CN110227061A - 一种含铂纳米颗粒的纳米凝胶、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种含铂纳米颗粒的纳米凝胶、其制备方法和应用。该纳米凝胶事先以顺铂作为交联剂,可以包裹阿的平染料,随后在乙醇的还原下将纳米凝胶中的顺铂原位还原形成铂纳米颗粒。阿的平自身为溶酶体染料,结合该纳米凝胶的作用可以标记细胞中的溶酶体。利用铂纳米颗粒的类超氧化物歧化酶特性,在荧光成像过程中,铂纳米颗粒可以去除由光照诱导产生的活性氧自由基,因此可以保护溶酶体在成像过程中不受破坏,实现长时间的、稳定的和低光毒性的细胞溶酶体成像。
Description
技术领域
本发明涉及药物载体制备技术领域,具体涉及一种包含铂纳米颗粒和荧光染料的透明质酸纳米凝胶、其制备方法及其在溶酶体标记中的应用。
背景技术
光毒性(phototoxicity)是指针对生物样本荧光成像过程中,在光的激发和游离态氧的存在下,荧光分子产生活性氧自由基(ROS),进而诱导细胞毒性的产生。光毒性的光化学原理已经被广泛应用于光动力治疗(Photodynamic therapy),但是该过程产生的光毒性极大的限制了生物成像的应用。由于生物荧光成像中均涉及到荧光分子和光激发,因此光毒性是不可避免的。
在生物成像过程中,通常采用减少荧光成像过程中激发光光照的时间来降低光毒性,但是在长时间的生物成像(比如,细胞的实时观察)过程中,光激发所产生的活性氧自由基发生累积,从而导致明显的光毒性。因荧光染料所产生的活性氧自由基可以破坏细胞内的膜结构(如溶酶体膜),这不仅引起了细胞毒性而且可以导致荧光染料的定位发生迁移,进而导致溶酶体荧光标记过程中的光毒性和非特异性染色的发生。目前仍没有有效方法直接去除生物成像过程中的光毒性。
溶酶体是细胞内最重要的细胞器之一,参与了细胞代谢、信号通路和细胞死亡等生命过程。
溶酶体的荧光标记为研究溶酶体的生物功能提供了强有力的工具。目前溶酶体的标记主要依赖于:
(1)基于内吞途径的溶酶体标记物。荧光标记右旋糖苷(dextran)或量子点(quantum dots)在通过细胞内吞后,进而通过内含体(endosome)的成熟途径定位于溶酶体,从而达到标记溶酶体的目的。但是荧光标记的右旋糖苷依赖于有机荧光分子标记,其光稳定性不够。而量子点通常具有潜在的细胞毒性。
(2)小分子溶酶体染料。小分子溶酶体染料通常为弱碱性的小分子,其中细胞外或细胞质中的中性pH条件下呈电荷中性,因此可以自由穿透细胞膜和溶酶体膜。但是在染料渗透进入溶酶体中时,由于溶酶体中的酸性pH使得染料分子发生质子化从而带正电荷。正电荷的染料分子不能穿越溶酶体膜而大量富集于溶酶体中,从而达到标记溶酶体的目的。典型的溶酶体染料分子包括溶酶体示踪剂LysoTracker、吖腚橙(acridine orange)和阿的平(quinacrine,Qu)等。LysoTracker为实验室中大量使用的商业化溶酶体染料,但是其缺点之一为,很容易发生光漂白,从而不适用于长时间的溶酶体成像。吖腚橙染料在高浓度情况下,染色具有非特异性,而且长时间的荧光观察,导致光毒性的产生和溶酶体的破裂。Qu也是常用的溶酶体染料之一,具有光稳定性高的特点,但是具有一定的细胞毒性和明显的光毒性。
为了降低溶酶体成像过程中产生的光毒性及其导致的溶酶体氧化损伤,本领域仍需要提供一种改进的溶酶体标记方法,以允许进行稳定且低光毒性的溶酶体实时成像;同时用于标记溶酶体的试剂也能够相对简便的得以合成。
发明内容
鉴于上述需求,根据本申请的一些实施方案,提供了一种制备含铂纳米颗粒的纳米凝胶的方法,其包括步骤:
a)在溶液中提供透明质酸或其钠盐;
b)在溶液中提供顺铂;
c)在溶液中提供染料分子;
d)将所述顺铂和所述染料分子混合,之后与所述透明质酸或其钠盐混合,其中所述染料分子为1至10个重量份、所述顺铂为9至60个重量份、所述透明质酸或其钠盐为16至80个重量份;
e)在85℃至95℃交联反应0.5小时至3小时;优选,90℃交联反应1小时至2小时;
f)向步骤e)所得反应产物中加入还原剂,混匀,在85℃至95℃还原反应2小时至4小时,得到包含染料分子和铂纳米颗粒的纳米凝胶;优选,加入无水乙醇,混匀,在90℃还原反应2小时至4小时;
g)冷却至4℃至25℃;
h)任选地,将所述包含染料分子和铂纳米颗粒的纳米凝胶对水进行透析;
