CN110123799A - 雷复尼特在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
雷复尼特在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了常用的杀灭吸虫药雷复尼特在制备抗肿瘤药物方面的新用途。本发明发现雷复尼特对p38MAPK有显著的抑制效果，能显著抑制骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌细胞的增殖。此外，在15mg/kg时，雷复尼特可以显著抑制人骨髓瘤细胞H929裸鼠移植瘤的增长，而对裸鼠体重没有任何影响，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药用途领域，具体涉及雷复尼特(rafoxanide)在制备不以B-RafV600E为靶标的抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
B-Raf是人类最重要的原癌基因之一，大约8％的人类肿瘤发生B-Raf突变。B-RAF绝大部分突变形式为B-RafV600E突变，主要发生于黑色素瘤、结肠癌和甲状腺癌中。该突变导致下游MEK-ERK信号通路持续激活，对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要，是抗黑色素瘤等V600E突变肿瘤的有效作用靶标之一。2011年，首个B-RafV600E靶向抑制剂维罗非尼(vemurafenib)被FDA批准上市，用于治疗B-RafV600E突变的晚期黑色素瘤患者，有效延长了患者无进展生存期及总生存期，取得了突破性的治疗效果，也是典型的基于基因诊断选择用药的靶向治疗药物。
文献表明，维罗菲尼对B-RafV600E的HT29结肠癌裸鼠移植模型有效，但对B-RafWT的HCT116结肠癌裸鼠移植模型无效(Yang,H.；Higgins,B.；Kolinsky,K.；Packman,K.；Bradley,W.D.；Lee,R.J.；Schostack,K.；Simcox,M.E.；Kopetz,S.；Heimbrook,D.；Lestini,B.；Bollag,G.；Su,F.,Antitumor activity ofBRAF inhibitor vemurafenib inpreclinical models of BRAF-mutant colorectal cancer.Cancer Res.2012,72,779-789图3)。
雷复尼特(rafoxanide)的结构式如下所示：
该化合物的分子式为C19H11Cl2I2NO3，白色粉末状，分子量为626.01，CAS编号为22662-39-1。该化合物的通用名为雷复尼特，目前主要用于牛和绵羊的肝片吸虫的治疗。专利(CN 201610124976)指出雷复尼特可以作为B-RafV600E的抑制剂，因此可以用于制备以B-RafV600E为靶标的药物，即用于制备预防和/或治疗黑色素瘤、结直肠肿瘤以及甲状腺癌的药物。
本申请的发明人发现有些B-RafV600E的抑制剂对骨髓瘤无效。譬如化合物1a，针对B-RafV600E的IC50为0.50μM，针对B-RafV600E的IC50为1.50μM，针对黑色素瘤A375细胞的IC50为0.80μM(Wang,G.-m.；Wang,X.；Zhu,J.-m.；Guo,B.-b.；Yang,Z.；Xu,Z.-j.；Li,B.；Wang,H.-y.；Meng,L.-h.；Zhu,W.-l.；Ding,J.,Docking-based structural splicing andreassembly strategy to develop novel deazapurine derivatives as potent B-RafV600E inhibitors.Acta Pharmacol.Sin.2017,38,1059-1068)，而在人骨髓瘤细胞H929中80μM仍没有任何抑制效应。化合物1m，针对B-RafV600E的IC50为0.05μM，针对B-RafV600E的IC50为0.44μM，针对黑色素瘤A375细胞的IC50为0.80μM(Wang,G.-m.；Wang,X.；Zhu,J.-m.；Guo,B.-b.；Yang,Z.；Xu,Z.-j.；Li,B.；Wang,H.-y.；Meng,L.-h.；Zhu,W.-l.；Ding,J.,Docking-based structural splicing and reassembly strategy to develop noveldeazapurine derivatives as potent B-RafV600E inhibitors.ActaPharmacol.Sin.2017,38,1059-1068)，而在人骨髓瘤细胞H929中80μM仍没有任何抑制效应。
化合物1a的结构为：
化合物1m的结构为：
大多数的肿瘤是没有B-RafV600E突变的。因此，雷复尼特在不以B-RafV600E为靶标的肿瘤治疗中是否有效，值得探索。
发明内容
