CN110179782A - 一种治疗aml的药物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了三羟基三甲基辅酶A合成酶1(3‑hydroxymethyl‑3‑methylglutaryl‑CoA synthase 1,HMGCS1)抑制剂hymeglusin在治疗急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)中的应用。经实验证明，HMGCS1抑制剂hymeglusin对多种AML细胞具有杀伤作用，抑制这些AML细胞增殖，同时促进AML细胞株的凋亡，与阿霉素联用，能促进阿霉素对AML细胞的杀伤作用。HMGCS1抑制剂hymeglusin无毒副作用，价格为大多数患者所接受，与化疗药物联用，一方面能促进化疗药物对AML细胞的杀伤作用，另一方面，能减少化疗药物剂量，减轻化疗毒副作用，有望为治疗和治愈急性髓系白血病提供一种新的途径和手段。

Description

一种治疗AML的药物及应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物领域，具体涉及三羟基三甲基辅酶A合成酶1 (3-hydroxymethyl-3-methylglutaryl-CoA synthase 1，HMGCS1)抑制剂 hymeglusin在制备抗AML的化疗增敏药物中的应用。
背景技术
在急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)治疗方面，目前化疗和造血干细胞移植是其主要的治疗方法，除极少数类型急性白血病，如急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocyte Leukemia,APL)治疗效果较好外，其余类型的急性白血病仅靠常规化疗难以完全清除骨髓内的肿瘤干细胞，且部分患者常常发生化疗后耐药，化疗或造血干细胞移植后复发,且化疗药物的毒副作用对人体损伤较大。造血干细胞移植近年来发展迅速，其有可能完全治愈急性白血病，但价格昂贵，风险较大，且受到供体来源和免疫排斥两大瓶颈的制约，难以普及。近年来，随着对白血病研究的深入，肿瘤细胞中发生的代谢变化逐渐为人们所重视。Pandyra等人研究发现在肿瘤细胞中发生的脂类的代谢变化主要是通过脂肪酸合成和甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway,MVApathway)来促进胆固醇和脂质的从头合成。
细胞内甲羟戊酸-胆固醇的合成过程复杂，其中甲羟戊酸途径，也被称为异戊二烯途径(Isoprenoid pathway)或β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶还原酶途径 (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase pathway,HMG-CoA reductase pathway)，是一条重要的代谢途径。该途径以乙酰辅酶A(acetyl-CoA,乙酰 CoA)为原料合成二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP) 和异戊二烯焦磷酸(isopentenylpyrophosphate,IPP)，活化的异戊二烯单元可以合成类固醇等生物分子。DMAPP与IPP缩合生成法尼酯二磷酸(farnesyl diphosphate,FPP)，FPP再缩合、还原生成鲨烯(squalene)，或者生成香叶酰香叶酰二磷酸(geranylgeranyl-diphosphate,GGPP)。
近来有研究发现MVA途径在细胞增殖和转化中具有重要的调节作用，其在许多癌症中有上调，例如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，以及乳腺癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌和食管癌，表明肿瘤依赖于该经典代谢途径。因此靶向MVA途径是一种重要的和新兴的治疗方法。
