CN110075315A - 一种抗体偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗体偶联物，其结构通式为Ab‑Lm‑Yn，其中Ab为抗人CD30抗体cAC10、其活性片段或其变体；所述Ab仅与所述L连接；Y为细胞毒剂美登木素生物碱DM1；n为2～5，且m≥n；所述L其左端与所述Ab的赖氨酸残基的氨基形成酰胺键，其右端与所述DM1巯基中的S形成硫醚键。还公开了一种抗体偶联物的制备方法、根据所述制备方法制得的抗体偶联物及抗体偶联物在制备治疗CD30阳性肿瘤的药物上的应用。本发明抗体偶联物其主要代谢物能够较好地在CD30阳性的肿瘤细胞内蓄积，靶向性较强，肿瘤杀伤效果高且安全性能好。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种抗体偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
分化抗原30(CD30)，又称为Ki-1，属于肿瘤坏死因子受体超家族，是I型跨膜糖蛋白，正常表达在激活的B和T淋巴细胞上。在多种肿瘤细胞膜上过表达，包括典型霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)，间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，原发性纵膈B细胞淋巴瘤(PMBCL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(Froese等，J.Immunol.139:2081(1987)；Carde等，Eur.J.Cancer 26:474(1990))。
其亦可表达于很多其它肿瘤细胞表面，尤其是淋巴起源的肿瘤。据认为，恶性细胞上CD30受体的过度表达对霍奇金淋巴瘤细胞的NF-kB激活引起的存活率和凋亡抗性起作用。同时也有显示CD30表达于部分非霍奇金淋巴瘤亚型上，包括伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特氏淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤和成人T细胞白血病等(Stein等，Blood 66:848(1985)；Miettinen,Arch.Pathol.Lab.Med.116:1197(1992)；Piris等，Histopathology17:211(1990)；Burns等，Am.J.Clin.Pathol.93:327(1990)；和Eckert等，Am.J.Dermatopathol.11:345(1989))。大约20-30％的年龄较大的霍奇金淋巴瘤患者在经过一线化疗药物治疗后会复发。由高剂量化疗药物治疗联合自体干细胞移植或异体干细胞移植组成的补救治疗能够治愈40-60％的患者，而其他化疗方法大多无效。
抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugate，ADC)是一种新型的治疗用生物技术药物，它将抗体和强效高毒性小分子化合物(细胞毒剂)通过生物活性连接子偶联而成，是一种定点靶向癌细胞的强效抗癌药物。既能避免单克隆抗体后期产生的耐药性导致的疗效不佳，又能克服小分子损伤正常组织引起的副作用等缺点。ADC药物由抗体、细胞毒剂和连接子这三部分组成。即使是对同一种抗体进行偶联，选择不同的连接子、连接不同的细胞毒剂、改变毒剂的抗体偶联比率(DAR)都会直接影响ADC药物的最终性质，如药物活性、在体内的半衰期、药代动力学以及旁观者效应(bystander effect)等。