本发明的目的在于提供雷复尼特的新用途，即雷复尼特在制备不以B-RafV600E为靶标的抗肿瘤药物中的应用。
本发明一方面提供了雷复尼特在制备不以B-RafV600E为靶标的药物中的应用。
特别地，本发明提供了雷复尼特在用于制备预防和/或治疗不以B-RafV600E为靶标的肿瘤药物的应用，或者，本发明提供了雷复尼特在用于制备预防和/或治疗没有B-RafV600E突变的肿瘤药物的应用。
更为具体的，所述肿瘤为骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及B-RafV600E抑制剂无效的结直肠癌等。
在本发明中，特别地，雷夫尼特作为p38MAPK抑制剂。
本申请发明人经实验研究发现，雷复尼特能显著抑制没有B-RafV600E突变的肿瘤细胞，特别是骨髓瘤细胞的生长，在骨髓瘤裸鼠移植瘤上可显著抑制肿瘤的生长，可发展为骨髓瘤的预防和/或治疗药物。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明人对已知药物雷复尼特发掘了新的医疗用途，开拓了新的应用领域。
(2)本发明人发现雷复尼特在不以B-RafV600E为靶标的肿瘤中有效。
(3)本发明人发现雷复尼特可以抑制p38MAPK通路。
(4)本发明人发现雷复尼特在动物水平可以显著抑制肿瘤的生长。
附图说明
图1为三种化合物(雷复尼特、化合物1a、化合物1m)对人骨髓瘤细胞H929的抑制曲线。
图2为雷复尼特对人骨髓瘤细胞ARP-1的抑制曲线。
图3为雷复尼特对人骨髓瘤细胞OCI-MY5的抑制曲线。
图4为雷复尼特对p38MAPK的抑制作用实验。
图5为雷复尼特对人骨髓瘤细胞H929裸鼠移植瘤的抑制实验中显示肿瘤体积的照片。
图6为雷复尼特对人骨髓瘤细胞H929裸鼠移植瘤的抑制实验中肿瘤体积曲线。
图7为雷复尼特对人骨髓瘤细胞H929裸鼠移植瘤的抑制实验中小鼠体重曲线。
图8为雷复尼特对人淋巴瘤细胞OCI-LY8的抑制曲线。
图9为雷复尼特对人淋巴瘤细胞NUDUL-1的抑制曲线。
图10为雷复尼特对7721肝癌细胞的抑制曲线。
图11为雷复尼特对MDAMB231乳腺癌细胞的抑制曲线。
图12为雷复尼特对A549肺癌细胞的抑制曲线。
图13为雷复尼特对DU145前列腺癌细胞的抑制曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：针对人骨髓瘤细胞H929的杀伤活性
1.实验材料
(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(H929细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。
(2)主要试剂：1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)，化合物1a、1m(参照Wang,G.-m.；Wang,X.；Zhu,J.-m.；Guo,B.-b.；Yang,Z.；Xu,Z.-j.；Li,B.；Wang,H.-y.；Meng,L.-h.；Zhu,W.-l.；Ding,J.,Docking-based structural splicing and reassembly strategy to develop noveldeazapurine derivatives as potent B-RafV600E inhibitors.ActaPharmacol.Sin.2017,38,1059-1068文献方法自主合成)。
(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，全自动酶标仪(Bio-TEK，Elx800)。
2.实验方法
(1)细胞培养
细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，pH 7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％CO2环境下培养。
(2)CCK8试剂盒测定各药物的细胞毒性
取人多发性骨髓瘤细胞(H929细胞)的单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×105个/mL。取96孔培养板每孔加入95μL上述细胞悬液，然后加不同浓度的用培养基配制的药物(雷复尼特、化合物1a、化合物1m)5μL，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养48h，培养结束前2h，每孔加入CCK8试剂10μL，于CO2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测450nm各孔OD值。计算细胞存活率与抑制率：细胞存活率(％)＝(实验孔OD均值/对照孔OD均值)×100％。细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度IC50。实验重复三次。
3.实验结果
实验结果见图1。
结论：雷复尼特对人多发性骨髓瘤细胞H929具有杀伤活性，其IC50为10.2μM，而化合物1a和1m对H929细胞没有杀伤活性。
