CN110201167A - 光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法,涉及药物化学的合成领域,更具体地涉及从合成空心介孔硒化铋、载酶硒化铋以及全氟化碳的装载等各步的具体方法。光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法具体包括以下步骤:(1)利用水热法合成硒化铋(2)利用离子吸附法合成在空心介孔的硒化铋外壳上吸附葡萄糖氧化酶(3)利用超声法将全氟化碳填充入硒化铋空腔内,然后充入氧气。所得到的复合纳米药物递送系统具有精准控制氧气释放、较好的光热性能以及良好的生物相容性等优点。
Description
技术领域
本发明涉及化学药物领域,具体涉及具有光照释放氧气以及光热与饥饿治疗的联合疗法的硒化铋纳米粒子的制备与用途。
背景技术
对于光热治疗,开发具有优良特性的光热转化剂是取得有效光热治疗的关键。目前金属纳米材料、碳纳米材料、有机材料等多种类型的光热转化剂被广泛用于肿瘤的光热治疗。其中,硒化铋纳米颗粒因其优良的热稳定性和光热转化效率而成为一种极具潜力的光热治疗平台。硒化铋纳米颗粒,具有介孔和空心内腔,可作为潜在的药物载体,将药物输送到肿瘤区域。这为硒化铋纳米颗粒在纳米生物医学中的应用提供了更多可能性。
近年来,联合治疗的理念得到了学术界广泛认可。其中,饥饿治疗逐渐展露肿瘤治疗潜力。众所周知,快速增殖的肿瘤细胞需要大量的能量来维持其生物活性,这种活性主要是通过无氧糖酵解(Warburg效应)产生的,肿瘤的生长高度依赖于葡萄糖的供应。葡萄糖氧化酶可以通过氧气氧化葡萄糖,产生葡萄糖酸和过氧化氢。通过葡萄糖氧化酶消耗肿瘤细胞的葡萄糖,阻断了对癌细胞的必需葡萄糖供应,以抑制它们的生长和存活。然而,实体肿瘤中癌细胞的不规则增殖和血管的不完全生长产生的肿瘤缺氧,限制葡萄糖氧化酶消耗糖的速率。
十四氟正己烷(PFC)是一种液体全氟化碳,能溶解大量的氧,作为氧的载体,具有良好的生物相容性和较高的氧亲和力,广泛应用于临床作为人工血液替代品。近几年发现,近红外激光介导的光热效应可以触发含全氟化碳纳米粒子负载氧气的及时释放,因此可以显著提高饥饿治疗的效果。
发明内容
由于目前用于治疗肿瘤的药物递送载体其作用单一,生物相容性、降解性较差,治疗效果一般。本发明旨在合成一种具有较良好生物相容性同时又能精准控制氧气的释放,结合光热以及饥饿治疗的新型药物递送纳米平台。
本发明的技术方案具体如下:
光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法,其特征在于,包含以下步骤:
(1)将五水硝酸铋Bi(NO3)3·5H2O加入稀硝酸溶液中,然后磁力搅拌至硝酸铋完全溶解,得到混合溶液;
(2)向步骤(1)得到的混合溶液中加入氢氧化钠NaOH、聚乙烯吡咯烷酮PVP和乙二醇溶液,磁力搅拌几分钟至溶解,得到混合溶液;
(3)将步骤(2)得到的混合溶液转移至反应釜中150 ℃加热3 h,得到的乳白色溶液用去离子水洗涤三次,离心分离得到氧化铋;
(4)向步骤(3)得到的氧化铋重新悬浮于一定体积的水中,加入抗坏血酸、亚硒酸钠Na2SeO3,常温下磁力搅拌至完全溶解后转移至反应釜,150 ℃加热12 h;用去离子水洗涤三次,离心分离得到空心介孔硒化铋Bi2Se3 NPs;
(5)将步骤(4)得到的Bi2Se3 NPs重新悬浮于一定体积的水中,加入聚乙烯亚胺PEI水溶液,常温下磁力搅拌2 h,用去离子水洗涤三次,离心分离得到包裹PEI的空心介孔硒化铋Bi2Se3@PEI NPs;
(6)将步骤(5)得到的Bi2Se3@PEI NPs重新悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液PBS中,然后向溶液中加入葡萄糖氧化酶GOx溶液,常温下磁力搅拌10 h,用PBS洗涤三次,离心分离得到载酶的硒化铋纳米粒子Bi2Se3@GOx NPs,冷冻干燥后转移入橡胶塞瓶,抽真空后加入十四氟正己烷,超声5 min;再加入PBS后超声10 min,得到PFC@Bi2Se3/GOx NPs;向溶液充入氧气后得到充气粒子O2 @PFC@ Bi2Se3/GOx NPs。
进一步的,所述步骤(1)中的稀硝酸溶液的浓度为1 mol/L,所述步骤(1)中的混合溶液的硝酸铋浓度为7.5×10-2 mol/L。
进一步的,所述步骤(2)中的NaOH的浓度为2.7×10-3 mol/L, PVP的Mw为10000,PVP的浓度为2×10-5 mol/L,乙二醇的浓度为0.9 mol/L。
进一步的,所述步骤(3)中的离心的转速为8000 rpm,离心的时间为12 min。
进一步的,所述步骤(4)中的氧化铋、抗坏血酸和Na2SeO3的质量比为3:12:1;所述步骤(4)中的离心的转速为8000 rpm,离心的时间为12 min。
进一步的,所述步骤(5)中的PEI浓度为5 mg/mL,PEI与Bi2Se3 NPs的质量比为1.67:1;所述步骤(5)中的离心的转速为8000 rpm,离心的时间为12 min。
