CN110234784A - 沉积非晶态无机金属氧化物的薄膜作为用于哺乳动物细胞培养的选择性基底以及作为植入物涂层 - Google Patents

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Abstract

本文公开了可用作光学玻片和医学植入物的涂层的材料。该材料可以帮助或限制复合材料的涂层上的细胞的生长。因此，提供了具有基底的复合材料，通过使用脉冲激光沉积(PLD)连续组成扩展技术在基底的表面上形成了非晶态金属氧化物的涂层。金属氧化物可以是Ag2<D、ZnO、ZrCO2、T1O2、CuO和Y2O3中的一种或多种，且涂层可以为从5至100nm厚，且具有的涂层表面的均方根粗糙度为0.1至0.7nm。

Description

沉积非晶态无机金属氧化物的薄膜作为用于哺乳动物细胞培 养的选择性基底以及作为植入物涂层
技术领域
本发明涉及材料薄膜，其可用于帮助或阻碍细胞生长，并可用在需要这样的特性的任何表面上，诸如成像玻片和/或植入物材料。
背景技术
为了研究目的，能够在细胞周期的各个阶段对细胞进行成像是很重要的。为了实现这一点，我们需要有可允许对细胞的生长进行成像的细胞培养基底材料。这并不总是一件容易的事，因为不同哺乳动物组织类型可能会拒绝在标准表面上生长，诸如由玻璃玻片提供的表面。因此，需要可以有助促进不同生长阶段中的细胞成像的新材料。
医学植入物被广泛用于弥补身体缺陷，无论是先天性病症，还是由于疾病或创伤而获得的缺陷。这样的植入物的实例包括感觉和神经植入物、心血管植入物、矫形外科植入物、避孕植入物、整形植入物等。所有这些植入物的共同特征是，它们在植入后会与身体的一种或多种组织密切接触。这种组织可能是例如骨组织和/或一种或多种软组织，诸如肌肉组织、结缔组织、上皮组织和粘膜组织。然而总期望植入物与它所接触的一种或多种组织相容，无论植入物作为新组织生长的支架或用于防止生长取决于植入物旨在是永久的还是暂时的和所采取的医疗处理的类型。虽然已经为植入物开发了各种涂层，但这些涂层可能不适用于各种各样的组织类型，因此仍然需要植入物的新涂层，其可以根据需要促进或阻止组织结合和整合。
发明内容
本发明概述于以下编号的方面和实施方式。
1.一种复合材料，包括：
具有表面的基底；和
所述基底的表面上的非晶态金属氧化物涂层，其中涂层具有表面，其中：
金属氧化物选自由Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3组成的组中的一种或多种；且
基底表面上的金属氧化物涂层为从5nm至100nm厚(例如从5nm至50nm，或从5nm至25nm厚)。
2.根据条款1所述的复合材料，其中，金属氧化物选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3中的两种或更多种。
3.根据条款2所述的复合材料，其中，金属氧化物选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3中的两种或三种。
4.根据前述条款中任一条所述的复合材料，其中，金属氧化物选自ZrO2和/或Y2O3。
5.根据前述条款中任一条所述的复合材料，其中，当有两种或更多种金属氧化物时，每种金属氧化物的wt％含量在整个涂层中变化，使得在任何给定位置，金属氧化物中的一种的存在的量为从0wt％至100wt％。
6.根据条款5所述的复合材料，其中，每种金属氧化物的wt％含量在整个涂层中变化，使得在任何给定位置，金属氧化物中的一种的存在的量为从5wt％至95wt％。
7.根据条款1至4中任一条所述的复合材料，其中，当有两种或更多种金属氧化物时，每种金属氧化物的wt％含量在整个涂层中是恒定的，使得每种金属氧化物的存在的量为从0.1wt％至99.5wt％。
8.根据条款7所述的复合材料，其中，每种金属氧化物在整个涂层中的存在的量为从1wt％至99wt％，诸如从5wt％至90wt％。
9.根据条款8所述的复合材料，其中，每种金属氧化物在整个涂层中的存在的量为从15wt％至85wt％，诸如从40wt％至60wt％。
10.根据条款7所述的复合材料，其中，有两种金属氧化物为ZrO2和Y2O3，且ZrO2在整个涂层中的存在的量为从1wt％至99wt％，其余为Y2O3。
11.根据条款10所述的复合材料，其中，ZrO2在整个涂层中的存在的量为从5wt％至90wt％，其余为Y2O3。
12.根据条款11所述的复合材料，其中，ZrO2在整个涂层中的存在的量为从10wt％至90wt％，其余为Y2O3。
13.根据条款12所述的复合材料，其中，ZrO2在整个涂层中的存在的量为从15wt％至85wt％，其余为Y2O3。
14.根据条款13所述的复合材料，其中，ZrO2在整个涂层中的存在的量为从20wt％至80wt％，其余为Y2O3。
15.根据条款14所述的复合材料，其中，ZrO2在整个涂层中的存在的量为从40wt％至75wt％，其余为Y2O3。
16.根据条款15所述的复合材料，其中，ZrO2在整个涂层中的存在的量为50wt％，其余为Y2O3。
17.根据前述条款中任一条所述的复合材料，其中：
(a)基底选自由钛和氧化硅(例如石英)组成的组；和/或
(b)金属氧化物涂层具有表面粗糙度，其表面粗糙度可以为从0.1至0.7nm的均方根粗糙度。
18.根据前述条款中任一条所述的复合材料，其中，基底为适合显微镜检查的透明玻片的形式或者医学植入物的形式。
19.根据条款18所述的复合材料，其中，基底为临时医学植入物(例如临时导管、临时骨螺钉、隐形眼镜)，其中涂层包括从65至100wt％的Y2O3(例如从80至100wt％的Y2O3)。
20.根据条款18所述的复合材料，其中，基底为永久医学植入物，其中涂层包括从50至100wt％的ZrO2(例如从80至100wt％的ZrO2)。
21.根据条款18所述的复合材料，其中，基底为人工晶状体，其中涂层包括从65至100wt％的Y2O3(例如从80至100wt％的Y2O3)。
22.一种制造复合材料的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供具有表面的基底，并使用脉冲激光沉积法将金属氧化物沉积到所述表面上；和
(b)在最高至250℃的温度下烧结得到的材料，以在基底的表面上形成非晶态金属氧化物涂层，其中：