实施例2：雷复尼特针对人骨髓瘤细胞ARP-1的杀伤活性
1.实验材料
(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(ARP-1细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。
(2)主要试剂：1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)。
(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，全自动酶标仪(Bio-TEK，Elx800)。
2.实验方法
(1)细胞培养
细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，pH 7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％CO2环境下培养。
(2)CCK8试剂盒测定各药物的细胞毒性
取人多发性骨髓瘤细胞(ARP-1细胞)的单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×105个/mL。取96孔培养板每孔加入95μL上述细胞悬液，然后加不同浓度的用培养基配制的雷复尼特5μL，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养48h，培养结束前2h，每孔加入CCK8试剂10μL，于CO2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测450nm各孔OD值。计算细胞存活率与抑制率：细胞存活率(％)＝(实验孔OD均值/对照孔OD均值)×100％。细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度IC50。实验重复三次。
3.实验结果
实验结果见图2。
结论：雷复尼特对人多发性骨髓瘤细胞ARP-1具有杀伤活性，其IC50为19.3μM。
实施例3：雷复尼特针对人骨髓瘤细胞OCI-MY5的杀伤活性
1.实验材料
(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(OCI-MY5细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。
(2)主要试剂：1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)。
(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，全自动酶标仪(Bio-TEK，Elx800)。
2.实验方法
(1)细胞培养
细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，pH 7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％CO2环境下培养。
(2)CCK8试剂盒测定各药物的细胞毒性
取人多发性骨髓瘤细胞(OCI-MY5细胞)的单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×105个/mL。取96孔培养板每孔加入95μL上述细胞悬液，然后加不同浓度的用培养基配制的雷复尼特5μL，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养48h，培养结束前2h，每孔加入CCK8试剂10μL，于CO2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测450nm各孔OD值。计算细胞存活率与抑制率：细胞存活率(％)＝(实验孔OD均值/对照孔OD均值)×100％。细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度IC50。实验重复三次。
实验结果
实验结果见图3。
结论：雷复尼特对人多发性骨髓瘤细胞OCI-MY5具有杀伤活性，其IC50为27.8μM。
实施例4：雷复尼特对p38MAPK的抑制作用
1.实验材料
(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(H929、ARP-1细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。
(2)主要试剂：1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)，BCA工作液(碧云天公司)，裂解液(碧云天公司)，PBS(上海生工生物工程有限公司)，SDS(上海生工生物工程有限公司)，上样缓冲液(碧云天公司)，电泳缓冲液(碧云天公司)，转移缓冲液(碧云天公司)，PBST洗脱抗体缓冲液(碧云天公司)，p38MAPK抗体(美国abcam公司)，p-p38MAPK抗体(美国abcam公司)，p-Stat1抗体(美国abcam公司)，β-actin抗体(美国Sigma公司)。
