CN110129032B - 一种含铁蛋白的荧光鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含铁蛋白的荧光鉴定方法，涉及材料化学和蛋白质鉴定技术领域。所述鉴定方法采用自制的石墨烯量子点（GQDs）与含铁蛋白相互作用促使GQDs荧光快速猝灭的分子荧光光谱分析技术。GQDs的制备是采用直链淀粉为绿色原料，于反应釜中水热反应，自然冷却后离心形成的黄色澄清液体既为GQDs溶液。所制备的GQDs可以与Fe³⁺和含铁蛋白有效结合，导致荧光瞬间猝灭，从而实现含铁蛋白的鉴定。该鉴定方法操作简便快捷，样品消耗量少，使用成本低，可特异性猝灭含铁蛋白，有效去除基质干扰，鉴定结果可靠，可用于铁缺乏疾病的初期筛查，具有很大的使用价值和市场前景。

Description

一种含铁蛋白的荧光鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种含铁蛋白的荧光鉴定方法，涉及材料化学和蛋白质鉴定技术领域。

背景技术

含铁蛋白作为一种灵敏、微量、有实用诊断价值的指标，已受到血液、肿瘤、营养等临床学科的重视，取得了卓有成效的研究及应用。含铁蛋白可以与小分子化合物结合，如多酚类小分子化合物没食子酸( gallic acid，GA) ，研究其与GA的相互作用，可为作为小分子药物模型的GA在医药领域的应用提供理论依据。含铁蛋白还可以通过与氧化铁纳米颗粒的相互作用，降低血红蛋白的过氧化物酶活性，增加细胞色素 C 的过氧化物酶活性。另外，含铁蛋白可以催化活性氮RNS转化为惰性的NO₃ ^-，阻止蛋白质的硝化；同时，含铁蛋白也可通过高价铁氧化物及·NO₂的产生来加速蛋白质的硝化。含铁蛋白与多种物质材料可以发生相互作用，且与人类生活等密切相关，含铁蛋白的鉴定在免疫显微剖析、疾病诊断、鉴别诊断、观察某些疾病活动，估计预后及复发，均具有一定的意义，研究其鉴定方法势在必行。

含铁蛋白鉴定方法多样，其中自动无焰原子吸收光谱分析法、放免分析法 (RIA)、免疫放射分析法 (IRMA) 灵敏度较高，是目前开展最为普遍的检测方法，但所需设备复杂昂贵，不利于推广。免疫单扩散技术操作简便，易于普及，但灵敏度低。核素掺入试验又不适于大量的临床常规检查。因此需要建立更直接、高效、简单的检测方法以提高含铁蛋白鉴定的应用价值。

分子荧光光谱分析是利用某些物质分子受光照射时所发生的荧光的特性和强度，进行物质的定性分析或定量分析的一种方法。它可以分析物质的荧光特性，如GQDs的荧光谱图形状、最大发射波长、发光强度等，并通过最大发射波长和强度的变化来判断ＤＮＡ的修饰情况。同时可通过研究 GQDs的光致发光发射谱来表征物质对GQDs荧光强度的影响。可用于目标分子的定性和定量分析，它的先进之处就在于它的鲜明性、特异识别性、广泛实用性。简单的操作，低廉的成本，直接的分析检测，目前已经发展成为一种重要且有效的光谱化学分析手段，在生物、食品、药物分析、环境分析等领域已应用颇广。

在众多分析方法中，由于分子荧光光谱分析具有灵敏度高、选择性好、快速、简单、信息量丰富，能提供荧光物质的多种参数等优点已引起国内分析界广泛重视。但由于很多物质本身不发荧光，使得找到一种合适的荧光物质至关重要。据此本发明利用自制GQDs设计一种含铁蛋白的鉴定方法，采用直链淀粉自制GQDs直接与含铁蛋白相互作用，并通过荧光强度猝灭来检测含铁蛋白，可用于含铁蛋白的直接鉴定，该鉴定方法简单明了，成本低廉，每次使用量少，反应快，检测迅速，直接出分析结果，可用于铁缺乏疾病的初期筛查。