甲羟戊酸-胆固醇的生物合成途径对于白血病有重要意义，白血病细胞的快速增殖需要胆固醇生物合成提供各种原料物质，细胞内的胆固醇代谢活跃。早在1978年，Goldstein和Brown首次报道在AML中细胞内胆固醇水平明显增高。AML及慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML) 的白血病细胞即使在高浓度的固醇培养基下，也不会出现负反馈抑制固醇的生成。研究发现某些药物化疗后可导致AML中保护性胆固醇生物合成增多，减低了细胞对药物的敏感性，可能与白血病细胞耐化疗药物相关。且有报道发现抑制甲羟戊酸-胆固醇生物合成能显著提高慢性淋巴细胞白血病 (Chronic lymphocyticleukemia,CLL)细胞化疗敏感性。
MVA途径中有许多酶起作用，其中HMGCS1基因编码HMG-CoA合成酶，为HMG-CoA还原酶的上游基因，调节胆固醇生物合成。HMGCS1抑制剂hymeglusin，也称为1233A，F-244和L-659699，是最初被分离为靶向真菌细胞壁β-内酯的抗生素，后来被重新发现作为不可逆的HMG-CoA合成酶的抑制剂，但其在急性髓系白血病中的作用尚未见报道。
发明内容
本发明通过检测急性髓系白血病患者的骨髓样本，发现MVA途径中的 HMGCS1在AML的难治和复发组中表达显著增高。因此本发明通过提出设想：HMGCS1是否参与MVA途径对AML的增殖调控作用，是否能影响 AML细胞对化疗药物的敏感性，且以上作用是否与和MVA途径密切相关的MAPK通路(Mitogen-activatedprotein kinase pathway)有关。针对以上设想，本发明基于急性髓系白血病细胞株及临床样本为研究对象实验证实了这个设想，然后针对这一证明事实，本发明基于急性髓系白血病细胞株及临床样本为研究对象，探讨HMGCS1在急性髓系白血病细胞中的作用及其对化疗药物阿霉素(adriamycin,ADR)敏感性的影响，验证了抑制剂hymeglusin 在不对正常细胞株的增殖造成明显的影响的情况下，在急性髓系白血病细胞株中能够抑制细胞的增殖和促进其凋亡，且能增强AML细胞株对ADR的敏感性。
本发明要解决的问题是提供hymeglusin的新用途，即在制药中的新应用。本发明的目的是提供hymeglusin在制备抗急性髓系白血病和化疗增敏药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种AML治疗药物，包含hymeglusin。
进一步的，可以用于与阿霉素的联合用药。
hymeglusin在制备抗AML药物中的应用。
进一步的，药物为以hymeglusin为活性成分，加入一种或多种药学上可接受的辅料，辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂、香味剂、甜味剂及色素。
进一步的，药物为增加AML细胞对阿霉素敏感性的增敏剂。
进一步的，药物为一种抗AML药物组合物，该组合物含有药学上有效量的hymeglusin和药学上有效量的阿霉素及药学上可接受的载体。
进一步的，药物被制成任何一种药学上可接受的剂型，所述剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、纳米制剂、注射剂。
本发明检测了hymeglusin对多株AML细胞株(HL-60、HL-60耐阿糖胞苷和THP-1)的细胞杀伤作用，发现:1.HMGCS1抑制剂hymeglusin在急性髓系白血病细胞株中能抑制细胞的增殖，HMGCS1抑制剂hymeglusin在 HL-60/Ara-c中抑制作用较普通的HL-60和THP-1细胞抑制作用强； 2.HMGCS1抑制剂hymeglusin对人脐静脉内皮细胞的增殖未造成明显影响；3.Hymeglusin促进AML细胞的凋亡；4.Hymeglusin联合阿霉素作用于AML 细胞株，对细胞增殖的抑制较单用阿霉素明显增强；总之，HMGCS1抑制剂hymeglusin在急性髓系白血病细胞株中能抑制细胞的增殖和促进其凋亡；且不对正常细胞株的增殖造成明显的影响；hymeglusin能增强AML细胞对化疗药物的敏感性。
由于阿霉素是治疗AML的经典化疗药物之一，本发明也探索了 hymeglusin对阿霉素疗效的影响，通过实验发现hymeglusin能够促进阿霉素对AML细胞的杀伤作用。
本发明提出一种治疗急性髓系白血病的新药物—hymeglusin，该药物尚未报道对人体有毒副作用，与化疗药物阿霉素联用，一方面能促进阿霉素对 AML细胞的杀伤作用，另一方面，能减少阿霉素剂量，减轻化疗药物对人体的毒副作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是技术路线1-1；
图2是技术路线1-2；
