CN110199027B

CN110199027B - 无细胞蛋白质合成系统

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Publication number: CN110199027B
Application number: CN201880007966.4A
Authority: CN
Inventors: 马提亚·邦特魯; 西蒙·沃格尔; 斯蒂芬·席勒伯格
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: DK3354737T3; EP3574100B1; US20190380330A1; US11317623B2; EP3574100A1; JP7030137B2; CN110199027A; DK3574100T3; JP2020506721A; EP3354737B1; CA3049825C; WO2018138195A1; CA3049825A1; EP3354737A1; AR110849A1

Abstract

本文提供的技术涉及用于无细胞蛋白质合成的新方法和系统，特别涉及适合于在用于短期或长期储存的冷冻之前和之后的蛋白质合成的无细胞蛋白质合成系统，其中所述系统包含冷冻保护剂。

Description

无细胞蛋白质合成系统

技术领域

本公开内容涉及用于无细胞蛋白质合成的新方法和系统，特别涉及适合于在用于短期或长期储存的冷冻之前和之后的蛋白质合成的无细胞蛋白质合成系统，其中所述系统包含冷冻保护剂。

背景技术

对于新的治疗用蛋白质、技术酶、蛋白质工程和功能基因组学的需求不断增长，需要快速且有效的蛋白质生产和筛选平台。

无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis，CFPS)这一新兴技术可以帮助满足这种需求(Carlson等，2012)。基于粗裂解物的CFPS系统相对于体内系统提供了诸多优势，并在蛋白质工程、生物制药产品开发和后基因组研究中提供广泛应用。

与基于细胞的表达相比，CFPS提供诸如更短处理时间以及直接控制和监测反应条件的优点。PCR产物可以直接用于同时表达多种蛋白质，而无需繁琐的克隆和转化步骤。CFPS平台允许添加促进蛋白质折叠或非天然氨基酸掺入的辅助因子(Albayrak和Swartz，2013；White等，2013)。它们还有利于表达无法在活细胞中产生的细胞毒性蛋白质。

粗裂解物含有用于翻译、蛋白质折叠和能量代谢所必需的组分，因此为它们提供氨基酸、能量底物、核苷酸和盐以允许可以合成由RNA模板编码的几乎任何蛋白质。在额外地补充有适当RNA聚合酶的偶联转录/翻译系统中，也可以使用DNA模板。

如上所述，与传统的基于细胞的表达方法相比，CFPS提供了更短的处理时间、有限的蛋白质水解和表达毒性蛋白质或者在限定位置含有特定化学基团或非天然氨基酸的蛋白质的能力。此外，系统的开放性使得可以直接控制和监测反应。尽管化学合成允许快速且受控地合成长度<40个残基的肽，但这对于较大多肽的生产而言并不是经济上可行的方法。

最广泛使用的无细胞系统基于大肠杆菌提取物(Escherichia coli extract，ECE)、小麦胚芽提取物(wheat germ extract，WGE)、兔网织红细胞裂解物(rabbitreticulocytes lysate，RLL)和昆虫细胞提取物(insect cell extract，ICE)。其含有以不同方式增强蛋白质表达、折叠和修饰的多种细胞组分和辅因子。因此，最适合的系统将取决于靶蛋白的来源和生物化学性质。ECE的制备简单且廉价，并且通常实现最高的蛋白质产量，在间歇(batch)反应中产量为每毫升数百微克至毫克(取决于靶蛋白)。

相反，真核系统的生产力较低并且提取物制备更费力，但可以更有效地生产复杂的蛋白质并支持延长的翻译后修饰。WGE通常每毫升产生数十微克至毫克的重组蛋白质，这取决于蛋白质和反应形式，但提取物制备需要4-5天，并且来自小麦种子的提取物的产量低。RLL系统的产量通常比WGE低两个数量级，并且从草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)制备的ICE可以实现高达50μg/mL的产量。

最近，已经描述了另外两种基于CHO细胞和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的真核系统。CHO提取物产生高达50μg/mL的活性萤火虫萤光素酶，但发酵培养基非常昂贵。相反，酵母提取物的制备是廉价的，但该系统仅产生8μg/mL低靶蛋白水平的活性萤火虫萤光素酶。因此，目前无细胞系统的缺点产生了对于可以大量地快速制备的高产量真核无细胞系统的需求。

