CN110193019B - 具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物及其应用，它由下列重量份数的原料制成：人参皂苷Rg10.1～10份，远志口山酮III 0.1～10份，α‑细辛醚0.1～10份，茯苓酸0.1～10份。本发明提供的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物，具有改善动物抑郁样行为，增强神经退行性痴呆症模型动物学习与记忆能力的作用，可用于制备抗抑郁与抗老年痴呆症的药物。

Description

具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种组合物，特别是涉及一种具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物及其临床上应用。
背景技术
抑郁症，是一种以显著而持久的心境低落为主要临床特征的病症，同时伴有失眠，记忆缺失，饮食失调等症状，严重者可出现自杀念头和行为。据世界卫生组织统计，抑郁症已成为世界第4大疾患，并且预计到2020年，可能成为仅次于冠心病的第二大疾病。抑郁症患者不能适应社会，注意力下降，是自杀的高危人群。其具体发病机制主要有如下假说：(1)单胺类神经递质调控紊乱假说：神经元突触间隙内神经递质5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺、重摄取增加，含量降低，神经传导阻滞；(2)神经生长营养因子调控失常假说：抑郁症患者海马与前额皮质部位神经生长因子(NGF)与脑源性神经营养因子(BDNF)缺失，神经细胞萎缩、神经可塑性受损；(3)神经内分泌失调假说：抑郁症患者下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴持续激活，皮质醇释放增加，作用于海马神经元的糖皮质激素受体，最终损害海马组织，导致神经元与胶质细胞受损，影响神经可塑性；(4)中枢神经炎症假说：抑郁症患者脑中炎症因子IL-1β，IL-6，TNF-α表达增加，激活HPA功能亢进，加剧抑郁。此外，炎性因子会激活色氨酸犬尿酸通路，导致去甲肾上腺素与5-羟色胺过度降解。同时，通路激活产生的喹啉酸则会激动NMDA受体，引起神经兴奋毒性，损伤海马神经元。显然，抑郁症是一种十分复杂的情志疾病，涉及多种发病机理。而现有的治疗抑郁症的药物，包括：三环类抗抑郁药，如丙咪嗪等；五羟色胺重摄取抑制剂，如氟西汀等；单胺氧化酶抑制剂，如苯乙肼等，均以提高神经元突触间隙神经递质的浓度，抑制神经递质的重摄取作为治疗靶点，不仅导致有30％的抑郁症病人对现有药物无效。更为严重的是，一些抗抑郁药物，例如氟西汀，长期使用后病人易于产生自杀倾向。
除抑郁症外，老年痴呆症(另译阿尔茨海默症，简称AD)也是广受社会关注的神经系统病变。老年痴呆症，是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。全世界有2400万病患，早期最显著的症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期记忆缺失。随着病情的加重，病人的语言能力、空间辨别能力、认知能力会逐步衰退。调查显示，80岁以后15％的人有罹患痴呆性疾患的危险。老年痴呆症患者最主要的病理表现是大脑皮质、海马中存在大量的神经炎症老年斑与神经原纤维缠结。对于其具体的发病机制主要有以下几点认识：(1)神经损伤加剧：AD患者脑内β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积，通过氧自由基、刺激胶质细胞产生炎症因子，加剧神经元死亡。同时Aβ的聚集导致神经元钙摄取增加，引发兴奋型神经递质谷氨酸释放增加，产生兴奋性中毒，加剧神经元死亡；(2)神经生长受损：在诸多损伤因素下，神经可塑性降低。患者脑内神经营养因子分泌不足，导致神经元无法抵御损害，生长异常，构成轴突的Tau蛋白过度磷酸化，形成神经原纤维缠结，导致神经元退化死亡；(3)神经传导阻滞：患者脑内胆碱能神经受损，乙酰胆碱含量不足，同时伴有多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺和γ-氨基丁酸含量下降，相应受体表达降低，导致神经传导阻滞；(4)血管病变：脑部血管粥样硬化，导致脑梗死，脑血流量下降，能量供给不足，导致神经元损害和认知功能损害。脑部血管病变原是血管性痴呆的发病机制，但是目前AD发病原因中，该因素已居第2位。总之，神经退行性痴呆症的发病机制可归结为因衰老所致的脑内种种损伤因素增加，导致神经生长受损，影响神经传导功能的正常发挥，产生意识障碍。
目前，老年痴呆症无法彻底根治，有效的前期预防和延缓疾病进程，显得尤其重要。临床用药主要有(1)胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐、加兰他敏、石杉碱甲等,旨在抑制乙酰胆碱酯酶活性，增加乙酰胆碱供给；(2)谷氨酸受体阻断剂，如美金刚等,旨在减少神经兴奋毒性；(3)自由基清除剂和抗氧剂，如司来吉兰(selegiline)，旨在对抗氧化损伤神经毒性；(4)雌激素：用于更年期妇女，改善海马细胞的糖转运，促进胆碱吸收转运，促进神经元及神经突触完整性；另有钙拮抗剂，脑活素等。可是这些药物的副作用常为人诟病，除了常见的眩晕、恶心呕吐等消化不良现象，常会引发失眠等睡眠障碍等。同时，司来吉兰还具有心毒性。雌激素替代疗法也有罹患乳腺癌的风险。
目前，临床研究发现，抑郁症患者罹患老年痴呆症的风险远较一般人风险为高。同时，老年痴呆症患者也经常出现抑郁症与老年痴呆症并发的现象，多表现为发病初期以抑郁症状为主，随着疾病的发展，出现记忆缺失等老年痴呆症的症状。仔细研究这两种疾病的发病机理，有诸多共性之处，如神经递质传导紊乱，神经营养因子缺失、神经炎症损伤加剧，最终导致神经元退化死亡密切相关。由于两种疾病多呈伴生状态，病人往往同时需要服用两种不同的药物，不仅用药不便，更带来沉重的经济负担。种种不便，使医学界更为迫切的希望在传统草药中寻找可从多靶点，多环节起作用的有效治疗方法与药物，用于同时治疗老年痴呆症与抑郁症。