图3是HMGCS1在正常细胞和AML细胞中的表达图；
图4是HMGCS1在AML患者中的表达图；
图5是技术路线2-1；
图6是人脐静脉内皮细胞与AML细胞药物干预后增殖结果图；
图7是HL-60与HL-60/Ara-c细胞经hymeglusin干预后的增殖结果图；
图8是AML细胞经hymeglusin及ADR处理后的凋亡结果图；
图9是hymeglusin联合ADR干预AML细胞增殖结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的相关技术进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参考图1～9，
实施例：
一：建立HMGCS1在AML细胞株及临床患者中的表达
技术路线
技术路线1-1，如图1所示；
技术路线1-2，如图2所示；
材料：细胞株
人AML细胞株HL-60、HL-60耐阿糖胞苷细胞(HL-60/Ara-c)和THP-1 及人脐静脉内皮细胞株(HUV-EC-E)均购于中南大学细胞中心。
临床样本
收集8例正常成人和32例AML患者的新鲜骨髓标本，标本用含肝素钠抗凝剂的采血管收集，每份标本量约为2-3mL。
主要实验方法
临床标本收集
收集32例AML患者的新鲜骨髓标本和8例正常成人捐赠的骨髓造血干细胞作为对照组。收集到的骨髓标本中患者基本情况如下(表1)。标本来源于中南大学湘雅医院门诊或者住院部的AML患者，同时通过伦理审核并征得每位患者的知情同意。所有标本按照世界卫生组织2016年的急性髓系白血病诊断标准收入。按照治疗情况，将这些患者分为三组，分别为初治组 (Newly diagnosed AML,AML ND)，缓解组(Completely Remission AML, AMLCR)，和难治/复发组(Relapsed/Refractory AML,AML RR)。
表1 AML患者的基本信息
注：组间平均年龄、性别之间无统计学差异，p＞0.05
细胞培养
悬浮细胞培养
悬浮细胞HL-60、HL-60/Ara-c及THP-1用含10％胎牛血清的RPMI-1640 完全培养基培养，置于饱和湿度的二氧化碳(5％CO2)、37℃的细胞培养箱内培养。观察细胞生长状态，定期细胞换液，传代。取生长状态好、存活率高的细胞进行实验。
贴壁细胞培养
贴壁细胞HUV-EC-C用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养，置于饱和湿度的二氧化碳(5％CO2)、37℃的细胞培养箱内培养。观察细胞生长状态，定期细胞换液，传代。取生长状态好、存活率高的细胞进行实验。
骨髓标本提取单个核细胞
(1)采集新鲜AML患者骨髓标本约2-3mL，用肝素抗凝采血管4℃保存，24h内进行处理。
(2)用4℃的PBS按等比例稀释骨髓样本，混匀备用。
(3)将4℃保存的人淋巴细胞分离液2mL加入到15mL离心管中。用1mL 移液枪吸取混匀的后的骨髓和PBS稀释液，沿装有人淋巴细胞分离液的 15mL离心管管壁，离心管最少45°倾斜，将骨髓稀释液缓慢均匀的平铺于淋巴细胞分离液液面，切忌不能混匀，使骨髓稀释液与分离液液面呈明显表层。
(4)水平离心，0.4rcf/min×20mins。
(5)离心后取出离心管，避免震荡，可见细胞从下到上分为四层，分别是：红细胞、透明淋巴细胞分离液、乳白色单个核细胞以及血浆。用1000μL 移液枪插到第一层液面与第二层液面交界处，轻轻吸取乳白色单个核细胞层的细胞，置于另一干净15ml离心管中，完全吸取干净后，加入4℃的PBS 约2mL，吹打混匀。
(6)将细胞悬液离心，0.2rcf/min×5mins，可见细胞沉于管底(如果红细胞较多，需用红细胞裂解液裂解后再清洗)，弃上清，重复洗涤2次。
(7)加入PBS，吹打混匀细胞，重悬后备用。
Western blot
临床样本蛋白样品制备
(1)将骨髓样本提取的单个核细胞细胞悬液，离心0.2rcf/min×5mins，去上清。用4℃预冷的PBS洗涤2次，以1mL 4℃预冷的PBS吹打重悬后移入1.5mL离心管。
(2)离心0.2rcf/min×5mins，弃上清，细胞沉于离心管底部，备用。
(3)取存放于-20℃的蛋白裂解液NP40和蛋白酶抑制剂PMSF溶解，溶解后按100:1比例配置蛋白裂解液与蛋白酶抑制剂约1mL，混匀后置于冰上，根据提取的单个核细胞量加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂的混合液约 50-100μL，置于冰上裂解。
