CN110133289B - 磷酸化神经丝蛋白重链在梅毒检测中的应用 - Google Patents

磷酸化神经丝蛋白重链在梅毒检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及磷酸化神经丝蛋白重链在梅毒检测中的应用。具体地说，本发明提供了一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测生物样品中pNF‑H水平的检测试剂例如抗pNF‑H的抗体。本发明还提供了用于检测pNF‑H的第一检测试剂和可选的第二检测试剂在制备梅毒检测试剂盒中的应用，所述第二检测试剂为用于检测NF‑L、脑脊液白细胞、脑脊液白蛋白等的检测试剂。本发明以用于梅毒尤其是神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估，具有可靠、灵敏、方便和快捷等优点。

Description

磷酸化神经丝蛋白重链在梅毒检测中的应用
本申请是发明名称为“磷酸化神经丝蛋白重链在梅毒检测中的应用”、申请号为“201810253688.2”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及磷酸化神经丝蛋白重链(pNF-H)在神经梅毒检测中的应用。
背景技术
梅毒是由梅毒螺旋体侵入人体后引起的一种全身性、感染性疾病。梅毒螺旋体是一种小而纤细的螺旋状微生物，横断分裂的方式进行繁殖，其结构中有维持螺旋体弹性的轴纤维，可以屈曲及伸缩，有利于梅毒螺旋体穿入宿主组织。梅毒螺旋体在人体外不易生存，煮沸立即死亡，干燥肥皂水以及酒精等一般的消毒剂可以很容易将其杀死，因此目前不能体外培养，梅毒螺旋体在低温(-78℃)下可保存数年，仍能保持其形态活力及毒性。梅毒螺旋体在不能体外培养可以在一定程度上限制了梅毒螺旋体的传播和侵入，但是也使得对梅毒螺旋体的研究以及对梅毒疾病的研究造成了极大的困难和不变，因此目前梅毒的诊断、治疗以及预后研究进展不大。
近10年来，梅毒的发病率在逐年升高，从2006年的12.80(1/10万)上升至2015年的31.85(1/10万)，远远没有实现消灭梅毒的目标(参见图1)。虽然随着青霉素治疗的推广应用，梅毒患者的生存质量得到显著提升，死亡率显著下降，梅毒仍然是应该引起高度重视的乙类传染病。
当梅毒螺旋体侵入人体后，首先在皮肤粘膜的侵入部位繁殖，形成一期梅毒硬下疳，为界限清楚、边缘隆起、基底坚实、软骨样硬度的无痛性圆形或椭圆形浅在性溃疡，并可伴随腹股沟或患侧淋巴结肿大。若一期梅毒未治疗或者治疗未彻底，则梅毒螺旋体可通过淋巴系统进入血液循环，播散至全身，临床上主要表现为二期梅毒疹，包括斑疹、丘疹、脓庖等等。一期梅毒硬下疳和二期梅毒疹都具有自限性，且一般不留痕迹，如果未能治疗或者治疗不成功，则进入隐性梅毒阶段。梅毒螺旋体在人体内潜伏数年后(2年及以上)，对所潜伏的器官造成不同程度的损害，可累及神经系统、心脏、骨骼、血管等，即进入三期梅毒。需要注意的是，已有研究证明早期梅毒患者的脑脊液接种于动物后可分离到梅毒螺旋体，说明梅毒螺旋体在侵入人体早期，就能够入侵到神经系统。
神经梅毒并非是只发生在三期梅毒，而是可以发生于梅毒的各个阶段。神经梅毒可分为无症状神经梅毒(Asymptomatic Neurosyphilis)、脑脊膜梅毒(MeningealSyphilis，包括梅毒性脑膜炎和梅毒性硬脊膜炎)、脑膜血管梅毒(MeningovascularSyphilis)、实质性神经梅毒(麻痹性痴呆(general Paresis)和脊髓痨(Tabes Dorsalis))及树胶肿性神经梅毒。
无症状神经梅毒是指梅毒的血浆学检查阳性，脑脊液存在异常，但是无神经系统的症状和体征。O’Leary等人的研究发现，13.5％的梅毒患者(包含各个梅毒阶段)是无症状神经梅毒，而Keidel等人在一期梅毒和二期梅毒的研究中发现20％的患者至少存在一种脑脊液异常(O’Leary PA,Cole HN,Moore JE,et al.Cooperative clinical studies inthe treatment of syphilis:Asymptomatic neurosyphilis.Arch Derm Syphilol1937；35:387–401；Keidel A,Moore JE.Studies in asymptomatic neurosyphilis I:Atentative classification of early asymptomatic neurosyphilis.Arch NeurolPsychiatry 1921；6:286–291y)。无症状神经梅毒通常发生在感染后的12至18个月，是神经梅毒的最初阶段，无症状神经梅毒患者比脑脊液正常的梅毒患者更容易进展为有症状神经梅毒，因此应对可疑患者进行脑脊液检查，以期早发现早治疗，避免无症状神经梅毒进展为有症状神经梅毒。