发明内容
发明目的：本发明目的在于提供一种疗效可靠，安全性好，具有很好的抗抑郁与增强学习记忆能力的组合物。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物，它包括下列重量份数的原料：人参皂苷Rg10.1～10份，远志口山酮III 0.1～10份，α-细辛醚0.1～10份，茯苓酸0.1～10份。
作为优选方案，以上所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物，它包括下列重量份数的原料：人参皂苷Rg13份，远志口山酮III 3份，α-细辛醚0.3份，茯苓酸0.1份。
本发明所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗抑郁药物中的应用。
本发明所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗老年痴呆症药物中的应用。
本发明所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗老年痴呆症合并抑郁症的药物中的应用。
本发明所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗抑郁药物中的应用，将组合物和药学上可接受的载体制成的口服制剂、液体制剂以及缓释制剂。其中口服制剂包括片剂、锭剂或胶囊剂等；液体制剂包括溶液剂、糖浆剂、混悬剂或注射剂；缓释制剂包括肠包衣制剂、固体分散体等。
本发明所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗老年痴呆症药物中的应用，将组合物和药学上可接受的载体制成的口服制剂、液体制剂以及缓释制剂。其中口服制剂包括片剂、锭剂或胶囊剂等；液体制剂包括溶液剂、糖浆剂、混悬剂或注射剂；缓释制剂包括肠包衣制剂、固体分散体等。
本发明所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗老年痴呆症合并抑郁症的药物中的应用，将组合物和药学上可接受的载体制成的口服制剂、液体制剂以及缓释制剂。
有益效果：本发明提供的组合物，通过大量实验筛选了大量的化合物配伍所得。动物模型实验结果表明：该组合物具有显著的缓解动物抑郁样行为、增加脑内神经递质与神经营养因子供给、抑制中枢神经炎症、抑制HPA轴激活的作用。在拟老年痴呆症动物模型上，该组合物亦表现出增强模型动物学习记忆能力，同时降低脑中β淀粉样蛋白含量，增强神经营养因子的表达，修复胆碱能神经系统，提高脑组织SOD水平。上述研究表明本发明提供的组合物有显著的抗抑郁对动物的抑郁症与老年痴呆症有显著的改善作用，可用于制备改善抑郁症与老年痴呆症的药品或保健品，适合抑郁症与神老年痴呆症患者。
本发明所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在改善抑郁症与老年痴呆症的药品或保健品中的应用，将此组合物和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、固体分散体、滴丸等固体制剂。并且本发明提供的组合物，实验过程中未发现明显毒副作用，安全性好。
附图说明
图1为组合物对悬尾小鼠不动时间影响的柱状图。
图2为成分组合物对强迫游泳小鼠不动时间影响的柱状图。
图3为组合物对慢性压力应激抑郁小鼠糖水偏嗜指数影响的柱状图。
图4为组合物对慢性压力应激抑郁小鼠强迫游泳不动时间影响的柱状图。
图5为组合物对慢性压力应激抑郁小鼠脑内神经递质影响的柱状图。
图6为组合物对慢性压力应激抑郁小鼠海马区神经营养因子影响的柱状图。
图7为组合物对慢性压力应激抑郁小鼠海马区炎症因子影响的柱状图。
图8为组合物对慢性压力应激抑郁小鼠血清中压力因子影响的柱状图。
图9为组合物对Aβ海马区注射小鼠潜伏期影响的柱状图。
图10为组合物对Aβ海马区注射小鼠站台穿越次数影响的柱状图。
图11为组合物对Aβ海马区注射小鼠海马区SOD活力影响的柱状图。
图12为组合物对Aβ海马区注射小鼠海马区NGF与BDNF含量影响的柱状图。
图13为组合物对Aβ海马区注射小鼠海马区Aβ含量影响的柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1最佳化合物的筛选实验
一、实验材料与药物
1.实验仪器
二氧化碳培养箱(Thermo 3100，美国Thermo公司)；生物安全柜(1300SERIES,A2，美国Thermo公司)；超微量紫外/可见分光光度计(DENOVIX DS-11，美国)；荧光实时定量PCR仪(ABScience 7500，美国)；电子天平(BT125型，赛多利斯科学仪器有限公司)；超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司)
2.药物
氟西汀购自TCI(上海)化成工业发展有限公司。待筛选的化合物：人参代表性成分：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re；远志中代表性成分远志口山酮III、3,6-二酰基蔗糖酯、石菖蒲中代表性成分α-细辛醚、β-细辛醚；茯苓中的代表性成分茯苓酸、去氢茯苓酸、猪苓酸C购自四川维克奇公司。
3.试剂
