CN110144303B - 一种哌嗪二酮类化合物、菌株及制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种哌嗪二酮类化合物、菌株及制备与应用，将微杆放线菌(Actinomycetes microbacterium)40DY180经发酵培养获得的发酵液离心，取上清液进行乙酸乙酯萃取，有机相经LH‑20凝胶柱、ODS反向柱、半制备液相分离纯化，获得所述哌嗪二酮类化合物；本发明的微杆放线菌40DY180，能够制备一种新的哌嗪二酮类化合物，该化合物具有抑制酪氨酸酶活性(250μM下的抑制率为50.69％)，可用于美白产品。

Description

一种哌嗪二酮类化合物、菌株及制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及海洋微生物与酶抑制剂领域，具体涉及一株微杆放线菌40DY180及其次级代谢产物在酶抑制剂方面的应用。
(二)背景技术
生命起源于海洋，海洋特殊生态环境中的生物资源已成为拓展天然药用资源的新空间，也是目前资源最丰富、保存最完整、最具有新药开发潜力的新领域。海洋微生物在寡营养的海洋环境条件下，可产生多种生理活性物质。在浩瀚的海洋中一定存在着大量超乎人们想象的化学结构新颖、生物活性多种多样、作用机制独特的次生代谢产物。研究开发海洋微生物生物活性物质有以下几方面优势：1.起源于海洋的微生物具有特异的遗传和代谢特性，往往能产生新型生物活性物质；2.来源于陆地的海洋微生物经过长期环境适应，其生理和代谢特性也发生明显变化，因而不少菌株能产生陆地上所不能产生的新活性物质。由于海洋环境的特殊性，海洋微生物具有独特的代谢方式，产生许多新颖的化学结构，代谢物化学结构具有极大的复杂性和多样性。海洋微生物有五类基本代谢物，即：胺及酰胺类、吲哚生物碱类、乙酰配基类、环肽类、聚丙酸酯类，其中以含氮化合物和乙酸酯类化合物占首位，萜类化合物较少。在已鉴定的海洋微生物代谢物中，约56％为含氮化合物，30％为乙酸酯类化合物，甲羟戊酸酯约占13％，含硫化物约占13％，卤化物约占8％，其中以氯化物为主。近30年来，海洋天然产物越来越受到科学家的重视，并已经成为发现重要先导药物的主要源泉和研制开发新药的基础。
酶抑制剂是一种可以抑制生物体内与某种疾病有关的专一酶活性，从而获得疗效的物质。酶抑制剂作为有用的工具，之所以越来越受到重视，不仅是因为它可用于研究酶的结构和反应机理，而且还由于它们有可能用于药理学研究和农业科学。已发现特异性和选择性蛋白酶抑制剂，可用于人类疾病诸如肺气肿、关节炎、胰腺炎、血栓形成、高血压、肌营养不良、癌症和艾滋病的致病过程中，抑制靶标蛋白酶的可能有效的工具。20世纪60年代初，Umezawa提出了酶抑制的概念，从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。酶抑制剂新药发现的途径：一是来源于天然化合物，包括动植物和各种微生物等，二是化学合成物。进入80年代以来，有报道在天然和实验室培养株系中陆续发现微囊藻属蓝藻还能产生另一些具有显著的药理活性，结构独特的多肽。这些活性多肽是通过筛选一些人体内具重要生理作用的酶的抑制剂而得到，现筛出的酶抑制剂有胰蛋白酶抑制剂，血管紧张素转换酶抑制剂，血浆酶抑制剂，凝血酶抑制剂，酪氨酸酶抑制剂，弹性蛋白酶抑制剂等多种。在目前上市的药物中，以受体为作用靶点的药物占52％，以酶为靶点的药物占22％，以离子通道为靶点的药物占6％，以核酸为靶点的药物占3％。因此，酶抑制剂的开发是新药来源的一个主要途径。以酶为靶点开发新药存在巨大潜力，今后很长一段时间仍然是发现新药的重要着手点。来自陆生微生物的新的酶抑制剂似乎是罕见的。这些微生物有可能产生具有相同结构的抑制剂。海洋环境的特征显著不同于陆地环境，因此海洋微生物很可能是酶抑制剂的重要的新的来源。
海洋环境高盐、高压、寡营养、低光照，这可以造就与陆地微生物不同的生理功能和代谢机制，大大提高了海洋微生物次级代谢产物的结构多样性和活性多样性。从海洋微生物当中筛选得到结构新颖，药理活性好的先导化合物是药学工作者的重心，相对具有比陆地微生物更加深远的研究价值。
(三)发明内容
本发明目的是针对现有技术不足，提供一种新菌株--微杆放线菌(Actinomycetesmicrobacterium 40DY180)，该菌株发酵制备一种对酪氨酸酶具有一定抑制活性的哌嗪二酮类化合物，可应用于美白产品。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种式(Ⅰ)所示哌嗪二酮类化合物(micropiperazinedion-A)，即(S)-3-((1H-咪唑-5-基)亚甲基)-6-甲基哌嗪-2,5-二酮，
Figure BDA0002003872690000021
第二方面，本发明提供一种所述哌嗪二酮类化合物的制备方法，所述方法为：将微杆放线菌(Actinomycetes microbacterium)40DY180经发酵培养获得的发酵液离心，取上清液进行乙酸乙酯萃取，有机相经LH-20凝胶柱、ODS反向柱、半制备液相分离纯化，获得所述哌嗪二酮类化合物；所述微杆放线菌(Actinomycetes microbacterium)40DY180，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC NO.60591，保藏日期2019年02月25日，地址中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075。
