CN110122412A - 一种肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，涉及肺部菌群研究技术领域，该方法以小鼠为实验对象，小鼠气管滴注抗生素后，气管滴注其他小鼠肺泡灌洗液，即得到菌群移植模型；该方法的有益效果在于：方法快速简单可行，效果显著，无副作用，重复率高。
Description
技术领域
本发明涉及肺部菌群研究技术领域，具体涉及一种肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法。
背景技术
正常生理情况下，人体内含有多达数万种不同的菌种，这些菌群所携带的基因数是人体自身基因的100倍以上，宿主与微生物之间互惠互利的动态平衡在维持机体各项功能中发挥着极为重要的作用。随着研究的深入，微生物与机体健康的关系日益清晰，其对机体免疫系统、循环系统、中枢神经系统和消化系统正常功能的维持均有着不可替代的作用。
当前，肠道菌群是学术界热点之一，但肺部菌群研究尚处于探索阶段，很多问题亟待深入研究，例如：肺部菌群影响机体免疫和代谢的途径和机制；肺部菌群中致病菌或致病代谢产物的筛选鉴定；致病菌或致病代谢产物作用机制及与其他因素(如基因型)的交联作用；肺部菌群中有益菌或有益代谢产物的分离鉴定及其作用机制的研究等。因此，迫切需要一种合适的动物模型来研究肺部菌群与机体的相互作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法。
本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供一种肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，该方法以小鼠为实验对象，小鼠气管滴注抗生素后，气管滴注其他小鼠肺泡灌洗液，即得到肺部菌群移植啮齿动物模型。
优选的，所述抗生素的使用方法为：每次气管滴注量为50μL/次/只，间隔1天再次气管滴注，共气管滴注两次。
优选的，所述抗生素由头孢噻污、头孢呋辛、庆大霉素混合制成。
优选的，所述肺泡灌洗液的获取方法为：使用静脉留置针将1mL生理盐水通过气管注射进小鼠肺中，进行抽吸，直至生理盐水变呈粘稠状，即获得肺泡灌洗液。
优选的，所述小鼠选取2月龄雄性C57BL/6小鼠。
优选的，所述选取的小鼠无特定病原体，体重30±2.0g。
优选的，所述小鼠的饲养方法为将小鼠饲养于屏障环境中，每日所需的食物和水经过灭菌处理，自由进食进水。
优选的，还包括菌群移植模型的验证步骤：通过qRT-PCR方法检测小鼠肺部菌群量和优势菌群量，用以验证菌群移植模型是否建立成功。
优选的，还包括检测建模方法副作用的步骤：通过Elisa法检测小鼠体内白介素-1β和白介素-6含量，通过化学比色法测定小鼠体内乳酸脱氢酶含量，以检测建模方法的副作用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明建模时间短，从开始建模到模型建立仅需5天，简单易行，可重复性好；
(2)本发明效果显著，建立的啮齿类动物肺部菌群移植模型是肺部菌群研究不可缺少的动物模型；
(3)本发明的建模方法无副作用。
附图说明
图1为本发明实施例1中三组小鼠建模完成后肺组织解剖图；其中a为对照组；b为抗生素组；c为移植组；
图2为本发明实施例1中三组小鼠建模完成后单位质量肺部组织菌群16s rDNA基因V4区qRT-PCR绝对定量结果；
图3为本发明实施例1中三组小鼠建模完成后单位质量肺组织拟杆菌门qRT-PCR绝对定量结果；
图4为本发明实施例1中三组小鼠建模完成后单位质量肺组织肠球菌属qRT-PCR绝对定量结果；
图5为本发明实施例1中三组小鼠建模完成后血清IL-6水平；
图6为本发明实施例1中三组小鼠建模完成后血清IL-1β水平；
图7为本发明实施例1中三组小鼠建模完成后血清LDH水平。
具体实施方式
以下将结合说明书附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
(一)肺部菌群研究的菌群移植模型的建立方法：
(1)以2月龄C57BL/6小鼠为实验动物，雄性，15只，体重30±2.0g，随机分为三组：对照组、抗生素组和移植组(各5只)；饲养在屏障环境中，饲喂基础维持饲料；每日所需的食物和水经过灭菌处理，自由进食进水；
(2)抗生素的配制：所使用的抗生素含头孢噻污0.5mg，头孢呋辛0.5mg，庆大霉素0.25mg，混合后溶于10mL双蒸水中，充分混匀；
(3)肺泡灌洗液的获取：使用静脉留置针将1mL生理盐水通过气管注射进小鼠肺中，进行反复抽吸，直至生理盐水变呈粘稠状，即获得肺泡灌洗液；
对照组：小鼠气管滴注生理盐水(50μL)后间隔24h后再气管滴注生理盐水(50μL)，间隔24h后再次气管滴注生理盐水(50μL)；
抗生素组：小鼠气管滴注抗生素(50μL)后间隔24h后再次气管滴注抗生素(50μL)，间隔24h后再气管滴注生理盐水(50μL)；
移植组：气管滴注抗生素(50μL)，间隔24h后再次气管滴注抗生素(50μL)，快速清除小鼠肺组织微生物，间隔24h后再气管滴注其他小鼠肺泡灌洗液(50μL)，移植肺部菌群。
(二)评价和分析所构建的肺部菌群研究的菌群移植模型：
(1)qRT-PCR法(quantitative Real-Time PCR)检测三组C57BL/6小鼠肺组织内菌群含量和组成的变化，定量分析肺部菌群移植的效果：
①设计最大限度包含微生物16s rRNA V4区和乳酸杆菌(Lactobacillus)，多形拟杆菌(Bacteroides)，粪肠球菌(Enterococcus)，螺旋菌科(Lachnospiraceae)，肉毒杆菌(Clostridium)。引物序列如下：
②气管滴注肺泡灌洗液后24小时处死小鼠，采集实验动物全部气管和肺组织，称重，使用QIAGEN公司DNA提取试剂盒提取组织DNA，按照试剂盒操作说明书进行，具体步骤如下：
a.将组织样本置于2mL离心管中，并置于冰上；