TPA、Bt2-cAMP、多聚甲醛(PFA)、多聚赖氨酸(Poly L-lysine)、抗荧光淬灭剂(DAKO)、二甲基亚砜(DMSO)、Triton-100、EDTA、焦碳酸二乙酯(DEPC)购自自美国Sigma公司。DMEM-High glucose培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(P/S)、胰酶+EDTA、TRIzol购自美国Invitrogen公司、磷酸缓冲盐(PBS)0.01M，粉末购自南京企榕科技有限公司、反转录试剂盒购自TAKARA公司、SYBR荧光定量PCR试剂盒购自Roche公司、三氯甲烷购自上海凌峰化学试剂有限公司、异丙醇购自TEDIA公司、无水乙醇购自无锡市亚盛化工有限公司、购自Sigma公司。
4.细胞培养
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系(PC12)：培养基组成为H-DMEM，6％胎牛血清(FBS)，6％马血清(HS)，1％青霉素/链霉素(P/S)。每48h换液一次，待细胞密度为70％进行传代。传代三次后的稳定生长状态细胞用于种板和药物实验。给药前3小时，培养基需要将培养换为分化培养基。培养基组成为：H-DMEM，1％胎牛血清(FBS)，1％马血清(HS)，1％青霉素/链霉素(P/S)。
大鼠胶质瘤细胞系(C6)：培养基组成为H-DMEM(89％)，10％胎牛血清(FBS)，1％青霉素/链霉素(P/S)。细胞复苏于60mm的培养皿中，待细胞密度达到80％，吹打传代，每隔48h更换一次培养基，每四天进行一次传代。待细胞传代三次生长状态稳定后，将细胞以1.0×104个/cm2的密度种于6孔细胞培养板，培养体积为2ml，给药3h前，需要将培养基换为新鲜培养基。
小鼠小胶质永生化细胞系(BV2)：培养基组成为MEM(88％)，FBS(10％),P/S(1％)，丙酮酸钠(100X，1％)。细胞复苏于60mm的培养皿中，待细胞密度达到80％，吹打传代，每隔48h更换一次培养基，每四天进行一次传代。待细胞传代三次生长状态稳定后，将细胞以1.0×104个/cm2的密度种于6孔细胞培养板，培养体积为2ml，给药3h前，需要将培养基换为新鲜培养基。
小鼠海马永生化神经细胞系(HT22)：培养基组成为H-DMEM(89％)，10％胎牛血清(FBS)，1％青霉素/链霉素(P/S)。每48h换液一次，待细胞密度为70％进行传代。细胞复苏于60mm的培养皿中，待细胞密度达到80％，吹打传代，每隔48h更换一次培养基，每四天进行一次传代。待细胞传代三次生长状态稳定后，将细胞以1.0×104个/cm2的密度种于6孔细胞培养板，培养体积为2ml，给药3h前，需要将培养基换为新鲜培养基。
人神经瘤母细胞系(SHSY-5Y)：培养基组成为RPMI-1640(84％)，15％胎牛血清(FBS)，1％青霉素/链霉素(P/S)。细胞复苏于60mm的培养皿中，待细胞密度达到80％，吹打传代，每隔48h更换一次培养基，每四天进行一次传代。待细胞传代三次生长状态稳定后，将细胞以1.0×104个/cm2的密度种于6孔细胞培养板，培养体积为2ml，给药3h前，需要将培养基换为新鲜培养基。
5.RNA提取
吸去细胞培养液，加入2ml的PBS冲洗，每盘细胞中加入500μl的TRIzol。使用刮刀用力刮取细胞。将刮取下来的细胞收集入1.5ml的离心管中，静置2～3min。再加入100μl三氯甲烷，盖上盖子，混合均匀，静置5min。然后于13，200rpm，4℃，10min条件下离心。离心完成后，分离，取出上层水相于新的1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，室温放置10min，观察是否有白色浑浊产生。再于13，200rpm，4℃，10min条件下离心，除去上清液，加入500μl使用DEPC处理过的水配制的70％的乙醇，洗涤沉淀。在13200rpm，4℃，10min条件下离心后，将洗涤液弃去，空气干燥5min。用预热55℃的DEPC处理过的水，加入20μl溶解RNA，待RNA完全溶解后，将RNA于-80℃保存。
6.cDNA的制备
用Nanodrop测试RNA的浓度和纯度，根据TaKaRa逆转录试剂盒的说明，总计取用1μg的RNA来进行逆转录的操作。
7.qPCR操作：
依照Roche SYBR荧光实时定量试剂盒操作步骤，利用荧光实时定量PCR仪测定实时荧光定量PCR检测基因表达。引物序列如下表1：
表1神经递质调控酶引物序列
Primer Sequence(5’-3’) Source
Rat TH-F CCT TCC AGT ACA AGC ACG G NM_012740.3
Rat TH-R GAT GCT GTC CTC TCG GTA G
Rat Dbh-F CAG ACT CAA CTA CTG TCG CC NM_013158.2
Rat Dbh-R CGC CGG CCT TGT ATA TTC C
Rat MAOa-F CGG CCA GGA ACG GAA ATT TG NM_033653.1
Rat MAOa-R GGC AGT CAA AAT CGG TGG G
Rat MAOb-F GAC AGG AGA GGA AAT TTA TTG G NM_013198.1
Rat MAOb-R CAT GCC CAA AAC AGG TGG G
Rat COMT-F GAC GCG AAA GGC CAA ATC NM_012531.2
Rat COMT-R TCC TGT AGG CCT GCA AAG
Rat GAPDH-F ACA TCA AGA AGG TGG TGA AGC NM_022651.2
Rat GAPDH-R TTG TCA TAC CAG GAA ATG AGC TT
TH，酪氨酸羟化酶；Dbh，多巴胺-β-羟化酶；MAOa，单胺转化酶A；MAOb，单胺转化酶B；COMT，儿茶酚-氧-甲基转移酶；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
神经营养因子引物序列如表2：
表2神经营养因子引物序列
Figure BDA0002094501080000071