CD30在正常细胞中占比相当小，所以其在肿瘤细胞中的过表达使其成为抗体介导的治疗的重要目标。2011年，由西雅图基因公司开发的抗CD30抗体cAC10与MMAE偶联的抗体偶联药物(brentuximab vedotin，即维布妥昔单抗)在临床上治疗霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤取得了较好的肿瘤治疗作用，验证了CD30可以作为肿瘤特异性药靶进行药物开发。Adcetris的结构为cAC10-(MC-VC-PABC)-MMAE，属于酶可降解偶联物，其连接子为可切割型，其中VC(Val-Cit二肽)是组织蛋白酶B特异性识别位点，ADC内吞进入细胞后，在溶酶体释放毒性小分子MMAE。然而，其一，Adcetris采用VC二肽可以被组织蛋白酶水解，在尚未到达靶点时就释放出MMAE，从而产生细胞毒性；其二，MMAE容易被人多耐药基因MDR1泵出细胞外(Robert Chen etal,Mol Cancer Ther.2015June；14(6):1376–1384)，因而产生对Adcetris的耐药。因此，如何解决Adcetris耐药和细胞毒性，是当今医药研发急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中治疗CD30阳性肿瘤药物的耐药和细胞毒性高的问题，提供一种低毒性、不易产生细胞耐药的抗人CD30抗体偶联物及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案之一为：一种抗体偶联物，其结构通式为Ab-Lm-Yn；
其中Ab为抗人CD30抗体cAC10、其活性片段或其变体；
所述Ab仅与所述L连接；
Y为细胞毒剂美登木素生物碱DM1；
n为2～5，且m≥n；所述Y仅与所述L连接；部分所述L其两端分别与所述Ab和所述Y连接，剩余部分的所述L仅与所述Ab连接；
当所述L其两端分别与所述Ab和所述Y连接时，所述L为其左端与所述Ab的赖氨酸残基的氨基形成酰胺键，其右端与所述DM1巯基中的S形成硫醚键；
当所述L仅与所述Ab连接时，所述L为其左端与所述Ab的赖氨酸侧链的氨基形成酰胺键。
所述抗体偶联物的m一般为2～10。优选地，所述m等于所述n，其结构通式为Ab-(L-Y)n，其结构如下所示：
更优选地，所述抗人CD30抗体cAC10的变体与所述cAC10的氨基酸序列的相似度不小于90％，且与赖氨酸相关的突变不大于80％。
进一步更优选地，n＝3～4；最优选地，n＝3.6。
为更清楚地了解本发明，首先定义一些术语。
天然或者天然序列的CD30可以分离自大自然，也可以用重组DNA技术、化学合成法，或以上及类似技术的联合制得。抗体在此取最广义的解释，其可透过位于该免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原辨认区特异性地与目标结合，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。具体包括完整的单克隆抗体，多克隆抗体，双特异抗体以及抗体片段，只要他们具有所需的生物活性。本发明的抗体可利用该领域广为周知的技术制备，例如杂交瘤方法、重组DNA技术、噬菌体展示技术、合成技术或该等技术的组合、或该领域己知的其它技术。
单克隆抗体或单抗指的是该抗体来自一群基本均一抗体，即构成该集群的各抗体完全相同，除了可能存在的少量天然突变或在抗体表达制备过程中产生的异构体。单克隆抗体具有针对单一抗原的高度特异性。本发明中，单克隆抗体还特别包含嵌合抗体及其片段，即抗体的重链和/或轻链的一部分来自于某种、某类或某亚类，其余部分则与另一种、类或亚类。
抗体活性片段包括抗体的一部分，最佳的是抗原结合区或可变区。如Fab，Fab的一部分，Fab2或者Fab的一部分的二聚体形式，甚至是Fv片段。
抗体的变体指氨基酸序列突变体，以及天然多肽的共价衍生物，条件是保留了与天然多肽相当的生物活性。氨基酸序列突变体与天然氨基酸序列的差异一般在于天然氨基酸序列中的一个活多个氨基酸被取代或在多肽序列中缺失和/或插入一个或多个氨基酸。缺失突变体包括天然多肽的片段和N端和/或C端截短突变体。本发明中，氨基酸序列突变体与天然序列相比至少具有90％以上的同源性。同源性指氨基酸序列排列比对后相同氨基酸残基的百分比。用于序列排列比对的方法和程序都是本领域所熟知的，如BLAST和Fasta。
关于术语“药物抗体偶联比率”(drug-antibody ratio，即DAR)的说明。L是和抗体上的缀合点具反应性的基团，在本发明中L为SMCC，每个抗体连接L的数目用m表示；Y是在连接L的抗体上进一步缀合的细胞毒剂，在本发明中Y为DM1，每个抗体最终缀合Y的DAR数目用n表示。m大于等于n，在一些实施方式中，与连接L的单个抗体分子缀合的细胞毒剂的数目即DAR为1、2、3、4，但由于连接反应的特殊性，连接有L的抗体上缀合的细胞毒剂的DAR实际上为介于1至4、1至3或1至2的平均值，即本发明的抗体偶联物实为抗体连接了不同数目的L-Y或L的混合物；在一些实施方式中，n为介于2至4或2至3的平均值；在其它实施方式中，n是1、2、3、4、5、6、7或8的平均值。