(4)将细胞悬液置于高速低温离心机中离心，4℃，12000rpm×5-10mins，离心后可见白色沉淀附在离心管壁上。
(5)吸取透明上清至1.5mL无菌离心管中，存放于-80℃冰箱中。
细胞株样本蛋白样品制备
(1)将悬浮的AML细胞取出(贴壁细胞先用胰酶消化)，离心 0.2rcf/min×5mins，去掉上清。用4℃预冷的PBS洗2次，以1mL 4℃预冷的 PBS吹打混匀后移入1.5mL无菌离心管中，置于冰上备用。
(2)离心0.2rcf/min×5mins，去掉上清，可见细胞沉于离心管底部。
(3)取存放于-20℃的NP40和PMSF溶解，溶解后按100:1比例配置混合液约1mL，混匀后置于冰上。
(4)根据提取的单个核细胞量加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂的混合液约50-100μL，置于冰上裂解。
(5)将细胞悬液置于高速低温离心机中离心，4℃，12000rpm×5-10mins，离心后可见白色沉淀附在离心管壁上。
(6)吸取透明上清至1.5mL无菌离心管中，存放于-80℃冰箱中。
测定蛋白含量(BCA法)
(1)取置于-20℃冰箱蛋白标准品溶液(2μg/μl)于冰上溶解。
(2)配制足量BCA工作液。按200μl/孔的BCA工作液及样本总数计算所需BCA工作液总体积，将试剂盒中的A液和B液按50:1的比例充分混匀，制成工作液，保存在4℃冰箱中24小时内使用有效。
(3)将蛋白标准品溶液分别按0、2、4、6、8、10μL加到96孔板中的标准品孔中，按顺序依次做好标记，每孔中按10、8、6、4、2、0μL的体积加入ddH2O，使每个标准品孔总体积补足至10μL，每个孔标准蛋白浓度为 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg/μl。(每个浓度设置三个复孔)
(4)在同一96孔板的待测样品孔中分别加入ddH2O 9μL/孔，再分别加入待测样本蛋白1μL，总体积10μL(每份待测样本设置三个复孔)。
(5)各孔中均分别加入200μL已配好的BCA工作液，轻轻摇匀，放置于37℃温箱孵育30mins。
(6)设定酶标仪参数，波长562nm，Flash 5，检测吸光光度值(OD值)。用Excel绘制标准曲线后得出关于标准蛋白和OD值的回归方程，按照方程计算出相应待测样品的蛋白浓度，再按稀释比例算出原蛋白样本的浓度，并计算出每个样本上样量。
凝胶电泳
(1)将两块厚薄玻璃板仔细洗净后，再用ddH2O冲洗后晾干。
(2)将两块干净的厚薄玻璃板对齐，用制胶夹夹紧，再卡紧在放有配套防漏胶条的制胶架上，置于水平桌面上待灌胶。
(3)制备下层胶。按SDS-PAGE分离胶(10％)方法配置，混匀后立即用1mL移液枪进行水平灌胶，灌胶至制胶架横梁下缘后停止，用1mL移液枪吸取双蒸水后水平、均匀、快速地封在下层胶液面上。
(4)制备上层胶。置约15-30mins，观察双蒸水和下层胶交界界面出现折光线时，表明下层胶已凝固，倒掉上层水封，用滤纸吸干胶槽内残余水。按SDS-PAGE浓缩胶(5％)的配置方法配制上层胶，混匀后立即用1mL移液枪进行灌胶，灌胶完毕后抓住10孔梳子两端，两端均匀地轻插入上层胶中，注意梳齿下缘保持水平，插入时避免产生气泡，置于水平桌面上待凝固。
(5)静置约15-30mins后，用电泳夹将玻璃板两端夹紧，放入盛有足量电泳缓冲液的电泳槽中。胶槽中间必须加满电泳缓冲液，胶槽外有适量电泳缓冲液即可，之后将梳子沿两端轻拔出，避免气泡及碎胶产生。
(6)蛋白变性。取出-80℃的蛋白样本于冰上溶解，按蛋白样本体积的4 倍加入5×SDS上样缓冲液，充分震荡混匀后置于100℃干式恒温加热器中加热5mins，使蛋白变性。变性完成后将样品迅速置于冰上冷却。
(7)上样。左边第一个孔内加入5μL蛋白标记样品(Maker)，依次在余下各个梳孔中用10μL移液枪加入已计算好等量上样量的变性蛋白样本。上样需充分混匀蛋白样，上样时应注意避免气泡产生。
(8)电泳。80V恒压电泳上层胶约15-20mins，当溴酚蓝带跑至上层胶和下层胶交界处，病出现红色条带(75kd)，上层胶上预染条带均已跑开后，改电压120V继续恒压电泳45mins左右，当溴酚蓝带跑到接近胶底时停止电泳，准备转膜。
转膜
(1)切胶。取出玻璃板将其浸泡于4℃预冷的废转膜缓冲液中，撬开玻璃板，切掉上层胶，根据蛋白Marker指示带裁取出目的蛋白(57kd)和内参 (GAPDH)所在的下层胶，测量切出的胶长度和宽度后剪出长宽稍长的PVDF 膜，将膜于甲醇中浸泡激活5mins。
