InDel)突变(13,16)。InDel突变的表型范围从框内缺失到完全的基因敲除。最近，已经证明CRISPR/Cas系统通过使用源自患者的干细胞和祖细胞来有效地校正导致镰状细胞病的突变(17)。因此，CRISPR/Cas系统是一种具有巨大潜力的范围从标准细胞生物学到治疗应用的可编程的基因编辑工具(18)。

单一遗传变化可用于生成良好控制的模型系统，但这些不允许无偏差的筛选。为了进行遗传筛选，可以将大量gRNA序列组合以产生文库，靶向人和其他基因组中的特定区域(19-22)。这些遗传筛选的主要优点是其无偏差的应用和易用性。截至今天，只有几个全基因组CRISPR/Cas敲除筛选已经公布，但实施这些实验和报告相应结果的速度已经大大加快。除了敲除筛选外，少数实验室也已经证明了全基因组CRISPR/Cas转录激活和抑制筛选的益处(23-27)。这些筛选所涵盖的领域包括耐药性、细胞生长、隐性和必需基因、长链非编码RNA(lncRNA)以及NF-KB激活/抑制基因或转移诱导基因(28-30)。

目前可用的gRNA文库在其设计和程度上存在显着差异。第一个公布的文库基于来自Feng Zhang实验室(McGovern,Broad,MIT,Boston,USA)的lentiCRISPRv1和-v2质粒，并根据基因组存在PAM序列的原理设计(19)。最近的文库基于机器学习算法设计，其优化gRNA活性并使人类(Brunello-文库)和小鼠(Brie-文库)基因组中潜在的脱靶效应最小化，从而提供初步结果的更高置信度(31,32)。两个基本原则区分了这些全基因组文库：1)用于预测和选择功能性gRNA的算法，和2)文库的总体复杂度，所述总体复杂度主要由靶向单基因的gRNA的总数决定，范围分别为Brunello敲除的4至Toronto敲除的12(30,32)。生成这些文库的方法主要是基于常规的限制酶消化或Gibson Assembly定向的克隆。因此，这些文库对gRNA的子集具有高达数百倍的偏差，这直接阻碍了后续应用及结果的规模和质量(19,32)。因此，迫切需要新的方法来产生没有不希望的偏差的任何复杂度的RNA/DNA编码的基因扰动文库。

在一个方面，本发明的目标通过用于产生基于共价闭合环状(ccc)DNA的小RNA/DNA表达载体或载体文库的方法而得以解决，所述方法包括以下步骤：

(a)提供单链(ss)噬菌粒载体，其包括(i)至少一个小RNA/DNA表达盒，其包括RNA/DNA启动子和空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或小RNA/DNA编码序列和/或DNA/RNA核酸酶靶标序列或以上的部分序列，(ii)至少一个单链DNA复制原点(ORI)，如噬菌体ORI，且特别是f1原点，以及

(b)提供至少一种诱变RNA或DNA引物，其中所述诱变RNA或DNA引物在3’-5’方向具有以下结构：第一同源区、编码待表达的小RNA/DNA的靶标序列区和第二同源区，其中所述第一同源区在5’侧与所述空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或所述小RNA/DNA编码序列或其部分序列侧翼的ss-噬菌粒载体构建体的序列互补或能够与之退火，并且其中所述第二同源区在3’侧与所述空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或所述小RNA/DNA编码序列或其部分序列侧翼的ss-噬菌粒载体构建体的序列互补或能够与之退火，

(c)使至少一种诱变RNA或DNA引物与所述ss-噬菌粒载体构建体退火，并从其扩增共价闭合环状(ccc)异源双链dsDNA，

(d)去除残留的野生型噬菌粒载体DNA。

对于去除残留的野生型噬菌粒载体DNA，可以应用核酸内切酶消化。例如，单链(ss)噬菌粒载体构建体在其至少一个小RNA/DNA表达盒内提供了核酸内切酶靶标位点。优选地，核酸内切酶靶标位点位于与诱变的DNA引物的第一同源区互补的区域和与诱变引物的第二同源区互补的区域之间的单链(ss)噬菌粒载体构建体中。因此，核酸内切酶靶标位点位于在3Cs合成中未复制的位置处，因此其仅存在于野生型ss-噬菌粒载体构建体中。因此，所述方法在这里于步骤(d)中包括利用靶标位点特异性的核酸内切酶酶促消化3CsDNA。例如作为核酸内切酶，在一些实施方案中使用了限制酶及其靶标位点。示例性的限制酶及其靶标位点为I-PpoI、SmaI、HpaI、I-SceI或I-CeuI。可以使用不存在于模板ss DNA也不存在于引入的序列I诱变引物中的任何限制识别位点。除了使用限制核酸内切酶外，还可以使用以下酶中的任何一种来去除残留的野生型质粒：I-CeuI、I-PpoI、I-SceI，所有归位核酸内切酶是优选的，所有非归位核酸内切酶，使用针对例如TALEN、ZFN、CRISPR/Cas和类似的酶的基因扰动靶标序列，使用旨在阻抑这样的序列扩增的原核和/或真核毒性核苷酸序列，以及使用基于同源和/或重组的克隆序列。

去除野生型DNA载体的另一种可能是使用Kunkel方法。因此，通过本发明，通过用于产生小RNA/DNA表达(或编码)载体的方法，或使用Kunkel的诱变方法(Kunkel方法)将小RNA/DNA编码序列引入载体的方法，上述问题得以解决。因此，优选的方面涉及使用Kunkel方法或Kunkel诱变将小RNA/DNA序列引入载体中的方法。本发明背景下的Kunkel方法或Kunkel诱变指的是以下程序：将待突变的DNA片段插入噬菌粒(任何含f1ori的载体，如M13mp18/19)中，然后转化至两种酶-dUTP酶(dut)和尿嘧啶脱糖苷酶(ung)缺陷的大肠杆菌(E.coli)菌株中。两种酶都是DNA修复途径的一部分，所述DNA修复途径通过dCTP自发脱氨为dUTP而保护细菌染色体免于突变。dUTP酶缺乏可防止dUTP的分解，从而导致细胞中高水平的dUTP。尿嘧啶脱糖苷酶缺乏防止从新合成的DNA中除去尿嘧啶。由于双突变体大肠杆菌复制噬菌体DNA，因此其酶促机构可能会错误地掺入dUTP而不是dTTP，导致含有一些尿嘧啶的单链DNA(ssUDNA)。ssUDNA是从释放到培养基中的噬菌体中提取的，然后用作诱变的模板。含有核苷酸序列中所需突变或变化的寡核苷酸用于引物延伸。形成的异源双链DNA由一个含有dUTP的亲本非突变链和含有dTTP的突变链组成。然后将DNA转化到携带野生型dut和ung基因的大肠杆菌菌株中。这里，含有尿嘧啶的亲本DNA链被降解，使得几乎所有得到的DNA都由突变的链组成。本发明的方法特别适用于将向导RNA序列引入基因组编辑载体中以用于靶标基因组编辑。

本发明背景下的“Kunkel方法”是这样的方法，其包括利用突变引物，使用单链尿嘧啶化的DNA，优选环状单链尿嘧啶化的DNA作为模板进行扩增。“尿嘧啶化的”应指核苷酸中含一个或多个尿嘧啶碱基的任何DNA分子。

在本发明的优选实施方案中，上述方法为用于产生基于共价闭合环状(ccc)DNA的小RNA/DNA表达载体或载体文库的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供单链(ss)噬菌粒载体构建体，其包括至少一个尿嘧啶碱基和/或DNA/RNA核酸酶靶标位点；所述ss-噬菌粒载体构建体包括：(i)至少一个小RNA/DNA表达盒，其包括RNA/DNA启动子和空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或小RNA/DNA编码序列或其部分序列，(ii)至少一个单链DNA的复制原点(ORI)，如噬菌体ORI，且特别是f1原点，以及

(b)提供至少一种诱变DNA引物，其中所述诱变DNA引物在3’-5’方向具有以下结构：第一同源区、编码待表达的小RNA/DNA的靶标序列区和第二同源区，其中所述第一同源区在5’侧与所述空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或所述小RNA/DNA编码序列或其部分序列侧翼的ss-噬菌粒载体构建体的序列互补或能够与之退火，并且其中所述第二同源区在3’侧与所述空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或所述小RNA/DNA编码序列或其部分序列侧翼的ss-噬菌粒载体构建体的序列互补或能够与之退火，