其中,所述步骤a)、b)、c)的顺序可互换。
在一些实施方案中,技术人员可以根据步骤d中限定的量,按比例调整制备规模。
在申请的上下文中,纳米凝胶是指由亲水多聚物(如透明质酸或其钠盐)交联形成的网状结构,尺寸在纳米尺度范围;由于包含亲水多聚物,因而纳米凝胶内含大量水。
在本领域中,铂纳米颗粒(Platinum nanoparticles)通常是指由还原型六氯铂酸(或其盐)制成的尺寸在2至20nm的颗粒,其可以分散在介质中。
本申请的制备方法关键在于:先利用顺铂交联HA,形成纳米凝胶,再把处于交联位点处的顺铂原位还原并形成铂纳米颗粒,从而形成了包含铂纳米颗粒的纳米凝胶。当在反应体系中引入染料分子时,便允许形成包含染料分子和铂纳米颗粒的纳米凝胶(图3)。
在申请的上下文中,如无特别指明,术语“透明质酸”还包括其钠盐的范畴。
在一些实施方案中,透明质酸或其钠盐选自:高分子透明质酸钠(分子量大于1800kDa)、中分子透明质酸钠(1000kDa至1800kDa)、低分子透明质酸钠(10kDa至1000kDa,例如200kDa至400kDa)。
在一些具体的实施方案中,透明质酸或其钠盐分子量为1000kDa。应当注意的是,绝不能将1000kDa理解为所用透明质酸(或其钠盐)中每一个个体分子的分子量均为1000kDa整。在本领域中,用分子量来标示透明质酸(或其钠盐)的类型或规格,是指平均分子量在1000kDa附近,例如但不限于±20%、±10%、±5%范畴内。
在一些具体的实施方案中,染料分子选自:吖腚橙、阿的平、罗丹明(例如但不限于b型或800型)或其组合;优选阿的平。
在一些实施方案中,以1mg/ml至5mg/ml的浓度提供透明质酸或其钠盐。
在一些实施方案中,以3mg/ml至20mg/ml的浓度提供顺铂。
在一些实施方案中,以1mg/ml至10mg/ml的浓度提供染料分子。
在一些具体的实施方案中,在溶液中以5mg/ml的浓度提供透明质酸或其钠盐。
在一些具体的实施方案中,在溶液中以12.5mg/ml的浓度提供顺铂。
在一些具体的实施方案中,在溶液中以2.9mg/ml的浓度提供阿的平。
在一些具体的实施方案中,将所述顺铂和所述阿的平混合,之后与所述透明质酸或其钠盐混合,其中阿的平为1个重量份、顺铂为5个重量份、透明质酸或其钠盐为8个重量份。
根据一个具体的实施方案,提供了一种制备含铂纳米颗粒的纳米凝胶的方法,其包括步骤:
a)在溶液中提供透明质酸或其钠盐;
b)在溶液中提供顺铂;
c)将所述透明质酸或其钠盐和所述顺铂混合,其中所述透明质酸或其钠盐占16至80个重量份、所述顺铂占9至60个重量份;
d)在85℃至95℃交联反应0.5小时至3小时(优选,90℃交联反应1小时至2小时);
e)向步骤d)所得反应产物中加入还原剂,混匀,在85℃至95℃还原反应2小时至4小时(优选,加入无水乙醇,混匀,在90℃还原反应2小时至4小时),得到包含铂纳米颗粒的纳米凝胶;
f)冷却至4℃至25℃;
g)将所述包含铂纳米颗粒的纳米凝胶对水进行透析;
其中,所述步骤a)、b)的顺序可互换。
根据一些实施方案,提供了一种含铂纳米颗粒的纳米凝胶,其是通过本申请的方法所得。
根据一些实施方案,提供了一种含铂纳米颗粒的纳米凝胶,其包含透明质酸或其钠盐、铂和任选染料分子。在一些具体的实施方案中,纳米凝胶由所述透明质酸或其钠盐交联而成;且所述纳米凝胶包裹铂纳米颗粒和任选所述染料分子。
根据一些实施方案,还提供了本申请的含铂纳米颗粒的纳米凝胶在溶酶体检测中的用途。
在一些实施方案中,本申请的含铂纳米颗粒的纳米凝胶可用于溶酶体标记、溶酶体染色或溶酶体成像。
根据一些实施方案,还提供了一种溶酶体标记的方法,其包括:
-提供细胞;
-提供根据本申请的含铂纳米颗粒的纳米凝胶;
-将所述细胞和所述含铂纳米颗粒的纳米凝胶接触;
-任选地,将所述含铂纳米颗粒的纳米凝胶中包含的染料分子设置为0.1μM至50μM的浓度,通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测标记的细胞。
附图说明
图1.示意性示出合成单独含铂纳米颗粒的纳米凝胶的流程。
图2.制备例3中获得的含铂纳米颗粒的纳米凝胶的紫外可见吸收光谱。
图3.制备例3中获得的含铂纳米颗粒的纳米凝胶的透射电子显微镜图片。
图4.示意性示出合成含铂纳米颗粒和功能分子(Qu)的纳米凝胶的流程。
