CN110093256A - 一种自动溶氧周期性波动装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自动溶氧周期性波动装置，所述自动溶氧周期性波动装置包括一第一气体源，一第二气体源和一气体出口，并且，所述第一气体源与所述第二气体源分别通过管路与所述气体出口流体连接；其中，在所述第一气体源与所述气体出口之间的管路及所述第二气体源与所述气体出口之间的管路上分别设置一阀门，用于切换通气管路。本发明的自动溶氧周期性波动装置，可通过编辑断电计时器的条件对电动球阀的启闭进行控制，进而实现自动溶氧周期性波动。本发明可适用于各种微生物反应器培养过程中的溶氧周期性脉冲，提供自动溶氧周期性波动的环境，为微生物的活体动力学研究提供了良好基础。

Description

一种自动溶氧周期性波动装置
技术领域
本发明涉及生物培养、生物发酵等技术领域，尤其涉及一种自动溶氧周期性波动装置。
背景技术
在生物培养过程中，溶解氧是影响微生物生长的重要因素。目前，很少有研究报道发酵产量与发酵过程中不完全混合的影响，大部分报道的研究都只集中在溶解氧浓度上。Vardar和Lilly研究发现，在临界氧浓度（空气饱和度的30%左右）以下，青霉素的产量会急剧下降，同时还发现，当溶解氧浓度在这个临界水平上下波动时，青霉素的产量同样会下降（Vardar, F. and Lilly, M.D., Effect of cycling dissolved oxygenconcentrations on product formation in penicillin fermentations. EuropeanJournal of Applied Microbiology & Biotechnology, 1982.14(4): p. 203-211.）。Larsson和Enfors利用一个双室厌氧平推流的反应器发现，将P. chrysogenum长时间（5-10min）暴露在缺氧环境中会降低微生物的呼吸能力，而短时间（1-2min）暴露在这种缺氧环境中没有任何不可逆作用（Larsson, G. and Enfors, S.O., Studies of insufficientmixing in bioreactors: Effects of limiting oxygen concentrations and shortterm oxygen starvation on Penicillium chrysogenum. Bioprocess Engineering,1988.3(3): p. 123-127.）。然而，上述试验并未研究溶解氧波动对青霉素生产的影响。Diano等研究了在氧限制条件下黑曲霉连续发酵过程中副产物多元醇的生成情况，结果显示，在氧限制条件下，菌体合成多元醇所占碳源比重高达22%（Diano, A., et al., Polyolsynthesis in Aspergillus niger: influence of oxygen availability, carbon andnitrogen sources on the metabolism. Biotechnology and Bioengineering, 2010.94(5): p. 899-908.）。Pedersen等在探究氧和渗透压在深层发酵过程中对糖化酶产量的影响时，发现适当的氧限制和高渗透压可以提高糖化酶的产量（Lasse, P., et al.,Industrial glucoamylase fed-batch benefits from oxygen limitation and highosmolarity. Biotechnology and Bioengineering, 2011. 109(1): p. 116-124.）。
