CN110117531B - 耐药表型快速检测药敏平板及耐药表型快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种耐药表型快速检测药敏平板及耐药表型快速检测方法，用于耐药表型快速检测，在药敏平皿内的M‑H琼脂厚度均匀地铺设为3mm构成tMHA。在tMHA上涂布2.0～3.0麦氏单位菌液后贴药敏纸片，仅需4～6小时的培养，即可根据抑菌环直径判断出是否为相应的耐药表型。本发明公开了一种薄型M‑H药敏平板，可以将细菌耐药表型检测的时间从现有技术最快的16‑24小时缩短到4‑8小时，快速简便地检测细菌耐药表型对及时有效地抗感染治疗有非常重大的临床意义，利于临床的及时治疗和医院感染的防控。
Description
技术领域
本发明涉及细菌耐药表型检测，具体说是一种耐药表型快速检测药敏平板及其使用方法。
背景技术
随着抗生素在世界范围内的广泛使用，细菌对抗生素的耐药性也随之而来。细菌对抗生素的耐药性有多种机制，例如产生水解酶，膜通透蛋白的缺失等。目前细菌的耐药性已经成为威胁人类健康的重要因素，每年全球死亡的病因中感染性疾病占第一位。耐碳青霉烯肠杆菌（CRE）、产超广谱beta-内酰胺酶（ESBL）的肠杆菌等耐药株在全球范围内广泛传播。在中国，肺炎克雷伯菌中CRE菌株已经达到9%，在一些地区甚至已经超过20%，而CRE感染引起的粗死亡率已经超过30%。因此快速地检测这些耐药菌的耐药表型对有效地抗感染治疗和医院感染的防控有很重要的意义。
目前美国实验室标准化委员会（CLSI）针对这些细菌耐药表型也推荐了很多细菌耐药表型检测方法，比如MRS、ESBL、mCIM、eCIM等方法检测方法，这些表型检测方法使用的药敏平板均是Mueller-Hinton(M-H)琼脂平板,平板的M-H琼脂厚度为4mm[见参考文献1，2]。这些表型检测方法均将待测菌涂布在M-H琼脂平板, 在贴上不同的药敏纸片，根据抑菌环的大小或形状的改变来判断其耐药表型，因为在M-H琼脂平板形成肉眼可见的抑菌环一般需要16-24小时，故这些检测方法大多需要16-24小时，不利于临床的及时治疗和医院感染的防控。虽然分子生物学和质谱的方法可以快速地进行检测，但这些方面对设备和技术的要求较高，不利于临床实验室常规开展。
因此快速简便地检测细菌耐药表型有非常现实的意义，对及时有效地抗感染治疗有非常重大的临床意义。
参考文献：
1. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2012. PerformanceStandards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, 11th ed. Approvedstandard M2-A11. CLSI, Wayne,PA
2. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial SusceptibilityTesting. 29th ed. CLSI supplement M100. Wayne, PA: Clinical and LaboratoryStandards Institute; 2019.
发明内容
本发明的第一目的在于提供耐药表型快速检测方法所使用的药敏平皿，使细菌在药敏平板上可以快速形成肉眼可以的菌膜。
本发明的第二个目的在于提供一种细菌在薄M-H平板上生长出肉眼可以的菌膜的方法，将检测时间从传统的16-24小时大幅缩短。
为实现上述目的，本发明的技术方案为，所述的耐药表型快速检测药敏平板，用于耐药表型快速检测，其特征在于：包括无菌的药敏平皿和所述药敏平皿内的M-H琼脂；
所述药敏平皿是底面为平面的敞口器皿，底面为连续整面，边缘外凸或平直，相当直径为6～15cm，器皿的深度大于3.5mm；
所述M-H琼脂厚度均匀地铺设于药敏平皿的底面上，厚度为3.0±0.1mm。
优选地，设有与所述药敏平皿配套的平皿盖，平皿盖正常盖在所述药敏平皿上时将药敏平皿完全覆盖，所述药敏平皿和平皿盖为无色透明的玻璃或有机玻璃材质。