b.样品中加入800μL试剂CD1，持续震荡30min以上，直至样品完全混匀；
c.15,000g离心样品1min，移取上清液至新的2mL离心管；
d.加入200μL试剂CD2，轻微混匀；
e.15,000g离心样品1min，移取上清液700μL至新的2mL离心管；
f.加入600μLCD3，轻微混匀；
g.小心移取650μL上述液体至离心柱中，并将离心柱放置于收集管中，12,000rpm离心1min，弃去滤液；
h.重复步骤7，直至所有上清液均过滤；
i.将离心柱转移至新的收集管中，加入500μL试剂EA，15,000g离心样品1min，弃去滤液；
j.加入500μL试剂CD5，15,000g离心样品1min，弃去滤液；
k.将离心柱转移至新的收集管中，15,000g离心样品1min，弃去滤液；
l.将离心柱转移至新的收集管中，加入100μL试剂CD6，摇匀，直至试剂CD6完全覆盖离心柱的膜；
m.15,000g离心样品1min，收集滤液；
n.使用NanoDrop分光光度计检测提取的DNA浓度与纯度，并置于-80℃冰箱保存。
③qRT-PCR法检测实验动物肺组织内微生物含量：采用美国Roche公司96实时荧光定量PCR系统检测实验小鼠肺组织组织内微生物总量与不同种类微生物含量
25μL扩增体系由12.5μL SYBR Mix(Promega)，2μL引物，5μL模板DNA引物和5.5μLddH2O组成。荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火，延伸30s，执行50个循环，每个循环结束后收集荧光信号。
(2)处死动物后，采集实验动物外周血，离心后取血清，使用Elisa法检测血清中白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)含量，并使用化学比色法检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)含量，以检测该建模方法副作用；其中Elisa法和化学比色法均为现有技术。
(三)实验结果
通过分析对照组、抗生素组和移植组实验动物肺部菌群总量与不同种类微生物含量的变化，分析肺部微生物清除程度和建模是否成功：
(1)如图1所示，处死实验动物后解剖实验小鼠，三组小鼠肺组织无明显变化。
(2)对照组、抗生素组和移植组中小鼠肺部菌群总量与菌群丰富度：
①肺部菌群总量：如图2所示，与对照组实验小鼠相比，抗生素组实验小鼠单位质量肺组织内微生物总量显著降低，移植组实验小鼠较抗生素组实验小鼠单位质量肺组织组织内微生物总量明显回升。
②菌群丰富度：如图3，抗生素组实验小鼠单位质量肺组织组织内拟杆菌门明显减少，移植组实验小鼠较抗生素组实验小鼠单位质量肺组织组织内拟杆菌门明显回升；如图4所示，抗生素组实验小鼠单位质量肺组织组织内肠球菌属明显减少，移植组实验小鼠较抗生素组实验小鼠单位质量肺组织组织内肠球菌属明显回升。
③IL-6，IL-1β和LDH检测结果：如图5、图6和图7所示，三组实验动物血清IL-6，IL-1β和LDH检测结果均显示无统计学差异。
综上，本发明实施例中抗生素组实验小鼠相比较对照组实验小鼠肺部微生物显著减少，而移植组实验小鼠相比较抗生素组实验小鼠肺部微生物明显增加，表明本发明可有效重置啮齿类动物肺组织微生物，且无副作用。本发明建立的肺部菌群移植模型是肺部菌群研究不可缺少的动物模型，在研究肺部菌群在肺部疾病发生发展和/或环境污染物暴露过程具有重要的意义。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，其特征在于：所述方法以小鼠为实验对象，小鼠气管滴注抗生素后，气管滴注其他小鼠肺泡灌洗液，即得到肺部菌群移植啮齿动物模型。
2.根据权利要求1所述的肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，其特征在于：所述抗生素的使用方法为：每次气管滴注量为50μL/次/只，间隔1天再次气管滴注，共气管滴注两次。
3.根据权利要求1所述的肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，其特征在于：所述抗生素由头孢噻污、头孢呋辛、庆大霉素混合制成。
4.根据权利要求1所述的肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，其特征在于：所述肺泡灌洗液的获取方法为：使用静脉留置针将1mL生理盐水通过气管注射进小鼠肺中，进行抽吸，直至生理盐水变呈粘稠状，即获得肺泡灌洗液。
5.根据权利要求1所述的肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，其特征在于：所述小鼠选取2月龄雄性C57BL/6小鼠。
6.根据权利要求5所述的肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，其特征在于：所述选取的小鼠无特定病原体，体重30±2.0g。
7.根据权利要求1所述的肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，其特征在于：所述小鼠的饲养方法为将小鼠饲养于屏障环境中，每日所需的食物和水经过灭菌处理，自由进食进水。
8.根据权利要求1所述的肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，其特征在于：还包括菌群移植模型的验证步骤：通过qRT-PCR方法检测小鼠肺部菌群量和优势菌群量，用以验证菌群移植模型是否建立成功。
9.根据权利要求1所述的肺部菌群移植啮齿动物模型的构建方法，其特征在于：还包括检测建模方法副作用的步骤：通过Elisa法检测小鼠体内白介素-1β和白介素-6含量，通过化学比色法测定小鼠体内乳酸脱氢酶含量，以检测建模方法的副作用。
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