(c)使至少一种诱变DNA引物与所述ss-噬菌粒载体构建体退火，并扩增共价闭合环状(ccc)异源双链dsDNA，

(d)用含无尿嘧啶的互补DNA链替换ccc-异源双链dsDNA中的含尿嘧啶的链，以获得基于cccDNA的小RNA/DNA表达载体或载体文库。

在本文中，术语“噬菌粒”是指已转化为质粒的噬菌体基因组。

在一个优选的实施方案中，单链(ss)噬菌粒载体构建体在其至少一个小RNA/DNA表达盒中另外包括限制酶识别位点(限制位点)。优选地，限制位点位于与诱变DNA引物的第一同源区互补的区域和与诱变引物的第二同源区互补的区域之间的单链(ss)噬菌粒载体构建体中。因此，限制位点位于3Cs合成中未复制的位置处，因此其仅存在于含尿嘧啶的ss-噬菌粒载体构建体中。实施方案允许另外消化残留的尿嘧啶化的野生型DNA。因此，在一个实施方案中，所述方法在步骤(c)和(d)之间还包括步骤(c`)，其包括利用能够在限制位点处选择性引入双链断裂的限制酶来酶促消化3Cs DNA。在该实施方案的背景下，使用具有在基因组中很少发现的识别位点的限制位点及其对应的酶。示例性的限制酶及其靶标位点为I-PpoI、SmaI、HpaI、I-SceI或I-CeuI。可以使用在模板尿嘧啶化的ss DNA中不存在的任何限制识别位点。除了使用限制核酸内切酶外，还可以使用以下酶中的任何一种来去除残留的野生型质粒：I-CeuI、I-PpoI、I-SceI，所有归位核酸内切酶是优选的，所有非归位核酸内切酶，使用针对例如TALEN、ZFN、CRISPR/Cas和类似的酶的基因扰动靶标序列，使用旨在阻抑这样的序列扩增的原核和/或真核毒性核苷酸序列，以及使用基于同源和/或重组的克隆序列。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了如上所述的单链(ss)噬菌粒载体构建体，其包括至少两个小RNA/DNA表达盒，更优选至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个和更多个如本文中之前所述的小RNA/DNA表达盒。在该实施方案中，称为“多重的”载体分子能够产生大量同时表达的小RNA/DNA。

在一个另外的实施方案中，至少一个小RNA/DNA表达盒为至少两个或更多个小RNA/DNA表达盒(多重表达gRNA或其他小RNA/DNA)。在其他优选的实施方案中，在两个或更多个小RNA/DNA表达盒中使用的限制位点是相同的、类似的或不同的。

如本文所用，术语“共价闭合环状DNA”或“cccDNA”是指假定具有与包括切口或包括游离3’或5’端的线性DNA分子如真核生物染色体DNA或细菌染色体DNA形成对比的环状形式的DNA分子。而且，上述DNA分子的环状结构是共价闭合的。cccDNA是本领域熟知的，并且进一步描述在例如KG.Hardy(ed)“Plasmids,a practical approach”,IRL Press OxfordU.K.,Washington D.C.,U.S.A.,1987中。

如本文所用，术语“载体文库”是指多个载体(或质粒)，其包括插入RNA/DNA表达盒中的待表达的多种独特的小RNA/DNA序列(例如，siRNA、shRNA、gRNA或类似的序列)。在优选的实施方案中，载体文库包括至少10¹或10²种，更优选地至少10³种，甚至更优选地至少10⁴种，且进一步更优选地至少10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种或10⁹种独特的载体序列(意指每个载体或质粒中包含的RNA/DNA序列)。

在本发明的背景下，小RNA应理解为包括siRNA、shRNA、抗miR、向导RNA(gRNA)或向导DNA(gDNA)。最优选的是小RNA为gRNA，并且其中ss-噬菌粒载体构建体还包括但不限于存在基因组编辑核酸酶表达序列，其任选地与启动子可操作地连接。

在一些优选的实施方案中，本发明寻求提供用于产生小RNA/DNA表达载体的高阶文库的新方法。在本发明的背景下，术语“高阶”应意指文库包括多种载体，其不同于通过/经由载体表达的小RNA/DNA的序列。本方法使用诱变DNA引物来将这样的序列引入选择的载体中。因此，在一些实施方案中，至少一种诱变DNA引物为至少两种诱变DNA引物，优选至少3种，更优选至少4种、5种、6种、10种、50种、100种、1000种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种或10¹²种诱变DNA引物，并且其中每种cccDNA在选择的小RNA/DNA编码序列中具有不同的序列。

在本发明的一些实施方案中，通过将至少一个或多个IUPAC编码的碱基(例如简并碱基)引入选择的小RNA/DNA编码序列(如本发明的诱变DNA引物中所含有的)中来提供大量诱变DNA引物序列种类。“简并碱基”或“简并位置”在序列命名中称为“n”。在本发明的背景下，简并碱基不是一种核苷酸碱基，而是表示这样的可能性：在制备具有基本相同的序列的核酸时，所述序列中的位置“n”允许在这个位置有多种碱基的可能性。因此，具有含有至少一个“n”位置的序列的核酸的制备物表示在位置n处具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶(具有等概率)的核酸的混合物。例如，如果合成寡核苷酸，则可以使用等量的含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧和胞嘧啶的核苷酸作为供体核苷酸来进行一个或多个位置处的反应。在这样的反应中，这些核苷酸中的每一种都有相同的机会加入到生长的寡核苷酸链中，因此允许在位置“n”处产生具有不同碱基的分子的混合物。如果在一个位置处仅打算引入两种或三种不同的碱，则可以使用相同的原理。在本公开中，使用以下命名法：R＝G，A(嘌呤)，Y＝T，C(嘧啶)，K＝G，T(酮)，M＝A，C(氨基)，B＝G，T，C(除A外的所有碱基)，D＝G，A，T(除C外的所有碱基)，H＝A，C，T(除G外的所有碱基)，V＝G，C，A(除T外的所有碱基)，并且N＝A，G，C，T(任意碱基)。

在本发明的其他实施方案中，小RNA/DNA编码序列的长度为至少10个核苷酸至200个核苷酸，更优选10-100个，更优选10-50个，更优选10-30个，更优选15-30个，更优选15-25个，最优选17-23个，最优选约20个。技术人员可以根据待表达的小RNA/DNA的类型来调整序列长度。向导RNA和shRNA或siRNA优选的长度是不同的，但为技术人员所熟知。

本发明的诱变DNA引物包括侧翼同源区，其用于使引物与本发明的反应中使用的ss环状尿嘧啶化的载体分子退火。因此，侧翼区优选为允许在适合引物延伸的条件下使诱变DNA引物与模板退火的长度。3’或5’同源区的长度可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，每个同源区的长度为至少5个核苷酸，优选至少10个核苷酸，更优选5-40个核苷酸，最优选10-30个，或10-20个，最优选13-18个，且甚至更优选约15个核苷酸。最优选为5-40个核苷酸。在本发明的一些其他的实施方案中，诱变DNA引物具有SEQ ID NO:2-12中任一个所示的序列。

在本发明方法的一些实施方案中，通过以下另外的方法步骤来提供单链(ss)噬菌粒载体构建体：

(aa)在dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶和/或其同源物、旁系同源物或直系同源物缺陷的细菌菌株中，优选在CJ236菌株中扩增相同序列的dsDNA噬菌粒载体，以获得含尿嘧啶的异源双链dsDNA噬菌粒载体，以及

(bb)产生包括含尿嘧啶的ssDNA的噬菌体颗粒，以及

(cc)从所述噬菌体颗粒纯化所述含尿嘧啶的ssDNA，以获得包括至少一个尿嘧啶碱基的ss-噬菌粒载体构建体。

在根据本发明优选的另一个实施方案中，dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶和/或其同源物、旁系同源物或直系同源物缺陷的细菌菌株，优选CJ236菌株，包括辅助噬菌粒，或者其中在步骤(bb)中，所述dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶和/或其同源物、旁系同源物或直系同源物缺陷的细菌菌株，优选在CJ236菌株中感染了辅助噬菌体，其中所述辅助噬菌粒或辅助噬菌体优选为M13K07。

在一些实施方案中，优选通过在具有功能性dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶活性的细菌如XL1或SS320中转化且扩增所述ccc-异源双链dsDNA来进行本发明方法的步骤(d)，以获得所述cccDNA。

在一些实施方案中，本发明的方法用于产生适合基因组编辑的载体。这样的基因组编辑载体的特征通常在于存在向导RNA表达盒，其包括用于引入选择的gRNA序列的位点，其将基因组编辑复合体引导至基因组中的靶标位点。因此，gRNA表达盒包括用于靶向的gRNA部分和用于结合基因组编辑核酸酶(Cas)的gRNA区段。gRNA表达盒通常与RNA启动子如人或小鼠U6启动子或人7SK启动子或小鼠H1启动子可操作地连接(转录控制)。然而，其他RNA启动子为技术人员已知。基因组编辑载体通常还包含可表达的基因组编辑核酸酶如Cas9。