图5.制备例4中获得的含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶的紫外可见吸收光谱。
图6.制备例4中获得的含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶的透射电子显微镜图片。
图7.制备例4中获得的含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶中Qu的释放曲线。
图8.示意性示出,与单独的Qu染料相比,含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶在溶酶体标记和荧光成像过程中的优势。
图9.制备例4中含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶的细胞毒性。
图10A和图10B.制备例4中含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶的细胞溶酶体标记。图10A为游离Qu;图10B为含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶。
图11.制备例4中,用含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶处理细胞后,荧光显微镜观察前后诱导产生的ROS。
图12.制备例4中,和游离Qu相比,含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶标记细胞溶酶体后,于荧光显微镜下的实时观察。
图13.制备例4中含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶标记细胞溶酶体后,光照条件下诱导产生的光毒性评价。
具体实施方式
实施例1
母液配制:称量透明质酸钠(分子量10kDa至1000kDa)、顺铂、和阿的平,各自加入双蒸水配成水溶液(加热助溶,如需);浓度分别为:
-透明质酸水溶液浓度:1mg/ml至5mg/ml;
-顺铂水溶液浓度:3mg/ml至20mg/ml;
-阿的平水溶液浓度:1mg/ml至10mg/ml。
制备例1.含铂纳米颗粒的纳米凝胶的制备(图1)
(1)将150μL上述顺铂水溶液与50μL双蒸水,加入800μL上述透明质酸水溶液并迅速混匀;
(2)将混合物于90℃加热0.5小时至3小时;
(3)加入250μL 30%-100%(v/v)乙醇作为还原剂,继续在90℃孵育2小时至8小时;
(4)在冰上冷却5分钟至15分钟;
(5)将混合物转入透析袋中进行透析,透析液为双蒸水;
(6)将获得的产物储存于4℃备用。
制备例2.含功能分子和铂纳米颗粒的纳米凝胶的制备(图4)
(1)将150μL上述顺铂水溶液与50μL阿的平水溶液,加入800μL透明质酸水溶液并迅速混匀;
(2)将混合物于90℃加热0.5小时至3小时;
(3)加入250μL 30%-100%(v/v)乙醇作为还原剂,继续在90℃孵育2小时至8小时;
(4)在冰上冷却5分钟至15分钟;
(5)将混合物转入透析袋中进行透析,透析液为双蒸水;
(6)将获得的产物储存于4℃备用。
应当理解,所述步骤(1)中的阿的平为代表性功能分子,可选用其他染料或药物。所述的反应体积可以进行放大。
实施例2
母液配制:称量透明质酸钠(分子量1000kDa)、顺铂、和阿的平,各自加入双蒸水配成水溶液;浓度分别为:
-透明质酸水溶液浓度5mg/ml(室温下旋转混匀4小时至完全溶解);
-顺铂水溶液浓度12.5mg/ml(90℃条件下加热至顺铂完全溶解);
-阿的平水溶液浓度2.9mg/ml。
制备例3.含铂纳米颗粒的纳米凝胶的合成(图1)
(1)200μL顺铂溶液迅速与800μL透明质酸溶液混合后;
(2)于90℃条件下加热2小时,此时产物为顺铂交联的透明质酸纳米凝胶;
(3)随后加入250μL无水乙醇并迅速混匀,继续在90℃下加热4小时后,获得含铂纳米颗粒的纳米凝胶;
(4)随后将混合物于冰上冷却10分钟;
(5)将混合物转入透析袋,进行透析,透析液为1L纯水;
(6)透析1天后,将产物储存于4℃备用。
结果显示制备例3制备获得的含铂纳米颗粒纳米凝胶的紫外可见吸收光谱(图2)。形成铂纳米颗粒纳米凝胶后其紫外可见吸收比单纯的顺铂交联透明质酸纳米凝胶出现明显的增强。其中铂的包封率为97.4%。