金属氧化物选自由Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3组成的组中的一种或多种；且
基底表面上的金属氧化物涂层为从5nm至100nm厚(例如从5nm至50nm厚，诸如从5nm至25nm厚)。
23.根据条款22所述的方法，其中，金属氧化物选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3中的两种或更多种，诸如选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3中的两种或三种，且其中步骤(a)使用脉冲激光沉积法或脉冲激光沉积连续组成扩展技术。
24.根据条款22或条款23所述的方法，其中，金属氧化物选自ZrO2和/或Y2O3，且其中步骤(a)使用脉冲激光沉积法或脉冲激光沉积连续组成扩展技术。
25.根据前述条款中任一条所述的方法，其中，当有两种或更多种金属氧化物时，每种金属氧化物的wt％含量在整个涂层中变化，使得在任何给定位置，金属氧化物中的一种的存在的量为从0wt％至100wt％。
26.根据条款25所述的方法，其中，每种金属氧化物的wt％含量在整个涂层中变化，使得在任何给定位置，金属氧化物中的一种的存在的量为从5wt％至95wt％。
27.根据条款22至25中任一条所述的方法，其中，当有两种金属氧化物时，金属氧化物为ZrO2和Y2O3：
(a)ZrO2在整个涂层中的存在的量为从1wt％至99wt％，其余为Y2O3；
(b)ZrO2在整个涂层中的存在的量为从5wt％至90wt％，其余为Y2O3；
(c)ZrO2在整个涂层中的存在的量为从10wt％至90wt％，其余为Y2O3；
(d)ZrO2在整个涂层中的存在的量为从15wt％至85wt％，其余为Y2O3；
(e)ZrO2在整个涂层中的存在的量为从20wt％至80wt％，其余为Y2O3；
(f)ZrO2在整个涂层中的存在的量为从40wt％至75wt％，其余为Y2O3；
或
(g)ZrO2在整个涂层中的存在的量为50wt％，其余为Y2O3。
28.根据条款22至25中任一条所述的方法，其中：
(a)基底选自由钛和氧化硅(例如石英)组成的组；和/或
(b)金属氧化物涂层具有表面粗糙度，该表面粗糙度可以为从0.1至0.7nm的均方根粗糙度。
29.根据条款22至28中任一条所述的方法，其中，烧结步骤在温度最高至200℃下进行。
30.在根据条款1至21中任一条所述的复合材料上生长细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供根据条款1至21中任一条所述的复合材料和第一细胞群；
(b)将第一细胞群施加至复合材料；和
(c)在复合材料上培养第一细胞群以形成第二细胞群。
31.根据条款30所述的方法，其中，细胞群细胞选自由角质形成细胞、成纤维细胞、神经嵴细胞、神经干细胞、脂肪细胞、成骨细胞和细菌细胞(例如沙门氏菌(salmonella)细胞和大肠杆菌(E.coli)细胞)组成的组中的一种或多种。
32.根据条款30或条款31所述的方法，其中，该方法不涉及用细胞外涂层和/或层粘连蛋白涂层涂覆复合材料。
33.根据条款30至32中任一条所述的方法，其中该方法还包括在条款30的步骤(b)后对细胞进行成像。
附图说明
图1基底上的材料的化学表征。(a)氧化钇和(b)氧化锆在基底上的浓度。一种氧化物的量从一侧至另一侧减少，导致元素比例的变化。材料库的(c)厚度和(d)粗糙度，由涂覆基底上的表面的AFM图像计算。
图2用于研究氧化物层上的细胞特性的涂覆基底的尺寸和所做的修改。成像帧的位置显示为“x”标记。
图3描绘了角质形成细胞(原代KC细胞和无限增殖化NTERT细胞)在具有不同量的Y2O3和ZrO2涂覆的基底上的生长：(a)描绘了细胞培养5天之后KC和NTERT细胞的平均细胞计数(KC为n＝2，NTERT为n＝3)。从行(5列的每一列中共8行)中得到平均值。底图基底上的热点图表示在基底的不同位置处的相对细胞计数(归一化至在特定晶片样品上的最高细胞浓度)；(b)提供了在具有不同量的Y2O3和ZrO2涂覆的基底上生长的KC的代表性图像(比例尺——20μm)；以及(c)提供了显示在Y2O3-ZrO2涂覆的基底上不同“区”处的KC的细胞分布的代表性图像。这些“区”代表不同的区域，细胞在这些区域表现出独特的粘附特点。
图4描绘了原代人包皮成纤维细胞(fFB)、成人成纤维细胞(aFB)和成纤维细胞细胞系(ES-FB)在具有不同量的Y2O3和ZrO2涂覆的基底上的生长：(a)描绘了细胞培养5天之后fFB、aFB和ES-FB细胞的平均细胞计数(n＝2)。从行(5列的每一列中共8行)中得到平均值。底图基底上的热点图表示在基底的不同位置处的相对细胞计数(归一化至在特定晶片样品上的最高细胞浓度)；(b)提供了细胞培养5天之后在具有不同量的Y2O3和ZrO2涂覆的基底上生长的fFB的代表性图像(比例尺——20μm)。箭头指示基底的一半，在这里细胞开始粘附至氧化物表面(约50％氧化锆含量)；以及(c)提供了显示在Y2O3-ZrO2涂覆的基底上不同“区”处的人成人FB的细胞分布的代表性图像。这些“区”代表不同的区域，细胞在这些区域表现出独特的粘附特点。
图5提供了神经嵴细胞(NCC)生长的代表性图像，没有细胞外基质涂层，于：(a)组织培养塑料；(b)对照SiO2基底；和(c)Y2O3-ZrO2涂覆的基底上，以及(d)描绘了Y2O3-ZrO2涂覆的基底的放大的中部区域(大约1:1的Y2O3-ZrO2)，示出了NCC的健康且正常的细胞形态。
图6描绘了神经干细胞(NSC)在具有不同量的Y2O3和ZrO2涂覆的基底上的生长：(a)提供了显示在具有不同量的Y2O3和ZrO2涂覆的基底(有层粘连蛋白涂层)上的不同“区”处的NSC的细胞分布的代表性图像.；(b)NSC在有层粘连蛋白涂层的具有不同量的Y2O3和ZrO2涂覆的基底上的分化的图像(比例尺——10μm，n＝3)。增殖5天之后可观察到细胞的黏附。分化之后，细胞从Y2O3涂覆表面剥落。
图7描绘了因脂肪细胞生长脂滴形成，于：(a)对照基底；(b)Y2O3-ZrO2涂覆的基底；(c)没有脂滴形成的未成熟细胞；和(d)有脂滴形成的成熟细胞。与(a)对照基底相反，在(b)Y2O3-ZrO2涂覆的基底上观察到有脂质形成的分化的脂肪细胞增加。
图8描绘了脂肪细胞的荧光染色。在(a)对照基底(无金属氧化物涂层)；和(b)Y2O3-ZrO2涂覆的基底上生长的细胞上的脂滴的GFP-BODIPY染色。在(c)对照基底(无金属氧化物涂层)上和在(d)Y2O3-ZrO2涂覆的基底上生长的细胞的RFP-PPARλ染色。