美登木素生物碱(Mertansine，DM1)是一种自天然存在的酯安丝菌素P3衍生的、含有硫醇的美登木素生物碱，属于常见的细胞毒剂。其中文化学名：N2'-去乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素，英文化学名：N2'-Deacetyl-N2'-(3-mercapto-1-oxopropyl)maytansine，化学文摘(CAS)号：139504-50-0。其分子式：C35H48ClN3O10S；分子量为738.29。其结构式如下：
为实现上述发明目的，本发明的另一技术方案为：一种抗人CD30抗体偶联物的制备方法，其为方法一或方法二；
所述的方法一包含以下步骤：
(i)将连接子SMCC与抗人CD30抗体cAC10连接获得经SMCC修饰的抗体；
(ii)将经SMCC修饰的抗体与DM1连接即得抗体偶联物；
所述的方法二包含以下步骤：
(i)将DM1与连接子SMCC连接获得连接产物；
(ii)将连接产物与抗人CD30抗体cAC10连接，即得抗体偶联物。
本发明公开的抗体偶联物的制备方法中，优选地，所述步骤(i)的后处理为：纯化所述经SMCC修饰的抗体。
本发明公开的抗体偶联物的制备方法中，优选地，所述步骤(ii)的后处理为：纯化所述的抗体偶联物。
本发明公开的抗体偶联物的制备方法中，优选地，所述的纯化为凝胶过滤纯化。
本发明公开的抗体偶联物的制备方法中，更优选地，所述的凝胶过滤纯化在所述方法一的步骤(i)或所述方法二的步骤(i)中为使用Sephadex G25纯化。
本发明公开的抗体偶联物的制备方法中，更优选地，所述的凝胶过滤纯化在所述方法一的步骤(ii)或所述方法二的步骤(ii)中为使用Superdex 200纯化。
本发明公开的抗体偶联物的制备方法中，所述抗体溶解或纯化过程使用的缓冲液含50mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾、50mM的NaCl和2mM的EDTA，pH6.5。
本发明公开的抗体偶联物的制备方法中，所述的SMCC的溶剂为DMSO或DMA。
本发明公开的抗体偶联物的制备方法中，所述方法一的步骤(i)中连接使用的所述抗体和SMCC的质量摩尔比为150～250mg:16～34μmol；和/或，所述方法一的步骤(ii)中连接使用的所述经SMCC修饰的抗体和DM1的浓度比为150～250mg:4.8～6.8μmol；优选地，所述方法一的步骤(i)中抗体和SMCC的质量摩尔比为200mg:30μmol；和/或，所述方法一的步骤(ii)中连接使用的所述经SMCC修饰的抗体和DM1的浓度比为186mg:6.8μmol；
本发明公开的抗体偶联物的制备方法中，所述连接在20～30℃中进行；和/或，所述方法一中，步骤(i)的连接时间为15分钟以上，步骤(ii)的连接时间为1～16小时；优选地，所述方法一中，步骤(i)的连接时间为4小时，步骤(ii)的连接时间为16小时。
纯化可以使用本领域现有技术中的常规纯化手段，较佳地，本发明的一些实施例中采用了凝胶过滤纯化方法。凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。理论上在本发明的一些实施例中，优选地，使用了Sephadex G25柱；在本发明的另一些实施例中，优选地，使用了Superdex 200层析柱；凝胶过滤中使用的缓冲液含50mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，50mM的NaCl，2mM的EDTA，pH6.5或其他本领域常规的缓冲液。
为实现上述发明目的，本发明的另一技术方案为：上述的制备方法获得的抗体偶联物。
为实现上述发明目的，本发明的另一技术方案为：一种上述的抗体偶联物在制备治疗CD30阳性肿瘤的药物上的应用。
术语“治疗”或它的同等表达当用于例如癌症时，指用来减少或消除患者体内癌细胞数目或减轻癌症的症状的程序或过程。癌症或另外的增生性障碍的“治疗”不一定指癌症细胞或其它障碍会实际上被消除，细胞或障碍的数目会实际上被减少或者癌症或其它障碍的症状会实际上被减轻。通常，即使只具有低的成功可能性也会进行治疗癌症的方法，但是考虑到患者的病史和估计的生存预期，其仍然被认为诱导总体有益的作用过程。