如本文所用，术语“向导RNA”通常是指RNA序列或分子(或统称为一组RNA分子)，其能够结合Cas蛋白并帮助Cas蛋白靶向靶标多核苷酸(例如，DNA或RNA)中的特定位置。向导RNA可包括crRNA区段和tracrRNA区段。如本文所用，术语“crRNA”或“crRNA区段”是指这样的RNA分子或其部分，其包括靶向多核苷酸的向导序列、茎序列和任选地5’突出序列。如本文所用，术语“tracrRNA”或“tracrRNA区段”是指包含蛋白质结合区段(例如，能够与CRISPR相关蛋白质相互作用的蛋白质结合区段，如Cas9)的RNA分子或其部分。术语“向导RNA”包括单一向导RNA(sgRNA)，其中crRNA区段和tracrRNA区段位于相同的RNA分子中。术语“向导RNA”还共同地包括两个或更多个RNA分子的组，其中crRNA区段和tracrRNA区段位于不同的RNA分子中。

术语“支架”是指包括基本相同的或在天然生物物种中高度保守的序列的向导RNA分子的部分。支架包括tracrRNA区段和crRNA区段的除位于crRNA区段的5’端处或附近的靶向多核苷酸的导向序列之外的部分，其将包括在天然crRNA和tracrRNA中不保守的序列的任何非天然的部分排除在外。

本发明的基因组编辑载体可以编码f1噬菌体复制原点、RNA聚合酶启动子、用于CRISPR/Cas系统的向导RNA支架、RNA引导的核酸酶或以上的任何其他合适的替代物。优选的构建体是基于慢病毒的构建体。可以在本发明的背景下使用或者可以用作开发其他基因组编辑载体的蓝图的本领域已知的标准CRISPR/Cas载体，是称为pLentiCRISPR、pLentiCRISPRv2或pLentiGuide的载体。

在本发明的一些实施方案中，通过使用具有DNA聚合酶活性的酶如T7DNA聚合酶，任选地连同DNA连接酶如T4DNA连接酶或其替代物(其为技术人员已知的)一起，来进行步骤(c)中共价闭合环状(ccc)异源双链dsDNA的扩增。

在另一个方面，本发明的目标通过提供根据如本文公开的本发明的方法产生的载体或载体文库而得以解决。根据本发明产生的载体文库的特征优选在于包括至少10⁶种，更优选10⁷、10⁸种，且最优选10⁹种不同种类的如本文所述的载体序列。

此外，提供了全基因组筛选细胞表型的方法，所述方法包括使用根据本发明的方法产生的载体文库。

本发明的筛选方法可以包括以下步骤：将本发明的载体文库-特别是全基因组文库引入靶标细胞群，以及使用任何目标测定对转导的细胞进行表型分型。可以在下一步骤中分析具有目标表型的任何细胞中转导的gRNA或RNAi的身份，从而确定表型产生中涉及的基因或基因组区域。例如，可以使细胞与细胞死亡诱导剂接触，并分析存活细胞的转导的3Cs载体，以确定导致对细胞死亡诱导剂具有抗性的遗传扰动。

在本发明的另一个方面，提供了用于实施如上文所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)噬菌粒载体构建体，其包括：

(i)至少一个向导RNA(gRNA)/向导DNA(gDNA)表达盒，其包括gRNA/gDNA启动子、空的gRNA/gDNA靶标序列引入位点或gRNA/gDNA靶标序列，

(ii)至少一个噬菌体复制原点，和

(iii)至少一个表达盒，其包括在启动子序列控制下的编码基因组编辑核酸酶的序列；

(b)DNA聚合酶，任选地DNA连接酶；

(c)具有功能性dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶活性的细菌细胞的制备物，

(d)以及任选地，本发明的试剂盒的使用说明书。

在一些实施方案中，试剂盒还包含至少一种或多种如上文所述和定义的诱变DNA引物。

在一些实施方案中，DNA聚合酶为T7DNA聚合酶，并且/或者DNA连接酶为T4DNA连接酶或任何通常已知的其替代物。

在本发明的其他实施方案中，本发明的噬菌粒载体构建体为包括至少一个尿嘧啶碱基的单链(ss)噬菌粒载体构建体。

在其他实施方案中，噬菌粒载体为dsDNA载体。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以包含dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶和/或其同源物、旁系同源物或直系同源物缺陷的细菌细胞(优选CJ236菌株)的制备物、样品或培养物。这样的菌株在相关领域中通常为已知的。

在涉及本发明的试剂盒的其他实施方案中，细菌细胞还包括/包含辅助噬菌粒，优选M13K07。

在本发明的其他实施方案中，根据本发明的试剂盒还包含辅助噬菌粒或辅助噬菌体的制备物，其中所述辅助噬菌粒或辅助噬菌体优选为M13K07颗粒。

本发明的又一个方面涉及用本文所述的方法制备的载体文库。本发明的另一个可选或另外的方面为载体文库，其包括至少10¹、10²种，更优选至少10³种，甚至更优选至少10⁴种，且进一步更优选至少10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种或10⁹种独特的载体序列(意指每个载体或质粒中含有的RNA/DNA序列)。因此，本发明的优选实施方案涉及包括多种独特的载体序列的载体文库，其中文库中的每种载体的载体骨架为CRISPR/Cas9载体，或其功能性替代物，并且文库中的每种独特的载体序列包括独特的gRNA表达序列。这样的文库中的独特gRNA序列的数量优选为至少10¹或10²种，更优选至少10³种，甚至更优选至少10⁴种，且进一步更优选至少10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种或10⁹种。更优选地，载体文库在文库中具有差异性的独特的gRNA序列使得可以利用基因组编辑靶向给定基因组中的每个序列，因此为真正的全基因组gRNA表达文库。可选的实施方案涉及本发明的基于siRNA(或通常为RNAi)表达载体骨架的载体文库。

此外，发明涉及以下优选项：

项1：产生基于共价闭合环状(ccc)DNA的小RNA/DNA表达载体或载体文库的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包括至少一个尿嘧啶碱基的单链(ss)噬菌粒载体构建体；所述ss-噬菌粒载体构建体包括：(i)至少一个小RNA/DNA表达盒，其包括RNA/DNA启动子和空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或小RNA/DNA编码序列和/或DNA/RNA核酸酶靶标序列或以上的部分序列，(ii)至少一个单链DNA的复制原点(ORI)，如噬菌体ORI，且特别是f1原点，以及(b)提供至少一种诱变DNA引物，其中所述诱变DNA引物在3’-5’方向具有以下结构：第一同源区、编码待表达的小RNA/DNA的靶标序列区和第二同源区，其中所述第一同源区在5’侧与所述空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或所述小RNA/DNA编码序列或其部分序列侧翼的所述ss-噬菌粒载体构建体的序列互补或能够与之退火，并且其中所述第二同源区在3’侧与所述空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或所述小RNA/DNA编码序列或其部分序列侧翼的所述ss-噬菌粒载体构建体的序列互补或能够与之退火，

(c)使至少一种诱变DNA引物与所述ss-噬菌粒载体构建体退火，并从其扩增共价闭合环状(ccc)异源双链dsDNA，

(d)用含无尿嘧啶的互补DNA链替换ccc-异源双链dsDNA中含尿嘧啶的链，以获得基于cccDNA的小RNA/DNA表达载体或载体文库。

项2.如项1所述的方法，其中所述小RNA为siRNA、shRNA、抗miR、向导RNA(gRNA)或向导DNA(gDNA)或任何其他RNA/DNA编码的基因扰动序列。

项3.如项2所述的方法，其中所述小RNA为gRNA，并且其中所述ss-噬菌粒载体构建体还包括基因组编辑核酸酶表达序列，其任选地与启动子(稳定的或可诱导的)可操作地连接。

项4.如项1-3中任一项所述的方法，其中所述至少一种诱变DNA引物为至少两种诱变DNA引物，优选为至少3种，更优选至少4种、5种、6种、10种、50种、100种、1000种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种或10¹²种诱变DNA引物，并且其中每种cccDNA在选择的小RNA编码序列中具有不同的序列。

项5.如项1-4中任一项所述的方法，其中通过向选择的小RNA编码序列中引入至少一个或多个简并碱基(N)来提供大量的诱变DNA引物种类。

项6.如项1-5中任一项所述的方法，其中小RNA编码序列的长度为至少10个核苷酸至100个核苷酸，更优选10-50个，更优选10-30个，更优选15-30个，更优选15-25个，最优选17-23个，最优选约20个。