结果显示,通过透射电子显微镜观察,制备例3制备获得的含铂纳米颗粒纳米凝胶,其中铂纳米颗粒在纳米凝胶中呈团簇状态。
制备例4.含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶的合成(图4)
(1)200μL顺铂溶液迅速与175μLQu溶液混合后加800μL透明质酸溶液并混匀;
(2)于90℃条件下加热1至2小时;
(3)随后加入75μL无水乙醇并迅速混匀,继续在90℃下加热2至4小时后,获得含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶;
(4)随后将混合物于冰上冷却5至10分钟;
(5)将混合物转入透析袋进行透析,透析液为1L纯水(根据反应体系大小,可以调整提及);
(6)透析1天后(根据实际情况可以调整时间),将产物储存于4℃备用。
结果显示,制备例4制备获得的含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶的紫外可见吸收光谱。同时包含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶具有铂纳米颗粒和Qu的紫外可见吸收特性,其中铂和Qu的包封率为94.9%和60.1%(图5)。
结果显示,制备例4制备获得的含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶的透射电子显微镜照片(图6)。
结果显示,制备例4制备获得的含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶中Qu的缓释曲线。于PBS和37℃条件下,纳米凝胶中的Qu呈现缓释方式(图7)。
测试例
测试例1.细胞溶酶体标记的细胞毒性与特异性
(1)接种10000个人乳腺癌细胞MDA-MB-231于96孔板中,过夜培养待细胞贴壁;
(2)将制备例2制备的含铂纳米颗粒和溶酶体染料(阿的平)的纳米凝胶用DMEM培养基稀释,溶酶体染料的浓度控制在0.1μM至50μM(鉴于非特异染色和细胞毒性,当采用游离Qu时,优选5μM);
(3)将步骤(1)的细胞与步骤(2)的培养基共孵育0.5至3小时,用PBS洗涤细胞,加入新鲜的无血清培养基;
(4)于荧光显微镜或激光共聚焦显微镜上观察标记的细胞。
现有技术中的细胞溶酶体标记方法:
-溶酶体用标准染料LysoTrakcer进行标记;
-如使用游离的Qu,在高浓度出现非特异的染色。
结果显示,制备例4中含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶的细胞毒性。MDA-MB-231细胞与单独的游离Qu、或本申请含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶共孵育3小时,随后细胞于新鲜培养基中培养24小时并进行细胞活性检测。与单独的Qu相比,本申请的纳米凝胶具有更低的细胞毒性(图9)。
结果显示,制备例4中含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶的细胞溶酶体标记和荧光成像。MDA-MB-231细胞与单独的Qu或含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶共孵育3小时,随后用商业化溶酶体染料LysoTracker和细胞核染料Hoechst进行溶酶体和细胞核标记。单独的Qu在高浓度情况下出现非特异性染色,部分Qu结合在细胞核。而含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶的使用,即使在高浓度情况下仍可以特异的标记溶酶体(图10A和图10B)。
测试例2:含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶的连续荧光成像和光毒性(图8)
人乳腺癌细胞系MDA-MB-231经含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶处理3小时。其中培养基中的Qu浓度为控制在0.1μM至50μM(鉴于非特异染色和细胞毒性,游离Qu时,优选5μM)。