随着人们对不完全混合在发酵过程中影响的研究越来越多，溶氧在发酵过程中的作用逐渐被揭开。根据Hanison和Topiwala的研究，微生物对空气饱和度在10%到100%之间的氧浓度变化不敏感（Harrison, D.E.F. and Topiwala, H.H., Transient andoscillatory states of continuous culture. Advances in BiochemicalEngineering, 1974.3:p.167-219.）。Sweere通过在单反应器中循环通入氮气和空气研究了酵母细胞的溶氧周期性脉冲，发现溶氧波动对细胞的组成影响很小（Sweere, A.P., etal., Experimental simulation of oxygen profiles and their influence on baker's yeast production: I. One-fermentor system. Biotechnology andBioengineering, 2010.31(6): p.567-578.）。Oosterhuis使用双反应器的溶氧限制-脉冲装置发现将培养物暴露于氧浓度的波动中，Gluconobacter oxydans葡萄糖酸的产量下降，葡萄糖酸产量的减少与细胞暴露在限氧条件下的时间有关，然而，细胞生产葡萄糖酸的潜在能力没有受到影响（Oosterhuis, N.M. and Kossen, N.W., Dissolved oxygenconcentration profiles in a production-scale bioreactor. Biotechnology andBioengineering, 1984.26(5): p. 546.），由此可见，Gluconobacter oxydans对外界施加的环境波动不敏感。上述研究中Vardar 和 Lilly在Penicillium chrysogenum的溶氧波动实验中同样发现了青霉素产量的下降。此外，Moes等人在Bacillus subtilis中发现溶氧充足区域产生乙酸乙酯，而溶氧限制区域则产生副产物丁二醇（Moes, J., et al., Amicrobial culture with oxygen-sensitive product distribution as a potentialtool for characterizing bioreactor oxygen transport.Biotechnology andBioengineering, 2010.27(4): p. 482-489.），因此，可以通过排出的产物检测发酵罐中溶氧限制的区域。
目前国内尚未有关于自动溶氧周期性波动装置的报道，溶氧波动也仅仅局限于对一段时间内通气量人工的调节。溶解氧的大小与通气中的氧气含量和通气量有关，改变通气量的方法对微生物生长和溶解氧的分布存在影响，这使得模拟的溶氧周期性波动不能符合大规模反应器中溶解氧梯度的真实情况。本发明在溶氧周期性波动装置的设计中不改变通气量，而是从通气中的氧含量入手，在不改变通气量的基础上设计控制溶氧周期性波动的装置，能够模拟自动溶氧周期性波动的环境。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种自动溶氧周期性波动装置，可模拟出自动溶氧周期性波动环境，运用到微生物发酵中，为微生物的活体动力学研究提供了良好基础。
为了实现上述目的，本发明提供了一种自动溶氧周期性波动装置，所述自动溶氧周期性波动装置包括一第一气体源，一第二气体源和一气体出口，并且，所述第一气体源与所述第二气体源分别通过管路与所述气体出口流体连接；其中，在所述第一气体源与所述气体出口之间的管路及所述第二气体源与所述气体出口之间的管路上分别设置一阀门，用于切换通气管路。
进一步，所述自动溶氧周期性波动装置包括一第一管路、一第二管路和一第三管路；其中，所述第一气体源通过所述第一管路与所述第三管路连接，进而与所述气体出口流体连接，所述第二气体源通过所述第二管路与所述第三管路连接，进而与所述气体出口流体连接；所述第一管路上设置一第一阀门，并且所述第二管路上设置一第二阀门。
进一步，所述第一阀门及所述第二阀门为一电动球阀，且所述电动球阀通过球阀连接管路连接在所述第一管路和所述第二管路上。