进一步，所述发酵液按如下方法制备：
(1)种子培养：将微杆放线菌40DY180接种于种子培养基中，在摇床于30℃，200rpm条件下培养1d，获得种子液；种子培养培养基组成：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，Nacl30g/L，溶剂为蒸馏水，pH值7.4；
(2)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵培养基中，在摇床转速200rpm、30℃振荡培养3d，获得发酵液。发酵培养基组成：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，Nacl 30g/L，溶剂为蒸馏水，pH值7.4。
进一步，所述哌嗪二酮类化合物的分离纯化方法为：1)取上清液，用等体积的乙酸乙酯(EtOAc)浸提3次，将EtOAc相减压蒸馏至无冷凝液流出，获得油状物质；将所得油状物质上LH-20凝胶柱(
Figure BDA0002003872690000031
LH-20凝胶柱填料，100-200目，有效长100cm，内径3.9cm)进行层析，用无水甲醇进行洗脱，每一个柱体积(500mL)收集一次流出液，共收集7次；3)将第6次收集的流出液减压蒸干后上ODS反向柱(ODS-AQ-HG(C18)反向色谱柱填料，有效长度50cm，内径5cm)进行层析，分别用甲醇∶水(v/v)＝25∶75，50∶50洗脱液进行洗脱，每种洗脱液洗脱2个柱体积，收集体积比50:50的甲醇：水的流出液；4)将步骤3)收集的洗脱液减压蒸干后进行半制备液相(Shimadzu LC-2030C HPLC)分离，通过C18半制备柱(Waters Xbridge prepC18 5μm，10mm×250mm column)用甲醇：水(v/v)＝20：80洗脱，流速4.6ml/min，收集保留时间为3.7min的组分并减压蒸馏至干得到所述哌嗪二酮类化合物。
第三方面，本发明提供一种所述哌嗪二酮类化合物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。
第四方面，本发明还提供一种用于制备哌嗪二酮类化合物的微杆放线菌(Actinomycetes microbacterium)40DY180，所述微杆放线菌(Actinomycetesmicrobacterium)40DY180，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC NO.60591，保藏日期2019年02月25日，地址中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明的微杆放线菌40DY180，能够制备一种新的哌嗪二酮类化合物，该化合物具有抑制酪氨酸酶活性(250μM下的抑制率为50.69％)，可用于美白产品。
附图说明
图1化合物1的质谱图。
图2化合物1的1H NMR图。
图3化合物1的13C NMR图。
图4化合物1的H-H COSY图。
图5化合物1的HSQC图。
图6化合物1的HMBC图。
图7化合物1的UV图。
图8微杆放线菌40DY180的菌株形态。
图9微杆放线菌40DY180光学显微镜下的菌体形态。
图10微杆放线菌40DY180菌株系统发育树。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1微杆放线菌(Actinomycetes microbacterium)40DY180的筛选及鉴定
1、菌株40DY180的筛选
将太平洋海泥样品(21.1°N 159.2°E；-5591m)放置于无菌样品袋中，在-20℃下进行保藏。将海泥样品分别进行如下操作，筛选细菌。
(1)取海泥5g，在无菌研钵中加适量无菌海水研磨成细，置于预先装有灭好菌的LB液体培养基的锥形瓶中，30℃、180rpm震荡培养，富集12h，获得富集海泥悬液。
(2)然后取1ml富集海泥悬液用无菌去离子水进行梯度稀释，获得10-1-10-9九个稀释度的海泥悬液。
(3)分别取各稀释度海泥悬液100μL涂布于LB平板上，于30℃恒温培养箱中培养24h后，观察，挑取生长形态不同的菌落，在新的LB平板上进行划线，在30℃恒温培养箱中继续进行培养，连续传代至少5次，直至单个筛选平板上长成形态单一的单菌落。
(4)挑取纯化好的单菌落进行LB试管斜面纯培养，生长好的斜面菌落可在-20℃短期保存(3-6个月)，用20％甘油为冻存剂，刮取生长势态好的菌落在1ml EP管中制成甘油管，-80℃长期保存。
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、Nacl 10g/L、海盐33.3g/L，溶剂为去离子水，pH7.4。LB平板在LB液体培养基中添加质量浓度为2％的琼脂。