基于烟草BY-2细胞的非偶联CFPS系统已在文献中描述(Buntru等，Buntru等，BMCBiotechnology 2014,14:37)。此外，在现有技术中还描述了基于烟草BY-2细胞裂解物(BY-2 cell lysate，BYL)的高度有效偶联的无细胞转录-翻译系统(Buntru等，Biotechnologyand Bioengineering,Vol.112,No.5,2015,867-878)。

然而，现有的无细胞蛋白质合成系统由于其高昂的建立成本而导致其广泛使用和应用受到了限制。高昂成本的问题来自于复杂且高成本的细胞提取物制备程序，所述细胞提取物用作用于无细胞蛋白质合成的催化剂。此外，裂解物或提取物的制备通常很耗时，这使得为每个体外翻译反应新制备裂解物或提取物在经济上不可行。

因此，本公开内容的一个目的在于提供不具有现有技术的缺点的用于体外蛋白质合成的改进方法和无细胞蛋白质合成系统。

发明内容

本公开内容总体上涉及无细胞蛋白质合成(也称为体外蛋白质合成或缩写为CFPS)的冷冻保存的领域。更具体地，本公开内容涉及利用所谓的冷冻保护剂(例如糖、DMSO、氨基酸、相容性溶质)来处理真核细胞裂解物(或提取物)以在低于冰点(freezingpoint)的短期和长期储存期间维持细胞裂解物的代谢活性的方法和系统。

在第一方面中，本公开内容涉及适合于在用于短期或长期储存的冷冻之前和之后的蛋白质合成的新型无细胞蛋白质合成系统，其中所述系统包含冷冻保护剂。

特别地，冷冻保护剂是非还原糖海藻糖或二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，特别地海藻糖的浓度在0.5至10％w/v之间，特别地在1.0至5.0％w/v之间，特别地在1.25至2.5％w/v之间的范围内，并且DMSO的浓度在0.8或8％之间，特别地在1至4％v/v之间的范围内。

本公开内容在第二方面中涉及用于无细胞蛋白质合成的另一些新方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)将根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统冷冻至低于-50℃、低于-60℃、低于-70℃、低于-80℃、低于-90℃或低于-196℃的温度，

b)储存所述经冷冻的无细胞蛋白质合成系统，

c)将所述无细胞蛋白质合成系统解冻，

d)通过使用所述无细胞蛋白质合成系统和核酸模板在体外合成蛋白质。

在第三方面中，本公开内容涉及保存无细胞蛋白质合成系统的方法，其包括以下步骤：

a)使无细胞蛋白质合成系统与冷冻保护剂接触，以获得根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统，

b)将所述无细胞蛋白质合成系统在与所述冷冻保护剂接触下进行冷冻。

附图说明

图1是示出了在使用冷冻前和在液氮中冷冻并在-80℃下储存一天后的烟草BY-2细胞裂解物(BYL)的偶联无细胞转录-翻译反应中的eYFP的产量的图。

具体实施方式

本发明的一个优点在于根据本公开内容的无细胞翻译系统可以在使用前进行冷冻和储存。因此，可以生产、冷冻和储存大量的细胞提取物/裂解物，而无需在使用前新鲜制备。建立了来源于不同原核和真核细胞如酵母、哺乳动物或植物细胞的裂解物。裂解物或提取物制备方法通常是耗时的，这使得为每个体外翻译反应新鲜制备裂解物或提取物在经济上不可行。因此，这样的裂解物/提取物制备物的储存和长期稳定性是高度感兴趣的。

本公开内容描述了无细胞裂解物的冷冻，特别是用于长期储存的无细胞裂解物冷冻。在一个有利的实施方案中，最近开发的基于烟草BY-2细胞裂解物(BYL)的无细胞系统(Buntru等，BMC Biotechnology 2014,14:37和Buntru等，Biotechnology andBioengineering,Vol.112,No.5,2015,867-878)显示，与冷冻前新鲜制备的裂解物相比，在液氮中冷冻、在-80℃下储存并且解冻后，蛋白质翻译活性严重降低。为避免活性损失的问题并在低温保存期间保持裂解物特性，某些冷冻保护剂如DMSO、氨基酸和糖类如海藻糖的加入使得在冻融循环后提高和保持了无细胞裂解物的体外翻译能力。

如上所述，本公开内容涉及适合于在用于短期或长期储存的冷冻之前和之后的蛋白质合成的无细胞蛋白质合成系统，其中所述系统包含冷冻保护剂。

无细胞蛋白质合成(也称为体外蛋白质合成或缩写为CFPS)是在没有使用活细胞的情况下使用生物机制(biological machinery)的蛋白质生产。体外蛋白质合成环境不受维持细胞活力所必需的细胞壁或稳态条件限制。因此，CFPS能够直接接近(access)和控制翻译环境，这对于许多应用是有利的，所述应用包括蛋白质生产的优化、蛋白质复合物的优化、研究蛋白质合成、掺入非天然氨基酸、高通量筛选以及合成生物学。