进一步的,所述步骤(6)中的葡萄糖氧化酶溶液浓度为1 mg/mL,葡萄糖氧化酶与Bi2Se3@PEI NPs的质量比为2:125;所述步骤(6)中的离心的转速为8000 rpm,离心的时间为12 min;所述步骤(6)中的Bi2Se3@GOx NPs与十四氟正己烷的质量:体积比为1 mg:10 µL。
本发明主要优点有:
针对目前纳米药物载体存在的问题,本项目创造性地提出能够实现多种治疗方法协同治疗同时又具有较好生物相容性的纳米药物递送平台。本项目创新性地设计制备了一种光照型多功能无机纳米粒子,将光热和饥饿治疗巧妙结合用于乳腺癌的联合治疗。同时,将运载氧气的全氟化碳与中空介孔材料结合在一起,构建出氧气释放的光照开关,使氧气只能在肿瘤部位释放,改善肿瘤缺氧环境,进一步提高饥饿治疗效果,同时促进光热治疗。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图:
图1为本发明实施例1中合成光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的流程图。
图2为本发明实施例1中光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的电镜图。
图3为本发明实施例1中光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的DLS及近红外光谱吸收图。
图4为本发明实施例1中光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的光热效果以及氧气释放图。
图5为本发明实施例1中光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子对4T1癌细胞的体外毒性图。
图6为本发明实施例1中光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子对乳腺癌小鼠模型的体内治疗效果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1 制备光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子
合成光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的流程图如图1所示,包括如下步骤:
(1)Bi2Se3 NPs的制备:首先将7.5×10-4 mol五水硝酸铋加入10 mL浓度为1 mol/L稀硝酸溶液中,常温下磁力搅拌均匀,使其完全溶解。在上述体系中加入2.7×10-3 mol/L氢氧化钠和2×10-5 mol/L表面修饰剂聚乙烯吡咯烷酮,再加入50 mL的乙二醇,常温下磁力搅拌至其溶解,然后转移至反应釜。150 ℃加热3 h,得到的乳白色溶液8000 rpm 离心12 min,去离子水洗涤三次,离心分离得到氧化铋纳米粒子。粒子重新悬浮于二次水中,加入抗坏血酸、亚硒酸钠,使氧化铋、抗坏血酸、亚硒酸钠的质量比为3:12:1,常温下磁力搅拌至完全溶解后转移至反应釜,150 ℃加热12 h。8000 rpm 离心12 min分离制备的硒化铋,用去离子水洗涤三次,离心分离得到空心介孔硒化铋纳米粒子(Bi2Se3 NPs)。将所得产物置于50 ℃真空干燥箱中干燥备用。
(2)Bi2Se3@GOx NPs的制备:称取硒化铋纳米粒子重悬于二次水,加入等体积浓度为5 mg/mL聚乙烯亚胺水溶液,PEI与Bi2Se3 NPs的质量比为1.67:1,常温下磁力搅拌2 h。8000 rpm 离心12 min分离包裹PEI的Bi2Se3 NPs(Bi2Se3@PEI NPs),用去离子水洗涤三次。将所得产物置于50 ℃真空干燥箱中干燥后,取Bi2Se3@PEI NPs分散到磷酸盐缓冲液(PBS)中,加入浓度为1 mol/L葡萄糖氧化酶溶液,葡萄糖氧化酶与Bi2Se3@PEI NPs的质量比为2:125。室温下磁力搅拌10 h,PBS洗涤三次,离心得到产物。将所得产物置于冷冻干燥机内干燥备用。
(3)O2@PFC@ Bi2Se3/GOx NPs的制备:向干燥后的纳米粒子中加入十四氟正己烷(PFC),Bi2Se3@GOx NPs与十四氟正己烷的质量:体积比为1 mg:10 µL。超声5 min,再加入PBS后超声10 min,最后向溶液充入氧气,得到充氧粒子(O2@PFC@ Bi2Se3/GOx NPs)。其电镜见图2, TEM和场发射结果显示Bi2Se3纳米颗粒(2a-2b)直径约为109.2±4.2 nm,Bi2Se3@GOx纳米颗粒(2c-2d)直径约为113.3 ±6.7 nm,表明成功合成出了空心介孔的硫化铜纳米颗粒。其DLS图见图3,结果显示Bi2Se3纳米颗粒(3a)水合粒径约为290.9 ± 7.2 nm,Bi2Se3@GOx纳米颗粒(3b)水合粒径约为421.2 ±9.5 nm。稍微大于TEM的测试结果。