CN110161167A - 尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法，涉及尿液中甲卡西酮的贮存和检测技术领域，尿液中甲卡西酮的检测方法包括以下步骤：(1)、样品制备；(2)、仪器检测条件；(3)、质谱条件。该尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法，通过HPLC‑MS/MS法采用多反应监测模式(MRM)建立了尿液中甲卡西酮的定性定量方法，同时进行了长期稳定性考察，得出了甲卡西酮阳性尿液在不同环境中长期存储的降解规律，为确定甲卡西酮阳性尿液样本的安全稳定的存放方式和存放期限提供科学依据，同时所选初始浓度可覆盖所有阳性尿液样本的浓度范围，适用范围广。

Description

尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法

技术领域

本发明涉及尿液中甲卡西酮的贮存和检测技术领域，具体为一种尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法。

背景技术

甲卡西酮的滥用是一个持续存在的问题，对于滥用者的监测，可以采集各种生物样本进行检测，如尿液、血样、唾液和毛发等，其中尿液是最常用的检材，生物检材与毒品缴获物检材不同，毒品缴获物的性质是非常稳定的，一般不会受温度等外界环境的影响，而生物检材由于是人体的一部分或是人体排泄物和分泌物，其具有生物特性，例如检材会腐败变质、被污染以及检材中的毒品成分会降解等，因此生物检材的运输和存储都需要特殊的环境条件，一般情况下，在实际办案过程中，采集的生物检材常需要经过一段时间才能被送到实验室进行仪器分析，在标本采集和运输时，可能会暴露在各种可能的环境下，这就会使人产生一些质疑，因此迫切需要全面研究生物检材中毒品成分的稳定性来保证实验室检测时生物样本与采集时的样本一致。

在以往的研究中对生物检材中的毒品的稳定性进行过一些研究和探讨，包括血液中卡西酮的稳定性，唾液中卡西酮的稳定性，甲基甲卡西酮在福尔马林溶液中的稳定性，甲基甲卡西酮在尸检解剖样本中的稳定性等，其中有些研究报道的监测时间较短未达到要求的存储时限，部分研究监测方法操作复杂，尚未有对甲卡西酮的尿液样本用HPLC-MS/MS技术采用MRM法进行长期稳定性监测的研究，为此，我们提出一种尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法来解决这一问题。

发明内容

本发明的目的就是为了弥补现有技术的不足，提供了一种尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法，它具有快速和准确检测的优点，解决了对甲卡西酮阳性尿液的稳定性进行了为期六个月的研究，考察了初始浓度、存储温度和反复冻融条件对被分析物稳定性的影响，确定了影响因素和合适的阳性尿液保存条件的问题。

本发明为解决上述技术问题，提供如下技术方案：一种尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法，尿液中甲卡西酮的检测方法包括以下步骤：

(1)、仪器检测条件：高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)：岛津LCMS-8050，配有SIL-30AC自动采样器和LC-30AD检测系统进行分析，色谱柱为Waters Acquity UPLC@BEH·HILLIC(2.1×100mm，1.7μm)，流动相A为水相缓冲液，流动相B为有机相缓冲液，梯度洗脱程序为(洗脱程序见图1)：0～5min，流动相A由0％变为20％，6min，由20％变为0％，平衡1min，总运行时间为6min，流动相B由100％变为80％，6min，由80％变为100％，平衡1min，总运行时间为6min，柱温：35℃，进样量：1ul，流速为：0.4ml/min；

(2)、质谱条件：采集模式：正离子多反应监测(MRM)模式，(MRM检测参数见图2)；离子源温度：400℃，接口温度：300℃，DL温度：250℃，喷雾器氮气流量：2.0L/min，干燥气体流量：10.0L/min，加热气体流量：10L/min，碰撞电压：270kpa。

进一步的，所述水相缓冲液：量取2mL甲酸和0.63g甲酸铵，加入1000mL超纯水溶解。

进一步的，所述有机相缓冲液：量取2mL甲酸和0.63g甲酸铵，加入100mL超纯水溶解，加入900mL乙腈。

尿液中甲卡西酮的适宜储存条件探究方法：

(1)、样品制备：取100μl尿液加入100μl内标液(甲卡西酮-d3)和800μl乙腈涡旋混合，经0.22μm滤膜过滤至样品瓶；

(2)、方法验证：前期对尿液中甲卡西酮定量方法进行了验证试验，(验证结果见表3)，回收率在88.4％至96.5％之间，基质效应在101.5％至109％之间，定量限(LOD)均为5ng/mL，每项试验均取五份尿液样本进行平行分析，测定结果显示，低浓度和高浓度的尿液样品的精密度RSD值均低于6.5％；