无细胞蛋白质合成(CFPS)系统已成为用于蛋白质表达的强大技术。突出的应用包括药物蛋白和疫苗的生产(Goerke,A.R.等，"Development of cell-free proteinsynthesis platforms for disulfide bonded proteins,"Biotechnol.Bioeng.99,351-367(2008)；Kanter,G.等"Cell-free production of scFv fusion proteins:Anefficient approach for personalized lymphoma vaccines,"Blood 109,3393-3399,(2007)；Stech,M.等，"Production of functional antibody fragments in a vesicle-based eukaryotic cell-free translation system,"J.Biotechnol.164,220-231(2012)；Yang,J.等，"Rapid expression of vaccine proteins for B-cell lymphoma ina cell-free system,"Biotechnol.Bioeng.89,503-511(2005)；Yin,G.等，"Aglycosylated antibodies and antibody fragments produced in a scalable invitro transcription-translation system,"MAbs 4,217-225(2012)；Zawada,J.F.等，"Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a newapproach for shortening protein production development timelines,"Biotechnol.Bioeng.108,1570-1578(2011))。

这样的系统能够实现难以在体内产生的蛋白质的体外表达，以及用于蛋白质演化、功能基因组学和结构研究的蛋白质文库的快速和高通量产生(Madin,K.等，"A highlyefficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheatembryos:Plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,559-564(2000)；Takai,K等，"Practical cell-freeprotein synthesis system using purified wheat embryos,"Nat.Protoc.5,227-238(2010))。

需要两种基本组分来完成体外蛋白质表达：(1)编码靶蛋白质的遗传模板(mRNA或DNA)和(2)含有必需的转录和翻译分子机制的反应溶液。细胞提取物(或无细胞蛋白质合成(CFPS)系统提供反应溶液的全部或大部分分子，包括：

-用于mRNA转录的RNA聚合酶，

-用于多肽翻译的核糖体，

-tRNA和氨基酸，

-酶促辅因子和能量源，

用于适当蛋白质折叠所必需的细胞成分。

细胞裂解物提供翻译所需的酶和构建单元的正确组成和比例(通常，还必须添加能量源和氨基酸以维持合成)。除去细胞膜以仅留下细胞的胞质和细胞器组分(因此称为“无细胞提取物/裂解物”)。开发用于无细胞蛋白质表达的第一类裂解物来源于原核生物体。最近，已开发出基于昆虫细胞、哺乳动物细胞和人细胞的提取物的系统，并且该系统可商购获得。

根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统包括生物提取物/裂解物，如原核或真核细胞裂解物。用于蛋白质转录/翻译的反应混合物将包含用于产生大分子的模板，例如DNA、mRNA等；用于要合成的大分子的单体，例如氨基酸、核苷酸等，以及这样的合成所需的辅因子、酶和其他试剂，例如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子以及能量再生系统，例如磷酸肌酸/肌酸激酶等。这样的合成反应系统在本领域中是公知的，并且已在文献中描述。用于多肽合成的许多反应化学可以用于本发明的方法中。例如，反应化学描述于2002年1月8日授权的美国专利No.6,337,191和2001年1月2日授权的美国专利No.6,168,931中。

无细胞表达系统可以支持自DNA模板(转录和翻译)或mRNA模板(仅翻译)的蛋白质合成。原则上，无细胞表达系统可以设计为作为两个分别的顺序反应(非偶联)完成转录和翻译步骤，或作为一个反应(偶联)同时地完成转录和翻译步骤。

基于原核大肠杆菌(Escherichia coli)提取物的无细胞系统已经迅速发展(对于综述，参见Carlson,ED等，“Cell-free protein synthesis:Applications come of age”,Biotechnol.Adv.30,1185-1194，(2012))。出于本发明的目的，任何原核或真核细胞裂解物均可用作无细胞蛋白质合成系统。作为无细胞蛋白质合成系统的原核细胞裂解物，Zubay，G.(1973，Ann.Rev.Genet.Vol 7,p.267)描述了大肠杆菌S30无细胞提取物。当将待表达的基因克隆入含有适当的原核调控序列如启动子和核糖体结合位点的载体中时，可以使用这些。