优选地，所述药敏平皿为直径9±0.2cm，深度3.5～7mm的底面圆形器皿。
一种耐药表型快速检测的方法，其特征在于：按照下述的步骤顺序进行：
第一步：制作耐药表型快速检测药敏平板：
在无菌消毒的药敏平皿内制作M-H琼脂，使M-H琼脂在药敏平皿内各处的厚度为3±0.1 mm，制成薄型琼脂平板tMHA，放4℃环境保存一天以上备用；
第二步：涂布菌液；
取出tMHA待温度稳定，根据不同的耐药表型将对应的细菌菌液浓度调整到2.0～3.0麦氏单位，制备好的菌液在15分钟内完成tMHA琼脂表面的涂布；
第三步：贴药敏纸片；
涂布完菌液的tMHA在第3～5分钟内贴上抗菌药物纸片，在涂布菌液的tMHA表面贴上符合CLSI标准的与耐药表型检测相应的抗菌药物纸片，抗菌药物纸片距离tMHA边缘不低于20mm，多片抗菌药物纸片相互之间的中心距离不低于24mm；
第四步：判断：
根据不同的耐药表型，将药敏平皿在35±1℃环境下经过4～6小时的培养，测量相应抗菌药物纸片的抑菌环，再与相应的耐药表型的判断标准进行比较，根据耐药表型判断标准来判断是否为相应的耐药表型，符合耐药表型判断标准的就判定为耐药表型阳性，不符合耐药表型判断标准的就判定为耐药表型阴性；
根据操作方法，所述的耐药表型判断标准如下：
如果用大肠埃希菌ATCC25922涂布tMHA平板，则沾取了测试菌的药敏纸片抑菌环与不沾取测试菌的药敏纸片抑菌环直径之差大于5mm为阳性，小于3mm为阴性；
如果直接用待测菌涂布tMHA平板，则加了待检测酶的酶抑制剂的药敏纸片和不加待检测酶的酶抑制剂的药敏纸片抑菌环直径之差大于5mm为阳性，小于3mm为阴性。
其中，在第一步中，药敏平板的制作方法为：取每38g M-H琼脂干粉加1000ml去离子水，加热使M-H琼脂干粉完全溶解，调节溶液pH值至7.3±0.1，然后在121℃高压环境进行15分钟灭菌；将液态的M-H琼脂倒入无菌药敏平皿上，水平放置使M-H琼脂各处厚度为3.0±0.1 mm，待凝固后制成tMHA。
作为实施例，在第二步中，将对应的细菌菌液浓度调整到3.0麦氏单位。
作为实施例，在第二步中，将对应的细菌菌液浓度调整到2.0麦氏单位。
在第二步中涂布的具体方法为，将无菌棉拭子浸入所述细菌菌液中，旋转数次，在液面上方的管壁按压去除棉拭子里多余的菌液，然后将棉拭子在整个tMHA表面来回涂布三次，每次旋转平板60度，以确保菌液均匀分布；最后在平板琼脂的边缘涂一圈。
本发明公开了一种薄型药敏平板，可以将细菌耐药表型检测的时间从现有技术最快的16-24小时缩短到4-8小时，并同时公开了的与之相应的细菌耐药表型检测的方法。
通过试验组和对照组的对比试验，从实验效果来看，检测方法能达到要求。试验特异性在99%以上。如碳青霉烯酶的表型检测同另一种目前CLSI推荐的表型检测方法mCIM的一致性达到99.8%。
快速简便地检测细菌耐药表型对及时有效地抗感染治疗有非常重大的临床意义，非常利于临床的及时治疗和医院感染的防控。
附图说明
图1 是本发明结构示意图，
图2 是图1的截面仰视图，
图3是直径9cm的药敏平板培养6个小时时的肠杆菌科细菌碳青霉烯酶产酶株的表型检测试验状态实物图，
图4是直径9cm的药敏平板培养6个小时时的铜绿假单胞菌碳青霉烯酶产酶株的表型检测试验状态实物图。
图中：1-药敏平皿，2-M-H琼脂，3-平皿盖。
实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：如图1、2所示耐药表型快速检测药敏平板，用于耐药表型快速检测，由无菌的药敏平皿1、所述药敏平皿1内的M-H琼脂2和平皿盖3组成。
所述药敏平皿1是底面为平面的敞口器皿，平皿盖3与所述药敏平皿1配套，平皿盖正常盖在所述药敏平皿上时将药敏平皿完全覆盖，所述药敏平皿1和平皿盖3为无色透明的玻璃或有机玻璃材质。药敏平皿1的底面为连续整面，边缘外凸或平直，相当直径为6～15cm，通常，药敏平皿1的深度大于3.5mm，小于15mm。典型的药敏平皿1为直径9.0±0.2cm，深度3.5～7mm的底面圆形器皿。