发明内容

本发明的目的是提供一种含铁蛋白的荧光鉴定方法，用于一类蛋白（含铁蛋白）的识别与鉴定。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述一种含铁蛋白的荧光鉴定方法，具体步骤如下：

1) GQDs的制备

称取直链淀粉，加入25 mL蒸馏水在60 ℃下水浴加热15 min，取出加入反应釜中，烘箱中加热，自然冷却后移出，离心得黄色澄清液体于冰箱中冷藏，备用。

2）GQDs与金属离子的相互作用

取上述GQDs溶液和金属离子水溶液1：1（V/V）混合，混匀，再加入与GQDs同等体积的纯水，混匀，离心，取上清于微量石英比色皿中，荧光光谱扫描。

3) GQDs与蛋白质的相互作用

取步骤1）中的GQDs溶液和蛋白质水溶液1：1（V/V）混合，混匀，再加入与GQDs同等体积的纯水，混匀，离心，取上清与微量石英比色皿中，荧光光谱扫描。

在步骤1）中直链淀粉来源土豆，分子式(C₆H₁₀O₅)n，分子量502.42，直链淀粉用量0.1～0.5 g。

在步骤1）中所制备的GQDs 溶液比市售GQDs 溶液（南京先丰纳米科技有限公司，1.0 mg/mL）对含铁蛋白表现出更好的荧光猝灭效应。

在步骤1）中反应釜体积50 mL，水热反应温度150～250 ℃，反应时间0.5～5 h，高速离心转速10000～16000 r/min，离心10～3 min，所得GQDs 溶液为黄色澄清液。

在步骤2）中金属离子为Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Na⁺、K⁺、Cd²⁺、Ag⁺中的一种，浓度范围0.01～10 mmol/L，其中Fe³⁺可有效猝灭GQDs 荧光，其余金属离子对GQDs荧光无显著影响。

在步骤3）中蛋白为辣根过氧化物酶（HRP）、细胞色素C（Cyt C）、肌红蛋白（Mb）、马脾铁蛋白（HSF）、转铁蛋白（TRF）、牛血红蛋白（Hb）、刀豆蛋白（Con A）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白(OVA)、溶菌酶 (Lyz)中的一种，浓度范围0.01～10 mg/mL。

在步骤3）中含铁蛋白：辣根过氧化物酶（HRP）、细胞色素C（Cyt C）、肌红蛋白（Mb）、马脾铁蛋白（HSF）、转铁蛋白（TRF）、牛血红蛋白（Hb）可有效猝灭GQDs 荧光，其余不含铁蛋白：刀豆蛋白（Con A）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白(OVA)、溶菌酶 (Lyz) 对GQDs荧光无显著影响。

在步骤2）和步骤3）中荧光光谱扫描条件为激发波长360 nm，光谱扫描范围390-450 nm，最大发射波长是440 nm；荧光光谱分析前混合样品需要离心，去沉淀，取上清液。

本发明的显著优点在于：

1）本发明所用的GQDs采用直链淀粉自制，材料简单，成本低廉，制备时间短，产率高，荧光性质稳定，可方便携带，可用于实时在线样品监测。

2）所制备的GQDs对Fe³⁺具有较强的相互作用，产生显著的荧光猝灭效应，可用于Fe³⁺的鉴定。

3）所制备的GQDs对含铁蛋白具有较强的相互作用，产生显著的荧光猝灭效应，可用于含铁蛋白的鉴定。该方法操作简单，用量极少，反应时间短，检测速度快，对含铁蛋白具有特异性识别能力。