NGF，神经生长因子；BDNF，脑源性神经营养因子；GDNF，胶质细胞源性营养因子；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
炎症因子引物序列如下表3：
表3炎症因子引物序列
Figure BDA0002094501080000072
IL-1β，白介素1β；IL-6，白介素6；TNF-α，肿瘤坏死因子；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
8.MTT法检测细胞的存活率
细胞种板于96孔板中，密度为10cell/μl。给药前需要换液，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、远志口山酮III、3,6-二酰基蔗糖酯、α-细辛醚、β-细辛醚、茯苓酸、去氢茯苓酸和猪苓酸C各药物作用48h，给药两次，各化合物的药物浓度均为5μM(微摩尔/升)。LPS(1μg/ml)，Cortisol(300μM)与药物共同作用。96孔板上A1孔不加任何试剂，再预留空白对照。给药48h后，每孔加入终浓度为5μg/ml的MTT，放入37℃培养箱中孵育3h，后吸走MTT，每孔加入150ml DMSO，置于37℃摇床上孵育30min。之后在波长为570nm处，用酶标仪测定吸光度。分析细胞存活率。
二、实验结果
1.单体成分对PC12细胞神经递质合成降解酶的表达影响
以PC12类神经元细胞，利用qPCR法，评价了不同带筛选的单体成分对神经递质合成与代谢关键酶转录表达的影响，结果见表，其中人参皂苷Rg1、远志口山酮III、α-细辛醚、茯苓酸有较好的促进神经递质合成，抑制神经递质降解的活性。具体实验结果如表表4至表9。
表4单体成分对PC12细胞中神经递质合成降解酶表达的影响
成分 TH Dbh MAOa MAOb COMT
人参皂苷Rb<sub>1</sub> ↑ ↑↑ ↓ ↓ ↓
人参皂苷Rg<sub>1</sub> ↑↑ ↑↑↑ ↓↓ ↓↓ ↓↓
人参皂苷Re ↑ ↑↑ ↓ ↓ ↓
远志口山酮III ↑↑ ↑↑ ↓↓ ↓↓ ↓↓
3,6-二酰基蔗糖酯 ↑ ↑ ↓ ↓ ↓
α-细辛醚 ↑↑ ↑↑ ↓↓ ↓↓ ↓↓
β-细辛醚 ↑ ↑ ↓ ↓ ↓
茯苓酸 ↑↑ ↑↑ ↓↓ ↓↓ ↓↓
去氢茯苓酸 - - - - -
猪苓酸C - - - - -
↑：与空白组相比，表达有1倍增长；↓：与空白组相比，表达有1倍下降；-：与空白组相比，无显著变化。
2.单体成分对C6细胞神经营养因子的表达影响
以C6胶质细胞，利用qPCR法，评价了单体成分对神经营养因子NGF、BDNF与GDNF转录表达的影响，结果如表。其中人参皂苷Rg1、远志口山酮III、α-细辛醚、茯苓酸有较好的促进神经营养因子表达的活性。
表5单体成分对C6细胞中神经营养因子表达的影响
Figure BDA0002094501080000081
Figure BDA0002094501080000091
↑：与空白组相比，表达有1倍增长；-：与空白组相比，无显著变化。
3.单体成分抑制细胞神经炎症因子的表达影响
以BV2小胶质细胞加以脂多糖LPS刺激促进炎症因子IL-1β、IL-6与TNF-α表达，模拟中枢神经炎症环节中炎症因子的生成，利用qPCR法，评价单体成分对炎症因子表达的抑制作用，结果如表。其中人参皂苷Rg1、远志口山酮III、α-细辛醚、茯苓酸有较好的活性。
表6单体成分对BV2细胞中炎症因子表达的影响
成分 IL-1β IL-6 TNF-α
人参皂苷Rb<sub>1</sub> ↓ ↓↓ ↓
人参皂苷Rg<sub>1</sub> ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓
人参皂苷Re ↓ ↓ ↓
远志口山酮III ↓↓ ↓↓ ↓↓
3,6-二酰基蔗糖酯 ↓ ↓ ↓
α-细辛醚 ↓↓ ↓↓ ↓
β-细辛醚 ↓ ↓ ↓↓
茯苓酸 ↓↓ ↓ ↓↓
去氢茯苓酸 ↓ ↓ ↓↓
猪苓酸C ↓ ↓ ↓
↓：与空白组相比，表达有1倍下降。
4.单体成分对TNF-α致神经细胞损伤的保护作用影响
以HT22细胞加以TNF-α进行损伤，模拟海马区神经元炎性损伤，利用MTT法，评价单体成分对炎性损伤细胞的保护作用，结果如表。其中人参皂苷Rg1、远志口山酮III、α-细辛醚、茯苓酸有较好的活性。
表7单体成分对HT22细胞中炎性损伤的保护作用
成分 细胞存活率
人参皂苷Rb<sub>1</sub> *
人参皂苷Rg<sub>1</sub> ***
人参皂苷Re *
远志口山酮III **
3,6-二酰基蔗糖酯 *
α-细辛醚 ***
β-细辛醚 **
茯苓酸 **
去氢茯苓酸 *
猪苓酸C *
*：与模型组相比，P<0.05；**：与模型组相比，P<0.01；***：与模型组相比，P<0.005；
5.单体成分对皮质醇致神经细胞损伤的保护作用影响
以SHSY-5Y细胞加以皮质醇进行损伤，模拟海马区神经元压力因子损伤，利用MTT法评价单体成分对压力因子损伤细胞的保护作用，结果如表。其中人参皂苷Rg1、远志口山酮III、α-细辛醚、茯苓酸有较好的活性。
表8单体成分对HT22细胞中炎性损伤的保护作用
成分 细胞存活率
人参皂苷Rb<sub>1</sub> **
人参皂苷Rg<sub>1</sub> ***
人参皂苷Re **
远志口山酮III **
3,6-二酰基蔗糖酯 *
α-细辛醚 **
β-细辛醚 *
茯苓酸 **
去氢茯苓酸 *
猪苓酸C *
*：与模型组相比，P<0.05；**：与模型组相比，P<0.01；***：与模型组相比，P<0.005。
实施例2
本发明基于神经递质、神经营养因子、中枢神经炎症、压力应激系统等细胞模型功效物质的筛选结果。确定最佳的化合物组成为人参皂苷Rg1、远志口山酮III、α-细辛醚以及茯苓酸。然后本发明再采用四因素三水平的正交设计优选人参皂苷Rg1、远志口山酮III、α-细辛醚以及茯苓酸的最佳用量比，采用动物行为学实验考为考察指标。实验结果表明，通过正交试验，优选出了成分组合物的最优组成为人参皂苷Rg13份，远志口山酮III 3份，α-细辛醚0.3份，茯苓酸0.1份。具体实验筛选如下：