图9描绘了：(a)人成骨细胞在钛和非晶态氧化钇稳定的氧化锆(aYSZ；95wt％ZrO2和5wt％Y2O3)涂覆的钛基底上的增殖(n＝3，比例尺——100μm)；(b)各种基因表达的比较；以及(c)分别生长在钛和氧化钇稳定的氧化锆涂覆的钛基底上的成骨细胞的碱性磷酸酶活性。
图10提供了用茜素红染色的，在Y2O3-ZrO2涂覆的玻璃基底和未涂覆的玻璃基底上生长的小鼠成骨细胞前体MC3T3的代表性图像。
图11描绘了将PDMS掩膜置于金属氧化物涂覆的基底上，以将基底分成32个圆形隔区，然后在其上培养细菌。
图12描绘了在二元金属氧化物涂覆的基底上的表面特点和生物膜形成：(a)基底表面上ZnO和CuO的组成；(b)表面的粗糙度(平均0.4nm)；(c)样品表面的AFM图像；(d)基底上的生物膜形成结果(归一化到对照)；(e)如(d)(n＝3)中的箭头所指示，基底上6个位置处的生物膜形成和材料含量的图。
图13描绘了在三元金属氧化物涂覆的基底上的表面特点和生物膜形成：(a)基底表面上ZnO、ZrO2和TiO2的组成；(b)表面的粗糙度(平均0.52nm)；(c)样品表面的AFM图像；(d)基底上的生物膜形成结果(归一化到对照)；(e)如(d)(n＝3)中右侧箭头所指示，基底的孔1-6处的生物膜形成和材料含量的图；(f)如(d)(n＝3)中左侧箭头所指示，基底的孔7-12处的生物膜形成和材料含量的图。
图14描绘了当在ZrO2上生长12小时的细胞与在Y2O3上生长12小时的细胞相比时，所观察到的明显上调的粘附相关的基因的数量。
具体实施方式
令人惊讶地发现，用某些金属氧化物的薄涂层涂覆基底材料可使得到的表面具有细胞粘附和细胞生长特性，或者相反——即不发生细胞粘附。而更令人惊讶的是，对于某些细胞类型，这些金属氧化物的某些的混合物可提供比原本预期的更大的粘附力。因此，提供了复合材料，包括：
具有表面的基底；和
所述基底的表面上的非晶态金属氧化物涂层，其中涂层具有表面，其中：
金属氧化物选自由Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3组成的组中的一种或多种；且
基底表面上的金属氧化物涂层为从5nm至100nm厚。
不受理论的约束，据信薄的非晶态金属氧化物涂层的使用是本文所获得的性能的主要原因。值得注意的是，金属氧化物涂层的薄度可以导致透明的材料层，因此其可能可用于制造用于显微镜检查的玻片等，或者用于眼植入物(临时和永久的两者)。此外，不受理论的约束，值得注意的是，金属氧化物层的薄度可降低通常与这样的金属氧化物涂层相关的脆性，使得它们可用于本文所述的医学植入物。
金属氧化物层的厚度可以为从5nm至100nm。在可替代的实施方式中，金属氧化物层的厚度可以为从5nm至50nm，诸如从5nm至25nm。应认识到，相对薄的金属氧化物层可能比相对厚的金属氧化物层(当相互比较时)更透明和/或脆性更小。在某些实施方式中，金属氧化物涂层也可以是光滑的。可测量表面粗糙度为均方根粗糙度，其可以为从0.1至0.7nm。
在本文的实施方式中，词语“包括”可以理解为需要所提及的特征，但不限制其他特征的存在。可替代地，词语“包括”也可以涉及以下情形，其中仅所列出的组分/特征是旨在存在的(例如词语“包括”可以用短语“由……组成”或“基本上由……组成”替换)。明确地设想了较广泛和较狭义的解释两者均可施用于本发明的所有方面和实施方式。换句话说，词语“包括”及其同义词可以用短语“由……组成”或短语“基本上由……组成”或其同义词替换，反之亦然。
在本文可能提到的某些实施方式中，复合材料可仅包含选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3的一种金属氧化物。例如，在其中期望医学植入物不促进细胞在表面生长的实施方式中，所使用的唯一金属氧化物可以是Y2O3，在本文中证实了其防止在涂覆基底上的细胞粘附和/或细胞生长。相反，当在医学植入物中(或在用于成像的玻片上)期望细胞生长和粘附时，金属氧化物可以是Y2O3，或者更特别地是ZrO2，以在单独使用时粘附和生长一系列不同的细胞类型。
可替代地，金属氧化物可以选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3中的两种或更多种。例如，金属氧化物可以选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3中的两种或三种。在本文所述的特定实施方式中，金属氧化物可以选自ZrO2和Y2O3。正如下文将详细描述的，在本文所述的涂层中两种或更多种金属氧化物的组合得到混合的涂层材料，其与任一单独的材料相比具有更优越的性质。例如，在涂层材料中使用ZrO2和Y2O3两者(例如重量比为50:50)，相比于任一单独的材料，可以为某些细胞类型(例如成熟脂肪细胞)提供增加的细胞粘附和生长。
应认识到，当有两种或更多种金属氧化物时，每种金属氧化物的重量百分比在整个涂层中可以是固定的百分比，或者也可以是变化的。这可能取决于使用涂层的应用。例如，在医学植入物中，可能期望能够使细胞组织在涂层表面上(并因此在植入物上)仅在某些区域中生长和粘附，同时防止或最小化在其他区域的生长和粘附。这可以通过选择合适的涂层材料用于植入物的不同区域来实现。例如，在打算用于细胞粘附的区域，涂层可以仅包括Y2O3，或更特别地包括ZrO2(即100wt％的ZrO2)或富含ZrO2的混合物(例如80wt％ZrO2和20wt％Y2O3)或(取决于待粘附的细胞)50:50wt％ZrO2和Y2O3的混合物。相反，在旨在无细胞粘附的区域，预期的无细胞区域可以仅用Y2O3或富含Y2O3的混合物(例如80wt％Y2O3和20wt％ZrO2)涂覆。虽然上文参考医学植入物进行描述，但应认识到它也可涉及光学玻片、培养表面或在反应器中(例如在需要细胞的图案化表面的地方)。所需区域可以是离散的，使得具有80wt％Y2O3和20wt％ZrO2的涂层区域可以与具有80wt％ZrO2和20wt％Y2O3的不同区域紧密相邻(这可以通过脉冲激光沉积法来实现)。可替代地，在其中需要两个极端之间的梯度的实施方式中，可以通过脉冲激光沉积连续组成扩展技术提供混合层。