(2)制作“三明治”。按转膜夹负极(黑色)—海绵—滤纸—胶—PVDF 膜—滤纸—海绵—转膜夹正极(红色)的顺序依次叠好，整齐压平，夹紧转膜夹，PVDF膜和胶之前应避免残留有气泡。
(3)将转膜夹正负极对准转膜槽上正负极后放入转膜槽中，倒入没过转膜夹的4℃预冷的转膜缓冲液，盖上盖子后埋入冰盒中，以290mA恒流转膜约70mins。
(4)转膜结束后，可见Maker清晰印在PVDF膜上，胶条透明，说明转膜成功，丢弃胶条。
免疫反应
(1)封闭。5％脱脂牛奶封闭PVDF膜约1h，各目的条带及内参分开封闭，注意置于摇床上室温充分封闭。
(2)清洗牛奶。脱脂牛奶封闭完成后，将膜分别用1×TBST缓冲液置于摇床上清洗3遍，每遍10mins，清洗完后用滤纸轻轻吸干膜两面。
(3)一抗孵育。在一抗孵育盒中加入约4μL已配置好的一抗(抗 HMGCS1，浓度1:2500)4℃孵育过夜。注意放置于摇床上，使抗体与膜表面蛋白充分结合。
(4)清洗一抗。一抗孵育过夜后回收，4℃保存(可循环利用，最多再用2次)；将膜放置于摇床上用1×TBST缓冲液快速冲洗3遍，每遍10mins；清洗完后用滤纸轻轻吸干膜两面。
(5)二抗孵育。在二抗孵育盒中加入已配置好的二抗(羊抗兔，浓度 1:3000)，膜充分浸泡在抗体中，室温孵育1h。注意放置于摇床上，使抗体与膜表面蛋白充分结合。
(6)清洗二抗。将已孵育完二抗的膜用1×TBST缓冲液于摇床上充分清洗3遍，每遍约10mins，清洗完后发光。
化学发光成像
(1)将预混ECL发光液从4℃冰箱取出待用，注意避光。
(2)将洗好的膜用滤纸轻轻吸干膜两面，摆好正反面，平放于清洁的玻璃培养皿上，根据每张膜的大小加入适量发光液(约200μL)，避光静置约 5s使发光液与膜蛋白充分接触，避免膜上气泡，可用镊子轻轻压膜下气泡。
(3)打开凝胶成像仪，将玻璃皿放入成像处进行显色成像。用Image Lab 软件获得内参及目的条带成像。
(4)用Image J软件分析各条带灰度值，用Excel计算各目的条带灰度值与内参灰度值比值，可调整内参。
统计方法
应用成像软件Image Lab以及Image J软件进行图像分析，应用GraphPad Prism 7做统计图表，进行数据统计分析。多样本比较进行t检验。P<0.05 认为结果有统计学意义。
本发明通过以上实验步骤证明了HMGCS1基因在急性髓系白血病细胞中的作用及对药物敏感性的影响如下
1、HMGCS1在AML细胞株中表达高于人脐静脉内皮细胞株，且在耐药株中表达高于普通AML细胞株
通过蛋白免疫印迹(Western Blot)方法，比较正常细胞株(人脐静脉内皮细胞株，HUV-EC-E)和白血病细胞株，我们检测到HMGCS1在AML细胞株中显著增高(图3)。同时，检测到HMGCS1的蛋白水平在阿糖胞苷白血病细胞株，即HL-60/Ara-c中，较普通HL-60细胞株表达明显增高(图 3)。
图3中，(a)用蛋白免疫印迹方法检测正常细胞株(人脐静脉内皮细胞， HUV-EC-E)和AML细胞株中HMGCS1的蛋白表达水平，以GAPDH作为内参，和正常细胞株(HUV-EC-E)比较后发现，AML细胞株中的HMGCS1 在蛋白水平表达明显增高，且阿糖胞苷HL-60细胞株较普通AML细胞株中的HMGCS1表达增高。(b)用GraphPad Prism 7软件分析多次蛋白免疫印迹方法检测细胞株中HMGCS1相对内参GAPDH的灰度值，结果发现AML 细胞株中的HMGCS1蛋白水平较正常细胞株(HUV-EC-E)表达明显增高(P <0.001)，且HMGCS1在阿糖胞苷HL-60细胞株中较普通AML细胞株中表达增高(P<0.005)。**P<0.005，***P<0.001。
2、HMGCS1在AML患者中，初治组和难治/复发组较缓解组和正常组表达增高
本实验通过蛋白免疫印迹(Western Blot)方法检测成人AML患者的初治组(AMLND)、缓解组(AML CR)、难治/复发组(AML RR)以及正常对照组(Normal)的HMGCS1蛋白的表达差异。提示难治/复发组(AML RR)中HMGCS1的蛋白水平较治疗后缓解患者(AML CR)和正常成人组(Normal)的表达明显增加(P<0.005)(图4)。由以上实验结果可知，在急性髓系白血病中难治/复发患者中，相比较缓解患者与正常成人，HMGCS1 的蛋白表达明显增高，说明HMGCS1与急性髓系白血病的疾病进展有关。