进一步，所述电动球阀为断电式电动球阀。
进一步，所述第一阀门为一常开型电动球阀或一常闭型电动球阀，所述第二阀门为一常开型电动球阀或一常闭型电动球阀。
进一步，所述第一阀门与所述第二阀门的电动球阀类型不同。
进一步，所述第一阀门与所述第二阀门分别与一断电计时器导电连接，所述断电计时器控制所述第一阀门与所述第二阀门的启闭。
进一步，所述第三管路上设置一质量流量计，用于控制流量。
进一步，所述第一气体源为一惰性气体源；所述第二气体源为一空气气体源。
进一步，所述惰性气体为氮气。
进一步，所述第一管路、所述第二管路与所述第三管路的材料为热塑性聚氨酯，所述球阀连接管路的材料为氟橡胶。
进一步，所述电动球阀的全闭时间为3s，全开时间为12.5s。
本发明中所述断电式电动球阀的内芯为陶瓷球芯，缩径球阀为14.5mm，阀体材质为增强聚苯醚（PPO），接口为内螺纹外接4分外丝铝塑直通管（POM），电动球阀长度为14mm，高度为144mm，外丝直通管直径为20mm。
本发明的优点在于：
①本发明中采用断电计时器来控制两个断电式电动球阀的开闭，两个断电式电动球阀的启闭又能够控制通气管路的切换，进而实现正常通气和溶氧限制模式之间的转换，改变通入气体的氧气含量。其中，断电计时器的条件可以编辑，通过编辑器条件来控制本发明的通气管路的启闭，自动在正常通气和溶氧限制模式之间进行转换，提供自动溶氧周期性波动环境。本发明在气体出口的前方还设置了一质量流量计，可以控制气体流量，使气体流量更加稳定，减小由于流量的波动从而引入新的误差。
②本发明的装置开辟了自动溶氧周期性波动装置的搭建，同时实现了自动溶氧周期性波动，大大节省了微生物活体动力学研究中的人力和物力；本发明中切换步骤的时间非常短暂，可实现瞬间切换，降低切换时间对微生物胞内的代谢物变化的干扰，能够更为真实地模拟出微生物细胞胞内的情况。
③本发明可在3s内实现的正常通气和溶氧限制模式之间的切换，也可选择单一的模式；切换的时间和频率可根据实验需求进行任意调控，可根据实验需求选择不同模式的先后顺序；本发明的装置搭建和操作简便，还可灵活连接各种反应器。
④采用本发明装置可提供一种自动溶氧周期性波动环境，适用于各种微生物反应器培养过程中的溶氧周期性脉冲，为微生物的活体动力学研究提供了良好基础。利用本发明可弄清微生物细胞的胞内代谢反应在溶氧周期性波动的环境下是如何变化的，并通过获得大量周期性溶氧波动后的代谢物数据，进行代谢物和代谢流的分析，构建动力学模型，以期找到工业放大的瓶颈所在。
附图说明
图1为本发明实施例1中周期性溶氧限制-脉冲实验的装置示意图。
图2为本发明实施例1中冷模实验的溶氧波动变化图。
图3为本发明实施例1中周期性溶氧限制-脉冲实验的溶氧波动变化图。
图中的标号分别为：
1、第一气体源；
2、第二气体源；
3、断电计时器；
4、质量流量计；
5、反应器；
6、第一阀门；
7、第二阀门；
8、第一管路；
9、第二管路；
10、第三管路；
11、气体出口。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
在本实施例中，提供一种自动溶氧周期性波动装置，参见图1，所述自动溶氧周期性波动装置包括：一第一气体源1，一第二气体源2和一气体出口11。所述第一气体源1与所述第二气体源2分别通过管路与所述气体出口11流体连接。如图1所示，在所述第一气体源1与所述气体出口11之间的管路及所述第二气体源2与所述气体出口11之间的管路上分别设置一阀门，用于切换通气管路。
具体来说，如图1所示，所述自动溶氧周期性波动装置包括一第一管路8、一第二管路9和一第三管路10，利用一三通连接头将所述第一管路8、所述第二管路9与所述第三管路连接；其中，所述第一气体源1通过所述第一管路8与所述第三管路10连接，进而与所述气体出口11流体连接，所述第二气体源2通过所述第二管路9与所述第三管路10连接，进而与所述气体出口11流体连接。所述第一管路8上设置一第一阀门6，并且所述第二管路9上设置一第二阀门7，通过所述第一阀门6及所述第二阀门7可以分别控制所述第一管路8及所述第二管路9。在本实施例中，用于气体流通的所述第一管路8、所述第二管路9及所述第三管路10的材料为热塑性聚氨酯。