一、实验材料与药物
1.实验仪器
ANY-MAZE行为分析系统(美国ANY-MAZE公司)、动物行为分析系统(上海吉量公司)等。
2.药物
氟西汀购自TCI(上海)化成工业发展有限公司。。人参皂苷Rg1、远志口山酮III、α-细辛醚、茯苓酸购自四川维克奇公司。
二、实验方法
1.正交试验设计：表9为正交试验的设计方法。
表9四因素三水平正交试验的设计方法
Figure BDA0002094501080000111
2.给药方案：见表10。
表10动物实验分组和给药剂量
Figure BDA0002094501080000112
Figure BDA0002094501080000121
3.小鼠悬尾实验
小鼠灌胃7天(见表1与2)后，于末次灌胃给药30min后，用悬尾箱顶板中心绳连着的小夹子夹住小鼠尾尖，使小鼠成倒挂状态，其头部离箱底约5cm。小鼠悬挂2min后，立即开始观察，观察持续4min，累计此4min内小鼠的不动时间。
4.小鼠强迫游泳实验
小鼠给以氟西汀(7.2mg/kg)与组合物低、中、高剂量组(见表1)灌胃7天后，于末次给药30min后，将小鼠放入高20cm，直径14cm的圆柱形玻璃缸中，每缸1只，缸中水深10cm，水温25℃。小鼠游泳2min后，立即开始观察，观察持续4min，累计此4min内的不动(小鼠在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动)时间。
三、实验结果
1.小鼠悬尾实验测试结果：
给药7天后，进行小鼠悬尾实验测试，结果见表11。
表11小鼠悬尾实验测试
Figure BDA0002094501080000122
＊与空白组相比，p<0.05。
2.小鼠强迫游泳实验测试结果：
给药7天后，进行小鼠强迫游泳实验测试，结果见表12。
表12小鼠强迫游泳实验测试
Figure BDA0002094501080000131
＊与空白组相比，p<0.05。
正交试验结果及最优组合的确定
(1)正交试验极差分析与因素水平。
将各实验组动物悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST)的结果各按照50％加权计算，并进行极差分析与方差分析，结果见表13～表16。
表13正交试验分析表-极差分析表
Figure BDA0002094501080000132
表14正交试验分析表-极差分析表
Figure BDA0002094501080000133
Figure BDA0002094501080000141
表15正交试验分析表-方差分析表
变异来源 平方和/SS 自由度/df 均方/MS F值 F0.05(2，4) F0.01(2，4) 显著性
因素A 158.12 2 79.06 65.2 6.94 18 ＊＊
因素B 38.56 2 19.28 15.9 6.94 18 ＊
因素C 68.37 2 34.19 28.19 6.94 18 ＊＊
因素D / / / / / /
误差 4.85 2 2.43 / / /
误差delta 4.85 4 1.21 / / /
＊与空白组相比，p<0.05。＊＊与空白组相比，p<0.05。
表16正交试验分析表
首要影响因子 第二影响因子 第三影响因子 第四影响因子
极差分析 A C B D
方差分析 A C B D
显著水平 ＊＊ ＊＊ ＊ 误差列
最优配比 A3 C1 B3 D1
通过正交试验的结果分析，本发明得到最优的剂量组合为人参皂苷Rg1(3mg/kg/d)、远志口山酮III(3mg/kg/d)、α-细辛醚(0.3mg/kg/d)、茯苓酸(0.1mg/kg/d)，即成分组合物的最优组成为人参皂苷Rg13份，远志口山酮III 3份，α-细辛醚0.3份，茯苓酸0.1份。
(2)最优组合验证性实验。
以正交实验获得的最佳配伍组合，进行动物行为学验证实验，结果见表17。
表17小鼠行为学测试结果
Figure BDA0002094501080000151
＊与空白组相比，p<0.05。
实施例3
一种具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物，它由人参皂苷Rg1 3份，远志口山酮III1份，α-细辛醚0.3份，茯苓酸1份组成。
实施例4
一种具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物，它由人参皂苷Rg1 1份，远志口山酮III1份，α-细辛醚3份，茯苓酸0.1份组成。
实施例5
一种具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物，它由人参皂苷Rg1 3份，远志口山酮III 3份，α-细辛醚0.3份，茯苓酸0.1份组成。
实施例6成分组合物抗抑郁效用研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
动物多重行为测试仪(上海吉量仪器有限公司)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。
2.药物
氟西汀购自TCI(上海)化成工业发展有限公司。
受试药物：本发明实施例5组合物，剂量设置情况见表18：
表18组合物剂量设置表
Figure BDA0002094501080000152
Figure BDA0002094501080000161
3.实验动物
SPF级雄性ICR种小鼠，体重18～22g，购自南京中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(苏)2015-0001。
二、实验方法
1.小鼠悬尾实验