2、菌株40DY180的鉴定
(1)菌落特征：菌株40DY180菌体呈现淡黄色，菌落表面不光滑，有细小白色颗粒，在1000倍光学显微镜下可见为杆菌。
(2)菌株40DY180分子鉴定：采用16s rRNA进行，正向引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，反向引物：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR条件：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环，72℃延伸10min。NCBI BLAST 16s rRNA序列(40DY180的16s rRNA见SEQ ID NO.1所示)搜索结果与Microbacterium sp.菌株同源性100％，结合菌落特点，最终鉴定为Microbacterium，命名为微杆放线菌(Actinomycetes microbacterium)40DY180，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC NO.60591，保藏日期2019年02月25日，地址中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075。
实施例2：化合物制备
1、发酵
(1)种子培养：
将微杆放线菌40DY180接种于种子培养基中，在摇床于30℃，200rpm条件下培养1d，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，Nacl 30g/L，溶剂为蒸馏水，pH值7.4，用250ml的三角瓶每瓶分装100ml。
(2)发酵培养：
将种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵培养基中，在摇床转速200rpm、30℃振荡培养3d，获得发酵液。发酵培养基组成：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，Nacl30g/L，溶剂为蒸馏水，pH值7.4，于1×105Pa，120℃下灭菌1hr后分装于2L三角瓶，每瓶1L。
2、化合物的分离
取20L发酵液经8000rpm转速离心机离心分离，取上清液，再用等体积的乙酸乙酯(EtOAc)浸提3次，将EtOAc相减压蒸馏至无冷凝液流出，获得2.3g油状物质。
将所得油状物质上LH-20凝胶柱(
Figure BDA0002003872690000062
LH-20凝胶柱填料，100-200目，有效长100cm，内径3.9cm)进行层析，用无水甲醇进行洗脱，每一个柱体积(500ml)收集一次流出液，共收集七次。将第六次收集的流出液减压蒸干后(149.6mg)上ODS反向柱(ODS-AQ-HG(C18)反向色谱柱填料，有效长度50cm，内径5cm)进行层析，分别用甲醇∶水(v/v)＝25∶75，50∶50，80：20三种洗脱液进行洗脱，每种洗脱液洗脱两个柱体积(1000ml)收集全部流出液，总共收集三次，将第二次收集的流出液减压蒸干后(11.6mg，即甲醇∶水＝50:50洗脱液获得的流出液)进行半制备液相(Shimadzu LC-2030C HPLC)分离，通过C18半制备柱(WatersXbridge prep C18 5μm，10mm×250mm column)用甲醇：水(v/v)＝20：80，流速4.6ml/min，收集保留时间为3.7min的组分，减压蒸馏至干，获得化合物1(1.9mg，tR＝3.7min)。
3、结构鉴定
采用Varian 500MHz核磁共振仪测定化合物1的氢谱、碳谱及相关二维谱(H-HCOSY谱，HSQC谱，HMBC谱)辅助定位H和C的位置，其核磁数据见表1。
表1化合物1的NMR数据表(DMSO-d6，500MHz)
Figure BDA0002003872690000061
通过上述检测结果，确定了化合物1的所有碳原子和氢原子的归属，得到了该化合物的结构式：
Figure BDA0002003872690000071
将式(Ⅰ)所示哌嗪二酮类化合物命名为(S)-3-((1H-咪唑-5-基)亚甲基)-6-甲基哌嗪-2,5-二酮(micropiperazinedion A)，主要性质如下所示：
物理状态：无色粉末；
元素分析：C 52.42％；H 4.89％；N 27.17％；O 15.52％。
分子量：m/z 207.0886[M+H]+
分子式C9H10N4O2。
实施例3多巴速率法检测酪氨酸酶生物活性抑制