梅毒被称为最伟大的模仿者，而神经梅毒的临床表现亦是复杂多变，症状无特异性，几乎包括神经病学中的所有各种症状与体征，可出现神经科、眼科、皮肤科、精神科等科相似的临床表现，因此对神经梅毒的误诊率高，误诊率达55.6％，比如神经梅毒引起的青壮年不明原因脑梗死，青壮年出现癫痫、智能障碍等可能被误诊，因此，神经梅毒的正确诊断和及时治疗是非常重要的。
目前并没有诊断神经梅毒的金标准，实验室检测有助于神经梅毒的诊断；但是并没有单个检测方法可用于所有情况下神经梅毒的诊断。神经梅毒的诊断依赖于血浆学试验、脑脊液(CSF)检查、神经症状和体征的综合分析。对于出现神经梅毒临床症状的患者需要进一步测试。
血浆学试验主要包括两类试验，即非梅毒螺旋体抗原血浆试验和梅毒螺旋体抗原血浆试验。非梅毒螺旋体抗原血浆试验是以心磷脂作为抗原，检测血浆中的对心磷脂有反应的抗体，其中目前应用最广泛的是快速血浆反应素环状卡片试验(RPR，Rapid PlasmaReagin)，该方法操作简便、迅速，试验结果清晰易读，简便快速，稳定性好。其原理是利用心磷脂、卵磷脂及胆固醇组成混合物作为抗原，用特制的活性炭颗粒进行吸附，通过肉眼观察白色纸板上有无黑色凝集颗粒出现而直接进行结果判断。梅毒螺旋体抗原血浆试验是针对作为抗原的梅毒螺旋体特异成分，因此被用于筛查和确诊梅毒感染。梅毒螺旋体明胶凝集实验(TPPA)把致病性TP的精致菌株成分包被在人工载体明胶粒子上，检测血浆中梅毒相应的抗体，由于试剂制备过程排除了各种非特异性反应，敏感性和特异性均较高，是目前主要的梅毒螺旋体抗原血浆试验。
脑脊液检查主要包括CSF-RPR、CSF白细胞计数或蛋白水平。CSF-RPR与血浆RPR原理相同，特异性与脑脊液性病研究实验室(VDRL，Venereal Disease ResearchLaboratory)试验(CSF-VDRL)相似，但是敏感性比CSF-VDRL高，是目前常用的脑脊液梅毒螺旋体非特异性抗体试验，一般CSF-RPR阳性，即可诊断神经梅毒。神经梅毒的重要参考指标还包括脑脊液细胞计数或蛋白水平，在CSF-RPR为阴性结果时，如果出现神经梅毒临床征象、血浆学检测阳性以及脑脊液细胞计数(一般CSF白细胞计数>5/μl为异常，对于合并HIV感染的患者，脑脊液细胞计数会偏高，为提高诊断准确性，这类患者脑脊液细胞计数异常的标准应提高为白细胞>20/μl)和/或蛋白水平异常，可以考虑诊断为神经梅毒。
多项临床研究证实，神经梅毒患者脑脊液中蛋白质含量升高程度与病情严重程度呈正相关，与远期预后呈负相关；神经梅毒患者脑脊液中寡克隆区带(OCB)阳性，脑脊液tau蛋白含量升高，或CXCL13升高等均提示中枢神经系统内发生了免疫应答。但是目前并没有可信的反映神经梅毒神经损伤程度的生物学标志物。因此，寻找评估神经梅毒患者神经受损程度以及预后的指标显得尤为重要。
神经丝蛋白只表达于神经细胞，包括神经丝蛋白轻链(Neurofilament-Light，NF-L)、神经丝蛋白中链(Neurofilament-Medium，NF-M)、神经丝蛋白重链(Neurofilament-Heavy，NF-H)三种亚结构；其结构与其他中间纤维类似，包括头部氨基区、α螺旋的杆状区以及尾部羧基区。神经丝蛋白的作用是稳定轴索的形态，保持其直径及维持其稳定的传导速度，并在神经元分化，轴突生长和再生过程等过程中发挥作用。
据报道，能够反映中枢神经系统损伤的标记物很多，如β淀粉样前体蛋白及β淀粉样蛋白、髓鞘碱性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白tau等，在神经梅毒也有一些变化，但都存在特异性都不强等诸如此类的问题。神经丝蛋白在肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、阿尔兹海默症(Alzheim er’s disease，AD)、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease，CMT)、神经元中间丝包涵体病(neuronal intermediate filament inclusion disease，NIFID)、糖尿病性神经病变(diabetic neuropathy)、脊髓型肌萎缩(spinal muscular atrophy)等疾病中都有变化，推测神经丝蛋白的异常与多种神经系统疾病有关，但是其细胞分子学机制尚不清楚。
NF-L是神经丝蛋白中最先被表达的亚结构，分子量为68kDa。NF-H也是组成神经丝蛋白的主要成分之一，分子量为205kDa，是最后表达的神经丝蛋白，与扩增轴索直径以及提高轴索传导速度直接相关。据报道，NF-L与NF-H的表达水平是相互独立的，这可能与它们的基因组定位不同有关。
NF-H的羧基端有51个磷酸化的位点，从近端到远端，磷酸化程度不同。在神经元胞体或者树突中，NF-H基本无磷酸化存在，而在神经元轴索中，则多以磷酸化的形式即磷酸化神经微丝蛋白重链(phosphorylated Neurofilament-Heavy，pNF-H)存在，NF-H对于稳定轴索形态以及神经信号的传导起到重要作用。