如本文在实施方式部分中所公开的，与包含更多氧化钇的晶片(其避免了那些)相反，哺乳动物细胞，诸如原代人成人成纤维细胞、人胚胎干细胞衍生的成纤维细胞、原代人角质形成细胞、人骨细胞、人中脑源性神经干细胞、犬肾上皮细胞和大鼠神经鞘瘤，在包含更多氧化锆的无机薄膜沉积的玻璃基底上具有改善的粘附、迁移、增殖和分化(例如≥60wt％ZrO2，诸如≥80wt％ZrO2，如本文所述，其余为其他金属氧化物，诸如氧化钇)。然而，其他细胞类型，诸如小鼠脂肪细胞和人胚胎干细胞衍生的神经嵴细胞，更偏好有同等混合的氧化物(即大约50:50wt％ZrO2和Y2O3)的区域，而一种人黑色素瘤细胞的细胞系更偏好氧化钇区域(例如≥60wt％Y2O3，诸如≥80wt％Y2O3，如本文所述，其余为其他金属氧化物，诸如ZrO2)。这证明了不同金属氧化物及其组合对哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞的粘附有不同的影响，且这可以用作在实验室技术、诊断或治疗设备中的涂层，用于特定和定制的应用。
鉴于上述的考虑，应认识到当有两种或更多种金属氧化物时，每种金属氧化物的wt％含量在整个涂层中可以变化，使得在任何给定位置，金属氧化物中的一种的存在的量为从0wt％至100wt％。换句话说，每个位置可代表两种或更多种金属氧化物的混合物，或者在该位置处仅存在一种金属氧化物。例如，在某些实施方式中，当存在两种或更多种金属氧化物时，可以方便地确保有至少一定量的其他金属氧化物存在。这样，每种金属氧化物的wt％含量在整个涂层中变化，使得在任何给定位置，金属氧化物中的一种的存在的量为从5wt％至95wt％。
在可替代的医学植入物和/或玻片中，可能需要使用整个保持不变的金属氧化物涂层。在这样的情况下，当有两种金属氧化物时，每种金属氧化物的wt％含量在整个涂层中是恒定的，使得每种金属氧化物的存在的量可为从0.1wt％至99.5wt％。例如，每种金属氧化物在整个涂层中的存在的量为从1wt％至99wt％，诸如从5wt％至90wt％，从15wt％至85wt％，诸如从40wt％至60wt％，诸如50wt％。
如上所述，当涂层中存在两种金属氧化物时，这两种金属氧化物可以是ZrO2和Y2O3。在这样的情况下，ZrO2在整个涂层中的存在的量可以为从1wt％至99wt％，其余为Y2O3。例如，ZrO2在整个涂层中的存在的量为从5wt％至90wt％，诸如从10wt％至90wt％，诸如从15wt％至85wt％，诸如从20wt％至80wt％，诸如从40wt％至75wt％(例如50wt％)，其余为Y2O3。
本发明的一个令人惊讶的发现是，包括ZrO2和Y2O3的混合物(例如50:50wt％)的涂层会导致改善的外围神经细胞的粘附，其能为长期共培养实验提供便利，这在传统的细胞培养玻璃盖玻片上是不可能的。这允许电子显微镜和其他高分辨率光学显微镜技术在这些外围神经元上获得增强的性能(与塑料盖玻片相比)，否则这是不可能的。此外，在普通玻璃玻片上，细胞在长时间的培养后脱落。下面详述的实验表明，细胞对特定区域的偏好是由于它们对这些区域的偏好粘附。
上述材料和方法能够利用表面化学操纵细胞行为，以使细胞在不同种类和不同细胞类型的培养物或体内具有粘附性(或非粘附性)。在实施例中本文公开了允许不同类型的细胞粘附、不粘附和分化的特定金属氧化物组合。虽然本文展示的数据仅深入考虑了处于不同重量百分比的两种金属氧化物的组合，但也示出了不同细胞类型对特定的氧化物组合如何具有不同的偏好；一些氧化物组合可用于促进细胞粘附，而另一些可用于阻止细胞粘附。在组合库中增加金属氧化物类型以包含更多样化的混合，从逻辑上将对可使用的细胞过程产生更多样化的影响，本文对此进行了一些探讨。
基于本文的公开，已知细胞对不同比例的氧化物组合具有不同的粘附特点。对于哺乳动物细胞，虽然Y2O3和ZrO2两者是相似的(这两种金属仅原子序数相差1)，并且具有的氧化物厚度、粗糙度、润湿性、表面能和其他机械性能在基底上的差异可以忽略不计，但它们对不同细胞过程产生的影响仍然不同。对于细菌细胞来说，生物膜的分布不与任何单个组分直接相关，而是氧化物的组合的结果。一些氧化物的组合提供了可阻止生物膜形成的独特的性能，诸如锌，它具有已知的抗菌性能。然而，由于锌本身是有毒的，这种新方法可能能够降低其对哺乳动物细胞的一般毒性，同时防止生物膜形成。
任何合适的基底材料都可以用于负载本文所述的非晶态金属氧化物涂层。合适的基底材料包括但不限于钛和氧化硅(例如石英)。基底材料可以为任何合适的形式。例如，基底可以为适合于显微镜检查的透明玻片、反应容器的衬里的形式或为医学植入物的形式。有合适的基底的任何合适的医学植入物都可以按照本文所述的方式(且根据需要)进行涂覆。这样的医学植入物可以是临时医学植入物，或者它们可以是永久医学植入物。
临时医学植入物可以包括但不限于临时导管、临时骨螺钉和隐形眼镜。这些植入物是临时的，因为它们在被移除和/或替换之前应用于(或插入)身体一段时间。因此，用在植入物上阻止或抑制细胞粘附和生长的金属氧化物材料涂覆这些植入物可能是有利的，因为细胞粘附和生长可能使得在使用期结束时移除植入物更加困难。如本文所述的合适的金属氧化物涂层的实例为其中涂层包括从65至100wt％的Y2O3(例如从80至100wt％的Y2O3)的植入物。类似的涂层在植入物旨在永久保留于体内，但位于细胞粘附和生长将不利于该植入物的功能的位置处的情况下可能是有用的。例如，人工晶状体应保持无晶状体细胞，否则可能会损害其功能，其人工晶状体可具有包括从65至100wt％的Y2O3(例如从80至100wt％的Y2O3)的金属氧化物涂层。
在其他永久植入物中，可能需要使细胞粘附在植入物上并在植入物上生长，这在上文已详细描述。如上所述，这样的植入物可具有包括从50至100wt％的ZrO2(例如，从80至100wt％的ZrO2)的涂层。
当光学玻片和/或培养容器旨在提供所需细胞的最大量时，所述玻片/容器的整个工作表面可以用一种或多种所需金属氧化物涂覆，以确保实现所需细胞的最大产量。
如将认识到的，本文提到的任何产品也特定地旨在形成当前所要求保护的本发明的一部分。因此，还提供了包括本文所述的金属氧化物涂层的医学植入物、光学玻片、反应容器和培养容器。所述产品可以使用本文所述的任何涂层。
上述涂层表面可以使用脉冲激光沉积法或其变体制造，这允许将一种或多种材料沉积到基底上。所述工艺可包括以下步骤：
(a)提供具有表面的基底，并使用脉冲激光沉积法将金属氧化物沉积到所述表面上；和
(b)在最高至250℃的温度下烧结得到的材料，以在基底的表面上形成非晶态金属氧化物涂层，其中：