所述M-H琼脂2厚度均匀地铺设于药敏平皿1的底面上，厚度为3.0±0.1mm。虽然现有的M-H琼脂厚度为4mm，仅仅相差1mm，但是实验出乎意料地发现针对细菌耐药表型的快速检测有明显的效果。可以将细菌耐药表型检测的时间从现有技术最快的16-24小时缩短到4-8小时。
耐药表型快速检测的方法，按照下述的步骤顺序进行：
第一步：制作耐药表型快速检测药敏平板：
在无菌消毒的药敏平皿内制作M-H琼脂，使M-H琼脂在药敏平皿内各处的厚度为3.0±0.1 mm，制成薄型M-H琼脂平板tMHA。
药敏平板的制作方法为：按照每38g M-H琼脂干粉加1000ml去离子水的比例配制，加热使M-H琼脂干粉完全溶解，调节溶液pH值至7.3±0.1，然后在121℃高压环境进行15分钟灭菌；高压灭菌后将液态的M-H琼脂倒入无菌药敏平皿上，水平放置使M-H琼脂各处厚度为3.0±0.1 mm，制成tMHA，tMHA水平放置，等M-H琼脂凝固后放4℃冰箱保存备用。此处，M-H琼脂厚度为均匀的3.0±0.1mm。
第二步：涂布菌液；
根据不同的耐药表型将对应的细菌菌液浓度调整到2.0或3.0麦氏单位，制备好的菌液在15分钟内完成tMHA琼脂表面的涂布。
涂布的具体方法为，将无菌棉拭子浸入所述细菌菌液中，旋转1～4次，在液面上方的管壁按压，适当去除棉拭子里的菌液，到棉拭子内的菌液不会自行流出的程度，然后将棉拭子在温度已稳定的整个tMHA表面不破坏琼脂形状地来回涂布三次，每次旋转平板60度，以确保菌液均匀分布；最后在平板琼脂的边缘涂一圈。
第三步：贴药敏纸片；
涂布完菌液的tMHA在第3～5分钟内贴上抗菌药物纸片，在涂布菌液的tMHA表面贴上与耐药表型检测相应的抗菌药物纸片，抗菌药物纸片通常是直径约6mm的符合CLSI标准的商品化纸片，抗菌药物纸片距离tMHA边缘不低于20mm，如果有多片抗菌药物纸片，则抗菌药物纸片之间的中心距离不低于24mm。
第四步：判断：
根据不同的耐药表型，将药敏平皿在35±1℃经过4～6小时的培养，测量相应抗菌药物纸片的抑菌圈，再与相应的耐药表型的判断标准进行比较，根据耐药表型判断标准来判断是否为相应的耐药表型，符合判断标准的就判定为耐药表型阳性，不符合的就判定为耐药表型阴性。根据操作方法，常用的所述的耐药表型判断标准如下：
如果用大肠埃希菌ATCC25922涂布tMHA平板，则涂布了测试菌的药敏纸片抑菌环与不涂布测试菌的药敏纸片抑菌环直径之差大于5mm为阳性，小于3mm为阴性；
如果直接涂布侍测菌在tMHA平板，则加待检测酶的酶抑制剂药敏纸片和不加待检测酶的酶抑制剂药敏纸片的抑菌环直径之差大于5mm为阳性，小于3mm为阴性。
实施例：碳青霉烯酶产酶株的表型检测试验：
菌株
用临床分离的240株肠杆菌科细菌、235株铜绿假单胞菌进行碳青霉烯酶产酶株的表型鉴定试验。240株肠杆菌科细菌中，有 191株产碳青霉烯酶，包括Kpn (57.6%), Eco(29.8%), Ecl (11.5%), Cfr (1.1%)，其酶型分布为KPC-2 (56.5%)，IMP-4 (19.9%),IMP-2 (1.6%), VIM-1 (5.8%), NDM-1 (15.2%), OXA-48(1%)。235株铜绿假单胞菌中，有195株对亚胺培南耐药，有37株菌产碳青霉烯酶，酶型分布为KPC-2 (2.7%)，IMP-4 (2.7%)，VIM-1 (54.1%)，VIM-2 (8.1%)，VIM-4 (32.4%)。所有的实验细菌均用质谱进行鉴定，产酶株的碳青霉烯酶型均通过PCR扩增和测序证实。
方法：
将大肠埃希菌ATCC25922过夜培养，挑取大肠埃希菌ATCC25922菌落于无菌生理盐水中，将ATCC25922菌液浓度调整为3.0麦氏单位，然后将调好的菌液涂布在tMHA平板上，放置5分钟，然后取一张亚胺培南纸片（10 μg /片），沾取1-3个过夜培养的待测菌菌落，将带菌的一面贴在涂好菌液的tMHA平板上，同时贴一张没有粘菌的亚胺培南纸片。35℃培养5-6小时观察结果，如果沾了待测菌的亚胺培南纸片比没有沾菌的亚胺培南纸片抑菌环直径减少大于5 mm为阳性，减少小于3mm为阴性，如在两者之间则为不确定性。5-6小时内抑菌环直径基本不会有变化。