发明内容
本发明第一方面提供了一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测生物样品中pNF-H水平的检测试剂。
本发明第二方面提供了一种用于检测生物样品中pNF-H水平的检测试剂在制备本发明第一方面所述的试剂盒中的应用。
本发明人通过对来自神经梅毒患者的生物样品的pNF-H水平进行研究，首次发现pNF-H异常与神经梅毒的发展及相关症状的发生存在一定相关性，因而对于神经梅毒具有重大的临床意义。由于来自有症状神经梅毒患者组的生物样品中的pNF-H与来自无症状神经梅毒患者组或者其他类型的梅毒患者的相同类型的生物样品的pNF-H相比较差异有统计学意义，说明来自不同临床分型或分期梅毒患者的生物样品中的蛋白分子水平不同，患者生物样品中的蛋白分子水平有所不同，免疫反应程度及免疫损伤程度也不同，因此可以根据其蛋白分子水平对梅毒尤其是神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
附图说明
图1是中国2006年-2015年梅毒发病率(1/10万)。注：2006年12.80、2007年15.88、2008年19.49、2009年23.07、2010年26.86、2011年29.47、2012年30.44、2013年30.04、2014年30.93、2015年31.85。
图2显示了各组患者的血pNF-H水平。其中，NS表示有症状神经梅毒组；ANS表示无症状神经梅毒组；S表示隐性梅毒组。
图3显示了各组患者的平均脑脊液pNF-H水平。
图4显示了不同类型梅毒患者的血pNF-H水平。
图5显示了不同类型梅毒患者的脑脊液pNF-H水平。
图6至图11分别是一些患者个体治疗前后利用脑脊液样品检测得到的pNF-H水平、脑蛋白水平和脑白细胞水平的柱状图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。但是，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明第一方面提供了一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测生物样品中pNF-H水平的检测试剂。
在一些实施方式中，所述检测试剂为用于对生物样品中的pNF-H进行定性检测或量化检测的检测试剂。在一些优选的实施方式中，所述检测试剂为抗pNF-H的抗体。在一些更优选的实施方式中，所述抗体为抗人pNF-H的抗体。进一步优选的是，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，最优选为单克隆抗体。所述单克隆抗体可以是已知的，例如从商业试剂公司(如R&D Systems,Inc.，GeneTex International Corporation，abcam等)购得的单克隆抗体，或者从德国IBL等公司购得的pNF-H蛋白酶联诊断试剂盒中包括的单克隆抗体。
在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括可选的第二检测试剂，所述第二检测试剂为用于选自VDRL(venereal disease research laboratory(性病研究实验室))检测、USR(unheated serum regain(血浆不需加热的反应素))检测、TRUST(toluidine redunheated serum test(甲苯胺红血浆不需加热试验))检测、RPR(rapid plasma regain(快速血浆反应素))检测、FTA-ABS(fluorescent treponemal antibody-absorption(荧光螺旋体抗体吸收))检测、TPHA(Treponema pallidum hemagglutination assay(梅毒螺旋体血凝试验))检测、TPPA(Treponema pallidum particle agglutination assay(梅毒螺旋体颗粒凝集试验)检测、ELISA(enzyme-linked immuno-sorbent assay(酶联免疫吸附试验)检测和NF-L检测组成的组的一种或者多种梅毒检测方法的检测试剂，这些梅毒检测方法及其所用的试剂都是已知的。例如，VDRL检测、USR检测、TRUST检测、RPR检测、FTA-ABS检测、TPHA检测、TPPA检测和ELISA检测及其所采用的试剂均可以行业标准如梅毒诊断标准(WS 273-2007)所述。NF-L(例如来自血或脑脊液等生物样品中的NF-L)的检测试剂可以如商用试剂盒NF-
Figure BDA0002073076030000071