金属氧化物选自由Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3组成的组中的一种或多种；
基底表面上的金属氧化物涂层为从5nm至100nm厚(例如从5nm至50nm厚，诸如从5nm至25nm厚)；且
涂层表面的均方根粗糙度为从0.1至0.7nm。
应认识到，可以在本文使用脉冲激光沉积法的任何合适的变体。例如，当旨在在基底上按梯度模式使用两种或更多种材料时，使用脉冲激光沉积连续组成扩展技术(这是脉冲激光沉积法的一种变体)可能更加便利。此外，应认识到上述方法得到的产品旨在覆盖本文上述的复合材料。
如本文所述，金属氧化物涂层由非晶态金属氧化物组成。因此，需要注意的是，烧结步骤应保持在合适的温度——不会导致一种或多种金属氧化物在涂层中结晶的温度。基于这一点，烧结步骤可以在最高至200℃，诸如从150至200℃(例如175℃)的温度下进行。
如将认识到的，在某些实施方式中，本文公开的复合材料可适用于细胞的生长(例如在有此需要的培养物中或植入物中)。因此，提供了在如本文所述适合于细胞生长的复合材料上生长细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供如本文所述的复合材料和第一细胞群；
(b)将第一细胞群施加至复合材料；和
(c)在复合材料上培养第一细胞群以形成第二细胞群。
应认识到以上可仅在体外(ex vivo)进行。例如在培养细胞的方法中。用于细胞培养的合适的细胞包括但不限于角质形成细胞、成纤维细胞、神经嵴细胞、神经干细胞、脂肪细胞、成骨细胞和细菌细胞(例如沙门氏菌细胞和大肠杆菌细胞)。本涂层材料用于细胞培养和/或成像的优势在于通常不需要提供细胞外和/或层粘连蛋白涂层，其在不使用本涂层材料时是必需的，尽管在一些情况下这对于一些细胞类型——诸如神经干细胞——可能仍然是必须的。这通常简化了培养和/或成像程序，否则其需要用这些材料涂覆培养表面的额外步骤。
如本文所述，培养容器可包括光学玻片，其然后可进行成像。因此，本文上述方法还可包括在所公开的培养方法的步骤(b)之后对细胞进行成像的步骤。
现将参考以下非限制性实施例对本发明作进一步描述。
实施例
一般程序
在涂覆基底上的细胞的成像
在Olympus IX83倒置活细胞显微镜上使用10X物镜获得基底上细胞的亮场图像。在基底的长和宽(8张图像乘5张图像)上以1cm的间隔拍摄每张图像，如图2(“x”-标记)所示，得到40张图像。然后使用ImageJ将这些图像拼接在一起。
在涂覆基底上的细胞培养
使用不同的哺乳动物细胞类型。这些包括无限增殖化人角质形成细胞系(N/TERT-1s)、原代人角质形成细胞、原代人成纤维细胞、人神经干细胞系、人神经干细胞、人神经嵴细胞、小鼠前脂肪细胞系、小鼠神经鞘瘤细胞系、犬MDCK上皮细胞系和人成骨细胞(MC3T3)。
角质形成细胞的培养——使用原代人角质形成细胞和原代角质形成细胞衍生的细胞系，(N/TERT-1s)。将细胞解冻并在补充有0.2ng/ml EGF和25μg/ml牛脑垂体提取物的角质形成细胞无血清培养基中培养，在37℃和5％CO2下生长至50％融合，并使用TrypLEExpress传代培养(所有均购自Life Technologies，新加坡)。对于Ca2+变化实验，使用无Ca2 +的角质形成细胞无血清培养基，并相应地补充Ca2+。
成纤维细胞的培养——将细胞解冻并在补充有10％FBS的DMEM(Gibco，新加坡)中培养，在37℃和5％CO2下生长至50％融合，并使用TrypLE Express传代培养(所有均购自LifeTechnologies，新加坡)。如角质形成细胞一样，对于Ca2+变化实验，使用无Ca2+的DMEM(Gibco，新加坡)，并相应地补充Ca2+。小鼠神经鞘瘤细胞系、犬MDCK上皮细胞系和人成骨细胞(MC3T3)均在与成人成纤维细胞相同的培养基条件下生长。
神经干细胞的培养——ReNcell VM细胞系(ReNVM)由ReNeuron Ltd(Donato等人2007年)创建并分布。它源自十周龄胎儿中脑组织，该组织从伦敦国王学院医院(KingsCollege Hospital)获得，且可通过Millipore(cat#SCC008)获得。当细胞在下面所述的NSC增殖培养基中培养时获得了最佳结果。培养基组分如下：补充有L-谷氨酰胺(1mM)(Gibco，新加坡)、KnockOut血清替代物(10％)(Gibco)、B27(2％)(Gibco)、Wnt(40ng/ml)(R&DSystems)、cAMP(0.2mM)(Sigma，新加坡)、GDNF(20ng/ml)(R&D Systems，新加坡)、NGF(10ng/ml)(R&DSystems，新加坡)、BDNF(20ng/ml)(R&D Systems，新加坡)、神经营养因子-3(10ng/ml)Sigma，新加坡)、肝素(10单位/ml)(Sigma，新加坡)和L-抗坏血酸(200μM)(Sigma，新加坡)的Neurobasal培养基(cat#21103-049——Gibco，新加坡)。
细菌培养——将单一菌落的野生型鼠伤寒沙门氏菌菌株14028s接种在1.0mLLuria-Bertani肉汤中，并在37℃下在250rpm的振动下生长过夜。将2μL的过夜培养物接种在包含1％胰蛋白胨和0.5％酵母提取物的198μL的LB培养基(无盐)中，在材料库的每个孔中。在加入细菌培养物之前对材料进行UV杀菌。然后将样品于30℃下在静态条件下孵育两天，以使生物膜形成(S.K.Desai,R.S.Winardhi,S.Periasamy,M.M.Dykas,Y.Jie,L.J.Kenney,The horizontally-acquired response regulator SsrB drives aSalmonella lifestyle switch by relieving biofilm silencing,Elife 5(2016))。
实施例1
A：制造ZrO2-Y2O3涂覆的基底
使用适应的脉冲激光沉积连续组分扩展技术(例如参见Review of ScientificInstruments 72(6)(2001)2673-2678)实行在基底上的ZrO2-Y2O3薄膜涂层。首先通过按以下顺序的一系列洗涤(每次2分钟)清洁直径为4英寸的圆形熔融石英基底：
1)三氯乙烯(J.T.Baker)；
2)去离子水；