其点位图以及近红外光谱见图3,结果显示Bi2Se3、GOx的特征峰在Bi2Se3@GOx上均存在,说明Bi2Se3@GOx已成功的合成。红外段吸收较强,证明有良好的光热潜力。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(3f)结果证明葡萄糖氧化酶成功负载于硒化铋纳米颗粒上。图4是所得纳米颗粒在体外光照后温度变化和光热稳定性以及光照后释放氧气与葡萄糖氧化酶在体外耗氧情况,从图中可以看出,近红外照射后纳米颗粒温度逐渐升高(4a),并且循环稳定性较高(4b)。近红外照射的情况下氧气大量释放(4c),而葡萄糖氧化酶耗氧表明该方法制备的得到的硒化铋载酶纳米颗粒可以有效保持酶活性(4d)。图5是所得硒化铋载体的生物相容性(5a),不同处理组(5b)和所得未充氧纳米颗粒(5c)与充氧纳米颗粒(5d)对4T1肿瘤细胞6h的体外毒性示意图,从图中可以看出通过不同的处理,对4T1肿瘤细胞的毒性表现出一个很好的饥饿治疗与光热治疗联合效果。图6是所得纳米颗粒对BALB/c小鼠4T1肿瘤细胞模型的体内治疗效果的图,从图中可以看出通过不同的处理,肿瘤质量和体积差异较大(6c,6d),说明该方法合成的硒化铋复合纳米粒子对BALB/c小鼠4T1肿瘤细胞模型体现出了一个明显的治疗效果。小鼠体重在治疗期间较为稳定(6c)。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法,其特征在于:包含以下步骤:
(1)将五水硝酸铋Bi(NO3)3·5H2O加入稀硝酸溶液中,然后磁力搅拌至硝酸铋完全溶解,得到混合溶液;
(2)向步骤(1)得到的混合溶液中加入氢氧化钠NaOH、聚乙烯吡咯烷酮PVP和乙二醇溶液,磁力搅拌几分钟至溶解,得到混合溶液;
(3)将步骤(2)得到的混合溶液转移至反应釜中150 ℃加热3 h,得到的乳白色溶液用去离子水洗涤三次,离心分离得到氧化铋;
(4)向步骤(3)得到的氧化铋重新悬浮于一定体积的水中,加入抗坏血酸、亚硒酸钠Na2SeO3,常温下磁力搅拌至完全溶解后转移至反应釜,150 ℃加热12 h;用去离子水洗涤三次,离心分离得到空心介孔硒化铋Bi2Se3 NPs;
(5)将步骤(4)得到的Bi2Se3 NPs重新悬浮于一定体积的水中,加入聚乙烯亚胺PEI水溶液,常温下磁力搅拌2 h,用去离子水洗涤三次,离心分离得到包裹PEI的空心介孔硒化铋Bi2Se3@PEI NPs;
(6)将步骤(5)得到的Bi2Se3@PEI NPs重新悬浮于一定体积的磷酸盐缓冲液PBS中,然后向溶液中加入葡萄糖氧化酶GOx溶液,常温下磁力搅拌10 h,用PBS洗涤三次,离心分离得到载酶的硒化铋纳米粒子Bi2Se3@GOx NPs,冷冻干燥后转移入橡胶塞瓶,抽真空后加入十四氟正己烷,超声5 min;再加入PBS后超声10 min,得到PFC@Bi2Se3/GOx NPs;向溶液充入氧气后得到充气粒子O2 @PFC@ Bi2Se3/GOx NPs。
2.根据权利要求1所述的光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中的稀硝酸溶液的浓度为1 mol/L,所述步骤(1)中的混合溶液的硝酸铋浓度为7.5×10-2 mol/L。
3.根据权利要求1所述的光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中的混合溶液中的NaOH的浓度为2.7×10-3 mol/L, PVP的Mw为10000,PVP的浓度为2×10-5 mol/L,乙二醇的浓度为0.9 mol/L。
4.根据权利要求1所述的光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中的离心的转速为8000 rpm,离心的时间为12 min。
5.根据权利要求1所述的光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)中的氧化铋、抗坏血酸和Na2SeO3的质量比为3:12:1;所述步骤(4)中的离心的转速为8000 rpm,离心的时间为12 min。
6.根据权利要求1所述的光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法,其特征在于:所述步骤(5)中的PEI浓度为5 mg/mL,PEI与Bi2Se3 NPs的质量比为1.67:1;所述步骤(5)中的离心的转速为8000 rpm,离心的时间为12 min。
7.根据权利要求1所述的光照释放氧气的载酶硒化铋纳米粒子的制备方法,其特征在于:所述步骤(6)中的葡萄糖氧化酶溶液浓度为1 mg/mL,葡萄糖氧化酶与Bi2Se3@PEI NPs的质量比为2:125;所述步骤(6)中的离心的转速为8000 rpm,离心的时间为12 min;所述步骤(6)中的Bi2Se3@GOx NPs与十四氟正己烷的质量:体积比为1 mg:10 µL。
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