优选地，所述CD30阳性肿瘤为淋巴瘤。
更优选地，所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性组织细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤。
最优选地，所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：抗体偶联物cAC10-SMCC-DM1(以下简称FsdADC)对多种CD30阳性肿瘤细胞均显示出较高的杀伤活性，包括Karpas299、L540、HH、L428等，对于CD30阳性HL、ALCL、CTCL等均具有治疗价值。FsdADC在体外对HL细胞L428细胞的杀伤作用较强，对于对Adcetris(brentuximab vedotin)不敏感的肿瘤有望获得更优的临床效果。并且与Adcetris相比，FsdADC的非临床安全性显著提高，具有较大的安全窗，有望成为更为安全的治疗CD30阳性肿瘤的药物。
附图说明
图1为实施例1制得的cAC10抗体对Karpas299细胞的杀伤活性；
图2为实施例3制得的FsdADC对Karpas299细胞的杀伤活性；
图3为实施例4制得的FsdADC对Karpas299细胞的杀伤活性；
图4为实施例5制得的FsdADC对Karpas299细胞的杀伤活性；
图5为对比例1的Adcetris对Karpas299细胞的杀伤活性；
图6为实施例3制得的FsdADC在动物实验中的药时曲线。
图7为ADC对L428细胞的杀伤活性；其中图7A中ADC为实施例3制得的FsdADC，图7B中ADC为对比例1的Adcetris；
图8为ADC对HH细胞的杀伤活性；其中图8A中ADC为实施例3制得的FsdADC，图8B中ADC为对比例1的Adcetris；
图9为ADC对L540细胞的杀伤活性；其中图9A中ADC为实施例3制得的FsdADC，图9B中ADC为对比例1的Adcetris；
图10为ADC对SU-DHL-1细胞的杀伤活性；其中图10A中ADC为实施例3制得的FsdADC，图10B中ADC为对比例1的Adcetris；
图11为实施例3制得的FsdADC在Ramos和L428细胞中的释放研究；
图12为实施例3制得的抗体偶联物的不同偶联度分布质谱图；
图13为实施例4制得的抗体偶联物的不同偶联度分布质谱图；
图14为实施例5制得的抗体偶联物的不同偶联度分布质谱图；
图15为实施例6制得的抗体偶联物的不同偶联度分布质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1抗人CD30抗体cAC10的构建和表达
将全基因合成编码cAC10单抗重链和轻链的DNA片段(请参见专利US7090843,B1RECOMBINANT ANTI-CD30ANTIBODIES AND USES THEREOF,Seattle Genetics,Inc.,2006，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:9；和International Nonproprietary Names forPharmaceutical Substances(INN).WHO Drug Information Vol.24,No.2,2010)，分别克隆至Lonza公司的pEE12.4真核表达载体上，酶切和连接的操作按商业提供的试剂盒(DNALigation kit Ver2.0，TAKARA)说明书进行。
将构建好的重链和轻链表达载体分别转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNAPurification Kit)按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述含重链和轻链编码序列的质粒DNA以一定比例共转染入CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞，购自ATCC)，操作方法按照生产商说明书进行。