(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，全自动酶标仪(Bio-TEK，Elx800)，电泳仪(美国Bio-rad公司)，Odyssey双色红外激光成像系统(美国LICOR公司)。
2.实验方法
(1)细胞培养
细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，pH 7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％CO2环境下培养。
(2)蛋白质印迹法(Western Blot法)检测雷复尼特对p38MAPK的抑制作用
1)蛋白样品制备
用0、20和40μM雷复尼特处理H929细胞48小时；收集细胞，1200rpm/min，5min；去上清，用1mL 1×PBS重悬细胞，离心1200rpm/min，5min；去上清，加入RIPA裂解液，冰上裂解30min；4℃离心12000rpm/min，10min，收集上清，-20℃保存。
2)BCA法蛋白定量
用ddH2O稀释标准蛋白，使其浓度为0.5mg/mL；将BCA和Cu试剂按50:1配成BCA工作液；按表中的方法将各试剂加入96孔板中；将96孔板置于37℃培养箱中孵育30min；使用多功能酶标仪在波长为562nm检测吸光度；制定标准曲线，计算待测孔蛋白浓度X值。
表BCA法蛋白定量加样表
3)蛋白样品加入1×上样缓冲液(loadingbuffer)，100℃加热10min。
4)配胶
清洗玻璃板，晾干待用；将玻璃板安装在配胶架上；将2×PAGE Gel 4mL(10％)与2×分离胶缓冲液(resolvingbuffer)4mL混合，加入80μLAP(过硫酸铵)，混匀后立即加入玻璃板空隙中，立即加入无水乙醇封胶；待分离胶凝固后，将无水乙醇倒尽；将2×浓缩胶(stacking Gel)1.5ml与2×浓缩胶缓冲液(stacking buffer)1.5ml混合，加入30μLAP，混匀后立即加入玻璃板中，加满玻璃板空隙后，小心插入10孔梳子；等待上层浓缩胶凝固后，将玻璃板从配胶架上拆下，置于加有双蒸水的袋子中，放于4℃备用。
5)Western Blot试剂配置
①1×电泳液：
加入双蒸水定容到1000mL。
②1×转膜液：
加入双蒸水定容到800mL，混匀，加入甲醇200mL，置于-20℃冰箱预冷。
③PBST：1000mL 1×PBS内加入1mL吐温-20，混匀备用。
④5％脱脂奶粉或5％BSA：2.5mg脱脂奶粉或BSA，用1×PBS定容到50mL，混匀，置于4℃冰箱备用。
6)上样
将玻璃板安装到电泳槽内，加入足量电泳液，取下梳子，将蛋白样品小心的加入孔中。
7)电泳
接上电源，用80V的电压进行电泳，当蛋白跑至分离胶时，可将电压调至120V进行电泳。
8)转膜
将玻璃板取下，撬开玻璃板，切下需要的分离胶，置于转膜液中；转膜夹黑面朝下，打开置于转膜液中，上面覆一层海绵垫，海绵垫上覆一层滤纸；将分离胶置于滤纸上，上面覆盖一层预先浸润的PVDF膜，上覆一层滤纸，滤纸上覆一层海绵垫；赶走气泡，将转膜夹关上，安装至转膜槽中，内置冰盒，加入足量转膜液，将转膜槽置于冰中；转膜200mA，1小时。
9)用5％脱脂奶粉或5％BSA封闭1小时。
10)分别用p38MAPK、p-p38MAPK、p-Stat1和β-actin抗体4℃孵育过夜。
11)用PBST洗膜三次，每次5min。
12)用荧光标记的二抗室温、避光孵育1小时。
13)用PBST避光洗膜三次，每次5min。
14)用Odyssey双色红外激光成像系统分析。
实验结果见图4。
结论：雷复尼特能明显抑制p38MAPK信号通路。
实施例5：雷复尼特对H929裸鼠骨髓瘤移植瘤的抑制作用
1.实验材料
(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(H929细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。
(2)实验动物：雄性BALB/C裸鼠(6-8周，购自上海斯莱克实验动物有限公司)，置于SPF级环境中饲养(上海第十人民医院中心实验室动物房)。
2.实验方法
(1)细胞培养参见实施例1。
(2)动物实验
将含2.5×106个H929细胞的1640培养基注射到裸鼠右腋窝皮下，当瘤子长成并可测量时，随机分为对照组和给药组。给药组裸鼠隔天腹腔注射雷复尼特15mg/kg，对照组裸鼠注射相同体积的溶剂(100μL，5％DMSO+95％生理盐水)。每两天测量一次瘤子大小(测量瘤子的长和宽，瘤子体积＝(长/2)×(宽)^2。给药14天后处死老鼠并取瘤子拍照。
3.实验结果
实验结果见图5-图7。
结论：雷复尼特能够有效抑制裸鼠多发性骨髓瘤的生长。
实施例6：雷复尼特对对人淋巴瘤细胞的杀伤活性
1.实验材料
(1)细胞株：人淋巴瘤细胞(OCI-LY8细胞、NUDUL-1细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。