(Neurofilament light)ELISA(Enzyme immunoassay forquanlitative determination of human Neurofilament light(NF-L)protein incerebrosphinal fluid)(LBL international GME)所述；pNF-H(例如来自血或脑脊液的pNF-H)的检测试剂可以如商用试剂盒Human Phosphorylated Neurofilament H ELISA试剂盒(BioVendor-Laboratornímedicína a.s.)所述。更优选的是，所述第二检测试剂为用于选自由RPR检测、TPPA或TPHA检测、FTA-ABS检测和NF-L检测组成的组的梅毒检测方法的检测试剂；进一步优选的是，所述第二检测试剂为用于FTA-ABS检测和/或TPPA检测的检测试剂。FTA-ABS以及TPPA是诊断梅毒螺旋体感染特异性指标，一般认为脑脊液FTA-ABS阴性可以排除神经梅毒，该指标结合pNF-H检测结果，能够增加诊断神经梅毒的敏感性和特异性。
在另外一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于检测脑脊液蛋白和/或脑脊液白细胞的检测试剂。
在一些所述方式中，所述试剂盒还包括用于检测NF-L(例如用于检测血液或脑脊液中的NF-L)的检测试剂，例如抗人NF-L的单克隆抗体。
在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括用于辅助抗pNF-H的抗体通过ELISA检测法检测脑脊液pNF-H的辅助试剂。在一些优选的实施方式中，所述辅助试剂包括选自由pNF-H抗体包被微滴定板条、pNF-H抗体溶液、辣根过氧化酶偶联物溶液、pNF-H蛋白标准样品、稀释缓冲液、洗涤液、底物溶液、终止液组成的组。
在一些实施方式中，所述生物样品为所述生物样品为选自由全血、血浆、血清和脑脊液组成的组，优选为血浆、血清和/或脑脊液，更优选为脑脊液。在一些更优选的实施方式中，所述生物样品来自于人类的生物样品，更优选为来自梅毒患者或者疑似梅毒患者的样品。在对生物样品中的pNF-H进行量化检测的情况下，优选所述生物样品为来自神经梅毒患者或者疑似神经梅毒患者的全血、血浆、血清或者脑脊液，最优选为脑脊液，从检测灵敏度和精确量化考虑，最优选所述生物样品为脑脊液。
在一些实施方式中，所述试剂盒用于梅毒的分型检测，例如可以将梅毒区分为有症状神经梅毒、无症状神经梅毒、非神经梅毒(例如隐形梅毒)等。
神经梅毒是梅毒螺旋体侵犯中枢神经系统而引起的慢性感染性疾病，可以造成难以恢复的神经系统损害，是梅毒致残的主要原因，因此神经梅毒已经成为严重威胁人类健康的疾病。本发明人经过研究发现，脑脊液pNF-H水平与神经梅毒的发展及相关症状的发生存在相关性，有症状神经梅毒患者脑脊液pNF-H水平与无症状神经梅毒患者相比较差异有统计学意义，说明不同临床分型或分期神经梅毒患者脑脊液pNF-H水平的蛋白分子水平有所不同，免疫反应程度及免疫损伤程度也不同。而且，神经丝蛋白只存在于神经细胞当中，神经细胞特异性强，并且有很强的抗酶解能力。神经细胞受损后，pNF-H会释放到脑脊液中。本发明人通过对神经梅毒患者脑脊液pNF-H水平的研究，发现脑脊液pNF-H水平具有重大的临床意义，并探索其相关影响因素。虽然脑脊液是反应神经组织病理性改变的敏感指标，是生物学标志物的最佳选择，但是其适用人群范围窄并且具有一定潜在风险，因此本发明人分析pNF-H水平在脑脊液中的水平及其与其他因素的相关性可以为神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估提供可靠且有效的技术方案。
于是，在一些优选的实施方式中，所述梅毒为神经梅毒。由于神经梅毒患者的生物样品例如血液或者脑脊液具有与梅毒不同时期或者不同严重程度相对应的pNF-H水平。因此，在这种情况下，可以根据检测到的pNF-H水平对神经梅毒进行分型(例如有症状神经梅毒或无症状神经梅毒)或分期。由于pNF-H水平可以在很大范围内变化，并且含量远远高于目前能够检测的检测限，因此可以通过检测例如血或者脑脊液中的pNF-H水平以高灵敏度对梅毒尤其是神经梅毒进行分型或分期，还可以提早对疑似梅毒患者进行早期诊断(例如早期确诊或者早期排除)，还可以对提早对梅毒尤其是神经梅毒进行分型分期，对神经梅毒治疗方案的疗效进行精确地量化的评价(尤其是生物样品为脑脊液的情况下)，例如预后效果的评估。在一些实施方式中，所述梅毒为有症状神经梅毒，因为在有症状神经梅毒患者的生物样品例如血液或者脑脊液的表达水平高，容易以高灵敏度和高准确进行检测。
于是，在一些优选的实施方式中，所述生物样品为脑脊液，并且所述检测为对神经梅毒的严重程度和/或预后效果进行的量化检测。另外，在一些优选的实施方式中，所述试剂盒为用于对梅毒尤其是神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估的试剂盒。