如果在向提取物中添加DNA之后转录和翻译同时发生，则认为无细胞系统是“偶联的”。在一些有利的实施方案中，根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统是偶联的无细胞蛋白质合成系统。

然而，由于许多原因，真核无细胞裂解物是优选的表达系统，至少部分地因为它们保留了多种翻译后加工活性。例如，在向无细胞小麦胚芽提取物中添加犬微粒体膜的情况下，可以检查加工事件如信号肽切割和核心糖基化。真核细胞裂解物还支持广泛种类的病毒和另一些原核RNA以及真核mRNA的体外翻译。

先前开发的主要真核CFPS平台包括由小麦胚芽提取物(WGE)制成的系统(Goshima,N.等，"Human protein factory for converting the transcriptome into anin vitro-expressed proteome,"Nat.Methods 5,1011-1017(2008)；Hoffmann,M.等，Biotechnol Annu Rev Vol.10,1-30中(Elsevier,2004)；Takai等，(2010))、兔网织红细胞裂解物(RRL)(Jackson,R.J.等，Methods Enzymol Vol.Vol.96中(编辑，Becca Fleischer,Sidney Fleischer)Ch.4,50-74(Academic Press,1983))；昆虫细胞提取物(ICE)(Ezure,T等，"A cell-free protein synthesis system from insect cells,"MethodsMol.Biol.607,31-42(2010)；Kubick,S等，Current Topics in Membranes中,Vol.63(编辑Larry DeLucas)25-49(Academic Press,2009)；Tarui,H.等，"Establishment andcharacterization of cell-free translation/glycosylation in insect cell[Spodoptera frugiperda 21)extract prepared with high pressure treatment,"Appl.Microbiol.Biotechnol.55,446-453(2001))；利什曼原虫(Leishmania tarentolae)提取物(Kovtun,O.等，"Towards the construction of expressed proteomes using aLeishmania tarentolae based cell-free expression system,"PLoS One 5,el4388(2010)；Mureev,S.等，"Species-independent translational leaders facilitatecell-free expression,"Nat.Biotechnol.27,747-752(2009))；以及HeLa和杂交瘤细胞提取物(Mikami,S.等，Cell-Free Protein Production Vol.607 Methods in MolecularBiology中(编辑Yaeta Endo,Kazuyuki Takai,&Takuya Ueda)Ch.5,43-52(Humana Press,2010))。所有这些真核裂解物都受到研究人员的欢迎，并且是广泛可用的。

根据本公开内容，用作无细胞蛋白质合成系统的细胞提取物可以通过包括以下顺序步骤的方法制备：细胞裂解、高速离心(30,000RCF)、预孵育、透析和低速离心(4,000RCF)。在本公开内容中使用的细胞优选选自：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、小麦胚芽、稻胚、大麦胚芽、CHO细胞、杂交瘤细胞和网织红细胞，但不限于此。

在本公开内容的一个有利实施方案中，烟草BY-2细胞裂解物是优选的。这种烟草BY-2细胞裂解物可以例如通过由Buntru等，BMC Biotechnology 2014,14:37和Buntru等，Biotechnology and Bioengineering,Vol.112,No.5,2015,867-878(参见实施例)描述的方法制备。

根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统包含冷冻保护剂。冷冻保护剂是用于使蛋白质和膜稳定化以抵抗冷冻诱导的应激(即由于冰形成)的抗冻化合物或抗冻蛋白(antifreeze protein，AFP)。冷冻保护剂是减少与冷冻保存相关的损害的化学物质。冷冻保护剂的实例是氨基酸或其衍生物、糖如二糖或寡糖或其衍生物、肌氨酸、脯氨酸、甜菜碱、四氢嘧啶(ectoine)、羟基四氢嘧啶(hydroxyectoine)、N-乙酰基赖氨酸、糖基甘油酸酯，以及乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、PEG或其混合物。

根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统中包含的冷冻保护剂可选自由以下各项组成的组：乙酰胺、琼脂糖、藻酸盐、丙氨酸、白蛋白、乙酸铵、抗冻蛋白、甜菜碱、丁二醇、硫酸软骨素、氯仿、胆碱、环己二醇、环己二酮、环己三醇、葡聚糖、二甘醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、赤藓糖醇、乙醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、甲酰胺、葡萄糖、甘油、甘油磷酸酯、甘油单乙酸酯、甘氨酸、糖蛋白、羟乙基淀粉、肌醇、乳糖、氯化镁、硫酸镁、麦芽糖、甘露糖醇、甘露糖、甲醇、甲氧基丙二醇、甲基乙酰胺、甲基甲酰胺、甲基脲(methyl ureas)、甲基葡萄糖、甲基甘油、苯酚、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、脯氨酸、丙二醇、吡啶N-氧化物、棉子糖、核糖、丝氨酸、溴化钠、氯化钠、碘化钠、硝酸钠、亚硝酸钠、硫酸钠、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、三甘醇、乙酸三甲胺、尿素、缬氨酸、木糖及其混合物。