小鼠给以氟西汀(7.2mg/kg)与组合物低、中、高剂量组(见表18)灌胃7天后，于末次灌胃给药30min后，用悬尾箱顶板中心绳连着的小夹子夹住小鼠尾尖，使小鼠成倒挂状态，其头部离箱底约5cm。小鼠悬挂2min后，立即开始观察，观察持续4min，累计此4min内小鼠的不动时间。
2.小鼠强迫游泳实验
小鼠给以氟西汀(7.2mg/kg)与组合物低、中、高剂量组(见表1)灌胃7天后，于末次给药30min后，将小鼠放入高20cm，直径14cm的圆柱形玻璃缸中，每缸1只，缸中水深10cm，水温25℃。小鼠游泳2min后，立即开始观察，观察持续4min，累计此4min内的不动(小鼠在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动)时间。
三、实验结果
1.小鼠悬尾实验测试结果
给药7天后，进行小鼠悬尾实验测试。由图1可以看出，小鼠经灌胃组合物7天后，小鼠悬尾过程中的不动时间显著减少，与空白组相比有显著性差异(P<0.05)，其趋势与阳性药氟西汀作用相当，显示出明显的抗抑郁作用。
2.小鼠强迫游泳实验测试结果
给药7天后，进行小鼠强迫游泳实验。由图2可以看出，小鼠经灌胃7天后，本发明提供的组合物可减少小鼠强迫游泳的不动时间，与空白组相比有显著性差异(P<0.05)，其趋势与阳性药氟西汀作用相当，显示出明显的抗抑郁作用，且作用优于氟西汀。
实施例7成分组合物抗抑郁效用研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
动物多重行为测试仪(上海吉量仪器有限公司)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。Agilent1290Series高效液相色谱仪；Agilent QQQ 6410A三重四级杆质谱仪；分析色谱柱：ACEC18-AR,1.8μm,2.1x100mm；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；超纯水制备仪(南京易普易达公司)。多功能酶标仪(Enspire,Perkin-Elmer公司)，高速离心机(AllegraX-12R Centrifuge和Microfuge 22R Centrifuge，Backman公司)，恒温水浴锅(Bluepard公司)。
2.药物
氟西汀购自TCI(上海)化成工业发展有限公司。多巴胺，去甲肾上腺素，5-羟色胺均购自Sigma-Aldrich公司。
受试药物：本发明实施例5制备得到的组合物，剂量设置情况见表19：
表19组合物剂量设置表
Figure BDA0002094501080000171
3.试剂
小鼠NGF ELISA试剂盒(JEB-12458)，小鼠BDNF ELISA试剂盒(JEB-12339)，小鼠LPS ELISA试剂盒(JEB-12983)，小鼠IL-1βELISA试剂盒(JEB-14569)，小鼠IL-6ELISA试剂盒(JEB-17865)，小鼠TNF-αELISA试剂盒(JEB-12458)，小鼠CRF ELISA试剂盒(JEB-13765)，小鼠ACTH ELISA试剂盒(JEB-12678)，小鼠Corticosterone ELISA试剂盒(JEB-13773)购自南京金益柏生物科技有限公司。
4.实验动物
SPF级雄性ICR种小鼠，体重18～22g，购自南京中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(苏)2015-0001。
5.慢性压力应激抑郁小鼠糖水偏好性测试实验
将小鼠安置于培养室，静养7d后，测试小鼠基础饮水量和基础糖水消耗量，剔除数值异常的小鼠。选取糖水消耗量均一的小鼠，每天施加进行随机不可预测的轻度刺激，包括禁食24h，禁水24h，湿笼，强迫游泳5min，夹尾5min，束缚4h，昼夜颠倒，持续56d。然后灌胃给以氟西汀(7.2mg/kg)与组合物低、中、高剂量组(见表19)7d后，进行糖水偏好性测试实验。
6.慢性压力应激抑郁小鼠强迫游泳测试实验
模型构建与给药同上。糖水偏好测试实验结束24小时后，进行强迫游泳测试。具体方法为：将小鼠放入高20cm，直径14cm的圆柱形玻璃缸中，每缸1只，缸中水深10cm，水温25℃。小鼠游泳2min后，立即开始观察，观察持续4min，累计此4min内的不动(小鼠在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动)时间。
7.神经递质测定
(1)样品处理
将完成行为学测试的慢性压力应激抑郁小鼠处死后，解剖取全脑组织，按5g/mL的浓度值加入一定体积的甲酸(0.5M)，高速分散制成匀浆液，13,200转/分离心5分钟后取上清液。
(2)液相色谱分离
层析条件：流动相：0.1％甲酸(A)，乙腈+0.1％甲酸。流速：0.2ml/min。梯度条件：0.0min:99％A；2.0min:99％A；6.0min:90％A；10min:90％A。
(3)质谱检测
干燥气温度(Dryinggastemperature)：325℃；干燥气流速(Dryinggas flow):10L/min；毛细管电压(Vcap):4000V；雾化电压(Nebulizer)：35psig；检测极性(Polarity):Positive；扫描模式(Scanmode)：多离子检测模式(MRM)；检测离子对(Ionpairsdetection)：154.1>137.1，154.1>91.1(多巴胺)；170.1>153.1，170.1>107.1(去甲肾上腺素)；170.1>153.1，170.1>107.1(去甲肾上腺素)；177.1>160.1，177.1>115.1(5-羟色胺)；
8.海马组织神经营养因子含量测定