转染后24-48小时将DMEM/F12(1:1)细胞培养基(Invitrogen)更换为含筛选药物的GMEM筛选培养基(Sigma)，每3-4天更换筛选培养基一次直至细胞克隆形成。待细胞克隆直径达1-2mm时用克隆环从平板上挑取单克隆转接入含1ml筛选培养基的24孔板中。单细胞克隆在24孔板中长至50-70％满层时，取各克隆的培养上清进行ELISA检测，选取表达量高的细胞克隆进行药物加压扩增筛选。待筛选药物的浓度上升至最高时检测各克隆单细胞的表达量，选取表达量高且细胞生长状态良好的细胞进行扩增培养。收集重组细胞培养上清，用protein A亲合层析的方法纯化后用于功能评价。
将重组human CD30抗原(包被抗原，R&D Systems)用包被液(pH9.6CBS)稀释到一定浓度(0.5ug/ml)后包被于96孔板上，100μl/孔，于2～8℃放置过夜。弃去孔中液体，用PBST洗3次，甩干后加入400μl/孔的封闭液(1％BSA PBST)，室温2hr，再用PBST洗3次，甩干。用稀释液稀释标准品至一定浓度，表达上清根据情况适当稀释，以100μl/孔复孔加样至96孔板中，在37℃孵育1hr，弃液，洗板3次，甩干。用稀释液以1:20000稀释Goat anti-humanIgG(Fc)-HRP(酶联抗体，PIERCE公司)，以100μl/孔加至96孔板中，37℃下反应1hr，弃液，洗板3-6次，甩干。配制底物混合液，以100μl/孔加入到96孔板中，37℃孵育20min。加入终止液100μl/孔，终止反应。以波长655nm为参比波长，在波长450nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品的含量，选取表达量高的克隆进行扩增培养。收集重组细胞培养上清，用proteinA亲合层析的方法纯化后用于后续的连接实验。
实施例2 DAR检测方法
DAR检测是以Ab和DM1的紫外吸收测定和计算偶联度的，通过测定252nm和280nm处的吸光度来测定每个抗体分子平均连接的DM1个数即得。紫外/可见分光光度法(UV/Vis)是一种简单方便的方法，可用于测定蛋白浓度，以及抗体偶联药物(ADC)中抗体所偶联药物的平均数。通过使用ADC吸光度测量值，以及相应抗体和药物的消光系数，可确定DAR。
当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试样品配成溶液，测定其吸光度，即可用下列公式计算出该物质的含量：A＝E×c×l，其中A为吸光度，E为吸收系数，c为蛋白质含量，l为液层厚度(cm)。此公式也适用于多组分体系，如这些组分有不同吸收光谱且组分之间无相互作用，这种情况下，样品溶液的这些组分的光吸收可加成。此时的吸光度Aλ＝(E1λ×c1+E2λ×c2+……+Enλ×cn)×l，n为不同吸收组分的数量，Enλ为第n种组分的消光系数；cn为第n种组分的浓度。
已知FsdADC样品在紫外光区内有发色基团，cAC10单抗(下式中标记为mab)在280nm±3nm处有明显最大吸收值，药物(DM1，下式中标记为drug)在252nm±3nm处有最大吸收值，且药物存在不影响抗体的光吸收特性。故适用上述公式可得：
为降低系统误差，所测得的A280和A252的值都减去参比波长A320的值后，代入上述公式，再结合上面两个方程式可得到抗体和药物的浓度：
则平均药物抗体偶联比率(DAR)计算公式如下：
实施例3抗体偶联物的制备
本发明通过控制偶联反应的投料比例、pH、温度、搅拌等保障毒物抗体平均偶联比率(DAR)的稳定。
A.连接子SMCC修饰抗体：
配置缓冲液：50mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，50mM的NaCl，2mM的EDTA，pH6.5。将抗体用缓冲液经10倍体积超滤换液，抗体最终浓度为10mg/mL，加入氩气至充满。用1.5ml的20mM浓度的SMCC(溶于DMSO或DMA)加入到20ml的cAC10单抗(Brentuximab，即布妥昔单抗)溶液中，室温反应4小时。用Sephadex G25凝胶柱过滤反应混合物，该柱先用缓冲液以5倍柱体积平衡。在OD280下收集抗体特征峰即得经SMCC修饰的抗体。
B.经修饰的抗体与美登木素(DM1)的偶联：