(2)主要试剂：1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)。
(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，全自动酶标仪(Bio-TEK，Elx800)。
2.实验方法
(1)细胞培养
细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，pH 7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％CO2环境下培养。
(2)CCK8试剂盒测定各药物的细胞毒性
取人淋巴瘤细胞(OCI-LY8细胞、NUDUL-1细胞)的单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×105个/mL。取96孔培养板每孔加入95μL上述细胞悬液，然后加不同浓度的用培养基配制的药物5μL，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养48h，培养结束前2h，每孔加入CCK8试剂10μL，于CO2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测450nm各孔OD值。计算细胞存活率与抑制率：细胞存活率(％)＝(实验孔OD均值/对照孔OD均值)×100％。细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度IC50。实验重复三次。
3.实验结果
实验结果见图8-9。
结论：雷复尼特对人淋巴瘤细胞具有杀伤活性，OCI-LY8细胞及NUDUL-1细胞的IC50分别为13.83μM，23.65μM。
实施例7：雷复尼特对人实体瘤(肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌)细胞的杀伤活性
1.实验材料
(1)细胞株：人实体瘤细胞(7211肝癌、MDAMB231乳腺癌、A549肺癌、DU145前列腺癌)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于DMEM培养基(含10％胎牛血清)
(2)主要试剂：DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，雷复尼特(百灵威科技有限公司)。
(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，全自动酶标仪(Bio-TEK，Elx800)。
2.实验方法
(1)细胞培养
细胞培养于DMEM培养基(含10％胎牛血清，pH 7.2)，置于细胞培养箱中在37℃、5％CO2环境下培养。
(2)CCK8试剂盒测定各药物的细胞毒性
取7211、MDAMB231、A549及DU145细胞分别用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至6×104个/mL。取96孔培养板每孔加入50μL上述细胞悬液，置CO2孵箱37℃培养24h后，细胞贴壁且生长良好，加不同浓度的用培养基配制的雷复尼特5μL，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养48h，培养结束前2h，每孔加入CCK8试剂10μL，于CO2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪检测450nm各孔OD值。计算细胞存活率：细胞抑制率(％)＝[1-(实验孔OD均值/对照孔OD均值)]×100％。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度IC50。实验重复三次。
3.实验结果
实验结果见图10-图13。
结论：雷复尼特对人7211肝癌、MDAMB231乳腺癌、A549肺癌及DU145前列腺癌有很好的杀伤活性，其IC50分别为17.5μM，42.1μM，7.9μM及49.4μM。
Claims (7)
1.雷复尼特在制备不以B-RafV600E为靶标的药物中的应用。
2.雷复尼特在制备用于预防和/或治疗不以B-RafV600E为靶标的肿瘤药物中的应用。
3.雷复尼特在制备用于预防和/或治疗没有B-RafV600E突变的肿瘤药物的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括：骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及B-RafV600E抑制剂无效的结直肠癌。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，雷夫尼特作为p38MAPK抑制剂。
6.雷复尼特在制备预防和/或治疗骨髓瘤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，雷夫尼特作为p38MAPK抑制剂。
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