图4中，(a-b)采用蛋白免疫印迹方法检测AML患者中HMGCS1蛋白的表达水平。结果发现难治/复发组AML患者中的HMGCS1较缓解组和正常对照组表达明显增高。**P<0.005，***P<0.001。
本发明通过上述实验结果得出如下结论
急性髓系白血病是血液系统中的恶性增殖性肿瘤，部分难治/复发AML 对化疗药物治疗效果不理想、普遍生存期较短、预后差，即使经过治疗后能达到完全缓解的水平，缓解后早期复发的风险仍非常大。随着对AML发病机制、基因水平和代谢方向的相关研究，人们逐渐意识到AML细胞的肿瘤代谢对于疾病的进展和转归至关重要，甚至AML耐药的产生也与肿瘤细胞的代谢改变相关。
通过Western Blot技术，检测各组AML患者的骨髓标本中HMGCS1蛋白水平表达情况，结果发现相对于缓解组和正常对照组，在难治/复发组的骨髓标本中HMGCS1均高表达。由此可以推断，HMGCS1的过表达与急性髓系白血病的状态密切相关。本实验分别比较了初治组、缓解组和难治/复发组的急性髓系白血病患者及正常成人中HMGCS1蛋白的表达差异。我们的实验结果证明，HMGCS1的蛋白水平在难治/复发患者中较缓解患者及正常对照组中的表达明显增加。但是，目前收集的样本量有限，后期将会继续收集各类AML患者的骨髓标本，扩大样本量，使我们的实验更完善。同时，通过检测正常人脐静脉内皮细胞及急性髓系白血病细胞中的HMGCS1发现， AML细胞中HMGCS1蛋白的表达较正常细胞明显上调，其中耐药AML细胞中HMGCS1蛋白的表达较普通AML细胞增高。总而言之，HMGCS1与 AML的发病、耐药及预后有关，有望成为治疗急性髓系白血病的新方向。
因此，本发明证实了HMGCS1在复发/难治AML患者及AML细胞中均有高表达，在耐药株和野生型AML细胞中表达有差异，提示HMGCS1作为 MVA途径中的重要基因可能与急性髓系白血病的发病及复发、耐药相关。
二：HMGCS1抑制剂hymeglusin在AML细胞中对其增殖与耐药的影响
技术路线
技术路线2，如图5所示
主要实验方法
悬浮细胞培养
悬浮细胞HL-60、HL-60/Ara-c及THP-1用含10％胎牛血清的RPMI-1640 完全培养基培养，置于饱和湿度的二氧化碳(5％CO2)、37℃的细胞培养箱内培养。观察细胞生长状态，定期细胞换液，传代。取生长状态好、存活率高的细胞进行实验。
贴壁细胞培养
贴壁细胞HUV-EC-C用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养，置于饱和湿度的二氧化碳(5％CO2)、37℃的细胞培养箱内培养。观察细胞生长状态，定期细胞换液，传代。取生长状态好、存活率高的细胞进行实验。
细胞增殖的检测
Hymeglusin处理细胞
(1)取HUV-EC-E、HL60、HL60/Ara-c和THP-1的细胞株，进行细胞计数，如下表分别按5×104个/mL细胞接种于96孔板，细胞悬液总体积为 100μL，每种浓度设置3个复孔。
(2)按下表每个孔中加入浓度分别为0.0mmol/L、0.0125mmol/L、0.025mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L的HMGCS1抑制剂Hymeglusin 8μL，放入饱和湿度的二氧化碳(5％CO2)、37℃的细胞培养箱中培养72h。
(3)72小时后，在各待测孔中分别加入CCK-8溶液，每孔中加入10μL，继续放入细胞培养箱孵育3-4h。
(4)设定酶标仪参数，波长450nm，Flash 5，检测吸光光度值(OD值)。
阿霉素处理细胞
(1)取THP-1的细胞，进行细胞计数，分别按5×104个/mL接种于96 孔板，配制每孔为90μL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每种浓度3个复孔。
(2)按每个孔中加入浓度分别为0.0μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、 4.0μmol/L、8.0μmol/L、16.0μmol/L的阿霉素10μL。
(3)在各培养孔中分别加入CCK-8溶液，每孔中加入10μL，继续放入饱和湿度的二氧化碳(5％CO2)、37℃的细胞培养箱孵育3-4h。
(4)设定酶标仪参数，波长450nm，Flash 5，检测吸光光度值(OD值)。
Hymeglusin联合阿霉素处理细胞