经SMCC修饰后的抗体用缓冲液稀释到3mg/ml的最终浓度，共62ml。然后在抗体稀释液中加入1.7ml的DMA溶解的DM1溶液(浓度为4.0mM)。在氩气保护下于室温(20-30℃)反应16小时。将反应液经Superdex 200层析，在OD280下收集抗体特征峰即得目标产物。
所获得的FsdADC抗体偶联物的结构式为(其中Ab为抗体)：
根据实施例2中的检测方法获得本实施例抗体偶联物的DAR为3.6。其不同偶联度分布经质谱检测如附图12所示，不同偶联度分子已标记DAR 0～8。
实施例4抗体偶联物的制备
A.连接子SMCC修饰抗体：
采用与实施例3相同的缓冲液。
将抗体用缓冲液经10倍体积超滤后换液，抗体最终浓度为10mg/mL，加入氩气至充满。用1.2ml的20mM浓度的SMCC(溶于DMSO或DMA)加入到20ml的cAC10单抗溶液中，室温反应4小时。用Sephadex G25凝胶柱过滤反应混合物，该柱先用缓冲液以5倍柱体积平衡。
B.经修饰的抗体与美登木素(DM1)的偶联：
经SMCC修饰后的抗体用缓冲液稀释到3mg/ml最终浓度，共61ml。然后在抗体稀释液中加入1.5ml的DMA溶解的DM1溶液(浓度为4mM)。在氩气保护下于室温(20-30℃)反应16小时。将反应液经Superdex 200层析，收集主峰。
采用实施例2中的方法测定出本实施例抗体偶联物的DAR为3.2。其不同偶联度分布经质谱检测如附图13所示，不同偶联度分子已标记DAR 0～8(去糖后DAR0即裸抗，质谱检测分子量约145210d，每增加一个偶联度分子量理论上增加约957.7d)。
实施例5抗体偶联物的制备
A.连接子SMCC修饰抗体：
采用与实施例3相同的缓冲液。
将抗体用缓冲液经10倍体积超滤后换液，得到的抗体浓度为10mg/mL，充满氩气保护。用0.8ml的20mM浓度的SMCC(溶于DMSO或DMA)加入到20ml的cAC10单抗溶液中，室温反应4小时。用Sephadex G25凝胶柱过滤反应混合物，该柱先用缓冲液以5倍柱体积平衡。
B.经修饰的抗体与美登木素(DM1)的偶联：
经SMCC修饰后的抗体用缓冲液稀释到3mg/ml的浓度，共62ml。然后在抗体稀释液中加入1.2ml的DMA溶解的DM1溶液(浓度为4mM)。在氩气保护下于室温(20-30℃)反应16小时。将反应液经Superdex 200层析，收集主峰。
采用实施例2中的方法测定出毒物抗体偶联比率(DAR)为2.2。其不同偶联度分布经质谱如附图14所示，不同偶联度分子已标记DAR 0～8。
实施例6抗体偶联物的制备
A.连接子SMCC修饰抗体：
采用与实施例3相同的缓冲液。
将抗体用缓冲液经10倍体积超滤换液，抗体最终浓度为10mg/mL，加入氩气充满保护。用1.7ml的20mM浓度的SMCC(溶于DMSO或DMA)加入到20ml的布妥昔单抗溶液中，室温反应4小时。用Sephadex G25凝胶柱过滤反应混合物，该柱先用缓冲液以5倍柱体积平衡。
B.经修饰的抗体与美登木素(DM1)的偶联：
经SMCC修饰后的抗体用缓冲液稀释到3mg/ml最终浓度，共62ml。然后在抗体稀释液中加入1.4ml的DMA溶解的DM1溶液(浓度为4mM)。在氩气保护下于室温(20-30℃)反应16小时。将反应液经Superdex 200层析，收集主峰。
采用实施例2中的方法测定出毒物抗体偶联比率(DAR)为4.0。不同偶联度分布经质谱检测如附图15所示，不同偶联度分子已标记DAR 0～8。
效果实施例1抗体偶联物测活
不同的抗体偶联物对Karpas299细胞的杀伤活性对比：
Karpas299细胞按5×104cells/ml种板，培养18-24小时后分别加入实施例1制得的cAC10单抗、实施例3、4、5中制得的抗体偶联物、以及对比例1市售Adcetris的样品。加样后培养96小时，AlamarBlue荧光染料染色，培养6小时，530nm(激发)/590nm(发射)波长读数，其读数高低对应的是细胞的存活率大小。利用计算机四参数方程软件进行拟合，计算各个样品的抑制半效浓度IC50值(半最大效应浓度，是指能引起50％最大效应的浓度)。
结果如图1～6(分别对应实施例1、3、4、5、6和Adcetris)及图7～10所示，FsdADC的浓度增加，肿瘤细胞存活率显著降低，各抗体偶联物均表现出了较强的细胞杀伤作用，而实施例1中的cAC10单抗则基本无细胞长抑制杀伤作用。对比例中Adcetris的杀伤活性见图6，其细胞毒活性与实施3、4和6中制得的FsdADC相当。各样品的IC50值参见表1。从中可较为直观的看出，FsdADC是一种非常有潜力的抗CD30抗体交联药物。