3)丙酮(J.T.Baker)；
4)去离子水；
5)甲醇(J.T.Baker)；和
6)去离子水。
每一步骤之后都通过在氮气蒸汽下吹扫来移除多余的液体。
脉冲激光沉积法(PLD)的ZrO2靶标通过将ZrO2粉末(99.99％纯度，Sigma Aldrich)压缩成小球，然后将其在1000℃下烧结12h来制备。类似地，将Y2O3粉末(Alfa Aeser，99.999％纯度)压缩成小球并在1000℃下烧结12小时。在200℃下，在氧气分压为3×10- 3Torr(基础真空压力为5×10-7Torr)下制备ZrO2-Y2O3材料薄膜。KrF准分子激光(248nm)能量密度为2.15J/cm2，且重复频率为5Hz。激光束以45°角度聚焦到靶标上，靶标到样品的距离为84mm。重复进行一系列的到Y2O3靶标上的20个激光脉冲和到ZrO2靶标上的24个激光脉冲100次。
ZrO2-Y2O3涂覆的基底的化学表征
通过卢瑟福背散射光谱法测量厚度。通过颗粒诱导的X射线发射测量化学分布。
基底的表面组成从一种材料(ZrO2或Y2O3)在基底的一侧为约95％变化至在中间的约50％，并然后在另一侧减少至约5％(图1a和b)。氧化物的这样的化学分布可能被用于获得广泛的生物信息。
厚度变化由氧化物的不均匀沉积引起，由于大部分材料沉积在羽状物(plume)附近，而较少的在进一步远离羽状物处沉积(即当定位于每个源时与激光的轴在一条线上沉积更高量)。虽然膜的厚度(图1c)在基底中不同，但该变化与细胞的尺寸相比是微不足道的(22nm距离5cm——即基底上膜的厚度在5cm线上从边缘到基底的中心变化22nm)。此外，可影响细胞行为的基底的表面粗糙度可以忽略不计，因为变化小于1nm(图1d)。
B：ZnO-CuO和ZnO-TiO2-ZrO2涂覆的基底的制造
将Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2(99.999％来自Sigma)和CuO(99.995％来自Alfa Aesar)的高纯度粉末研磨数小时，然后在200MPa的压力下将每种不同的粉末压制15分钟，制成直径为1英寸的小球。然后，将小球分别在250℃下煅烧4h，在1250℃下煅烧10h，在1000℃下煅烧12h，在1200℃下煅烧24h并在900℃下煅烧48h。
首先通过按以下顺序的一系列洗涤(每次2分钟)清洁直径为4英寸的石英基底(来自Plan Optik，厚度为525μm，Ra＜0.5nm，目录编号：V015.04-0014)：
1)三氯乙烯(J.T.Baker)；
2)去离子水；
3)丙酮(J.T.Baker)；
4)去离子水；
5)甲醇(J.T.Baker)；和
6)去离子水。
每一步骤之后都通过在氮气蒸汽下吹扫来移除多余的液体。
在以下条件下通过PLD用薄膜涂覆清洁并干燥后的基底：
1)基底温度为200℃；
2)基准压力为5×10-7Torr，O2分压为3×10-3Torr；
3)靶标-基底距离为84mm；
4)能量密度为2.1J/cm2，激光频率为5Hz；以及
5)从基底中部的羽状物距离为约35mm。
对于二元材料(ZnO-CuO)的沉积，重复进行一系列的到ZnO靶标上的22个脉冲和到CuO靶标上的29个脉冲100次。对于从每个靶标的沉积，将基底角位置改变180度。
对于三元材料(ZnO-TiO2-ZrO2)的沉积，重复进行一系列的到ZnO靶标上的20个脉冲、到TiO2靶标上的21个脉冲和到ZrO2靶标上的24个脉冲100次。对于从每个靶标的沉积，将基底角位置改变120度。
C：出于成像目的对涂覆基底的修改
在Y2O3-ZrO2和其他基底上培养各种细胞类型。为了允许涂覆基底适合显微镜载片台用于成像目的，从基底的每侧切下2cm片段(图2)。图2的底部区域表示Y2O3的最大涂层，且每个十字表示已在基底上成像的单帧。使用类似的排列用于其他基底。
实施例2
无限增殖化人角质形成细胞系(N/TERT-1s)、原代人角质形成细胞(KC)在Y2O3-ZrO2涂覆的基底上的生长
图3示出了与Y2O3-ZrO2涂覆的基底的化学组成相关的角质形成细胞计数(行平均)的依赖性(培养超过5天)。如图3a所示，随着表面上ZrO2含量的增加，两种细胞系的细胞计数均增加。原代KC细胞与NTERT细胞之间无明显差异，表明两种细胞系对氧化物材料表面具有相似的亲和力。
对于对照基底(无金属氧化物涂层的SiO2基底)，细胞到处生长，对基底的任何部分都没有特异性(未示出)。然而，对于Y2O3-ZrO2涂覆的基底，在基底的前两列上(Y2O3＞80％，由箭头所指示)观察到的细胞较少，这表明这些细胞偏好ZrO2富集表面，而不是Y2O3富集表面(图3b)。图3b上的图像与图3a的细胞计数数据有良好的相关性。
图3c描绘了角质形成细胞(KC)在Y2O3-ZrO2表面上不同“区”处细胞分布的代表性图像。“区”代表不同的区域，其中细胞表现出不同的粘附特点，且“区”的位置对于不同的细胞类型是独特的。在I区，抑制区(87％-95％Y2O3)，没有细胞粘附在表面上。然而，应注意的是，与成纤维细胞相比(其中抑制区为～65％至～90％Y2O3)，KC的抑制区相对较窄。在II区，过渡区(～80％Y2O3)，更多的KC粘附在表面，有健康和不健康形态的混合细胞群。在III区，饱和区(低于60％Y2O3)，在表面上观察到有健康形态的KC。
实施例3
原代人包皮成纤维细胞(fFB)、成人成纤维细胞(aFB)和成纤维细胞细胞系(ES-FB)在Y2O3-ZrO2涂覆的基底上的生长
图4示出了在Y2O3-ZrO2涂覆的基底上培养超过5天，三种成纤维细胞系——原代人包皮成纤维细胞(fFB)、成人成纤维细胞(aFB)和成纤维细胞细胞系(ES-FB)的粘附情况。对于对照基底(无任何金属氧化物涂层的SiO2基底)，细胞到处生长，对基底的任何部分都没有特异性(未示出)。然而，对于Y2O3-ZrO2涂覆的基底，在金属氧化物涂覆的基底的前4列中(其中Y2O3＞50％)观察到极少的细胞生长或没有细胞生长，而在具有包含大于50％ZrO2的涂层的区域中观察到更多的细胞生长(图4a)。这表明成纤维细胞类型具有与之前显示的角质形成细胞不同的粘附需求。有趣的是，在中间区域(最主要在从氧化锆富集边缘的第2行和第3行中：掺杂20％-40％Y2O3的表面)中观察到最高量的细胞，如图4b所示。这些成纤维细胞表现出与角质形成细胞(实施例1中)非常不同的粘附模式，并且对Y2O3区域较难接受。