在本实施例中，所述第一气体源1为一氮气气体源；所述第二气体源2为一空气气体源。所述第一阀门6及所述第二阀门7为一电动球阀，更具体来说为断电式电动球阀。并且，所述第一阀门6与所述第二阀门7的电动球阀类型不同，这样可以通过控制阀门的启闭来控制通气管路，进而可以调节气体的氧含量。例如，所述第一阀门6为一常开型电动球阀，即通电闭、断电开，所述第二阀门7为一常闭型电动球阀，即通电开、断电闭。所述电动球阀与第一管路8或所述第二管路9通过球阀连接管路连接。本实施例中，用于将断电式电动球阀连接到第一管路8和第二管路9上的球阀连接管路的材料为氟橡胶。
在本实施例中，作为所述第一阀门6及所述第二阀门7的电动球阀可以是断电复位/二线/DC 9-24V，全闭时间为3s，全开时间为12.5s。
如图1所示，所述第一阀门6与所述第二阀门7分别与一断电计时器3导电连接，所述断电计时器3控制所述第一阀门6与所述第二阀门7的启闭，通过编辑断电计时器的条件控制电动球阀的启闭，改变流入的气体类型，从而实现自动调节通入气体的氧含量。
在本实施例中，所述断电计时器3可以是定时宝B14M[2200]。
此外，如图1所示，所述第三管路10上还设置一质量流量计4，用于控制流量，可设置通气量，这样可以更加稳定的控制流量，减小由于流量的波动从而引入新的误差。
在本实施例中，所述质量流量计4可以是七星华创气体质量流量计CS 200。
以下，详细描述在一具体应用实施例中，本发明所述自动溶氧周期性波动装置的运行。
为了模拟大规模生产发酵罐中溶氧波动的真实情况以及弄清黑曲霉胞内实际的动态响应，采用本发明所述的自动溶氧周期性波动装置进行周期性溶氧限制-脉冲实验，并记录实验中溶氧的波动变化。在实验中，利用本发明所述的自动溶氧周期性波动装置，模拟波动环境，记录实验中黑曲霉发酵过程的溶氧变化；以无菌情况下进行的周期性溶氧限制-脉冲实验（冷模实验）为空白对照组。
1）实验装置：采用本发明实施例的装置进行周期性溶氧限制-脉冲实验，气体从气体出口11流出后经一空气过滤器进入到反应器5中，模拟出溶氧波动环境。
其中，所述断电计时器3可设置运行的时长，断电和通电的时间间隔以及先后顺序，定时可设置最多八组，时间可精确到秒。额定电压220V，工作频率50Hz，最大电流10A，最大功率（阻性负载2200W，感性负载350W，容性负载200W）。
所述电动球阀的内芯为陶瓷球芯，缩径球阀为14.5mm，阀体材质为增强PPO，工作压力为0-1MPa，工作温度为0-60℃，接口为内螺纹外接4分外丝铝塑直通管（POM），电动球阀长度14mm，高度144mm，外丝直通管直径20mm。输入电压为直流12V，交流AC220V，电机功率2-3W，实际功率0.4-2.5W，全开时间为12.5秒，全闭时间为3秒。
所述质量流量计4用来控制通气量，可根据实验需要设置通气量，流量规格≤30SLM，工作压差范围0.1-0.35MPa，响应时间≤1s，漏率1×10-10Pa•m3/sec He，密封材料为氟橡胶，工作环境温度5-45℃，电源±8到±16VDC。
所述第一管路8（氮气管路）、所述第二管路9（空气管路）和所述第三管路10采用德国BJACRTAG透明热塑性聚氨酯PU管，工作压力10KGF/CM，工作温度-5-50℃，内外径8*12mm。
用于所述电动球阀与氮气管路、空气管路连接的球阀连接管路采用美国MasterFlex氟橡胶管，温度范围-20-260℃，内外径10*17mm。
2）实验方法：利用本发明的自动周期性溶氧波动装置，将连接在氮气管路上的电动球阀设为：通电时闭合，断电时开启；连接在空气管路上的电动球阀设置为：通电时开启，断电时闭合。断电计时器的参数设置为：通电5min，断电5min，10min为一个周期往复循环。由于达到恒化稳态时是在通空气，所以我们第一个周期设置为先断电通氮气5min，再通电通空气5min；取样周期同样也是通氮气为起始时刻，再次通氮气为结束时刻。
本实施例选择在单反应器中进行周期性溶氧限制-脉冲实验，并记录下实验数据，见图2和图3所示。