4）该鉴定方法可通过铁蛋白水平异常检测，用于医学领域铁缺乏疾病相关的研究，生物样品可以直接鉴定，不需预处理过程。

附图说明

图1 GQDs 的透射电子显微镜扫描图。

图2 不同金属离子对GQDs荧光强度的影响。

图3 不同浓度Fe³⁺对GQDs荧光强度的影响。

图4 不同蛋白对GQDs荧光强度的影响。

图5 GQDs 与HRP（A）和Fe³⁺（B）混合物的TEM 图。

图6 各含铁蛋白的系列浓度对GQDs的荧光变化曲线。

图7 胎牛血清中添加不同浓度的Hb的GQDs荧光光谱图，a: GQDs+FBS+ H₂O; b:GQDs+H₂O+H₂O; c: GQDs+FBS+1.0 mg/mL Hb; d: FBS+H₂O+H₂O; e: GQDs+FBS+10 mg/mLHb。

具体实施方式

实施例1

GQDs的制备

称取直链淀粉0.3 g，溶于25 mL蒸馏水中，60 ℃ 水浴加热15 min，转入反应釜中，于烘箱中190℃加热2 h，自然冷却后移出，15000 r/min离心20 min，得黄色澄清液体，所制备的GQDs进行透射电子显微镜扫描，如图1所示，由图可见良好的分散性和均一性，粒径2～3 nm。

实施例2

GQDs与金属离子的相互作用:

将实施例1中所制备的GQDs溶液分别与Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Na⁺、K⁺、Cd²⁺、Ag⁺金属离子 10 mmol/L水溶液1：1（V/V）混合，混匀，再加入与GQDs溶液同等体积的纯水，混匀，离心，取上清与微量石英比色皿中，进行荧光光谱扫描，扫描条件为激发波长360 nm，光谱扫描范围390-450 nm，最大发射波长是440 nm。其荧光强度的变化如图2所示，相比其他几种离子，Fe³⁺对GQDs具有明显的荧光猝灭效应，表明所制备的GQDs对Fe³⁺具有良好的特异性相互作用。

实施例3

GQDs与Fe³⁺离子的相互作用:

将实施例1中所制备的GQDs溶液与不同浓度的Fe³⁺离子溶液1：1（V/V）混合，混匀，再加入与GQDs同等体积的纯水，混匀，离心，取上清与微量石英比色皿中，进行荧光光谱扫描，扫描条件为激发波长360 nm，光谱扫描范围390-450 nm，最大发射波长是440 nm。其荧光光谱图如图3所示，由图可见GQDs的荧光强度随着Fe³⁺浓度的增加而明显降低，当Fe³⁺浓度达到10 mmol/L时，GQDs基本无荧光效应，实验结果进一步验证所制备的GQDs对Fe³⁺具有较强的相互作用。

实施例4

GQDs与蛋白质的相互作用:

将实施例1中所制备的GQDs溶液分别与HRP、Cyt C、Mb、HSF、TRF、Hb、Con A、BSA、OVA、Lyz 10 mg/mL水溶液1：1（V/V）混合，混匀，再加入与GQDs溶液同等体积的纯水，混匀，离心，取上清与微量石英比色皿中，进行荧光光谱扫描，扫描条件为激发波长360 nm，光谱扫描范围390-450 nm，最大发射波长是440 nm。其荧光强度的变化如图4所示，相比其它几种不含铁蛋白（Con A、BSA、OVA、Lyz），含铁蛋白（HRP、Cyt C、Mb、HSF、TRF、Hb）以及Fe³⁺对GQDs具有明显的荧光猝灭效应，表明所制备的GQDs对Fe³⁺以及含铁蛋白具有良好的相互作用，这也证明其相互作用来源于GQDs与含铁蛋白中Fe³⁺的产生较强的相互作用，导致GQDs的荧光猝灭。透射电子显微镜扫描图显示（图5），GQDs与HRP和Fe³⁺相互作用后发生明显的团聚现象，几乎未见游离GQDs颗粒，证明GQDs与含铁蛋白（HRP）和Fe³⁺产生了较强的相互作用，从而导致GQDs的荧光猝灭。