图4c中的代表性图像示出了人成人成纤维细胞(FB)在基底上不同“区”处的细胞分布。“区”代表不同的区域，其中细胞表现出不同的粘附特点，“区”的位置对于不同的细胞类型是独特的。在I区，抑制区(65％-95％Y2O3)，没有细胞粘附在表面上。在II区，过渡区(～50％Y2O3)，少量的FB粘附在表面上，且在饱和区III(小于45％Y2O3)，在表面上观察到致密单层的FB。
实施例4
人神经嵴细胞(NCC)在Y2O3-ZrO2涂覆的基底上的生长
不同于之前的细胞类型，其通常偏好在ZrO2富集表面上生长，人神经嵴细胞(NCC)偏好在中间区域上生长，中间区域通常包含等量混合的Y2O3和ZrO2。此外，这些细胞的粘附和增殖不需要细胞外基质涂层(EMC)。NCC通常需要EMC以粘附在组织培养塑料或玻璃材料上，所以这是一个意想不到的结果。图5a示出了在不存在EMC的情况下在组织培养表面(标准组织培养皿)上NCC的形态。这些细胞不符合正常NCC形态。对于在未涂覆的SiO2基底上的NCC，在不存在EMC的情况下，也观察到了类似的形态(图5b)。
然而，对于有Y2O3-ZrO2涂层的基底(无EMC)，观察到NCC粘附在中间区域(图5c)。当在更高放大倍数下观看时，涂覆基底的中间区域显示NCC正常地粘附并增殖，无需任何EMC(图5d)。当细胞分化时，它们倾向于从基底脱落，表明分化后它们的粘附性能发生了变化。
实施例5
神经干细胞(NSC)在Y2O3-ZrO2涂覆的基底上的生长
图6a示出了神经干细胞(NSC)在有层粘连蛋白涂层的Y2O3-ZrO2涂覆的基底上的不同“区”处的分布。在I区，抑制区(＞90％-100％Y2O3)，几乎没有细胞粘附在涂覆基底的表面上。在II区，过渡区(～90％Y2O3)，更多NSC粘附至表面。然而，这些细胞似乎并不健康，因为它们呈圆形形态并形成了团块。在III区，饱和区(小于80％Y2O3)，在表面上观察到致密单层的NSC。
增殖5天之后，NSC粘附在有层粘连蛋白涂层的Y2O3-ZrO2涂覆的基底上(图6b)。分化之后，细胞从Y2O3涂覆表面剥落。另一方面，即使在涂覆层粘连蛋白之后，细胞也不能粘附在对照基底(SiO2基底)上。此外，基于存在的Y2O3的量，NSC显示出粘附模式上的一些差异。此外，在分化成神经元时，粘附模式发生变化，如图6b所示，其变得与成纤维细胞的粘附模式相似。
实施例6
脂肪细胞在Y2O3-ZrO2涂覆的基底上的生长
前脂肪细胞具有分化以形成脂肪细胞或脂细胞的潜力，其在成熟时在细胞质周围包含脂滴。将小鼠前脂肪细胞接种于Y2O3-ZrO2涂覆的基底和对照基底(SiO2；无金属氧化物涂层)上。与对照基底相比，在金属氧化物涂覆的基底上观察到更高程度的细胞增殖。当两种基底融合后，用分化培养基孵育细胞以诱导分化。分化之后，与对照基底上的细胞相反，金属氧化物涂覆的基底上的细胞显示出增加的脂质形成(图7)。
为了验证上述观察，对用GFP-BODIPY(可将脂滴染色的绿色荧光蛋白-标记的硼二吡咯亚甲基)和RFP-PPARλ(过氧化物酶体增殖物激活受体λ的红色荧光蛋白-标记的配体，其靶向在成熟脂肪细胞上表达的PPARλ)染色的脂肪细胞进行荧光成像。
与对照设置中的那些相比，由于脂滴(图8a和b)和PPARλ(图8c和d)的染色，在于Y2O3-ZrO2涂覆的基底上生长的脂肪细胞上观察到更高的荧光强度。如图8所观察，更高浓度的脂滴和成熟脂肪细胞位于金属氧化物涂覆的基底的中心区域(包含Y2O3和ZrO2的混合)。
其他哺乳动物细胞
也测试了其他哺乳动物细胞，诸如犬MDCK和小鼠神经鞘瘤细胞(来自ATCC的RT4-D6-P2T)。结果表明，神经鞘瘤细胞强烈地偏好ZrO2区域，但MDCK细胞分散于整个材料库中，在Y2O3浓度最高的区域处细胞较少。
实施例7
成骨细胞在氧化钇稳定的氧化锆涂覆的钛或玻璃基底上的生长
钛(Ti)是用于骨植入物的常见材料。当人成骨细胞分别在Ti基底上和使用上文所述方法用掺杂有5％的Y2O3的ZrO2涂覆的Ti基底上生长时，注意到在1、4和7天的时间段中，与未涂覆的Ti基底相比，在金属氧化物涂覆的Ti基底上细胞数量显著增加(图9a)。
除了更高的成骨细胞计数之外，进一步的研究还揭示了在于金属氧化物涂覆的Ti基底上生长的细胞中，COL1A1表达和其他骨相关的基因表达增加(图9b和c)，以及Ca2+沉积。这些结果表明了骨形成。
小鼠成骨细胞前体MC3T3在Y2O3-ZrO2涂覆的玻璃基底和未涂覆的玻璃基底上生长。将分化细胞(21天龄)用茜素红染色以检测钙(Ca)沉积。与玻璃对照相比，在生长于金属氧化物涂覆的表面上的细胞中观察到更高的Ca沉积(图10)。基底的ZrO2富集区域显示出比Y2O3富集区域更强的染色。
以上表明，用于金属氧化物涂覆的表面的基底材料的选择(无论是Ti还是玻璃基底)对细胞响应(诸如细胞粘附、增殖、分化和Ca的沉积)没有显著影响。因为需要细胞相互作用的大多数植入物材料或涂层涉及骨整合的表达升高，因此这对于使用所选的氧化物对植入物进行修改，从而控制在植入物上细胞生长的选择性和特异性是有希望的。
实施例8
细菌在二元/三元金属氧化物涂覆的基底上的生长
使用定制的聚二甲基硅氧烷(PDMS)掩膜将金属氧化物涂覆的圆形基底分成32个圆形隔区(图11)。在静态条件下培养沙门氏菌48小时，并用结晶紫染色以测定沉积的生物膜的量。
将氧化锌(ZnO)和氧化铜(II)(CuO)用于二元金属氧化物涂覆的基底。基底中金属氧化物组成的变化与表面的粗糙度不具有相关性。在这种情况下，整个样品中的粗糙度相对低，平均rms粗糙度为0.4nm(图12b)。样品表面的AFM(原子力显微镜)图像在图12c中示出。
观察到基底表面的组成对生物膜形成有影响(图12d)。与对照石英样品相比，两种金属氧化物均延缓了生物膜形成。在图12e中可以观察到金属氧化物的量的变化与形成的生物膜的量之间有清晰的、近似线性的关系。样品边界(顶部和底部)处的结果通常达到在纯(100％)氧化物表面上获得的值。
将氧化锌(ZnO)、氧化锆(ZrO2)和氧化钛(TiO2)用于三元金属氧化物涂覆的基底。图13a示出了不同金属氧化物在基底上的分布。图13b和c分别示出了基底表面的粗糙度和表面的AFM图像。在三元库上形成的生物膜的量与金属氧化物组成梯度不像在二元体系中那样呈线性相关(图12e)。在这种情况下，可以观察到两种不同的趋势，如图13d所示。
第一种趋势如图13e所示(沿图13d中右侧的箭头)，与二元材料所获得的趋势相似。它显示出ZnO含量的增加(ZrO2含量的降低)导致形成更高量的生物膜。