项7.如项1-6中任一项所述的方法，其中所述同源区中的每一个的长度为至少5个核苷酸，优选至少10个核苷酸，更优选5-40个核苷酸，最优选10-30个核苷酸，或10-20个核苷酸，最优选13-18个核苷酸，甚至更优选约15个核苷酸。

项8.如前述项中任一项所述的方法，其中所述诱变DNA引物具有SEQ ID NO:1-12中任一个的序列。

项9.如前述项中任一项所述的方法，其中所述单链(ss)噬菌粒载体构建体通过以下提供：

(aa)在dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶和/或其同源物、旁系同源物或直系同源物缺陷的细菌菌株，优选在CJ236菌株中扩增相同序列的dsDNA噬菌粒载体，以获得含尿嘧啶的异源双链dsDNA噬菌粒载体，以及

(bb)产生包括含尿嘧啶的ssDNA的噬菌体颗粒，以及

项10.如项7所述的方法，其中所述dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶和/或其同源物、旁系同源物或直系同源物缺陷的细菌菌株，优选CJ236菌株，包括辅助噬菌粒，或其中在步骤(bb)中，所述dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶和/或其同源物、旁系同源物或直系同源物缺陷的细菌菌株，优选CJ236菌株，感染了辅助噬菌体，其中所述辅助噬菌粒或辅助噬菌体优选为M1307。

项11.如前述项中任一项所述的方法，其中通过在具有功能性dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶活性的细菌如XL1或SS320中转化且扩增所述ccc-异源双链dsDNA来进行步骤(d)，以获得所述cccDNA。

项12.如前述项中任一项所述的方法，其中通过使用具有DNA聚合酶活性的酶例如T7DNA聚合酶，任选地连同DNA连接酶如T4DNA连接酶一起，来进行步骤(c)中共价闭合环状(ccc)异源双链dsDNA的扩增。

项13.用于实施前述项中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)噬菌粒载体构建体，其包括：

(ii)至少一个噬菌体复制原点，和

(b)DNA聚合酶，任选地DNA连接酶；

(d)以及使用说明书。

项14.载体文库，其通过项1-12中任一项所述的方法获得。

项15.载体文库，其包括至少10⁷种，优选至少10⁹种独特载体序列，其中所述文库中的每种独特载体序列的载体骨架为基因组编辑载体，如包括可表达的CRISPR/Cas9酶和gRNA表达盒的载体。

现在将参考附图和序列在以下实施例中进一步描述本发明，但本发明不限于此。出于本发明的目的，本文引用的所有参考文献都通过引用整体并入本文中。在图中：

图1：共价闭合环状合成(3Cs)dU-dsDNA产生的基本原理。A)示出3Cs-gRNA合成的基本步骤的图示。B)可以将常规的CRISPR/Cas质粒转化为dU-ssDNA，通过凝胶电泳解析；C)eGFP靶向性3Cs-gRNA文库的下一代测序(NGS)揭示了与3Cs反应/试剂无序列偏差。D)NGS(eGFP靶向性3Cs-gRNA文库)数据的统计分析确定变异系数为33.18％，证实了无序列偏差。

图2：eGFP靶向性3Cs-gRNA的产生。A)确定最佳的3Cs引物同源性以产生dU-3Cs-dsDNA。B)6种eGFP靶向性gRNA序列的3Cs反应。C)扩增和克隆测序后突变序列与野生型序列的比例。D)突变的gRNA的序列标志和gRNA分布。E)当在CJ236培养基中含有或不含另外的尿苷的情况下分析时突变序列与野生型序列的比例。

图3：3Cs-gRNA在细胞中具有功能。A)在用eGFP靶向性3Cs-gRNA进行细胞转导后绿色荧光信号的慢病毒剂量依赖性减少。B)T7核酸内切酶I Surveyor测定证明了稳定的eGFP基因座(wt：野生型eGFP基因座，*：非特异性PCR产物)的基因组DNA编辑。

图4：人SpCas9靶标位点的分布。A-B)每条人染色体中SpCas9gRNA序列的总数量和独特数量。C)以核苷酸(nt)计的平均染色体SpCas9PAM序列距离。D)作为所有人gRNA的百分比的分配的(Binned)gRNA出现。E)gRNA出现的帕累托分布和人基因组中的gRNA出现x次。

图5：优化的SpCas9gRNA的真正的全基因组3Cs-gRNA文库。A)示出优化的、具有高活性的gRNA的变性3Cs-gRNA引物设计的方案。B)通过凝胶电泳解析的利用优化的变性3Cs引物的3Cs反应。C)扩增和克隆测序后突变序列与野生型序列的比例。D)3Cs-gRNA文库测序，结果以热图形式示出。单独核苷酸/gRNA位置的百分比为彩色编码的。

图6：利用优化的3Cs-gRNA文库鉴定阿霉素抗性。A)示出使用hTERT-RPE1细胞的实验方案，所述细胞用慢病毒颗粒转导(MOI＝1)并用1μM阿霉素选择3周。B)阿霉素抗性诱导的gRNA及其在注释的人基因组DNA中的位置的基于NGS和生物信息学的鉴定。C)CYSLTR2基因是一种可重复的蛋白质编码命中(hit)，针对其的两种化学抑制剂可商购获得。针对增加浓度的阿霉素滴定两种抑制剂，并诱导对阿霉素的抗性。

图7：产生多重含gRNA的共价闭合环状合成(3Cs)dU-dsDNA试剂的一般原理。A)示出产生多重3Cs-gRNA试剂的基本步骤的图示。B)用于产生多重3Cs-gRNA试剂的eGFP和mCherry基因靶向性gRNA的位置、质量和数量。C)通过凝胶电泳解析的成功的3Cs反应的典型的3条带模式(eGFP、mCherry和eGFP+mCherry靶向性3Cs-gRNA文库的产生)。D)3Cs合成产物电穿孔后的第一次DNA纯化的质量控制。利用I-CeuI、I-SceI或二者的组合酶促消化纯化的DNA以确定野生型(无内部gRNA、内部酶切割位点)质粒的提示(reminiscent)。然后将酶促消化的DNA电穿孔以去除野生型提示。E)第二次DNA扩增的质量控制揭示了不存在野生型提示。F)多重3Cs-gRNA文库的SANGER测序确定了在3Cs反应过程中依赖于提供的5’和3’同源性的gRNA序列的选择性整合。G)多重3Cs-gRNA试剂在人细胞中是完全有功能的，如通过慢病毒3Cs-gRNA文库转导至GFP/mCherry阳性细胞中所依赖的GFP和/或mCherry的消耗所证明的。

图8：3Cs是高度通用的，且使得能够产生shRNA编码的试剂。A)常规的慢病毒shRNA编码质粒(pLKO.1)可被有效地转化成单链质粒DNA(如图1和4中所示)，如通过凝胶电泳所解析的。B)显示了3Cs-shRNA引物设计原理。C)成功的3Cs反应的典型的3条带模式，如通过凝胶电泳所解析的(eGFP靶向性3Cs-shRNA的产生)。D)来源于3Cs-shRNA产生质粒的细菌集落的SANGER测序证实了eGFP靶向性shRNA序列的成功整合(用红色突出显示)。

实施例

实施例1：共价闭合环状合成突变CRISPR/Cas9质粒

虽然常规的定点诱变对含有大型逆转录病毒元件的质粒不起作用，但可以预见，基于ssDNA的T7DNA聚合酶和T4DNA连接酶介导的5’寡核苷酸延伸将是生成高质量和无偏差的gRNA文库的一种有效的方法(图1A)。为此，用最广泛使用的含有f1原点(f1-ori)的CRISPR/Cas质粒pLentiGuide和pLentiCRISPRv2转化含有dut-/ung-、F因子的K12大肠杆菌CJ236细菌。与常规K12大肠杆菌菌株相比，由于缺乏dUTP酶(dut-)和尿嘧啶糖基化酶(ung-)，CJ236细菌耐受在基因组和质粒DNA中存在脱氧尿苷。随后用M13K07噬菌体对转化的CJ236的超级感染允许产生噬菌体颗粒，其包装pLentiGuide和pLentiCRISPRv2的含有脱氧尿苷的ssDNA(dU-ssDNA)模板。在下一步骤中，从沉淀的噬菌体颗粒中纯化dU-ssDNA(图1B)。通常，这种方法可以应用于编码f1-ori的任何质粒。

为了从dU-ssDNA模板成功地生成异源双链的共价闭合环状合成dsDNA(3Cs-dsDNA)，测试了通过在2h的体外3Cs反应中比较5’和3’同源性的10、13、15和18个核苷酸(nt)的最佳引物/同源性长度(图2A)。通过凝胶电泳解析dU-CCC-dsDNA反应产物，并鉴定了异源双链dsDNA反应的典型三条带模式(33,34)。利用15个nt的引物同源性实现了正确延伸的、有切口的和链取代的3Cs产物之间的最佳比例(图2A)，因此，发明人将该长度用于所有后续反应。