(3)、初始浓度的确定：由于毒品滥用剂量、滥用时间和个人体质差异，尿液中毒品的含量差别很大，为了使监测结果更具代表性，在确定尿样中毒品初始浓度时，我们对采集的约100份尿液样本检测结果进行了统计分析(尿液样本中甲卡西酮浓度分布范围见图4)，根据实验结果，尿液中三种毒品浓度范围基本可以以0.1、1、10μg/mL为节点平均划分为四个部分(尿液样本中甲卡西酮浓度分布范围见图4)，最终确定此三个浓度为稳定性实验的初始浓度；

(4)、尿液的制备和取样：取空白尿液1升(PH值6.90-7.10)加入适量甲卡西酮标准溶液，制得浓度为0.1、1和10μg/mL的阳性尿液，分装于聚丙烯离心管中，每管1mL，分别存储于冷冻(-20℃)、冷藏(4℃)、室温(20℃)条件，其中冷冻存储的样品分为两部分，一部分为长期冷冻保存，另一部分为反复冻融保存，存储期限为6个月和12次冻结-解冻循环；

(5)、样本检测：样品制备好后立即进行仪器检测，检测结果作为初始浓度C0，分别存储于上述四种环境条件下，前3天内，每天进行一次取样检测，第1个月每周进行一次取样检测，第2个月到第6个月，每月进行1次抽样检测，每次取样，不同存储条件均取3份平行样本检测，计算浓度平均值，被分析过的聚丙烯管直接废弃；

(6)、数据分析：监测结果中，所取3份平行检测样本的RSD值均需小于12％，且实验采用t检验对检测结果进行统计评估，如果两组比较数据P＜0.05，说明有明显变化，否则无显著变化(尿液中甲卡西酮的监测含量与初始浓度的百分比及使用t检验统计数据之间的差异情况见图5)。

与现有技术相比，该尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法具备如下有益效果：

本发明通过HPLC-MS/MS法采用多反应监测模式(MRM)建立了尿液中甲卡西酮的定性定量方法，同时进行了长期稳定性考察，得出了甲卡西酮阳性尿液在不同环境中长期存储的降解规律，为确定甲卡西酮阳性尿液样本的安全稳定的存放方式和存放期限提供科学依据，同时所选初始浓度可覆盖所有阳性尿液样本的浓度范围，适用范围广，此外本研究在法医学和药理学研究中具有重要意义，首先法医和药物检测实验室中有很多尿液样本，需要储存一定的时间，而确定它们的最佳储存条件是至关重要的，其次这一结果有助于确定样本采集和实验室分析之间的时间间隔限制，第三有助于确定阳性尿液运输条件，避免尿液样本在日常运输和从采样地运输到实验室的过程暴露于不利的条件下，第四有助于解释在初检和复检结果之间的可能性差异，为法庭科学中涉及相关毒品吸食案件中检材复检结果的变化的评估提供相关参考依据。

附图说明

图1为本发明洗脱程序表；

图2为本发明MRM检测参数见表；

图3为本发明甲卡西酮定量分析方法验证结果表；

图4为本发明尿液样本中甲卡西酮浓度分布范围表；

图5为本发明尿液中甲卡西酮监测结果表。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-5，本发明提供一种技术方案：一种尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法，尿液中甲卡西酮的检测方法包括以下步骤：

(1)、仪器检测条件：高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)：岛津LCMS-8050，配有SIL-30AC自动采样器和LC-30AD检测系统进行分析，色谱柱为Waters Acquity UPLC@BEH·HILLIC(2.1×100mm，1.7μm)，流动相A为水相缓冲液，流动相B为有机相缓冲液，梯度洗脱程序为(洗脱程序见图1)：0～5min，流动相A由0％变为20％，6min，由20％变为0％，平衡1min，总运行时间为6min，流动相B由100％变为80％，6min，由80％变为100％，平衡1min，总运行时间为6min，柱温：35℃，进样量：1ul，流速为：0.4ml/min；