本发明第二方面提供了一种用于检测生物样品中pNF-H水平的检测试剂在制备本发明第一方面所述的试剂盒中的应用。优选的是，所述检测试剂可以如前文针对第一方面所述，例如可以为用于对生物样品中的磷酸化神经丝蛋白重链进行定性检测或量化检测的检测试剂；更优选的是，所述检测试剂为抗磷酸化神经丝蛋白重链的抗体，进一步优选的是，所述抗体为抗人磷酸化神经丝蛋白重链的抗体，更进一步优选的是，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，最优选为单克隆抗体。
在对神经梅毒进行诊断(包括早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估等)时，可以根据脑脊液pNF-H水平对神经梅毒患者进行分型分期(即对神经梅毒进行分型和/或分期)。或者，可以根据脑脊液pNF-H预后相对于预前(或称为治疗前)的差值对神经梅毒患者进行预后评估。于是，在一些具体的实施方式中，本发明提供了一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测脑脊液pNF-H水平的检测试剂，并且用于对神经梅毒患者进行分型分期或者预后评估。本发明还提供了所述检测试剂在制备用于对神经梅毒患者进行分型分期(即对神经梅毒进行分型和/或分期)或者预后评估的试剂盒中的应用。
另外，在对神经梅毒进行诊断(包括早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估等)时，可以将脑脊液pNF-H水平独立地或者与选自由脑脊液NF-L水平、血NF-L水平、脑脊液RPR滴度、脑脊液RPR滴度、脑脊液白细胞、脑脊液蛋白、治疗前和治疗后血NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值组成的组中一个或者多个指标结合地用于对梅毒尤其是神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。于是，在一些具体的实施方式中，本发明提供了一种梅毒检测试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测脑脊液pNF-H水平的第一检测试剂；可选的第二检测试剂，所述第二检测试剂用于检测选自由脑脊液NF-L水平、血NF-L水平、脑脊液RPR滴度、脑脊液RPR滴度、脑脊液白细胞、脑脊液蛋白、治疗前和治疗后血NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值组成的组中的一个或者多个指标或检测项目。本发明还提供了所述第一检测试剂和/或所述第二检测试剂在制备用于对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估的检测试剂盒中的应用。
在本发明中，脑脊液NF-L水平、血NF-L水平、脑脊液pNF-H水平、脑脊液RPR滴度、脑脊液RPR滴度、脑脊液白细胞数、脑脊液蛋白量都是通过已知的检测方法检测的，治疗前和治疗后血NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液pNF-H差值都可以通过已知方法测得的数据求算的。例如，NF-L、pNF-H都可以采用商用试剂盒测得，其他指标都可以根据我国行业标准梅毒诊断标准(WS 273-2007)规定的方法测得。
实施例
1.患者一般临床资料
本研究共入组患者92例。根据WS 273-2007梅毒诊断标准确诊患有有症状神经梅毒组、无症状神经梅毒和隐性梅毒。具体数据如表1所示。
表1 患者一般临床资料表
Figure BDA0002073076030000101
Figure BDA0002073076030000111
2、样品获取
根据入组患者情况，行腰椎穿刺术以及肘静脉穿刺术留取脑脊液、血液进行常规检验，并留取脑脊液和血液标本，标本配对置-80℃冰箱保存，最后统一检测，避免样本检测批次误差。
在患者知情同意下，腰穿收集脑脊液标5ml，静脉采集血液标本10ml。腰椎穿刺术收集脑脊液后，用冻存管分装，编码标记；静脉穿刺术收集血液后，置于4℃离心机中，离心10分钟，3000转/分钟，迅速分离上层清亮血浆置于冻存管中，编码标记。脑脊液和血浆标本全部保存于-80℃冰箱，最后统一检测。
3、检测方法
实施例中采用的检测方法都是已知的。其中，血NF-L和脑脊液NF-L的检测采用NF-
Figure BDA0002073076030000121
(Neurofilament light)ELISA(Enzyme immunoassay for quanlitativedetermination of human Neurofilament light(NF-L)protein in cerebrosphinalfluid)(LBL international GME)根据说明书进行检测。血浆和脑脊液pNF-H的检测采用Human Phosphorylated Neurofilament H ELISA试剂盒(BioVendor-Laboratorní medicína a.s.)并按照所附的厂家的说明书进行检测。血浆RPR滴度、脑脊液RPR滴度、脑蛋白检测和脑白细胞的检测根据WS 273-2007所述的方法进行。