接下来，发明人针对靶向增强的绿色荧光蛋白(eGFP)基因的细胞内活性gRNA的产生对该方案进行了测试。使用规则集2(RS2)算法设计了6种gRNA序列，并使用3Cs反应将其克隆到pLentiGuide和pLentiCRISPRv2中，其含有在U6启动子的控制下的非人靶向(NHT)控制序列，随后为负责结合SpCas9的gRNA支架DNA序列(图2B)(32)。所得异源双链dU-CCC-dsDNA被用于转化XL1细菌，以确定正确突变为含野生型(NHT)的序列的比例。发明人对20个克隆进行了单独测序，并确定81％的pLentiGuide和82％的plentiCRISPRv2被eGFP靶向性gRNA修饰(图2C，2D)。向M13K07培养基中添加尿苷将野生型比例显著降低至约12％，表明未修饰的质粒的存在很可能是由于dU不充分掺入dU-ssDNA模板(图2E)。重要的是，尽管发明人仅对20个单独的克隆进行了测序，但发明人能够鉴别所有6种eGFP靶向性gRNA序列的几个拷贝(图2D)，表明我们的高效方案适合于文库构建。

为了测试我们的eGFP靶向性gRNA构建体的细胞功能，产生了感染性慢病毒颗粒，并将其用于转导eGFP阳性人端粒酶永生化的视网膜色素上皮(RPE1)细胞。在没有任何选择压力的7天后，通过流式细胞术分析eGFP阳性和阴性细胞的存在。使用慢病毒3Cs-gRNA构建体减少绿色荧光是非常有效的，而对照质粒对eGFP荧光没有影响(图3A)。有趣的是，发明人观察到剂量依赖性荧光减少，表明RPE1细胞的慢病毒转导与常规产生的慢病毒CRISPR/Cas颗粒同样有效(图3A)。绿色荧光的剂量依赖性减少是通过3Cs-gRNA构建体的基因组DNA编辑的直接结果，如通过T7Surveyor测定所证明的(图3B)。因此，使用我们新建立的3C方法可以快速生成共价闭合环状合成CRISPR/Cas gRNA，且其在细胞中具有完全的功能。

为了进一步减少残留的尿嘧啶化的野生型质粒，发明人通过在gRNA盒中插入I-SceI的归位酶限制位点来修饰pLentiGuide和plentiCRISPRv2，并用eGFP靶向性寡核苷酸重复3Cs-合成。I-SceI切割位点的存在促进了3Cs反应后未修饰的野生型质粒的消化和去除，并将野生型质粒的存在降低至低于我们的SANGER测序检测限。eGFP 3Cs-gRNA文库(pLentiCRISPRv2骨架)的下一代测序(NGS)揭示野生型比例低于1％，并且所有6种gRNA均等存在，没有明显的序列偏差(变异系数(CV)为33.18％)。(图1c和1d)。

实施例2：产生高度复杂的3Cs-gRNA文库

大多数人全基因组SpCas9gRNA文库靶向编码基因组，其仅占人全基因组序列的约1.5％。因此，假定本发明的方法可用于生成任意复杂度的gRNA文库，也可用于生成siRNA或其他小核酸文库，包括不限于编码区的真正全基因组规模。为此，发明人在第一步中确定了所有推定的人SpCas9靶标位点，并分析了它们在各个染色体上的分布。该分析证明染色体大小和PAM存在强烈相关，表明SpCas9靶标位点的随机分布(图4A，4B)，其具有9个核苷酸的表观中值距离(图4C)。该结果与随机核苷酸序列中的平均PAM距离为约8个核苷酸的观察结果一致。发明人鉴定了总共248.985.973(2.5x10⁸)条独立的gRNA序列，其中98％在人基因组中是独特的(图4D)。在人基因组中出现n次的gRNA的出现数量和数量遵循直接的帕累托分布或幂次定律(图4E)，证明绝大多数的所有人SpCas9靶标位点确实是独特的，并且可以通过已建立的CRISPR/Cas技术以高的中靶活性靶向。

先前已经绘制了SpCas9靶标位点偏好，显示出对3’嘌呤碱基的明显偏好，而胸苷核苷酸是不受欢迎的(31,32)。发明人将SpCas9核苷酸偏好转换成优化的20nt长的寡核苷酸序列，其通过遵循IUPAC命名标准的单个寡核苷酸合成而产生(图5A)。从理论上讲，该单个gRNA序列可以产生靶向人基因组中所有可能的编码和非编码区的高度功能化的SpCas9gRNA文库。使用我们针对靶向eGFP的gRNA建立的设计原理，发明人进行了这种真正的全基因组gRNA文库的体外合成(图5B，2B)。用体外合成产物电穿孔SS320细菌，并基于转化细菌的总数确定文库多样性。在两个独立的反应中，实现了1.92x10⁹的平均文库多样性，产生了3.8x10⁹个独特gRNA的组合文库。因此，新构建的gRNA文库比所有目前可获得的文库大4个数量级。对200个单独克隆进行的测序证实了突变分布对应于在简并寡核苷酸合成期间引入的核苷酸偏差(图5C，5D)。因此，本发明产生了第一个真正的全基因组CRISPR/CasgRNA文库，其具有38亿条独特gRNA序列的多样性，超过了目前使用的所有目前文库设计。因此，该真正的全基因组文库可以用于筛选方法来剖析人基因组的编码区以及非编码区的功能。

本发明提出了有效生成基因扰动文库的新方法，其可用于创建任何规模和多样性的文库。当今的全基因组文库在其个体复杂度方面存在差异，但跨越的范围分别从Brunello的7.6x10⁴至活性优化的CRISPR敲除文库的1.8x10⁵(29,32)。然而，即使这些文库具有高质量，它们对于所选择的gRNA还包含几十到几百倍的偏差，这主要由合成的gRNA序列的常规gRNA克隆和PCR扩增引起。本发明的创新方法使用T7DNA聚合酶连同T4DNA连接酶一起来介导在常规CRISPR/Cas质粒的ssDNA模板上退火的寡核苷酸的5’延伸，其仅受3Cs反应中使用的不同寡核苷酸的总数的限制。因此，避免了常规克隆策略的缺点。

本发明的方法可以完成从几条序列到高度多样化的序列集的合成规模。因此，本发明建立了一种适用于不同实验环境，例如，单KO细胞系、中等大小的文库和无偏差的全基因组文库的产生的方法。另外，对于高达数百条序列的多样性，本发明的方法同时生成排列和合并的格式；将实验设计扩展到均匀排列的基于图像的屏幕。最重要的是，本发明的方法产生无序列偏差的基因扰动文库。因此，显著降低了整体实验规模和成本。

实施例4：使用3Cs文库筛选阿霉素相关的基因

为了证明细胞功能，发明人用真正的全基因组(TGW)文库转导RPE1细胞，以确定对最优先(first-in-line)化疗剂阿霉素的编码和非编码抗性机制。在无扰动的条件下，阿霉素在4天内诱导RPE1细胞活力的稳健和剂量依赖性降低。为了避免药物逃逸细胞并提高真阳性发现的比例，选择1μM的阿霉素作为筛选浓度。在总共三个生物学重复中，发明人产生了平均滴度为每毫升10⁷个感染性颗粒的慢病毒上清液，并筛选约6亿个RPE1细胞，以MOI为1进行转导。在选择慢病毒转导的最初7天后，将细胞暴露于1μM阿霉素并再培养21天，然后收集剩余的细胞，提取它们的基因组DNA，并处理以用于NGS介导的gRNA的鉴定(图6a)。有趣的是，在所有生物学重复中，鉴定出显著的gRNA和靶标重叠。这表明没有必要通过实验研究每个含gRNA的TGW文库以鉴定大多数生物学相关命中。