另一种趋势如图13f所示，沿图13d中左侧箭头，表明ZnO和TiO2两者当大量(＞90％)存在时均会减少生物膜的形成。
然而，如图13所示，金属氧化物涂层的抗生物膜性质并不是任何一种氧化物的直接产物，而是所有三种金属氧化物以非线性方式组合的结果。
实施例9
在Y2O3涂覆的和ZrO2涂覆的基底上生长的细胞之间的基因表达的比较
为了了解减轻细胞-基底粘附中涉及的粘附机理，对接种于Y2O3涂覆的和ZrO2涂覆的基底上的成人成纤维细胞的基因调控进行了研究。在将细胞于Y2O3和ZrO2薄膜涂覆的基底上接种并生长12h之后，提取细胞中的RNA。这在三个生物复制物中进行，并然后对RNA样品进行测序。图14示出了与于Y2O3上生长的细胞相比，在于ZrO2上生长的细胞中显著上调的基因的数量。结果表明，不同的粘附相关基因均显著上调，这些基因可分为以下几类：细胞-细胞连接、细胞连接、黏合连接和锚定连接，在它们所有之中有18个基因是普遍的。

Claims (22)

1.一种复合材料，包括：
具有表面的基底；和
所述基底的表面上的非晶态金属氧化物涂层，其中所述涂层具有表面，其中：
所述金属氧化物选自由Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3组成的组中的一种或多种；
所述基底表面上的所述金属氧化物涂层为5nm至100nm厚。
2.根据权利要求1所述的复合材料，其中，所述金属氧化物选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3中的两种或更多种。
3.根据权利要求2所述的复合材料，其中，所述金属氧化物选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3中的两种或三种。
4.根据权利要求1所述的复合材料，其中，所述金属氧化物选自ZrO2和/或Y2O3。
5.根据权利要求1所述的复合材料，其中，当有两种或更多种金属氧化物时，每种金属氧化物的wt％含量在整个所述涂层中变化，使得在任何给定位置，所述金属氧化物中的一种的存在的量为0wt％至100wt％。
6.根据权利要求5所述的复合材料，其中，每种金属氧化物的wt％含量在整个所述涂层中变化，使得在任何给定位置，所述金属氧化物中的一种的存在的量为5wt％至95wt％。
7.根据权利要求1所述的复合材料，其中，当有两种或更多种金属氧化物时，每种金属氧化物的wt％含量在整个所述涂层中是恒定的，使得每种金属氧化物的存在的量为0.1wt％至99.5wt％。
8.根据权利要求7所述的复合材料，其中，有两种金属氧化物为ZrO2和Y2O3，且ZrO2在整个所述涂层中的存在的量为1wt％至99wt％，其余为Y2O3。
9.根据权利要求8所述的复合材料，其中，ZrO2在整个所述涂层中的存在的量为15wt％至85wt％，其余为Y2O3。
10.根据权利要求9所述的复合材料，其中，ZrO2在整个所述涂层中的存在的量为20wt％至80wt％，其余为Y2O3。
11.根据权利要求10所述的复合材料，其中，ZrO2在整个所述涂层中的存在的量为50wt％，其余为Y2O3。
12.根据权利要求1所述的复合材料，其中，所述基底选自由钛和氧化硅(例如石英)组成的组。
13.根据权利要求1所述的复合材料，其中，所述基底为适合显微镜检查的透明玻片的形式或者医学植入物的形式。
14.根据权利要求13所述的复合材料，其中：
(a)所述基底为临时医学植入物(例如临时导管、临时骨螺钉、隐形眼镜)，其中所述涂层包括从65至100wt％的Y2O3(例如从80至100wt％的Y2O3).
(b)所述基底为永久医学植入物，其中所述涂层包括从50至100wt％的ZrO2(例如从80至100wt％的ZrO2)；或者
(c)所述基底为人工晶状体，其中所述涂层包括从65至100wt％的Y2O3(例如从80至100wt％的Y2O3)。
15.根据权利要求1所述的复合材料，其中，所述金属氧化物涂层具有的均方根粗糙度为0.1至0.7nm。
16.一种制造复合材料的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供具有表面的基底，并使用脉冲激光沉积连续组成扩展技术将金属氧化物沉积到所述表面上；和
(b)在最高至250℃的温度下烧结得到的材料，以在所述基底的表面上形成非晶态金属氧化物涂层，其中：
所述金属氧化物选自由Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3组成的组中的一种或多种；
所述基底表面上的所述金属氧化物涂层为5nm至100nm厚。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述金属氧化物选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3中的两种或更多种，诸如选自Ag2O、ZnO、ZrO2、TiO2、CuO和Y2O3中的两种或三种，且其中步骤(a)使用脉冲激光沉积法或脉冲激光沉积连续组成扩展技术。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述金属氧化物选自ZrO2和/或Y2O3，且其中步骤(a)使用脉冲激光沉积法或脉冲激光沉积连续组成扩展技术。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述烧结步骤在温度最高至200℃下进行。
20.在根据权利要求1所述的复合材料上生长细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求1所述的复合材料和第一细胞群；
(b)将所述第一细胞群施加至所述复合材料；和
(c)在所述复合材料上培养所述第一细胞群以形成第二细胞群。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述细胞群细胞选自由角质形成细胞、成纤维细胞、神经嵴细胞、神经干细胞、脂肪细胞、成骨细胞和细菌细胞(例如沙门氏菌细胞和大肠杆菌细胞)组成的组中的一种或多种。
22.根据权利要求16所述的方法，其中，所述金属氧化物涂层具有0.1至0.7nm的均方根粗糙度。
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