在一些有利的实施方案中，根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统中包含的冷冻保护剂是非还原糖，如海藻糖和/或二甲亚砜(DMSO)。在一些有利的实施方案中，海藻糖的浓度令人惊讶地在0.5至10％w/v之间的低浓度范围内，特别地在1至5％w/v之间的范围内，特别地在1,25至2,5％w/v之间的范围内。当使用DMSO作为冷冻保护剂时，DMSO的浓度在0.8或8％之间的范围内，特别地在1至4％v/v之间的范围内。

在一个优选的实施方案中，冷冻保护剂是海藻糖或DMSO。在冷冻和解冻程序后，添加了冷冻保护剂的裂解物显示出高多达21倍的翻译活性，并且保持在冷冻前新鲜制备的裂解物约100％的活性(图1)。

因此，向新鲜制备的真核细胞裂解物，特别是烟草BY-2裂解物添加冷冻保护物质对于低温保存和解冻后裂解物功能性保持而言是必不可少的。当需要裂解物的功能性细胞器如微粒体和其他囊泡结构时，这一点尤其重要。

在本公开内容的有利实施方案中，基于烟草BY-2细胞裂解物(BYL)的无细胞系统(Buntru等，2014；2015)显示，与冷冻前新鲜制备的裂解物相比，在-80℃下冷冻并解冻后的蛋白质翻译活性极大降低。为避免活性损失问题并在低温保存期间保持裂解物特性，我们发现通过添加某些冷冻保护剂如DMSO、氨基酸和糖类(优选海藻糖)，我们可以提高和维持无细胞裂解物在冻融循环后的体外翻译能力。

除了海藻糖之外，应该也可用于BYL的低温保存的化合物包括另一些糖和糖的组合；其他代谢活化剂和抑制剂；以及其他不可渗透的保护性或相容性渗透剂(osmolyte)，如二糖或寡糖、肌氨酸、脯氨酸、甜菜碱、四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、N-乙酰基赖氨酸、糖基甘油酸酯，以及乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、PEG及衍生物。海藻糖是优选的冷冻保护剂，因为它是非还原糖，这意味着它不容易与蛋白质的胺基团发生反应，这种反应可为有害的。

在有利的实施方案中，将根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统冷冻(不是冻干(freeze-dried))，即该无细胞蛋白质合成系统具有低于-50℃、低于-60℃、低于-70℃、低于-80℃、低于-90℃或低于-196℃的温度。

此外，本公开内容涉及根据本公开内容的用于无细胞蛋白质合成的方法，其包括以下步骤：

b)储存所述经冷冻的无细胞蛋白质合成系统，

c)将所述无细胞蛋白质合成系统解冻，

如上所述，将根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统冷冻，即该无细胞蛋白质合成系统具有低于-50℃、低于-60℃、低于-70℃、低于-80℃、低于-90℃或低于-196℃的温度。

用于冷冻无细胞蛋白质合成系统的方法包括通过将裂解物等分试样(在聚丙烯管中)浸入至-196℃的液氮中持续5分钟，然后在-80℃下或在-196℃的液氮下储存而将新鲜制备并等分的裂解物制备物进行急速冷冻(shock freezing)。替选地，可以将新鲜制备并等分的裂解物制备物直接储存在-80℃。

此外，根据本公开内容的方法包括将用于无细胞蛋白质合成的细胞提取物储存在-20至-196℃或更低的温度下。这可以是短期储存，或者优选地是超过几天、几周、几个月或几年的长期储存。

令人惊讶的是，本发明人发现，在使用根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统合成蛋白质之前不必除去冷冻保护剂。