本实验的设计是在极端条件下研究大规模发酵罐中细胞经历氧气富集区域和氧气匮乏区域时对菌体的生理代谢特性造成的影响，波动周期定为10min，正常通气和溶氧限制模式各5min。目的是为了放大细胞在经历不同区域时所作出的胞内应激响应。大规模反应器中溶氧波动环境的模拟可以在单反应器中进行，也可以在双反应器中实现。在单反应器中模拟的最大优点是所有的细胞都处于同一生理状态，而在双反应器中更加符合大规模发酵中从一个区域切换到另一个区域的实际情况。但由于双反应器的操作工艺较繁琐且稳定性不如单反应器，所以本次实验选择在单反应器中进行周期性溶氧限制-脉冲，可以使得所有细胞的生理代谢特性一致，使测得的胞内代谢物的变化情况更加精准。
3）实验结果：参见图2、图3，观察整个发酵过程的宏观数据可以发现溶氧（DO）呈明显的周期性波动，从溶氧数据中可以看出，采用本发明的自动溶氧周期性波动装置，溶氧波动的稳定性和重复性非常好。例如，图2中，可以看到冷模实验中脉冲1 h内溶氧的周期性波动情况和一个周期内的溶氧变化，由于限制-脉冲周期是10min，所以1h内可以清晰的看到6次完整且平行的峰形；因为冷模实验中没有菌体，所以也就没有氧气的消耗，在通空气后溶氧飙升至最大值130%。图3中，开启溶氧限制-脉冲1h内溶氧的波动形状为“梳齿形”，这与无菌时的冷模实验中溶氧的波动形状相类似；而溶氧限制-脉冲1h内的溶氧由于菌体的消耗，则在通空气时溶氧仅为110%。在通氮气后，两者溶氧皆能跌零。
通过分析上述实验数据可知，本发明装置的设计能够很好地实现自动溶氧周期性波动，适用于各种微生物反应器培养过程中的溶氧周期性脉冲，为微生物的活体动力学研究提供了良好基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种自动溶氧周期性波动装置，其特征在于，所述自动溶氧周期性波动装置包括一第一气体源，一第二气体源和一气体出口，并且，所述第一气体源与所述第二气体源分别通过管路与所述气体出口流体连接；其中，在所述第一气体源与所述气体出口之间的管路及所述第二气体源与所述气体出口之间的管路上分别设置一阀门，用于切换通气管路。
2.根据权利要求1所述的自动溶氧周期性波动装置，其特征在于，所述自动溶氧周期性波动装置包括一第一管路、一第二管路和一第三管路；其中，所述第一气体源通过所述第一管路与所述第三管路连接，进而与所述气体出口流体连接，所述第二气体源通过所述第二管路与所述第三管路连接，进而与所述气体出口流体连接；所述第一管路上设置一第一阀门，并且所述第二管路上设置一第二阀门。
3.根据权利要求2所述的自动溶氧周期性波动装置，其特征在于，所述第一阀门及所述第二阀门为一电动球阀，且所述电动球阀通过球阀连接管路连接在所述第一管路和所述第二管路上；优选地，所述电动球阀为断电式电动球阀。
4.根据权利要求3所述的自动溶氧周期性波动装置，其特征在于，所述第一阀门为一常开型电动球阀或一常闭型电动球阀，所述第二阀门为一常开型电动球阀或一常闭型电动球阀；优选地，所述第一阀门与所述第二阀门的电动球阀类型不同。
5.根据权利要求2所述的自动溶氧周期性波动装置，其特征在于，所述第一阀门与所述第二阀门分别与一断电计时器导电连接，所述断电计时器控制所述第一阀门与所述第二阀门的启闭。
6.根据权利要求2所述的自动溶氧周期性波动装置，其特征在于，所述第三管路上设置一质量流量计，用于控制流量。
7.根据权利要求1所述的自动溶氧周期性波动装置，其特征在于，所述第一气体源为一惰性气体源；所述第二气体源为一空气气体源。
8.根据权利要求7所述的自动溶氧周期性波动装置，其特征在于，所述惰性气体为氮气。
9.根据权利要求2或3所述的自动溶氧周期性波动装置，其特征在于，所述第一管路、所述第二管路与所述第三管路的材料为热塑性聚氨酯，所述球阀连接管路的材料为氟橡胶。
10.根据权利要求3所述的自动溶氧周期性波动装置，其特征在于，所述电动球阀的全闭时间为3s，全开时间为12.5s。
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