行为学测试结束后，处死小鼠，解剖获得海马组织，液氮迅速冷冻，粉碎。称取相应重量组织，加入10倍体积的组织裂解液(10mMHEPES,pH7.5,1MNaCl,1mMEDTA,1mM EGTA,0.5％Triton X-100,5mM benzamidine HCl,10μM aprotinin,10μM leupeptin)，利用NGF与BDNF ELISA试剂盒，按试剂盒所列操作步骤，测定NGF与BDNF的含量。试剂盒检测范围为7.8-500pg/mL。
9.海马区促炎物质含量测定
样品处理同上，利用LPS、IL-1β、IL-6与TNF-αELISA试剂盒，按试剂盒所列操作步骤，测定LPS、IL-1β、IL-6与TNF-α的含量。试剂盒检测范围为7.8-500pg/mL。
10.血清压力因子含量测定
行为学测试结束后，处死小鼠，处死动物，常规眼眶取血，常温静置2h后3500rpm/min,4℃离心，吸取血清。测定CRF、ATCH与corticosterone含量。试剂盒检测范围为7.8-500pg/mL。
11.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以
Figure BDA0002094501080000181
表示，组间差异采用OnewayANOVA检验，P<0.05为差异有统计学意义。
二、实验结果
1.慢性压力应激抑郁小鼠糖水偏好性测试实验结果
给药7天后，进行慢性压力应激抑郁小鼠糖水偏好性测试实验。由图3可以看出，小鼠经灌胃7天后，本发明提供的组合物可提升小鼠糖水偏好指数，与模型组相比有显著性差异(P<0.05)，显示出明显的抗抑郁作用，其趋势优于阳性药氟西汀。
2.慢性压力应激抑郁小鼠强迫游泳测试实验结果
给药7天后，行慢性压力应激抑郁小鼠强迫游泳实验。由图4可以看出，小鼠经灌胃7天后，本发明提供的组合物可减少小鼠强迫游泳的不动时间，与空白组相比有显著性差异(P<0.05)，其趋势与阳性药氟西汀作用相当，显示出明显的抗抑郁作用。
3.组合物对慢性压力应激抑郁动物脑内神经递质影响
由图5可以看出，本发明提供的组合物中剂量与高剂量均可显著提升小鼠脑内与抑郁症发病密切相关的多巴胺，去甲肾上腺素与5-羟色胺的含量，与空白组相比有显著性差异(P<0.05)。与之相比，阳性药氟西汀仅对5-羟色胺具有显著的上调作用，本发明提供的组合物的调控神经递质作用靶点则更为广泛。
4.组合物对抑郁动物脑内神经营养因子影响
由图6可以看出，小鼠经灌胃7天后，本发明提供的组合物中剂量与高剂量均可显著提升海马组织内与抑郁症发病密切相关的NGF、BDNF的含量，与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。与之相比，组合物可显著提升BDNF作用，趋势强于氟西汀，取得非常好的预料不到的技术效果。
5.组合物对慢性压力应激抑郁小鼠海马区促炎物质影响
由图7可以看出，小鼠经灌胃7天后，本发明提供的组合物中剂量与高剂量均可显著降低海马组织内与抑郁症发病密切相关的LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。与之相比，阳性药氟西汀仅能降低LPS的表达，组合物具有更多的调控神经炎性因子的作用靶点。取得看非常好的预料不到的技术效果。
6.组合物对慢性压力应激抑郁小鼠血清中压力因子影响
由图8可以看出，小鼠经灌胃7天后，本发明提供的组合物中剂量与高剂量均可显著降低血清内与抑郁症发病密切相关的CRF、ACTH与Corticosterone的含量，与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。与之相比，作用趋势与阳性药氟西汀相似。
实施例8组合物对Aβ海马区注射拟老年痴呆小鼠学习与记忆能力的影响研究
一、实验材料与药物
1.药物和试剂
Aβ1-40淀粉样蛋白购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。SOD试剂盒(a001-3)购自南京建成生物工程研究所。小鼠NGF ELISA试剂盒(JEB-12458)，小鼠BDNF ELISA试剂盒(JEB-12339)，小鼠Aβ 1-40ELISA试剂盒(JEB-12821)购自南京金益柏生物科技有限公司。
2.实验仪器
水迷宫行为测试仪(上海吉量仪器有限公司)；酶标仪(美国Perkin-Elmer公司)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；Anke GL-16GII型离心机(上海安亭科学仪器厂)。
3.实验动物
SPF级雄性昆明种小鼠，体重18～22g，购自南京中医药大学实验动物中心，合格证号SCXK(浙)2008-0033。
4、实验药物：氟西汀购自TCI(上海)化成工业发展有限公司。
受试药物：实施例5制备得到的组合物，剂量设置情况同表18。
二、实验方法
1.海马区注射Aβ淀粉样蛋白损伤的小鼠模型的建立与分组给药
取健康雄性C57BL/6小鼠80只，适应性喂养5d后，随机分为8组，每组10只。分为空白组、假手术组、模型组、阳性对照组、组合物低剂量组、组合物中剂量组、组合物高剂量组。Aβ1-40溶于0.01mmol/LPBS中，使其浓度为2ug/ul，置于37℃孵育7d使其变为聚集态。除空白组外，其余各组均用3.5％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，将其平颅位固定于脑立体定位仪上。参照小鼠脑立体定位图谱确定两侧海马坐标：前卤后0.21mm，中线侧旁开0.2mm，硬脑膜下0.34mm。按上述位点钻孔，假手术组右侧海马注射5ul 0.01mmol/LPBS，10min内注射完，留针5min以保证注射的液体充分弥散。模型组和其它给药组注射孵育好的Aβ1-40。术后1周为恢复期。而后，空白组、假手术组、模型组给以等体积生理盐水。阳性组给以石杉碱甲(0.05mg/kg)。组合物分高中低剂量(见表18)给药7天后，利用水迷宫实验进行行为学测试。
2.水迷宫行为学测试