将实施例2制备的micropiperazinedion-A用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成2.5mM的micropiperazinedion-A的DMSO溶液，再用去离子水稀释至250μM，作为实验样品组。用微量移液枪依次准确吸取80微升PBS溶液(pH 7.4)、40微升酪氨酸酶溶液(200units/ml，溶解在PBS中)、40微升250μM micropiperazinedion-A溶液于96孔板中，在37℃培养20分钟后用SpectraMax M2 microplate reader读取其在490nm的OD值，记为C1，加入40微升L-酪氨酸(2.5mM，溶解在PBS中)作为底物，37℃下培养10分钟后用SpectraMax M2 microplatereader读取其在490nm下测定OD值，记为C2。同样条件下，以体积浓度为10％的DMSO水溶液阴性对照组，曲酸为阳性样品组。每个实验重复3次，计算平均值。根据公式1计算micropiperazinedion-A对酪氨酸酶活性的抑制率。由表2可见micropiperazinedion-A对酪氨酸酶活性的抑制率达到70.04％，具有抗酪氨酸酶活性。
Figure BDA0002003872690000072
表2化合物在250μM下对酪氨酸酶的抑制活性
化合物 抑制率
曲酸 70.04％
Micropiperazinedion-A 50.69％
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种哌嗪二酮类化合物、菌株及制备与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 265
<212> DNA
<213> 微杆放线菌(Actinomycetes microbacterium)
<400> 1
aacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct cttttagcaa ggaagaagcg 60
aaagtgacgg tacttgcaga aaaagcgccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 120
cgtagggcgc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggtttgtcg 180
cgtctgctgt gaaaactgga ggctcaacct ccagcctgca gtgggtacgg gcagactaga 240
gtgcggtagg ggagattgga attcc 265

Claims (5)

1.一种式(Ⅰ)所示哌嗪二酮类化合物，
Figure FDA0002703234990000011
2.一种权利要求1所述哌嗪二酮类化合物的制备方法，其特征在于所述方法为：将微杆放线菌(Actinomycetes microbacterium)40DY180经发酵培养获得的发酵液离心，取上清液，用等体积的乙酸乙酯浸提3次，将乙酸乙酯相减压蒸馏至无冷凝液流出，获得油状物质；将所得油状物质上LH-20凝胶柱进行层析，用无水甲醇进行洗脱，每一个柱体积收集一次流出液，共收集7次；将第6次收集的流出液减压蒸干后上ODS反向柱进行层析，分别用体积比25∶75，50∶50的甲醇∶水作为洗脱液进行洗脱，收集体积比50:50的甲醇：水的流出液；将收集的流出液减压蒸干后进行半制备液相分离，通过C18半制备柱用体积比20:80的甲醇：水洗脱，流速4.6ml/min，收集保留时间为3.7min的组分并减压蒸馏至干，获得所述式(Ⅰ)所示哌嗪二酮类化合物；所述微杆放线菌(Actinomycetes microbacterium)40DY180，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC NO.60591，保藏日期2019年02月25日，地址中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述发酵液按如下方法制备：
(1)种子培养：将微杆放线菌40DY180接种于种子培养基中，在摇床于30℃，200rpm条件下培养1d，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，Nacl 30g/L，溶剂为蒸馏水，pH值7.4；
(2)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵培养基中，在摇床转速200rpm、30℃振荡培养3d，获得发酵液；发酵培养基组成：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，Nacl 30g/L，溶剂为蒸馏水，pH值7.4。
4.一种权利要求1所述哌嗪二酮类化合物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。
5.一种用于制备权利要求1所述哌嗪二酮类化合物的微杆放线菌40DY180，所述微杆放线菌(Actinomycetes microbacterium)40DY180，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC NO.60591，保藏日期2019年02月25日，地址中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075。
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