结果显示,制备例4中含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶的溶酶体标记之后,荧光显微镜观察前后导致细胞内产生的ROS。MDA-MB-231细胞与单独的Qu或含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶共孵育3小时,培养基中Qu浓度设置在5μM。随后细胞经过商业化ROS染料CellROX deepred进行染色。事先拍摄细胞中ROS图像,连续观察细胞中Qu荧光90秒钟后,再次拍摄细胞中ROS图像。由于荧光观察过程中的光照可以激发Qu,单独Qu处理的细胞累积了明显的ROS。铂纳米颗粒具有ROS清除剂的功能,含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶处理的细胞在光照过程中并未产生明显的ROS(图11)。
结果显示,制备例4中含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶的溶酶体标记之后的连续荧光成像。单独Qu标记的MDA-MB-231细胞,在连续光照下可产生ROS进而导致溶酶体的破坏和Qu荧光信号扩散至整个细胞。含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶处理的细胞在荧光观察过程中,溶酶体信号保持完整(图12)。
结果显示,显示制备例4中含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶的细胞光毒性。MDA-MB-231细胞与单独的Qu或含Qu和铂纳米颗粒纳米凝胶共孵育3小时,培养基中Qu浓度设置在5μM。细胞经光照0至5分钟后继续孵育12小时,随后进行细胞活性检测。由于铂纳米颗粒的ROS去除剂功能,含Qu和铂纳米颗粒的纳米凝胶比单独的Qu具有更低的光毒性(图13)。
有益效果
(1)铂纳米颗粒为铂原子构成的纳米级颗粒,在生物医药应用种主要用于针对肿瘤的光热治疗和成像研究(CN105816887A,一种基于纳米Pt@BSA仿生材料的CT造影剂及其制备方法和应用与流程)。由于铂纳米颗粒具有类似超氧化物歧化酶的催化性能,其也被用作ROS清除剂用来缓解细胞的氧化损伤。化学法合成铂纳米颗粒需要有含铂的前驱体、稳定剂和还原剂。目前主要的铂前驱体为氯铂酸,稳定剂包括两亲性表面活性剂、白蛋白、多聚物等,还原剂则包括硼氰化钠、乙醇和甲醇等。
在铂纳米颗粒的生物医药应用中,通常需要先合成铂纳米颗粒,然后对其进行修饰或装载功能分子,因此增加合成的复杂成都和成本。本申请的方法可以通过一步法实现同时装载有铂纳米颗粒和功能分子的纳米凝胶。一步法合成铂纳米颗粒并装载功能分子,更为简便。顺铂作为交联剂诱导纳米凝胶形成后,顺铂本身也可以作为前躯体,在纳米凝胶中可以原位还原形成铂纳米颗粒。整个合成过程过简单快速,条件温和易进行放大化生产的优点。
(2)与单独的溶酶体染料相比,含铂纳米颗粒和溶酶体染料的纳米凝胶可以更特异地标记溶酶体,具有更少的暗毒性和光毒性。在成像过程,含铂纳米颗粒和溶酶体染料的纳米凝胶具有极少的溶酶体损伤,从而实现长时间的稳定的溶酶体标记和观察。
(3)以纳米颗粒包裹溶酶体染料可以同时通过两种途径标记细胞溶酶体:纳米颗粒本身可以通过内吞定位于细胞溶酶体;纳米颗粒释放的部分染料自身也可以标记细胞溶酶体。整个过程避免了细胞与大量的溶酶体染料接触所产生的非特异性染色。
(4)为了降低溶酶体成像过程中固有的光毒性及其导致的溶酶体氧化损伤,结合纳米凝胶、溶酶体染料和铂纳米颗粒的ROS清除剂功能可以实现安全并稳定地标记细胞内溶酶体用于实时观察。而在荧光成像过程中,铂纳米颗粒可以原位去除光激发所产生的ROS进而保护溶酶体不被破坏。该方法不仅整合了透明质酸纳米凝胶良好的生物相容性,溶酶体染料的荧光特性和铂纳米颗粒的ROS清除剂功能,可以实现稳定和低光毒性的细胞内溶酶体的标记和实时观察。
Claims (8)
1.一种制备含铂纳米颗粒的纳米凝胶的方法,其包括步骤:
a)在溶液中提供透明质酸或其钠盐;
b)在溶液中提供顺铂;
c)在溶液中提供染料分子;
d)将所述顺铂和所述染料分子混合,之后与所述透明质酸或其钠盐混合,其中:
所述染料分子为1至10个重量份、
所述顺铂为9至60个重量份、