从在阿霉素选择中存活的细胞中，发明人鉴定了在生物学重复中显示出高再现性的TGW3Cs-gRNA。有趣的是，虽然TGW文库对于靶向非编码基因组具有强烈的偏差，但在阿霉素选择后富集的gRNA显示出对蛋白质编码基因组几乎倒转的偏差。在所有剩余的gRNA中，45.6％位于编码区，22.2％位于内含子中，10.5％位于非编码(RNA编码)区(图6b)。然而，21.7％的gRNA位于没有生物型可以分配的基因组区域，这表明对那些区域的了解还是空白(图6b)。为了以CRISPR/Cas独立方式验证一些发现，选择了蛋白质编码命中基因CYSLTR2，针对其的两种化学拮抗剂可商购获得。发明人针对增加浓度的两种化合物(BayCysLTR2和Bay u9773)滴定了增加浓度的阿霉素，并将药物暴露的RPE1细胞孵育4天，之后将它们进行细胞活力测定AlamarBlue。有趣的是，两种化合物都能够以剂量依赖性的方式恢复阿霉素的细胞毒性作用，但是Bay u9773显示出可重复的更强效果(图6c)。这证实了本发明的真正的全基因组CRISPR/Cas 3Cs-gRNA文库在鉴定与阿霉素抗性相关的基因组区域中是有功能的，并且表明它也可以应用于其他生物学问题。

实施例5：多重3Cs文库

已经建立了生成单一3Cs-gRNA试剂的方案，有理由认为只要单个引物结合位点(盒)之间能够产生足够的独特同源性，则可以在编码两种或更多种gRNA的质粒上有效地实施本发明的3Cs方法(图7a)。为此，发明人在生物信息学上鉴定并计算了eGFP和mCherry基因中所有可能的SpCas9靶标位点的RS2得分(图7b)。总共鉴定了119种eGFP靶向性gRNA，并且发明人分别向人S7K启动子和第二代SpCas9gRNA支架添加5’和3’同源性。编码靶向mCherry基因的140种gRNA的寡核苷酸分别补充了与人U6启动子和原始的SpCas9gRNA支架的5’和3’同源性。在基于慢病毒SpCas9gRNA多重质粒(pLenti-Multiplex)的3个单独的3Cs反应中，发明人产生了三个靶向GFP、mCherry或GFP和mCherry的组合(16.600个gRNA组合)的文库(图7c)。所有独立的3Cs反应的平均电穿孔效率均高于1.7*10⁹，确保单一和多重文库的完全扩增。与单一3CsgRNA试剂的I-SceI清除步骤类似，发明人进行了I-CeuI(GFP盒)、I-SceI(mCherry盒)或组合的I-CeuI/I-SceI清除，以从最终的文库中去除模板提示(图7d，7e)。发明人对来自每种实验条件的10个细菌质粒集落进行了SANGER测序，并确定各自的gRNA区域是高度突变的，而5’和3’临近位置的核苷酸没有突变负荷(图7f)。为了功能性验证GFP/mCherry多重3Cs-gRNA试剂，诱导了感染性慢病毒颗粒，并将它们用于转导GFP/mCherry阳性RPE1报告细胞系。当通过FACS分析进行分析时，基因组DNA编辑转化为对GFP和mCherry的蛋白质水平的强烈负面影响(图7g)。因此，提出了产生多重SpCas9 3Cs-gRNA文库的第一步的方案，其中文库不含克隆人工制品，并且可能仅受到不同gRNA编码引物序列的数量的限制。此外，本发明的方案可以潜在地与任何Cas/gRNA系统组合用于gRNA多重目的，其将多重试剂扩展到不同Cas酶的组合。

实施例6：3Cs shRNA文库的产生

已经证明，本发明的3Cs技术非常适合于产生高质量的单一和多重CRISPR/Cas基因扰动试剂。因此，相对于经典的RNA干扰(RNAi)试剂，进一步测试了3Cs技术的通用性。为了测试这一点，发明人使用大多数慢病毒CRISPR/Cas质粒所来源的最常见的慢病毒shRNA递送质粒pLKO.1，产生了两种细菌CJ236克隆的ssDNA，并用M13K07噬菌体进行超感染，然后进行噬菌体沉淀和ssDNA纯化，并通过凝胶电泳解析ssDNA(图8a，泳道2和3)。然后，发明人设计了3Cs-shRNA引物，其含有与U6RNA启动子具有5’3Cs同源性的15个核苷酸，然后是编码eGFP靶向性有义shRNA的21个核苷酸，然后是6个核苷酸的shRNA发夹序列，然后是21个与有义shRNA反向互补的核苷酸，以及15个核苷酸(3’3Cs-同源性)(图8b)。发明人将3Cs-shRNA引物应用于两个3Cs反应规模(60和120ng的ssDNA)，通过凝胶电泳分离3Cs产物，并观察到典型的三条带模式，在120ng ssDNA反应中最明显(图8c)。细菌转化、质粒DNA纯化与120ng3Cs产物的SANGER测序相结合，揭示了eGFP靶向性shRNA序列整合至pKLO.1质粒中(图8d)。这证明了我们的3Cs技术不限于产生CRISPR/Cas gRNA试剂，而是非常通用的，并且还可以用于产生用于RNAi目的的3Cs-shRNA试剂。

材料和方法

CJ236细胞中的dU-ssDNA模板扩增

用500ng模板质粒、2μl 5xKCM和7μl H2O转化KCM感受态和dut-/ung-大肠杆菌细胞(菌株K12CJ236)，并铺板在补充有氨苄青霉素的LB琼脂上。第二天早晨，挑取菌落，使每个菌落进入到含有100μg氨苄青霉素、35μg氯霉素和1:1,000辅助噬菌体M13KO7(1e11pfu)的1ml2YT培养基的新鲜培养物中。在37℃和200rpm孵育2小时后，加入25μg卡那霉素并继续振荡另外10小时。10小时后，将每种培养物转移到含有3,000μg氨苄青霉素、750μg卡那霉素和187.5μg尿苷的30ml 2YT生长培养基中。将生长培养基在37℃和200rpm孵育20小时。

dU-ssDNA的纯化

20小时后，将培养物在10,000rpm和4℃下，于Beckman JA-12固定角转子中离心10分钟。将含有噬菌体的上清液在新的falcon管中与6ml(1:5)PEG/NaCl(20％聚乙二醇8000，2.5M NaCl)轻轻混合，并在室温下孵育30分钟以沉淀噬菌体。然后将混合物在10,000rpm和4℃下离心10分钟。弃去上清液，并将噬菌体沉淀物以4,000rpm短暂离心以去除剩余的上清液。吸出剩余的上清液，并将噬菌体沉淀物重悬于1ml PBS中。然后将重悬的噬菌体沉淀物以13,000rpm离心5分钟以去除剩余的细胞碎片。将上清液转移到新的1.5ml反应管中。

使用E.Z.N.A.M13DNA Mini试剂盒(Omega)，根据厂商方案从上清液中纯化单链DNA。使用NanoDrop测定DNA浓度，并通过在0.8％TAE/琼脂糖凝胶上使500ng单链DNA电泳来分析DNA。

共价闭合环状合成gRNA(3Cs-gRNA)：小规模和大规模

使用小规模合成的方案(参见“eGFP库和不同同源性长度的小规模合成”)在单独实验中合成了四种具有增加长度的引物的构建体，以测试不同同源性长度的合成效率。使用相同的方案以合并的方式合成6种eGFP-KO构建体。

使用大规模合成的方案(参见“20N和Opti引物的大规模合成”)合成20N和优化的引物构建体。用于两种方法-小规模和大规模合成的模板质粒是pLentiCRISPRv2和pLentiGuide，每种都具有掺入的非人靶向性(NHT)gRNA。

发明人使用了以下NHT gRNA序列：

NHT：5’-aaaacatcgaccgaaagcgt-3’(SEQ ID NO:1)

为了测试不同同源臂长度，发明人使用了plentiGuide-NHT质粒和以下寡核苷酸(均为5’-3’)：

10nt：gctctaaaac YBBNDHDNNNNDNNNNNHNN cGGTGTTTCG

(SEQ ID NO:2)

13nt：Ctagctctaaaac YBBNDHDNNNNDNNNNNHNNcGGTGTTTCGTCC

(SEQ ID NO:3)

15nt：TTCtagctctaaaac YBBNDHDNNNNDNNNNNHNNcGGTGTTTCGTCCTT

(SEQ ID NO:4)

18nt：taTTTCtagctctaaaacYBBNDHDNNNNDNNNNNHNNcGGTGTTTCGTCCTTTCC

(SEQ ID NO:5)