在有利的实施方案中，无细胞蛋白质合成系统在使用(即合成蛋白质)前在室温下解冻。优选地，合成步骤(d)在20至25℃的温度下进行。

如本文所用的，“表达模板”或“核酸模板”是指用作用于转录至少一种可被翻译成多肽或蛋白质的RNA的底物的核酸。表达模板包括由DNA或RNA组成的核酸。用于表达模板的核酸的合适DNA来源包括可以转化成cDNA的基因组DNA、cDNA和RNA。基因组DNA、cDNA和RNA可以来自任何生物来源，例如组织样品、活组织检查物、拭子、痰、血液样品、粪便样品、尿液样品、刮擦物等。基因组DNA、cDNA和RNA可以来自宿主细胞或病毒来源以及来自任何物种，包括现存和灭绝的生物。如本文所用的，“表达模板”、“核酸模板”和“转录模板”具有相同的含义并可互换使用。

如本文所用的，“翻译模板”是指来自表达模板的RNA转录产物，其可被核糖体用于合成多肽或蛋白质。如本文所用的，术语“核酸”和“寡核苷酸”是指多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)，并且是指任何其他类型的作为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的多核苷酸。在术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”之间的长度方面没有意图的区别，并且这些术语可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。为了用于本发明，寡核苷酸还可以包含其中碱基、糖或磷酸酯骨架被修饰的核苷酸类似物以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸类似物。

在一些有利的实施方案中，在根据本公开内容的方法中，在反应混合物存在下、特别是在CFPS反应混合物中实现蛋白质合成。如本文所用的，术语“反应混合物”是指含有实施给定反应所必需的试剂的溶液。“CFPS反应混合物”通常含有粗制或部分纯化的原核或真核细胞提取物/裂解物、DNA转录模板(或RNA翻译模板)以及用于促进自DNA转录模板(或RNA翻译模板)的无细胞蛋白质合成的合适反应缓冲液。在一些实施方案中，CFPS反应混合物可以包括外源RNA翻译模板。在另一些实施方案中，CFPS反应混合物可以包括编码开放阅读框的DNA表达模板，所述开放阅读框可操作地连接至DNA依赖性RNA聚合酶的启动子元件。在这些其他方面，CFPS反应混合物还可以包括DNA依赖性RNA聚合酶，以指导编码开放阅读框的RNA翻译模板的转录。在这些其他方面，额外的NTP和二价阳离子辅因子也可以包括在CFPS反应混合物中。如果反应混合物含有使反应能够实现所需的所有试剂，则将其称为完全的，而如果反应混合物仅含有必要试剂的子集，则将其称为不完全的。

本领域普通技术人员将理解，为了方便、储存稳定或者允许对组分浓度进行应用依赖性调整，反应组分常规地作为单独的溶液储存，每种溶液含有全部组分的子集，并且反应组分在反应前合并以形成完全的反应混合物。此外，本领域普通技术人员将理解，将反应组分分开包装用于商业化，并且有用的商业试剂盒可包含本发明反应组分的任何子集。

以下描述了通过使用所述无细胞蛋白质合成系统在体外合成蛋白质的典型设置。将裂解物等分试样从-80℃储存取出并在室温下解冻。为了开始蛋白质表达，将核酸模板添加至裂解物—在偶联转录-翻译反应的情况下为DNA并且在非偶联转录-翻译反应的情况下为mRNA—并且加入由HEPES缓冲液、谷氨酸镁、谷氨酸钾、NTP(用于偶联转录-翻译反应的ATP、GTP、CTP和UTP，用于非偶联转录-翻译反应的ATP和GTP)、磷酸肌酸、肌酸激酶和T7 RNA聚合酶(仅用于偶联转录-翻译反应)构成的反应混合物。偶联和非偶联的转录-翻译反应均在热混合器中在25℃和700rpm下进行18h。基于靶蛋白的性质，可以通过不同方法例如荧光测量、酶测定和SDS PAGE来分析所合成的蛋白质。