实施例5

与市售的GQDs比较：

将实施例1中所制备的GQDs溶液（GQDs 1，约10 mg/mL）和市售的GQDs（GQDs 2，购自与南京先丰纳米科技有限公司，10 mg/mL），按照实施例4方法进行混合，荧光光谱扫描，记录440 nm处混合溶液的荧光强度值，其结果如图4所示，由图可见，所制备的GQDs 1对含铁蛋白的猝灭效果与市面上购买的GQDs 2结果整体趋势一致，均对含铁蛋白（HRP）和Fe³⁺产生显著的荧光猝灭效果，但不难发现所制备的GQDs与其他蛋白相互作用较弱，荧光强度变化不明显，证明所制备的GQDs对含铁蛋白具有更高的识别性能。

实施例6

GQDs与含铁蛋白质的相互作用:

将实施例1中所制备的GQDs溶液分别与不同浓度的含铁蛋白（HRP、Mb、HSF、TRF、Hb）水溶液1：1（V/V）混合，混匀，再加入与GQDs溶液同等体积的纯水，混匀，离心，取上清与微量石英比色皿中，进行荧光光谱扫描，发射波长440 nm处的荧光强度，其荧光强度的变化如图6所示，GQDs对这些含铁蛋白猝灭趋势一致，当蛋白浓度10 mg/mL时，GQDs几乎被猝灭完全。其中GQDs对HSF的猝灭效果最佳。

实施例7

胎牛血清样品的分析：

将实施例1中所制备的GQDs溶液分别与胎牛血清(FBS)和添加Hb蛋白的胎牛血清样品溶液1：1（V/V）混合，混匀，再加入与GQDs同等体积的纯水，混匀，离心，取上清与微量石英比色皿中，进行荧光光谱扫描，扫描条件为激发波长360 nm，光谱扫描范围390-450 nm，最大发射波长是440 nm，其荧光光谱图如图7所示。

FBS的主要成分是BSA，同时含少量Hb，图4可见BSA对GQDs荧光有较弱的增强作用，而Hb对GQDs荧光具有较强的荧光猝灭效果。为进一步验证结论，图7可见，从中可以看出FBS本身无明显荧光（d），与GQDs荧光光谱相比（b），FBS与GQDs结合荧光强度略有增强（a）。当加入1.0 mg/mL Hb 时荧光强度明显下降（c），10mg/mL的Hb 可以将GQDs荧光全部猝灭。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种含铁蛋白的荧光鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）石墨烯量子点的制备

称取直链淀粉，溶于25 mL蒸馏水中，60 ℃水浴加热15 min，转入反应釜中，烘箱中加热，自然冷却后移出，离心得黄色澄清液体于冰箱中冷藏，备用；

2) 石墨烯量子点与蛋白质的相互作用

取步骤1）中的石墨烯量子点溶液和蛋白质水溶液1：1 V/V混合，混匀，再加入与石墨烯量子点溶液同等体积的纯水，混匀，离心，取上清于 微量石英比色皿中，荧光光谱扫描；

步骤1）中直链淀粉来源土豆，分子式(C₆H₁₀O₅)n，分子量502.42，直链淀粉用量0.1~0.5g；

步骤1）中反应釜体积50 mL，水热反应温度150~250 ℃，反应时间0.5~5 h，高速离心转速10000~16000 r/min，离心10~3 min，所得石墨烯量子点溶液为黄色澄清液；

步骤2）中蛋白为辣根过氧化物酶、细胞色素C、肌红蛋白、马脾铁蛋白、转铁蛋白、牛血红蛋白、刀豆蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、溶菌酶中的一种，蛋白质水溶液浓度范围0.01~10 mg/mL；

步骤2）中含铁蛋白：辣根过氧化物酶、细胞色素C、肌红蛋白、马脾铁蛋白、转铁蛋白、牛血红蛋白可有效猝灭石墨烯量子点荧光，其余不含铁蛋白：刀豆蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、溶菌酶对石墨烯量子点荧光无显著影响；

步骤2）中荧光光谱扫描条件为激发波长360 nm，光谱扫描范围390-450 nm，最大发射波长是440 nm；荧光光谱分析前混合样品需要离心，去沉淀，取上清液。

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