所述透明质酸或其钠盐为16至80个重量份;
e)在85℃至95℃交联反应0.5小时至3小时;优选,90℃交联反应1小时至2小时;
f)向步骤e)所得反应产物中加入还原剂,混匀,在85℃至95℃还原反应2小时至4小时,得到包含染料分子和铂纳米颗粒的纳米凝胶;优选,加入无水乙醇,混匀,在90℃还原反应2小时至4小时;
g)冷却至4℃至25℃;
h)任选地,将所述包含染料分子和铂纳米颗粒的纳米凝胶对水进行透析;
其中,所述步骤a)、b)、c)的顺序可互换;
所述透明质酸或其钠盐选自:
分子量大于1800kDa的高分子透明质酸或其钠盐、
1000kDa至1800kDa的中分子透明质酸或其钠盐、
10kDa至1000kDa的低分子透明质酸或其钠盐;优选,10kDa至1000kDa的低分子透明质酸或其钠盐;
所述染料分子选自:吖腚橙、阿的平、罗丹明或其组合;优选阿的平。
2.根据权利要求1所述的方法,其中:
以1mg/ml至5mg/ml的浓度提供透明质酸或其钠盐;
以3mg/ml至20mg/ml的浓度提供顺铂;
以1mg/ml至10mg/ml的浓度提供染料分子。
3.根据权利要求1所述的方法,其中:
a)在溶液中以5mg/ml的浓度提供透明质酸或其钠盐;
b)在溶液中以12.5mg/ml的浓度提供顺铂;
c)在溶液中以2.9mg/ml的浓度提供阿的平;
d)将所述顺铂和所述阿的平混合,之后与所述透明质酸或其钠盐混合,其中:
所述阿的平为1个重量份、
所述顺铂为5个重量份、
所述透明质酸或其钠盐为8个重量份;
e)在90℃交联反应1小时;
f)向步骤e)所得反应产物中加入无水乙醇作为还原剂,混匀,在90℃还原反应2小时,得到包含阿的平和铂纳米颗粒的纳米凝胶;
g)冰上冷却至4℃至25℃;
h)将所述包含阿的平和铂纳米颗粒的纳米凝胶对水进行透析;
其中,所述步骤a)、b)、c)的顺序可互换;
所述透明质酸或其钠为10kDa至1000kDa的低分子透明质酸或其钠盐。
4.一种制备含铂纳米颗粒的纳米凝胶的方法,其包括步骤:
a)在溶液中提供透明质酸或其钠盐;
b)在溶液中提供顺铂;
c)将所述透明质酸或其钠盐和所述顺铂混合,其中:
所述透明质酸或其钠盐占16至80个重量份、
所述顺铂占9至60个重量份;
d)在85℃至95℃交联反应0.5小时至3小时;优选,90℃交联反应1小时至2小时;
e)向步骤d)所得反应产物中加入还原剂,混匀,在85℃至95℃还原反应2小时至4小时,得到包含铂纳米颗粒的纳米凝胶;优选,加入无水乙醇,混匀,在90℃还原反应2小时至4小时;
f)冷却至4℃至25℃;
g)任选地,将所述包含铂纳米颗粒的纳米凝胶对水进行透析;
其中,所述步骤a)、b)的顺序可互换;
所述透明质酸或其钠盐选自:
分子量大于1800kDa的高分子透明质酸或其钠盐、
1000kDa至1800kDa的中分子透明质酸或其钠盐、
10kDa至1000kDa的低分子透明质酸或其钠盐;优选,10kDa至1000kDa的低分子透明质酸或其钠盐。
5.一种含铂纳米颗粒的纳米凝胶,其是通过权利要求1至4任一项所述方法所得。
6.一种含铂纳米颗粒的纳米凝胶,其包含:
-透明质酸或其钠盐、
-铂、和
-任选,染料分子;
其中,所述纳米凝胶由所述透明质酸或其钠盐交联而成;
所述纳米凝胶包裹铂纳米颗粒和任选所述染料分子;
所述透明质酸或其钠盐选自:
分子量大于1800kDa的高分子透明质酸或其钠盐、
1000kDa至1800kDa的中分子透明质酸或其钠盐、
10kDa至1000kDa的低分子透明质酸或其钠盐;优选,10kDa至1000kDa的低分子透明质酸或其钠盐;
所述染料分子选自:吖腚橙、阿的平、罗丹明或其组合;优选阿的平。
7.权利要求4或5所述的含铂纳米颗粒的纳米凝胶在溶酶体检测中的用途,其中所述检测选自溶酶体标记、溶酶体染色、溶酶体成像。
8.一种溶酶体标记的方法,其包括:
-提供细胞;
-提供权利要求4或5所述的含铂纳米颗粒的纳米凝胶;
-将所述细胞和所述含铂纳米颗粒的纳米凝胶接触;
-任选地,通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测标记的细胞;
其中,将所述含铂纳米颗粒的纳米凝胶中包含的染料分子设置为0.1μM至50μM的浓度。
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