对于6种eGFP构建体的库，发明人使用了pLentiGuide-NHT和pLen-tiCRISPRv2-NHT，每种具有以下寡核苷酸(均为5’-3’)的库：

eGFP-1：TTCtagctctaaaac aggtgaagttcgagggcgac cGGTGTTTCGTCCTT

(SEQ ID NO:6)

eGFP-2：TTCtagctctaaaac ccctgagcaaagaccccaac cGGTGTTTCGTCCTT

(SEQ ID NO:7)

eGFP-3：TTCtagctctaaaac tcgtgaccaccctgacctac cGGTGTTTCGTCCTT

(SEQ ID NO:8)

eGFP-4：TTCtagctctaaaac cggcgcgggtcttgtagttgCcGGTGTTTCGTCCTT

(SEQ ID NO:9)

eGFP-5：TTCtagctctaaaac ttcagctcgatgcggttcac cGGTGTTTCGTCCTT

(SEQ ID NO:10)

eGFP-6：TTCtagctctaaaac cggtgaacagctcctcgccc cGGTGTTTCGTCCTT

为了合成20N引物(20N)和优化的引物(Opti)，发明人使用了pLentiGuide和pLentiCRISPRv2，产生了4种条件：20N于pLentiGuide-NHT上、20N于pLentiCRISPRv2-NHT上、Opti于pLentiGuide-NHT上，以及Opti于pLentiCRISPR-NHT上。20N引物是完全的随机化引物，即每个核苷酸在每个位置处以等概率出现。Opti引物根据先前公布的模式(31,32)为模型。在该引物中，针对核苷酸的选择对几个位置进行限制以减小产生的文库的大小(均为5’-3’)。

20N：TTCtagctctaaaac NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNcGGTGTTTCGTCCTT

(SEQ ID NO:11)

Opti：TTCtagctctaaaac YBBNDHDNNNNDNNNNNHNNcGGTGTTTCGTCCTT

(SEQ ID NO:12)

生长培养基的尿苷补充

为了测试尿苷补充对合成效率的影响，发明人用两种不同的生长培养基进行6种eGFP-KO构建体的库的小规模合成。在一个实验中，发明人用187.5μg(6.25μg/ml)尿苷补充30ml生长培养基。另一个实验是在没有尿苷补充的情况下进行的。除此之外，根据小规模合成方案进行了实验。将合成产物热激转化到感受态大肠杆菌细胞中，接种在LB琼脂/氨苄青霉素板上，并在37℃孵育过夜。通过测序确定两个实验中含野生型质粒的克隆相对于含eGFP-KO gRNA的克隆的比例。挑取来自每个实验的10个克隆并通过Sanger测序进行分析。

小规模3Cs-gRNA合成：利用T4多核苷酸激酶对寡核苷酸磷酸化

为了将寡核苷酸5’-磷酸化，发明人合并了0.6μg的诱变寡核苷酸、2μl 10x TM缓冲液、2μl 10mM ATP、1μl 100mM DTT和20单位T4多核苷酸激酶。加入H2O至总体积为20μl。将混合物在37℃孵育1h并立即用于退火。对于eGFP-KO构建体的库，发明人在单一反应中使用100ng的每种引物。单独合成具有不同同源性长度的构建体。

小规模3Cs-gRNA合成：寡核苷酸与模板的退火

为了使磷酸化的寡核苷酸与dU-ssDNA模板退火，发明人将2.5μl10x TM缓冲液和2μl磷酸化的寡核苷酸加入到2μg dU-ssDNA模板中，并加入H2O至终体积为25μl。在热循环仪中，将混合物在90℃孵育3分钟，在50℃孵育3分钟，并在20℃孵育5分钟。

小规模3Cs-gRNA合成：3Cs-gRNA的酶促合成

通过向退火的寡核苷酸/模板混合物中添加1μl 10mM ATP、1μl 10mM dNTP混合物、1.5μl 100mM DTT、200个连接单位或3个Weiss单位的T4DNA连接酶以及3个单位的T7DNA聚合酶来合成3Cs-dsDNA。将合成混合物在室温下孵育2h。在0.8％TAE/琼脂糖凝胶(100V,5min)上分析8μl反应产物。将2ml反应产物热休克转化到感受态大肠杆菌中。

小规模3Cs-gRNA合成：测序

将转化的大肠杆菌铺板在补充有氨苄青霉素的LB琼脂上。在TAE/琼脂糖凝胶上分析不同同源臂长度构建体。随机挑选20个用eGFP构建体的库转化的细菌克隆，并通过sanger测序分析以确定gRNA序列在群体中的分布。

大规模3Cs-gRNA合成：利用T4多核苷酸激酶对寡核苷酸磷酸化

为了5’-磷酸化寡核苷酸，发明人合并了0.6μg的诱变寡核苷酸、2μl10x TM缓冲液、2μl 10mM ATP、1μl 100mM DTT和20单位的T4多核苷酸激酶。添加H2O至终体积为20μl。将混合物在37℃下孵育1h，并立即用于退火。将20N和Opti引物用于单独的合成反应中。

大规模3Cs-gRNA合成：寡核苷酸与模板的退火

为了将磷酸化的寡核苷酸与dU-ssDNA模板退火，发明人将25μl 10x TM缓冲液和20μl磷酸化的寡核苷酸加入到20μg dU-ssDNA模板中，并加入H2O至终体积为250μl。在热循环仪中，将混合物在90℃孵育3min，在50℃孵育3min，并在20℃孵育5min。

大规模3Cs-gRNA合成：3Cs-gRNA的酶促合成

通过向退火的寡核苷酸/模板混合物中加入10μl 10mM ATP、10μl10mM dNTP混合物、15μl 100mM DTT、2000连接单位(或30Weiss单元)的T4DNA连接酶和30单位的T7DNA聚合酶来合成3Cs-ssDNA。将合成混合物在室温下孵育2h。2h后，使用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒对混合物进行亲和力纯化和脱盐。向混合物中加入1ml缓冲液QG(Qiagen)并混合。将样品施加至置于2ml微量离心管中的两个QIAquick离心柱，并以2,500rpm离心3分钟。使用了两个离心柱，这是因为单个柱的结合能力对于合成混合物中的DNA总量而言太低。向每个柱中加入750μl缓冲液PE(Qiagen)并以13,000rpm离心1min。然后将柱转移到新的1.5ml微量离心管中，并在开盖下以13,000rpm离心5min。将柱转移到新的1.5ml微量离心管中，将20μl蒸馏水施加至膜上。5min后，向柱中加入另外20μl蒸馏水并孵育5min。为了洗脱DNA，将柱以13,000rpm离心1分钟。将来自两个管的洗脱液合并在新的1.5ml微量离心管中，并在开盖下以13,000rpm离心15min，以将总体积减少至约70μl。将1μl洗脱的反应产物与单链DNA模板一起在0.8％TAE/琼脂糖凝胶上电泳(100V,30min)。

大规模3Cs-gRNA合成：电穿孔

利用Bio-Rad基因脉冲器，使用以下设置将20N文库和优化的向导文库电穿孔至电感受态(electrocompetent)的大肠杆菌(菌株SS320)中：电阻200Ohm，容量25，电压1.2kV。为了转化100μl的细胞，使用了400ng DNA。将电穿孔的细胞在4ml预热的SOC培养基中拯救，并在37℃和200rpm孵育1h。

孵育1小时后，进行稀释系列以确定转化效率和转化细菌的数量。将10μl培养物稀释10-1至10-12，铺板于含有氨苄青霉素的LB琼脂板上，并在37℃孵育过夜。第二天，测定电穿孔效率和转化细菌的数量。将剩余的培养物加入到补充有氨苄青霉素的200ml LB培养基中，并在37℃孵育过夜。第二天，使用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒纯化DNA。

大规模3Cs-gRNA合成：96孔测序

用20N文库和优化的向导文库的纯化的DNA通过热休克转化XL1Blue细胞，并在37℃孵育过夜。将转化细胞的集落各自接种到96孔板中补充有100μg/ml氨苄青霉素和1:1,000M13KO7辅助噬菌体(1e11pfu)的450μl 2YT培养基中，并在37℃，200rpm生长过夜。第二天，将细胞以4,000rpm离心5min。将含有噬菌体的上清液与PBT缓冲液以1:15在新的96孔板中稀释。在新的96孔板上，将2μl稀释的噬菌体加入到以下PCR混合物中：16.9μl蒸馏水、5μl5x OneTaq标准反应缓冲液(NEB)、0.5μl 10mM dNTP、0.5单位的OneTaq DNA聚合酶(NEB)和0.25μl的每种10μM引物。用以下PCR程序扩增DNA片段：95℃ 5min，30个循环的扩增(95℃30s，55℃ 30s，72℃ 40s)，72℃ 7min，并在4℃储存。在TAE/琼脂糖凝胶上分析代表性反应。

在新的96孔板的每个孔中，分配20.8μl的清洁混合物，其含有20μl蒸馏H20、4单位的核酸外切酶I和0.4单位的虾碱性磷酸酶。将6μl PCR产物转移至每个孔中并混合。将清洁反应物在37℃下孵育15min，并在80℃下孵育15min。将板送交测序并确定不同gRNA的分布。