结果：
240株肠杆菌科细菌中，191株产碳青霉烯酶菌株经rCDM检测，结果均为阳性，包括KPC-2(56.5%)，IMP-4(19.9%), IMP-2(1.6%), VIM-1(5.8%), NDM-1(15.2%), OXA-48(1%)， 49株非产碳青霉烯酶菌株, rCDM检测结果显示有1株为阳性，其余均为阴性. 检测肠杆菌科细菌的敏感性为100%，特异性为99.6%。图3是培养6个小时的肠杆菌科细菌碳青霉烯酶产酶株的表型检测试验状态实物照片。
235 株铜绿假单胞菌中，37 株产碳青霉烯酶菌株经rCDM检测，36株为阳性, 1 株产VIM-4的菌株为阴性，包括KPC-2(2.7%)，IMP-4(2.7%)， VIM-1(54.1%)，VIM-2(8.1%)，VIM-4(32.4%)， 其余158株碳青霉烯耐药菌株和40株碳青霉敏感菌株经rCDM检测均为阴性。rCDM 检测产酶的铜绿假单胞菌的敏感性为97.3%, 特异性为100%。图4是培养6个小时的铜绿假单胞菌碳青霉烯酶产酶株的表型检测试验状态实物照片。
本发明的检测方法同另一种目前被公认的CLSI推荐的表型检测方法mCIM的一致性达到99.8%。
Claims (5)
1.一种耐药表型检测方法，其特征在于：按照下述的步骤顺序进行：
第一步：制作耐药表型快速检测药敏平板：
在无菌消毒的药敏平皿内制作M-H琼脂，使M-H琼脂在药敏平皿内各处的厚度为3.0±0.1 mm，制成薄型琼脂平板tMHA，放4℃环境保存一天以上备用；
第二步：涂布菌液；
取出tMHA待温度稳定，根据不同的耐药表型将对应的细菌菌液浓度调整到2.0～3.0麦氏单位，制备好的菌液在15分钟内完成tMHA琼脂表面的涂布；
第三步：贴药敏纸片；
涂布完菌液的tMHA在第3～5分钟内贴上抗菌药物纸片，在涂布菌液的tMHA表面贴上符合CLSI标准的与耐药表型检测相应的抗菌药物纸片，抗菌药物纸片距离tMHA边缘不低于20mm，多片抗菌药物纸片相互之间的中心距离不低于24mm；
第四步：判断：
根据不同的耐药表型，将药敏平皿在35±1℃环境下经过4～6小时的培养，测量相应抗菌药物纸片的抑菌环，再与相应的耐药表型的判断标准进行比较，根据耐药表型判断标准来判断是否为相应的耐药表型，符合耐药表型判断标准的就判定为耐药表型阳性，不符合耐药表型判断标准的就判定为耐药表型阴性；
根据操作方法，所述的耐药表型判断标准如下：
如果用大肠埃希菌ATCC25922涂布tMHA平板，则沾取了测试菌的药敏纸片抑菌环与不沾取测试菌的药敏纸片抑菌环直径之差大于5mm为阳性，小于3mm为阴性；
如果直接用待测菌涂布tMHA平板，则加待检测酶的酶抑制剂药敏纸片和不加待检测酶的酶抑制剂药敏纸片的抑菌环直径之差大于5mm为阳性，小于3mm为阴性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在第一步中，药敏平板的制作方法为：取每38g M-H琼脂干粉加1000ml去离子水，加热使M-H琼脂干粉完全溶解，调节溶液pH值至7.3±0.1，然后在121℃高压环境进行15分钟灭菌；将液态的M-H琼脂倒入无菌药敏平皿上，水平放置使M-H琼脂各处厚度为3.0±0.1 mm，待凝固后制成tMHA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在第二步中，将对应的细菌菌液浓度调整到3.0麦氏单位。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在第二步中，将对应的细菌菌液浓度调整到2.0麦氏单位。
5.根据权利要求1、3或4所述的方法，其特征在于：在第二步中涂布的具体方法为，将无菌棉拭子浸入所述细菌菌液中，旋转数次，在液面上方的管壁按压去除棉拭子里多余的菌液，然后将棉拭子在整个tMHA表面来回涂布三次，每次旋转平板60度，以确保菌液均匀分布；最后在平板琼脂的边缘涂一圈。
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