4、治疗方案
有症状神经梅毒和无症状神经梅毒的治疗方法采用国家标准治疗方法，青霉素2400万U/天，分为400万U/4小时，静脉滴注，连续治疗14天。治疗前数据是使用在治疗之前第0天取得的样品检测得到的数据；治疗后数据是在采用上述治疗方案进行治疗后第180天取得的样品检测得到的结果。
5、结果与分析
各组患者血浆pNF-H水平和差异比较
各组患者血浆pNF-H水平和差异比较结果如图4所示，从图4可以看出，NS(有症状神经梅毒)患者的平均血浆pNF-H水平为230.50pg/ml，显著高于ANS(无症状神经梅毒)患者的12.84pg/ml和S(隐形梅毒)患者的18.26pg/ml。因此，血浆pNF-H水平可以用于例如梅毒分型等。
各组患者脑脊液pNF-H水平和差异比较
各组患者的脑脊液pNF-H水平的数据(表3)和对比分析(图3)结果如下：有症状神经梅毒组、无症状神经梅毒组、隐性梅毒组患者的脑脊液pNF-H的中位数分别为986.46pg/ml、43pg/ml、48.71pg/ml，其中有症状神经梅毒组脑脊液pNF-H水平高于无症状神经梅毒组(P<0.001)以及隐性梅毒组(P<0.001)，差异具有统计学意义。但是无症状神经梅毒组、隐性梅毒组患者的脑脊液pNF-H水平没有差异(P＝1.584)。
另外，如图5所示，NS患者的脑脊液pNF-H水平高达1464.77pg/ml，是ANS患者和S患者的20倍，因此非常适合于梅毒患者的分期分型。另外，NS患者的脑脊液pNF-H水平(1464.77pg/ml)是血浆pNF-H水平(230.50pg/ml)的6倍，在梅毒诊断时，采用脑脊液pNF-H水平检测法比血浆pNF-H水平法灵敏。
表2 各组患者血浆pNF-H水平(n＝84)
疾病类型 pNF-H水平(pg/ml)
有症状神经梅毒(20) 0(0,1930.08)
无症状神经梅毒(46) 0(0,36.07)
隐形梅毒(18) 0(0,133.97)
表3 各组患者脑脊液pNF-H水平(n＝92)
疾病类型 pNF-H水平(pg/ml)
有症状神经梅毒(23) 986.46(117.26,9018.81)
无症状神经梅毒(51) 43(0,196.53)
隐形梅毒(18) 48.71(0,199.05)
血浆pNF-H与各因素的相关性分析
所有患者血浆pNF-H的相关性分析结果如下：血浆pNF-H水平与梅毒分期有关(r＝0.366，P＝0.001)；除了与脑脊液NF-L水平(r＝0.352，P＝0.001)相关外，还与脑脊液pNF-H水平(r＝0.387，P<0.001)、脑脊液RPR滴度(r＝0.318，p＝0.003)、血浆RPR滴度(r＝0.426，p<0.001)、CSF蛋白(r＝0.330，p＝0.002)、脑脊液白细胞(r＝0.266，P＝0.015)呈正相关。由此可见，血浆pNF-H水平与梅毒分期、脑脊液NF-L水平、脑脊液pNF-H水平、脑脊液RPR滴度、血浆RPR滴度、CSF蛋白、脑脊液白细胞均相关，具有统计学意义，尤其是血浆RPR滴度，基本达到中度相关的程度。因此可以将血浆pNF-H水平独立地或者与上述检测项目结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
NS、ANS、S各组的相关性分析结果如下：NS组血浆pNF-H水平与脑脊液NF-L水平正相关(r＝0.475，P＝0.034)；ANS组以及S组血浆pNF-H水平与各因素均不相关。因此可以将血浆pNF-H水平独立地或者与脑脊液NF-L水平结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
脑脊液pNF-H与各因素的相关性分析
所有患者脑脊液pNF-H的相关性分析结果如下：脑脊液pNF-H水平与患者梅毒分期(r＝0.593，p<0.001)，除了与血浆NF-L水平(r＝0.544，P<0.001)和脑脊液NF-L水平(r＝0.764，p<0.001)呈正相关外，还与CSF蛋白(r＝0.541，p<0.001)、和脑脊液RPR滴度(r＝0.514，p<0.001)呈正相关。因此可以将脑脊液pNF-H水平独立地或者与上述检测项目结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
NS、ANS、S各组的相关性分析结果如下：NS组脑脊液pNF-H水平与脑脊液NF-L水平(r＝0.775，P<0.001)正相关；ANS组脑脊液pNF-H水平与脑脊液NF-L水平(r＝0.541，P<0.001)正相关；S组脑脊液pNF-H水平与各因素均不相关。因此可以将脑脊液pNF-H水平独立地或者与上述检测项目结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