慢病毒转导

将RPE1-H2B-eGFP细胞以每孔10,000个细胞的密度以一式三份接种于，含有补充有0.02μg/ml潮霉素、110单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和100μl/ml FBS的DMEM-F12培养基的6孔板中。第二天，用增加量的具有6种eGFP-KO gRNA的库的慢病毒进行慢病毒转导。一个孔用400uL的非人靶向性gRNA转导，并用作阴性对照。在一周的过程中，每隔一天更换培养基。在转导后第7天，通过流式细胞术确定eGFP消耗的程度。

T7核酸内切酶I Surveyor测定

将RPE1-H2B-eGFP细胞以每孔10.000个细胞的密度接种在补充有0.02μg/mL潮霉素、110单位/mL青霉素、100μg/ml链霉素和100μL/mL FBS的DMEM/F12培养基中。第二天，用200μL具有6种针对eGFP的gRNA的库的慢病毒上清液进行一个孔的慢病毒转导。另一个孔以非人靶向性gRNA转导并用作阴性对照。转导后第3天，将培养基更换为补充有0.02μg/mL潮霉素、110单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和100μL/mL FBS的新鲜DMEM/F12。在转导后第7天，使用酚-氯仿提取方法提取基因组DNA。于50μL反应体积中，利用基因组DNA样品进行PCR扩增，其中含有1μg DNA、10μL OneTaq标准缓冲液、1μL 10mM dNTP、0.25μL OneTaq DNA聚合酶、2.5μL以下10μM引物：GCGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG(SEQ ID NO:13)CACATCCCGCGAGATCCAGACG(SEQ ID NO:14)，以及蒸馏H20直至50μL的反应体积。使用以下循环条件：95℃预变性2min，30个循环的95℃变性15sec，60℃退火15sec和72℃延伸30secmin。72℃下进行1min最后延伸。然后使用以下方案对两种PCR扩增的样品变性：95℃预变性5min，使用以下斜率(ramp)退火：85℃ 10sec，75℃ 10sec，50℃ 10sec和25℃ 1min。在58.2μL的总体积中利用2.7μL的T7核酸内切酶I和5.5μL NEBuffer 2消化50μL的PCR产物。将混合物在37℃孵育1h，并在2.5％TAE/琼脂糖凝胶上分析。

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34.T.A.Kunkel,Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A 82,488-492(1985).

序列表

<110> 法兰克福大学(Johann Wolfgang Goethe-Universitaet Frankfurt am Main)

<120> 产生高阶基因组编辑文库的方法

<130> U30757WO

<150> DE102016125894.6

<151> 2016 12 29

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 1

aaaacatcga ccgaaagcgt 20

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<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<223> 引物

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<223> 引物

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<212> DNA

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<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<223> 引物

<400> 7

ttctagctct aaaacccctg agcaaagacc ccaaccggtg tttcgtcctt 50

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<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<223> 引物

<400> 8

ttctagctct aaaactcgtg accaccctga cctaccggtg tttcgtcctt 50

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<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<223> 引物

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ttctagctct aaaaccggcg cgggtcttgt agttgccggt gtttcgtcct t 51

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<223> 引物

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<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<223> 引物

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ttctagctct aaaaccggtg aacagctcct cgccccggtg tttcgtcctt 50

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<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<223> 引物

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<400> 13

ttctagctct aaaacybbnd hdnnnndnnn nnhnncggtg tttcgtcctt 50

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

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<223> 引物

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gcgggatcct tacttgtaca gctcgtccat gccgag 36

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 15

cacatcccgc gagatccaga cg 22

Claims

1.用于产生基于共价闭合环状(ccc)DNA的小RNA/DNA表达载体或载体文库的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供单链(ss)噬菌粒载体，其包括：(i)至少一个小RNA/DNA表达盒，其包括RNA/DNA启动子和空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或小RNA/DNA编码序列和/或DNA/RNA核酸酶靶标序列或以上的部分序列，(ii)至少一个单链DNA复制原点(ORI)，如噬菌体ORI，且特别是f1原点，以及

(b)提供至少一种诱变RNA或DNA引物，其中所述诱变RNA或DNA引物在3’-5’方向具有以下结构：第一同源区、编码待表达的小RNA/DNA的靶标序列区和第二同源区，其中所述第一同源区在5’侧与所述空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或所述小RNA/DNA编码序列或其部分序列侧翼的所述ss-噬菌粒载体构建体的序列互补或能够与之退火，并且其中所述第二同源区在3’侧与所述空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或所述小RNA/DNA编码序列或其部分序列侧翼的所述ss-噬菌粒载体构建体的序列互补或能够与之退火，

(d)去除残留的野生型噬菌粒载体DNA。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述小RNA为siRNA、shRNA、抗miR、向导RNA(gRNA)或向导DNA(gDNA)或任何其他RNA/DNA编码的基因扰动序列。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述小RNA为gRNA，并且其中所述ss-噬菌粒载体构建体还包括野生型或工程改造形式的RNA/DNA或基因组编辑核酸酶表达序列，其任选地与启动子(稳定的或可诱导的)可操作地连接。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述至少一种诱变DNA引物为至少两种诱变DNA引物，优选为至少3种，更优选至少4种、5种、6种、10种、50种、100种、1000种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种或10¹²种诱变DNA引物，并且其中每种cccDNA在选择的小RNA编码序列中具有不同的序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中通过向选择的小RNA编码序列中引入至少一个或多个IUPAC编码的碱基(例如N)来提供大量的诱变DNA引物种类。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中小RNA编码序列的长度为至少10个核苷酸至200个核苷酸，更优选10-50个，更优选10-30个，更优选15-30个，更优选15-25个，最优选17-23个，最优选约20个。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述同源区中的每一个的长度为至少5个核苷酸，优选至少10个核苷酸，更优选5-40个核苷酸，最优选10-30个核苷酸或10-20个核苷酸，最优选13-18个核苷酸，甚至更优选约15个核苷酸。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诱变DNA引物具有SEQ ID NO:1-12中任一个的序列。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供单链(ss)噬菌粒载体构建体，其包括至少一个尿嘧啶碱基；所述ss-噬菌粒载体构建体包括：(i)至少一个小RNA/DNA表达盒，其包括RNA/DNA启动子和空的靶标小RNA/DNA序列引入位点或小RNA/DNA编码序列和/或DNA/RNA核酸酶靶标序列或以上的部分序列，(ii)至少一个单链DNA复制原点(ORI)，如噬菌体ORI，且特别是f1原点，以及

(d)用含无尿嘧啶的互补DNA链替换所述ccc-异源双链dsDNA中含尿嘧啶的链，以获得基于cccDNA的小RNA/DNA表达载体或载体文库。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述单链(ss)噬菌粒载体构建体通过以下提供：

(aa)在dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶和/或其同源物、旁系同源物或直系同源物健全或缺陷的细菌菌株，优选在CJ236菌株中扩增相同序列的dsDNA噬菌粒载体，以获得野生型(含胸腺嘧啶)或含尿嘧啶的异源双链dsDNA噬菌粒载体，以及

(bb)产生包括野生型或含尿嘧啶的ssDNA的噬菌体颗粒，以及

(cc)从所述噬菌体颗粒纯化所述野生型或含尿嘧啶的ssDNA以获得包括至少一个尿嘧啶碱基的ss-噬菌粒载体构建体。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶和/或其同源物、旁系同源物或直系同源物缺陷的细菌菌株，优选CJ236菌株，包括辅助噬菌粒，或其中在步骤(bb)中，所述dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶和/或其同源物、旁系同源物或直系同源物缺陷的细菌菌株，优选CJ236菌株，感染了辅助噬菌体，其中所述辅助噬菌粒或辅助噬菌体优选为M13K07。

12.如权利要求9-11中任一项所述的方法，其中通过在具有功能性dUTP酶和/或尿嘧啶糖基化酶活性的细菌如XL1或SS320中转化且扩增所述ccc-异源双链dsDNA来进行步骤(d)，以获得所述cccDNA。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过使用具有RNA或DNA聚合酶活性的酶例如T7DNA聚合酶，任选地连同RNA或DNA连接酶如T4 DNA连接酶一起，来进行步骤(c)中共价闭合环状(ccc)异源双链dsDNA的扩增。

14.用于实施前述权利要求中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)噬菌粒载体构建体，其包括：

(ii)至少一个噬菌体复制原点，和

(b)DNA聚合酶，任选地DNA连接酶；

(d)以及使用说明书。

15.载体文库，其通过权利要求1-13中任一项所述的方法获得。

16.载体文库，其包括至少10⁷种，优选至少10⁹种独特载体序列，其中所述文库中的每种独特载体序列的载体骨架为基因组编辑载体，如包括可表达的CRISPR/Cas9酶和gRNA表达盒的载体。