(1)取THP-1的细胞，进行细胞计数，分别按5×104个/mL接种于96 孔板，配制每孔为90μL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每种浓度3 个复孔。
(2)按下表每个孔中加入浓度分别为0.0μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、 4.0μmol/L、8.0μmol/L、16.0μmol/L的阿霉素10μL。
(3)每孔中各加入浓度为0.1mmol/L的HMGCS1抑制剂Hymeglusin 8μL，放入培养箱中培养48小时。
(4)各待测孔中加入10μL CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续孵育 3-4h。
(5)设定酶标仪参数，波长450nm，Flash 5，检测吸光光度值(OD值)。
细胞凋亡的检测
(1)选取细胞株THP-1，进行细胞计数，将1×106/mL的细胞株分别接种于6孔板中，按已选定的浓度0μmol/L、4μmol/L、8μmol/L加入抑制剂 Hymeglusin，放入饱和湿度的二氧化碳(5％CO2)、37℃的细胞培养箱中继续培养24小时。
(2)24小时后用1000μl移液枪吸出细胞悬液，1.0rcf×5mins，弃上清，用4℃的PBS重复洗涤2次，弃上清。
(3)用ddH2O稀释5×Binding Buffer为1×的工作液，取1mL4℃的 1×BindingBuffer工作液重悬细胞，使细胞浓度约为1×106个/mL。
(4)每个浓度的细胞悬液设4个样品管，分别为空白管，单标管1 (Annexin V-APC，5μL)，单标管2(7-AAD，10μL)，双标管(5μL Annexin V-APC和10μL 7-AAD)，每个样品管中加入100μL细胞悬液，使细胞浓度约为1×105个/管后，每管中加入相应抗体。
(5)轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15mins。
(6)每管加入380μL预冷1×Binding Buffer。
(7)处理后的细胞上流式细胞仪检测凋亡率。
统计方法
应用Excel进行数据计算，Flow Jo 10软件做图，应用GraphPad Prism 7 做统计图表。多样本用单因素方差分析或t检验。P＜0.05认为结果有统计学意义。
本发明通过以上实验步骤证明Hymeglusin抑制剂在急性髓系白血病细胞中的作用及对药物敏感性的影响如下
1、Hymeglusin抑制AML细胞株的增殖，对正常细胞株的增殖未造成明显影响
本实验组将两种急性髓系白血病细胞HL-60和THP-1，与人脐静脉内皮细胞株HUV-EC-E比较，分别用不同浓度的hymeglusin处理72h，采用CCK-8 方法检测细胞生长抑制率。另外我们对比用抑制剂hymeglusin处理正常细胞株和白血病细胞株的结果，来探讨分别抑制HMGCS1对AML细胞的影响有无差异。
我们将HMGCS1抑制剂hymeglusin加入正常人脐静脉内皮细胞HUV-EC-E 中，予以处理72h，采用CCK-8方法检测细胞存活率。我们发现hymeglusin 对HUV-EC-E细胞株的增殖未造成明显影响(P<0.001)(图6)。这个结果揭示，抑制剂hymeglusin对正常的细胞的作用微乎其微，应用于临床治疗的可行性较强，将药物对正常细胞的毒副作用控制在最低限度是临床治疗需要关注的重要问题。以不同浓度的hymeglusin作用于急性髓系白血病细胞株(HL-60、THP-1、HL-60/Ara-c)和人脐静脉内皮细胞株HUV-EC-E，培养 24h后，细胞株的增殖曲线。可得出1)抑制剂hymeglusin对正常细胞株的增殖未造成明显影响；2)在急性髓系白血病细胞株中能明显抑制细胞的增殖。*P<0.05，***P<0.001。
2、Hymeglusin抑制剂对阿糖胞苷AML细胞株的增殖抑制较明显
本实验组取两种AML细胞株，HL-60和HL-60/Ara-c进行比较，分别用不同浓度的hymeglusin处理72h，采用CCK-8方法检测细胞生长抑制率(图 7)。由此可知，在耐药株中hymeglusin对细胞增殖的抑制作用更强(P<0.001)。以不同浓度的hymeglusin作用于急性髓系白血病细胞株(HL-60、 HL-60/Ara-c)，培养24h后，用CCK-8检测吸光度后得出细胞株的增殖曲线。可得出在阿糖胞苷的AML细胞株中抑制作用强于普通的AML细胞株。 ***P<0.001。