本公开内容的其他实施方案涉及保存无细胞蛋白质合成系统的方法，所述方法包括以下步骤：

a)利用冷冻保护剂制备无细胞蛋白质合成系统以获得根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统，

实施例

在本公开内容的一个实施方案中，制备如在Buntru等(2015)中所描述的BYL。

烟草BY-2裂解物(BYL)的制备

根据Komoda等(2004)和Gursinsky等(2009)的描述，在有重大改进的情况下，由脱液泡的BY-2原生质体制备裂解物。在发酵培养基中，直接通过用3.5％(v/v)Rohament CL和0.2％(v/v)Rohapect UF(均来自AB Enzymes，Darmstadt，Germany)处理细胞，由处于连续发酵的指数生长期的细胞制备原生质体。通过加入360mM甘露糖醇来调节培养基的渗透压。将得到的原生质体分层到在0.7M甘露糖醇、20mM MgCl₂和5mM PIPES-KOH(pH 7.0)中的不连续Percoll梯度上，该梯度含有(从下至上)70％(v/v，3ml)、40％(v/v，5ml)、30％(v/v，3ml)、15％(v/v，3ml)和0％(3ml)Percoll(GE Healthcare，Munich，Germany)。在浮桶式转头中在25℃下以6,800g离心1小时后，从40-70％(v/v)Percoll溶液界面回收脱液泡的原生质体。将脱液泡的原生质体悬浮在三体积的TR缓冲液(30mM HEPES-KOH(pH 7.4)，60mM谷氨酸钾，0.5mM谷氨酸镁，2mM DTT)中，其中每50ml的完全无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)补充一片并使用利用Dounce组织研磨机(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)的30次冲击进行破碎。通过在4℃下以500g离心10分钟来除去细胞核和未破碎的细胞。

将不同量的冷冻保护化合物加入至上清液的等分试样中，如浓度为1.25％、2.5％和5％的海藻糖，浓度为1％、2％和4％的DMSO以及浓度为0.5％的氨基酸脯氨酸。

将这些新鲜制备的等分试样中的一些直接用于利用编码荧光报告蛋白eYFP的质粒模板的偶联体外转录-翻译反应(Buntru等，2015)。将剩余的等分试样在液氮中急速冷冻并储存在-80℃。在-80℃下储存一天后，将等分试样在室温下解冻，以在先前提及的相同条件下重复该偶联体外转录-翻译反应。

BYL在间歇反应中的体外翻译活性

通过使用质粒pIVEX_GAAAGA_ω_Strep-eYFP作为模板产生报告蛋白eYFP来研究BYL的性能。偶联的转录-翻译反应在培养箱摇床(Kuehner，Basel，Switzerland)中在25℃和500rpm下在50μl等分试样中进行16小时。标准反应包含40％(v/v)BYL、40mM HEPES-KOH(pH 7.8)、8.5mM谷氨酸镁、3mM ATP、1.2mM GTP、1.2mM CTP、1.2mM UTP、30mM磷酸肌酸、0.1μg/μL肌酸激酶、80ng/μl载体DNA和50ng/μl自制T7RNA聚合酶。

使用具有485/20nm激发和528/20nm发射滤光器的Synergy HT多模式微板读数器(Biotek，Bad Friedrichshall，Germany)定量来自eYFP的荧光信号。通过在没有DNA模板的BYL转录-翻译反应中，基于不同浓度的eYFP产生标准曲线来确定eYFP的量。eYFP标准使用BYL转录-翻译系统产生并通过

纯化。使用比色测定法(Bradford，1976)测定纯化的eYFP的浓度。

结果

在冷冻和解冻程序后，添加了冷冻保护剂的裂解物显示出多达21倍更高的翻译活性，并且保持在冷冻前新鲜制备的裂解物的约100％的活性(图1)。

图1示出了在使用冷冻之前和在液氮中急速冷冻并在-80℃下储存一天之后的烟草BY-2细胞裂解物(BYL)的偶联无细胞转录-翻译反应中的eYFP的产量。裂解物的等分试样补充有不同量的冷冻保护剂(CP)海藻糖、DMSO和脯氨酸。使用质粒pIVEX_GAAAGA_ω_Strep-eYFP作为模板，在25℃和500rpm下反应16小时。使用具有485/20nm激发和528/20nm发射滤光器的荧光读数器定量来自eYFP的荧光信号。通过在没有DNA模板的BYL转录-翻译反应中，基于不同浓度的eYFP产生标准曲线来确定eYFP的量。eYFP标准使用BYL转录-翻译系统产生并通过

纯化。使用比色测定法测定纯化的eYFP的浓度。数据代表各自三次独立转录-翻译实验的平均值和标准偏差。

文献

Bradford MM.1976.A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding.Anal Biochem 72：248-54.

Buntru M，Vogel S，Spiegel H，Schillberg S.2014.Tobacco BY-2 cell-freelysate：an alternative and highly-productive plant-based in vitro translationsystem.BMC Biotechnol.14：37.doi：10.1186/1472-6750-14-37.

Buntru M，Vogel S，Stoff K，Spiegel H，Schillberg S.2015.A VersatileCoupled Cell-Free Transcription-Translation System Based on Tobacco BY-2 CellLysate.Biotechnol.Bioeng.112(5)：867-78.doi：10.1002/bit.25502.