(2)、质谱条件：采集模式：正离子多反应监测(MRM)模式，(MRM检测参数见图2)；离子源温度：400℃，接口温度：300℃，DL温度：250℃，喷雾器氮气流量：2.0L/min，干燥气体流量：10.0L/min，加热气体流量：10L/min，碰撞电压：270kpa。

进一步的，所述水相缓冲液：量取2mL甲酸和0.63g甲酸铵，加入1000mL超纯水溶解。

进一步的，所述有机相缓冲液：量取2mL甲酸和0.63g甲酸铵，加入100mL超纯水溶解，加入900mL乙腈。

尿液中甲卡西酮的适宜储存条件探究方法：

(1)、样品制备：取100μl尿液加入100μl内标液(甲卡西酮-d3)和800μl乙腈涡旋混合，经0.22μm滤膜过滤至样品瓶；

(2)、方法验证：前期对尿液中甲卡西酮定量方法进行了验证试验，(验证结果见表3)，回收率在88.4％至96.5％之间，基质效应在101.5％至109％之间，定量限(LOD)均为5ng/mL，每项试验均取五份尿液样本进行平行分析，测定结果显示，低浓度和高浓度的尿液样品的精密度RSD值均低于6.5％；

(3)、初始浓度的确定：由于毒品滥用剂量、滥用时间和个人体质差异，尿液中毒品的含量差别很大，为了使监测结果更具代表性，在确定尿样中毒品初始浓度时，我们对采集的约100份尿液样本检测结果进行了统计分析(尿液样本中甲卡西酮浓度分布范围见图4)，根据实验结果，尿液中三种毒品浓度范围基本可以以0.1、1、10μg/mL为节点平均划分为四个部分(尿液样本中甲卡西酮浓度分布范围见图4)，最终确定此三个浓度为稳定性实验的初始浓度；

(4)、尿液的制备和取样：取空白尿液1升(PH值6.90-7.10)加入适量甲卡西酮标准溶液，制得浓度为0.1、1和10μg/mL的阳性尿液，分装于聚丙烯离心管中，每管1mL，分别存储于冷冻(-20℃)、冷藏(4℃)、室温(20℃)条件，其中冷冻存储的样品分为两部分，一部分为长期冷冻保存，另一部分为反复冻融保存，存储期限为6个月和12次冻结-解冻循环；

(5)、样本检测：样品制备好后立即进行仪器检测，检测结果作为初始浓度C0，分别存储于上述四种环境条件下，前3天内，每天进行一次取样检测，第1个月每周进行一次取样检测，第2个月到第6个月，每月进行1次抽样检测，每次取样，不同存储条件均取3份平行样本检测，计算浓度平均值，被分析过的聚丙烯管直接废弃；

(6)、数据分析：监测结果中，所取3份平行检测样本的RSD值均需小于12％，且实验采用t检验对检测结果进行统计评估，如果两组比较数据P＜0.05，说明有明显变化，否则无显著变化(尿液中甲卡西酮的监测含量与初始浓度的百分比及使用t检验统计数据之间的差异情况见图5)。

工作原理：建立了采用HPLC-MS/MS多反应监测(MRM)模式对尿液中甲卡西酮的检测方法，MRM技术是一种基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术，并进行了方法验证，同时对含有甲卡西酮的阳性尿液样本进行为期6个月的监测，选取具有代表性的高、中和低三种初始浓度，定期对这三种毒品成分进行定量分析，目的是系统地评价尿液中甲卡西酮的稳定性与毒品浓度、储存条件的相关性，以确定阳性尿液样本的合适存储时间和存储方式，通过以上分析，对于甲卡西酮阳性尿液样本，含量对其稳定性影响较小，主要的影响因素是存储温度，甲卡西酮阳性尿液样本稳定性较差，需要冷冻保存于-20℃甚至更低的温度，需要注意的是，在反复冻融条件下，尿液中甲卡西酮的含量也会发生显著性降解，与冷冻条件下含量变化规律情况比较分析，此降解主要发生在尿液融化、平衡至室温和重新冷冻凝固的过程中，因此在对此类尿样的检测中应注意尽量减少融化和非低温条件下放置时间，同时在出现初复检结果差异时应综合考虑各种因素的影响程度。