血浆pNF-H预后分析
(1)pNF-H治疗前后的差异比较：治疗前后血浆pNF-H水平中位数均为0pg/ml，治疗前血浆pNF-H为0的有16例，治疗后血浆pNF-H为0的有19例，二者比较有差异(P＝0.028)。
(2)神经梅毒组与无症状神经梅毒组pNF-H预后差值的差异比较：神经梅毒组血浆pNF-H水平变化水平中位数为0pg/ml，7例无变化(＝0)；无症状神经梅毒组血浆pNF-H变化水平中位数为0pg/ml，9例无变化(＝0)；二者比较有差异(P＝0.022)。
脑脊液pNF-H预后分析
(1)pNF-H治疗前后的差异比较：脑脊液pNF-H治疗前水平中位数为342.28pg/ml，预后脑脊液pNF-H水平中位数为141.69pg/ml，神经梅毒治疗后脑脊液pNF-H水平下降，且具有统计学意义。
(2)神经梅毒组与无症状神经梅毒组pNF-H预后差值的差异比较：神经梅毒组脑脊液pNF-H水平变化水平(治疗后水平-治疗前水平)中位数为-1113.67pg/ml，即下降1113.67pg/ml；无症状神经梅毒组血浆pNF-H水平变化水平中位数为6.36pg/ml，即上升6.36pg/ml；两者比较有统计学意义(P＝0.001)。
预后血浆pNF-H与各因素的相关性分析
预后血浆pNF-H水平与治疗前血浆NF-L水平(r＝0.595，P＝0.003)、治疗前后血浆NF-L变化水平(r＝-0.595，P＝0.003)、治疗前血浆pNF-H水平(r＝0.758，P<0.001)、治疗前后血浆pNF-H变化水平(r＝-0.758，P<0.001)、预后脑脊液NF-L水平(r＝0.574，P＝0.005)、治疗前脑脊液NF-L水平(r＝0.591，P＝0.004)相关。因此可以将预后血浆pNF-H水平独立地或者与上述检测项目结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
治疗前后血浆pNF-H变化水平与梅毒分期(r＝0.501，P＝0.017)、治疗前血浆NF-L水平(r＝-0.581，P＝0.003)、预后血浆pNF-H水平(r＝-0.758，P<0.001)、治疗前血浆pNF-H水平(r＝-1)、预后脑脊液NF-L水平(r＝-0.670，P＝0.001)、治疗前脑脊液NF-L水平(r＝-0.672，P＝0.001)、预后脑脊液pNF-H水平(r＝-0.563，P＝0.006)、治疗前脑脊液pNF-H水平(r＝-0.574，P＝0.006)相关。因此可以将治疗前后血浆pNF-H变化水平独立地或者与上述检测项目结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
预后脑脊液pNF-H与各因素的相关性分析
预后脑脊液pNF-H水平与梅毒分期(r＝-0.617，P＝0.001)、年龄(r＝0.558，P＝0.004)、治疗前血浆pNF-H水平(r＝0.563，P＝0.006)、治疗前后血浆pNF-H变化水平(r＝-0.563，P＝0.006)、预后脑脊液NF-L水平(r＝0.694，P<0.001)、治疗前脑脊液NF-L水平(r＝0.656，P<0.001)、治疗前脑脊液pNF-H水平(r＝0.673，P<0.001)、脑蛋白(r＝0.534，P＝0.006)相关。因此可以将预后脑脊液pNF-H水平独立地或者与上述检测项目结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
治疗前后脑脊液pNF-H变化水平与梅毒分期(r＝0.668，P<0.001)、治疗前血浆NF-L水平(r＝-0.606，p＝0.003)、预后脑脊液NF-L水平(r＝-0.573，P＝0.003)、治疗前脑脊液NF-L水平(r＝-0.718，P<0.001)、治疗前后脑脊液NF-L变化水平(r＝0.571，P＝0.003)、治疗前脑脊液pNF-H水平(r＝-0.856，P<0.001)、脑蛋白(r＝-0.535，P＝0.006)相关。因此可以将治疗前后脑脊液pNF-H变化水平独立地或者与上述检测项目结合地用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
表3 有症状神经梅毒组与无症状神经梅毒组pNF-H治疗前后水平变化表。
Figure BDA0002073076030000161
另外，图6至图11分别展示了一些患者个体治疗前后利用脑脊液样品检测得到的pNF-H水平、脑蛋白水平和脑白细胞水平。从图6至11可以看出，治疗前后脑脊液pNF-H水平检测可以获得与脑蛋白和脑白细胞一致的检测结果，治疗前脑脊液pNF-H水平明显高于治疗后的水平。并且脑脊液pNF-H普遍比其他两种检测方式灵敏，这一点从图8的4号患者结果可以明显看出(1号患者的脑蛋白的超高水平可能是神经梅毒和其他病症一起导致的结果)。另外，pNF-H检测特别适合于对神经梅毒的严重程度和预后效果等进行量化检测。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (24)