Gursinsky T，Schulz B，Behrens SE.2009.Replication of Tomato bushystunt virus RNA in a plant in vitro system.Virology 390(2)：250-60.

Hodgman CE，Jewett MC.2013.Optimized extract preparation methods andreaction conditions for improved yeast cell-free protein synthesis.BiotechnolBioeng 110(10)：2643-54.

Komoda K，Naito S，Ishikawa M.2004.Replication of plant RNA virusgenomes in a cell-free extract of evacuolated plant protoplasts.Proc NatlAcad Sci USA 101(7)：1863-1867.

Claims

1.一种无细胞蛋白质合成系统，其适合于在用于短期或长期储存的冷冻之前和之后的蛋白质合成，其中所述系统包含冷冻保护剂，其中所述无细胞蛋白质合成系统是烟草BY-2细胞裂解物；

其中所述冷冻保护剂是非还原糖海藻糖或二甲亚砜，其中所述海藻糖的浓度在1.25至2.5% w/v之间的范围内，并且所述二甲亚砜的浓度在1至4% v/v之间的范围内。

2.根据权利要求1中所述的无细胞蛋白质合成系统，其中所述冷冻保护剂选自：二糖或寡糖、肌氨酸、脯氨酸、甜菜碱、四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、N-乙酰基赖氨酸、糖基甘油酸酯，以及乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、PEG及其混合物。

3.根据权利要求1中所述的无细胞蛋白质合成系统，其中所述冷冻保护剂选自：乙酰胺、琼脂糖、藻酸盐、丙氨酸、白蛋白、乙酸铵、抗冻蛋白、甜菜碱、丁二醇、硫酸软骨素、氯仿、胆碱、环己二醇、环己二酮、环己三醇、葡聚糖、二甘醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、赤藓糖醇、乙醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、甲酰胺、葡萄糖、甘油、甘油磷酸酯、单乙酸甘油酯、甘氨酸、糖蛋白、羟乙基淀粉、肌醇、乳糖、氯化镁、硫酸镁、麦芽糖、甘露糖醇、甘露糖、甲醇、甲氧基丙二醇、甲基乙酰胺、甲基甲酰胺、甲基脲、甲基葡萄糖、甲基甘油、苯酚、普朗尼克多元醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、脯氨酸、丙二醇、吡啶N-氧化物、棉子糖、核糖、丝氨酸、溴化钠、氯化钠、碘化钠、硝酸钠、亚硝酸钠、硫酸钠、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、三甘醇、乙酸三甲胺、尿素、缬氨酸、木糖及其混合物。

4.根据权利要求1中所述的无细胞蛋白质合成系统，其中所述无细胞蛋白质合成系统是冷冻的。

5.根据权利要求1中所述的无细胞蛋白质合成系统，其中在低于-50°C、低于-60°C、低于-70°C、低于-80°C、低于-90°C或低于-196°C的温度下储存所述无细胞蛋白质合成系统。

6.一种用于无细胞蛋白质合成的方法，所述方法包括以下步骤：

a）将根据权利要求1至5中任一项所述的无细胞蛋白质合成系统冷冻至低于-50°C、低于-60°C、低于-70°C、低于-80°C、低于-90°C或低于-196°C的温度，

b）储存经冷冻的所述无细胞蛋白质合成系统，

c）将所述无细胞蛋白质合成系统解冻，

d）通过使用所述无细胞蛋白质合成系统和核酸模板在体外合成蛋白质。

7.根据权利要求6中所述的方法，其中所述冷冻保护剂在合成蛋白质之前未被除去。

8.根据权利要求6中所述的方法，其中在使用前于室温下解冻所述无细胞蛋白质合成系统。

9.一种保存无细胞蛋白质合成系统的方法，其包括以下步骤：

a）使无细胞蛋白质合成系统与冷冻保护剂接触，以获得根据权利要求1至5中任一项的所述无细胞蛋白质合成系统，

b）将所述无细胞蛋白质合成系统在与所述冷冻保护剂接触下进行冷冻。

10.根据权利要求9中所述的方法，其中通过急速冷冻来冷冻所述无细胞蛋白质合成系统。

11.根据权利要求9中所述的方法，其中将所述无细胞蛋白质合成系统冷冻至低于-50°C、低于-60°C、低于-70°C、低于-80°C、低于-90°C或低于-196°C的温度。

12.根据权利要求9中所述的方法，其中在使用前于室温下解冻经冷冻的所述无细胞蛋白质合成系统。