表1抗体偶联物的生物活性比较
进一步测定DAR＝3.6的FsdADC(实施例3)以及对比例1的Adcetris对不同CD30阳性肿瘤细胞的体外杀伤活性，以IC50值(半抑制浓度，指示某一药物在抑制某些生物程序的半量)表征，结果见表2。
表2对不同的CD30阳性肿瘤细胞体外杀伤活性对比
其中，Adcetris对霍奇金淋巴瘤细胞L428细胞表现出了明显的耐药，IC50值高达54314ng/ml，这可能与维布妥昔单抗Adcetris临床上对部分患者不敏感相关。与之相比，实施例3制得的ADC对L428细胞的杀伤活性显著。
因此，根据本发明实施的FsdADC有望对更多种类的CD30阳性肿瘤体现出治疗价值，可作为广谱抗肿瘤药物使用。
效果实施例2抗体偶联物毒性测试
本试验目的在于：1)考察不同剂量受试物的毒性反应，探索最高非严重毒性剂量(HNSTD)、最大耐受剂量(MTD)或最小致死剂量(MLD)；2)单次给予FsdADC和市售药物Adcetris，比较二者的毒性。
A.重复给药试验设计：设实施例3制得的FsdADC的10mg/kg和20mg/kg组，每组食蟹猴4只，雌雄各半，每21天静脉输注1次为1周期，连续给药4周期。检测指标包括临床观察、体重、摄食情况、临床病理(血液学、血清生化和血凝)和解剖。
FsdADC重复静脉给予食蟹猴4周期，最高非严重毒性反应剂量(HNSTD)为10mg/kg，最小致死量(MLD)为20mg/kg。本试验观察到的主要毒性反应为体重降低，皮肤红斑/破溃，血液学改变(NEUT降低和MONO升高，HGB和PLT降低)，肝功能改变(ALT、AST、ALP和CK升高)，解剖发现毒性靶器官为肝脏和胸腺。
B.单次给药试验：根据重复给药试验结果，进行单次给药试验，其目的是为了比较FsdADC与Adcetris的毒性。为了在充分暴露的情况下进行毒性比较，考察的剂量为两者的MTD剂量或MLD剂量。设FsdADC 30mg/kg和Adcetris 6mg/kg，每组食蟹猴4只，雌雄各半，单次静脉给药。检测指标包括临床观察、体重、摄食情况、临床病理(血液学、血清生化和血凝)和解剖。
本试验条件下，食蟹猴单次给予FsdADC 30mg/kg和Adcetris 6mg/kg，动物对FsdADC 30mg/kg组的耐受性高于Adcetris 6mg/kg组，30mg/kg为FsdADC的可耐受剂量，6mg/kg为Adcetris的半致死剂量，死亡率2/4。两者均有可逆的皮肤，血液学指标和肝功能指标改变，但FsdADC 30mg/kg组肝功能改变更为明显(丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶和肌酸激酶)，而Adcetris 6mg/kg组血液学改变更为明显(白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)。停药恢复4周以上病变可恢复。
急毒探索性试验的结果表明，FsdADC体内的安全性显著优于Adcetris，其MTD达到30mg/kg。而Adcetris在6mg/kg剂量下对实验动物显示出显著的毒副作用，部分动物死亡，这一结果与Adcetris提交FDA的临床前申报资料一致。在长毒试验中，FsdADC的非限制毒性剂量(NHSTD)表现为10mg/kg。而FDA公开数据显示的Adcetris的猴长毒NHSTD为3mg/kg。
上述动物实验显示出FsdADC具备良好的安全性。因此，根据本发明实施的FsdADC有望成为靶向CD30治疗HL、ALCL、CTCL的更为安全的选择。
效果实施例3活性药物释放研究
将实施例3中的抗体偶联物FsdADC被内吞进入CD30靶标细胞后，胞内的蛋白酶作用使抗体裂解，释放出小分子物质产生细胞毒活性。通过质谱分析手段对FsdADC在L428细胞株中的小分子药物的释放与蓄积进行研究，同时以CD30表达阴性的Ramos细胞(Burkittlymphoma B cell)为对照进行分析，如附图11所示。结果表明，FsdADC药物作用于L428细胞时，在细胞内主要蓄积及释放Lys-MCC-DM1小分子，而在CD30阴性的Ramos细胞中没有发现小分子蓄积。该结果说明FsdADC药物对于CD30阳性细胞有很好的靶向性，且其细胞毒性也仅针对CD30阳性细胞，说明其具有很好的安全性。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种抗体偶联物，其特征在于，其结构通式为Ab-Lm-Yn；