1.用于检测生物样品中磷酸化神经丝蛋白重链水平的第一检测试剂在制备梅毒检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)所述第一检测试剂；
(2)第二检测试剂，所述第二检测试剂为用于选自VDRL检测、USR检测、TRUST检测、RPR检测、TPHA或TPPA检测、FTA-ABS检测、NF-L检测组成的组的一种或者多种梅毒检测方法的检测试剂；
其中，所述试剂盒用于梅毒的分型检测。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一检测试剂为用于对生物样品中的磷酸化神经丝蛋白重链进行定性检测或量化检测的检测试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一检测试剂为抗磷酸化神经丝蛋白重链的抗体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗体为抗人磷酸化神经丝蛋白重链的抗体。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二检测试剂为用于选自由RPR检测、TPHA或TPPA检测、FTA-ABS检测和NF-L检测组成的组的梅毒检测方法的检测试剂。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二检测试剂为用于FTA-ABS检测和/或TPPA检测的检测试剂。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物样品为选自由全血、血浆、血清和脑脊液组成的组。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物样品为血浆、血清和/或脑脊液。
11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物样品为脑脊液。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的应用，其特征在于，所述梅毒为神经梅毒。
13.用于检测生物样品中磷酸化神经丝蛋白重链水平的第一检测试剂在制备梅毒检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)所述第一检测试剂；
(2)第二检测试剂，所述第二检测试剂为用于选自VDRL检测、USR检测、TRUST检测、RPR检测、TPHA或TPPA检测、FTA-ABS检测、NF-L检测组成的组的一种或者多种梅毒检测方法的检测试剂；
其中，所述试剂盒用于对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述生物样品为脑脊液，并且所述检测为对神经梅毒的严重程度和/或预后效果进行的量化检测。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述第一检测试剂为用于对生物样品中的磷酸化神经丝蛋白重链进行定性检测或量化检测的检测试剂。
16.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述第一检测试剂为抗磷酸化神经丝蛋白重链的抗体。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述抗体为抗人磷酸化神经丝蛋白重链的抗体。
18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
19.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
20.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述第二检测试剂为用于选自由RPR检测、TPHA或TPPA检测、FTA-ABS检测和NF-L检测组成的组的梅毒检测方法的检测试剂。
21.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述第二检测试剂为用于FTA-ABS检测和/或TPPA检测的检测试剂。
22.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述生物样品为选自由全血、血浆、血清和脑脊液组成的组。
23.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述生物样品为血浆、血清和/或脑脊液。
24.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述生物样品为脑脊液。
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