在本发明的描述中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个引用结构”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。需要说明的是，在本文中，诸如“第一”、“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法，其特征在于：尿液中甲卡西酮的检测方法包括以下步骤：

(1)、仪器检测条件：高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)：岛津LCMS-8050，配有SIL-30AC自动采样器和LC-30AD检测系统进行分析，色谱柱为Waters Acquity UPLC @ BEH·HILLIC(2.1×100mm，1.7μm)，流动相A为水相缓冲液，流动相B为有机相缓冲液，梯度洗脱程序为(洗脱程序见图1)：0～5min，流动相A由0％变为20％，6min，由20％变为0％，平衡1min，总运行时间为6min，流动相B由100％变为80％，6min，由80％变为100％，平衡1min，总运行时间为6min，柱温：35℃，进样量：1ul，流速为：0.4ml/min；

(2)、质谱条件：采集模式：正离子多反应监测(MRM)模式，(MRM检测参数见图2)；离子源温度：400℃，接口温度：300℃，DL温度：250℃，喷雾器氮气流量：2.0L/min，干燥气体流量：10.0L/min，加热气体流量：10L/min，碰撞电压：270kpa。

2.根据权利要求1所述的一种尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法，其特征在于：所述水相缓冲液：量取2mL甲酸和0.63g甲酸铵，加入1000mL超纯水溶解。

3.根据权利要求1所述的一种尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法，其特征在于：所述有机相缓冲液：量取2mL甲酸和0.63g甲酸铵，加入100mL超纯水溶解，加入900mL乙腈。

4.根据权利要求1所述的一种尿液中甲卡西酮的贮存和检测方法，其特征在于：尿液中甲卡西酮的适宜储存条件探究方法：

(1)、样品制备：取100μl尿液加入100μl内标液(甲卡西酮-d3)和800μl乙腈涡旋混合，经0.22μm滤膜过滤至样品瓶；

(2)、方法验证：前期对尿液中甲卡西酮定量方法进行了验证试验，(验证结果见表3)，回收率在88.4％至96.5％之间，基质效应在101.5％至109％之间，定量限(LOD)均为5ng/mL，每项试验均取五份尿液样本进行平行分析，测定结果显示，低浓度和高浓度的尿液样品的精密度RSD值均低于6.5％；

(3)、初始浓度的确定：由于毒品滥用剂量、滥用时间和个人体质差异，尿液中毒品的含量差别很大，为了使监测结果更具代表性，在确定尿样中毒品初始浓度时，我们对采集的约100份尿液样本检测结果进行了统计分析(尿液样本中甲卡西酮浓度分布范围见图4)，根据实验结果，尿液中三种毒品浓度范围基本可以以0.1、1、10μg/mL为节点平均划分为四个部分(尿液样本中甲卡西酮浓度分布范围见图4)，最终确定此三个浓度为稳定性实验的初始浓度；

(4)、尿液的制备和取样：取空白尿液1升(PH值6.90-7.10)加入适量甲卡西酮标准溶液，制得浓度为0.1、1和10μg/mL的阳性尿液，分装于聚丙烯离心管中，每管1mL，分别存储于冷冻(-20℃)、冷藏(4℃)、室温(20℃)条件，其中冷冻存储的样品分为两部分，一部分为长期冷冻保存，另一部分为反复冻融保存，存储期限为6个月和12次冻结-解冻循环；

(5)、样本检测：样品制备好后立即进行仪器检测，检测结果作为初始浓度C0，分别存储于上述四种环境条件下，前3天内，每天进行一次取样检测，第1个月每周进行一次取样检测，第2个月到第6个月，每月进行1次抽样检测，每次取样，不同存储条件均取3份平行样本检测，计算浓度平均值，被分析过的聚丙烯管直接废弃；

(6)、数据分析：监测结果中，所取3份平行检测样本的RSD值均需小于12％，且实验采用t检验对检测结果进行统计评估，如果两组比较数据P＜0.05，说明有明显变化，否则无显著变化(尿液中甲卡西酮的监测含量与初始浓度的百分比及使用t检验统计数据之间的差异情况见图5)。