3、Hymeglusin促进AML细胞株的凋亡
通过对急性髓系白血病细胞THP-1，用不同浓度hymeglusin处理24h后，采用Annexin V-PE/7-AAD试剂盒检测AML细胞凋亡率，验证hymeglusin 是否能促进AML细胞的凋亡。结果提示，HMGCS1的抑制剂hymeglusin 对急性髓系白血病细胞株的凋亡有促进作用(图8)。以不同浓度的 hymeglusin作用于急性髓系白血病细胞株THP-1后培养24h，检测细胞株的凋亡率。如图可见药物处理后的细胞株的凋亡比例较未处理组明显升高。
4、Hymeglusin联合阿霉素作用于AML细胞株抑制细胞的增殖，作用较强
本实验组设为两组，取THP-1细胞，(1)加入不同浓度的阿霉素处理， (2)在已加入不同浓度的阿霉素处理组中加入同浓度HMGCS1抑制剂 hymeglusin(8μM)；分别培养48h，采用CCK-8方法检测细胞生长抑制率，由此可知，hymeglusin联合阿霉素对细胞增殖的抑制作用更强(P<0.001)。以 HMGCS1抑制剂hymeglusin联合阿霉素及阿霉素单药作用于急性髓系白血病细胞株(THP-1)，培养24h后用CCK-8检测吸光度后得出细胞株的增殖曲线。可得出抑制剂hymeglusin联合阿霉素对THP-1的抑制作用较单用阿霉素的抑制作用强。
本发明通过上述实验结果得出如下结论
急性髓系白血病对化疗药物的耐药及治疗后复发是目前临床治疗过程中较棘手的问题之一，且对化疗药物的治疗反应欠佳及治疗后耐药是AML治疗过程中及治疗后发生AML复发的主要原因。目前许多的研究都参与阐明耐药机制、耐药作用的因素，为攻克服AML的耐药而努力。造血干细胞移植虽然有可能从根本上治愈白血病，是目前治疗白血病的最好方法，但因配型难度、经济制约及风险较大等原因，仍难以普遍推广，所以目前白血病的治疗手段仍以联合化疗为主。
解决难治、复发白血病对化疗药物的耐药是治疗关键所在，而且，提高患者对化疗药物的敏感性能显著提高药物的临床疗效和改善患者的预后。本课题通过HMGCS1抑制剂hymeglusin作用后的普通AML细胞株、耐阿糖胞苷的AML细胞株以及正常人脐静脉内皮细胞株的增殖情况和AML细胞株的凋亡结果，我们可以看到HMGCS1的抑制可降低急性髓系白血病细胞的生长率，促进急性髓系白血病细胞的凋亡，且对正常细胞株的生长抑制较小，对阿糖胞苷的AML细胞株生长抑制作用更明显，hymeglusin联合阿霉素处理AML细胞比单用阿霉素处理抑制作用更强。以上结果都为研究 hymeglusin作为新的治疗急性髓系白血病药物的研发提供了理论基础，且有可能成为治疗AML细胞株耐药的潜在药物。
因此，本发明证实了：1.HMGCS1抑制剂hymeglusin在急性髓系白血病细胞株中能抑制细胞的增殖和促进其凋亡；且不对正常细胞株的增殖造成明显的影响。2.Hymeglusin能增强AML细胞株对化疗药物的敏感性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种用于治疗AML的药物，其为HMGCS1抑制剂：hymeglusin，所述hymeglusin化学结构式为：
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物至少还包含阿霉素。
3.HMGCS1抑制剂hymeglusin在制备抗AML药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为以HMGCS1抑制剂hymeglusin为活性成分，加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂、香味剂、甜味剂及色素。
5.根据权利要求4述的应用，其特征在于，所述药物为增加AML细胞对化疗药物，如阿霉素的敏感性的增敏剂。
6.根据权利要求4述的应用，其特征在于，所述药物为一种抗AML的联合药物，联合用药方案含有药学上有效量的HMGCS1抑制剂hymeglusin和药学上有效量的化疗药物，如阿霉素及药学上可接受的载体。
7.根据权利要求4-6任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物被制成药学上可接受的剂型，所述剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、纳米制剂、注射剂。
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