给药3d后，进行6d的Morris水迷宫实验，对其空间记忆能力进行测试。水迷宫水温为(20±1)℃，水深30cm左右，水面比站台高0.5cm。小鼠背对站台入水池，让其自由游60s。若小鼠找不到平台，引导其找到平台，让其在平台上保持10s。每天小鼠从四个不同的象限入水进行训练。训练期间，保持训练、学习和测试时水迷宫平台和周围物体位置不变，训练4天。第5天撤去站台，开始隐蔽站台试验，使小鼠从平台的对侧象限，即最远点背对平台入水，记录小鼠找到平台的过程，时间设为90s，未找到平台者按90s算。测试2次，取平均值作为实验数据。24h后开始空间探索试验，撤除站台，时间也设为90s，使小鼠从平台的对侧象限，即最远点背对平台入水，记录小鼠在90s内的轨迹，测试2次，取平均值作为实验数据。以小鼠在水迷宫实验的潜伏期、站台穿越次数、上台前路程等指标作为衡量小鼠学习与记忆的能力。
(1)行为学测试方法
30d多因素复合损伤造模结束后，进行连续4天的Morris水迷宫定位航行实验，以测试其空间记忆能力。将水迷宫内水温调到25±℃，水深约20cm，保持学习、训练和测试时水迷宫平台和周围物体位置固定不变。让小鼠在水迷宫内自由游120s,然后引导其找到水下平台，让其处于平台上10s。此操作一天进行2次，时间间隔2h以上。每天训练2个象限，训练共4天。第5天开始正式测试。让小鼠从平台所在象限对侧象限的最远点背对平台入睡，拍摄记录小鼠找到平台的全过程。共测试2天，每天测试2次。以各组小鼠自水迷宫起点游至平台终点所需的时间(潜伏期)与上台次数为衡量小鼠学习获得与记忆巩固能力的指标。
(2)生化指标测试
水迷宫测试结束后，取脑组织匀浆测定超氧化物歧化酶(SOD)活性、海马神经营养因子与Aβ淀粉样蛋白的表达。
3.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以
Figure BDA0002094501080000211
表示，组间差异采用One wayANOVA检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1.行为学测试结果
Morris水迷宫行为学测试显示，模型动物与正常组动物比较，潜伏期与上台路程显著高于正常组，站台穿越次数明显少于正常组(p<0.05)。说明造成了动物记忆与学习能力下降。给予本发明的组合物后，与模型组比较，动物潜伏期明显降低(见图9)，站台穿越次数显著提升(见图10)(p<0.05)，说明组合物可以显著改善海马区神经损伤动物的学习和记忆能力，作用趋势与阳性药石杉碱甲相似。
2.SOD活性测试结果
小鼠进行完行为学测试后，处死取脑，制得匀浆，依据SOD试剂盒的操作方法，测量小鼠脑内SOD活性。由图11可以看出，模型组小鼠经多重因素损伤后，脑内SOD活性显著降低(P<0.05)。给予本发明组合物后，SOD活性显著增加(P<0.05)，其作用与阳性药石杉碱甲效用相当。表明本发明所提供的组合物具有很好的抗神经氧化损伤作用。
3.NGF与BDNF测试结果
小鼠进行完行为学测试后，处死取脑，分取海马组织，制得匀浆，利用ELISA技术，测量小鼠海马区NGF与BDNF表达。由图12可以看出，模型组小鼠经多重因素损伤后，大脑皮层NGF表达显著降低(P<0.05)。给予实施例5组合物后，NGF表达显著增加(P<0.05)，其作用趋势与阳性药石杉碱甲作用相当。表明本发明所提供的组合物具有很好的增强NGF与BDNF表达，营养胆碱能神经元，对抗神经退行性痴呆的作用。
4.海马区Aβ含量 测试结果
行为学测试结束后，处死动物，解剖获得海马组织，采用AβELISA试剂盒测定Aβ的含量。图13结果显示，模型组Aβ含量显著高于正常组(p<0.05)。阳性药石杉碱甲可显著降低海马中的Aβ的含量(p<0.05)。给予实施例5组合物后，本发明组合物各剂量组均显示出较好的降低海马中Aβ含量的效果，效用趋势优于石杉碱甲。
以上实验结果表明，本发明提供的组合物具有显著的缓解动物抑郁样行为、增加脑内神经递质与神经营养因子供给、抑制中枢神经炎症、抑制HPA轴激活的作用。在拟老年痴呆症动物模型上，该组合物亦表现出该组合物亦表现出增强模型动物学习记忆能力，同时降低Aβ淀粉样蛋白含量，增强神经营养因子的表达，提高脑组织SOD水平。具有较高的药物开发价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物，其特征在于，它由下列重量份数的原料组成：人参皂苷Rg1 3份，远志口山酮III 3份，α-细辛醚0.3份，茯苓酸0.1份。
2.权利要求1所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗抑郁药物中的应用。
3.权利要求1所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗老年痴呆症药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗抑郁药物中的应用，其特征在于，将组合物和药学上可接受的载体制成口服制剂、液体制剂或缓释制剂。
5.根据权利要求4所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗抑郁药物中的应用，其特征在于，口服制剂包括片剂、锭剂或胶囊剂；液体制剂包括糖浆剂、混悬剂或注射剂；缓释制剂包括肠包衣制剂或固体分散体。
6.根据权利要求3所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗老年痴呆症药物中的应用，其特征在于，将组合物和药学上可接受的载体制成口服制剂、液体制剂或缓释制剂。
7.根据权利要求6所述的具有抗抑郁与抗老年痴呆症功效的组合物在制备抗老年痴呆症药物中的应用，其特征在于，口服制剂包括片剂、锭剂或胶囊剂；液体制剂包括糖浆剂、混悬剂或注射剂；缓释制剂包括肠包衣制剂或固体分散体。
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