其中Ab为抗人CD30抗体cAC10、其活性片段或其变体；
所述Ab仅与所述L连接；
Y为细胞毒剂美登木素生物碱DM1；
n为2～5，且m≥n；所述Y仅与所述L连接；部分所述L其两端分别与所述Ab和所述Y连接，剩余部分的所述L仅与所述Ab连接；
当所述L其两端分别与所述Ab和所述Y连接时，所述L为其左端与所述Ab的赖氨酸残基的氨基形成酰胺键，其右端与所述DM1巯基中的S形成硫醚键；
当所述L仅与所述Ab连接时，所述L为其左端与所述Ab的赖氨酸侧链的氨基形成酰胺键。
2.如权利要求1所述的抗体偶联物，其特征在于，所述m等于所述n，其结构通式为Ab-(L-Y)n，其结构如下所示：
3.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，
所述抗人CD30抗体cAC10的变体与所述cAC10的氨基酸序列的相似度不小于90％，且与赖氨酸相关的突变不大于80％。
4.如权利要求1所述的抗体偶联物，其特征在于，n＝3～4；优选地，n＝3.6。
5.一种抗体偶联物的制备方法，其特征在于，其为方法一或方法二；
所述的方法一包含以下步骤：
(i)将连接子SMCC与抗人CD30抗体cAC10连接获得经SMCC修饰的抗体；
(ii)将经SMCC修饰的抗体与DM1连接即得抗体偶联物；
所述的方法二包含以下步骤：
(i)将DM1与连接子SMCC连接获得连接产物；
(ii)将连接产物与抗人CD30抗体cAC10连接，即得抗体偶联物。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(i)的后处理为：纯化所述经SMCC修饰的抗体；和/或，所述步骤(ii)的后处理为：纯化所述的抗体偶联物；优选地，所述的纯化为凝胶过滤纯化；更优选地，所述的凝胶过滤纯化在所述方法一的步骤(i)或所述方法二的步骤(i)中为使用Sephadex G25纯化；在所述方法一的步骤(ii)或所述方法二的步骤(ii)中为使用Superdex 200纯化；
和/或，所述抗体溶解或纯化过程使用的缓冲液含50mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾、50mM的NaCl和2mM的EDTA，pH6.5；
和/或，所述的SMCC的溶剂为DMSO或DMA。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法一的步骤(i)中连接使用的所述抗体和SMCC的质量摩尔比为150～250mg:16～34μmol；和/或，所述方法一的步骤(ii)中连接使用的所述经SMCC修饰的抗体和DM1的浓度比为150～250mg:4.8～6.8μmol；优选地，所述方法一的步骤(i)中抗体和SMCC的质量摩尔比为200mg:30μmol；和/或，所述方法一的步骤(ii)中连接使用的所述经SMCC修饰的抗体和DM1的浓度比为186mg:6.8μmol；
和/或，所述连接在20～30℃中进行；和/或，所述方法一中，步骤(i)的连接时间为15分钟以上，步骤(ii)的连接时间为1～16小时；优选地，所述方法一中，步骤(i)的连接时间为4小时，步骤(ii)的连接时间为16小时。
8.一种抗体偶联物，其按照权利要求5～7任一项所述的制备方法制得。
9.如权利要求1～4和8中任一项所述的抗体偶联物在制备治疗CD30阳性肿瘤的药物上的应用。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述CD30阳性肿瘤为淋巴瘤；优选地，所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性组织细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤；更优选地，所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤。
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