CN110075303A - Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法 - Google Patents

Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Na+‑H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，包括如下步骤：准备药物与试剂；细胞培养及实验分组；MTT法检测乙基异丙基氨氯吡咪（EIPA）和顺铂(DDP)对细胞A2780/Taxol的IC50；Hoechst 33258染色检测细胞调亡；Quantative Real‑time PCR法检测A2780/Taxol细胞中目的基因的含量；Western blot法检测PI3K、Akt蛋白及MRP‑1的表达量；细胞内Rh123的积累；统计学分析。本发明在卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol中，EIPA诱导的细胞酸化抑制了PIK3/Akt信号通路的作用，进而降低MRP‑1的表达及其向外转运药物的作用，能够增加抗肿瘤药物在卵巢癌细胞内的积累，提高化疗药物的疗效。

Description

Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，特别涉及Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法。
背景技术
卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一,死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤的首位，严重威胁女性身体健康和生命。卵巢癌发病隐匿，缺乏早起诊断标志，多数患者被确诊时已经属于晚期。目前，临床对于卵巢癌的首选治疗方法是肿瘤减灭术与以铂类药物为主的联合治疗方法。但是化疗使肿瘤细胞产生的耐药性，导致患者5年生存率徘徊在40%，严重影响了治疗效果。卵巢癌的化疗耐药常表现为多药耐药(multidnug resistance, MDR),其耐药机制主要有:药代动力学、药物作用靶点、DNA损伤修复系统、细胞调亡调控、肿瘤微环境、细胞外信号转导通路、微小RNA、肿瘤干细胞及上皮间质转化等。无论何种机理存在，细胞内pH值增高是耐药细胞株所具有的共同改变，这就为肿瘤耐药的逆转研究提供了一个新的方向。目前，化疗仍然是临床中对肿瘤的治疗的主要对策之一，但化疗产生的肿瘤多耐药性却是降低疗效的一个重大的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，本发明在卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol中，EIPA 诱导的细胞酸化抑制了PIK3/ Akt信号通路的作用，进而降低MRP-1的表达及其向外转运药物的作用，能够增加抗肿瘤药物在卵巢癌细胞内的积累，提高化疗药物的疗效，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，包括如下步骤：
S1：准备药物与试剂
材料为：乙基异丙基氨氯吡咪、顺铂、紫杉醇、卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol、反转录酶试剂盒、荧光染料SYBR Green real-timePCR反应液、Rh123、Trizol 、Q-PCR引物、兔抗人β-actin、MDR-1抗体、兔抗人PI3K、Akt-1抗体、优质胎牛血清、 Annexin-V細胞凋亡试剂盒、RMP11640培养基；
S2：细胞培养及实验分组
卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol培养于含800ng/mlTaxol、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37C、5%CO2培养箱中孵育，实验分4组：空白对照组、顺铂组、乙基异丙基氨氯吡咪组、乙基异丙基氨氯吡咪联合顺铂组；
S3：MTT法检测乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC50
取对数生长期的细胞A2780/Taxol，0.25%的胰蛋白酶消化，离心，RPMI1640培养基调整细胞密度为5x105个/m1，接种至96孔细胞培养板中，每孔加100μ1细胞悬液，每个组设6个复孔，培养板放入CO2培养箱中孵育，细胞贴壁后加入乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂 ，24小时和48小时分别取出培养板，每孔加入MTT溶液20μl，放入37摄氏度培养中4小时，吸去孔中液体，每孔加入150μl的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490nm波长检测OD值，计算乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC50；
S4：Hoechst 33258染色检测细胞调亡
将灭菌的盖玻片置于6孔板中，接种A2780/Taxol细胞悬液，5x10个/ 孔，37℃培养箱培养24 h，实验组分别加入IC50浓度的乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂，继续培养24 h、36h、48h，除去培养液，用PBS清洗细胞3次，每孔加入1ml的Hoechst 33258染色液，室温放置3-5分钟，吸除Hoechst 33258染色液，用PBS洗涤2-3次，每次3-5分钟，封片后荧光显微镜下观察拍照；
S5：Quantative Real-time PCR法检测A2780/Taxol细胞中目的基因的含量
Trizol法提取各组总RNA，酶标仪检测OD260/0D280在1.8-2.0之间的，表明RNA纯度好，按逆转录试剂盒要求合成cDNA，将合成的cDNA稀释后，冰上配置20μl的PCR反应体系，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为95C30s预变性，然后95C5s，60C35s，共35个循环，实验重复3次，以B-actin为内参基因，用2-△△ct法计算各基因mRNA的相对表达量；
S6：Western blot法检测PI3K、Akt蛋白及MRP-1的表达量
参照SDS-聚丙烯酰胺快速凝胶试剂盒说明制备5%的浓缩胶及10%的分离胶，调整各组蛋白样品上样量20μg，按照浓缩胶60V，分离胶100V的电压将蛋白质进行垂直凝胶电泳后，半干法转移至NC膜，洗膜后，快速封闭液封闭15 分钟，分别加入稀释的PI3K、Akt及MRP-1的兔抗人抗体，4C孵育过夜，洗涤3次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育1.5小时，再次洗涤3次，每次3分钟，超敏化学发光试剂盒检测信号，内参为β-actin，以目的蛋白条带的灰度值/内参条带的灰度值表示目的蛋白的相对表达量；
S7：细胞内Rh123的积累
取对数生长期的A2780/Taxol细胞，实验分组同上，继续培养24h小时，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤离心后，在含有5μM Rh123的RMPI1640培养基中37C孵育60分钟，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，流式细胞仪激发波长488nm、发射波长530nm检测细胞内细胞内平均荧光强度，以此观察细胞内Rh123的的含量；
S8：统计学分析
采用SPSS16.0统计软件包，对数据进行检验，所有数据均采用mean+SD方式表示，用单因素方差分析检验总体均数差异性，有显著性差异者再进行两两比较，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异极显著性。
进一步地，S2的10%胎牛血清的RPMI1640培养基含100U/m1的青霉素和链霉素。
进一步地，S3的乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂均设置6.25μM、12.5μM、 25μM、50pM、100μM 5个浓度。
进一步地，S3的抑制率= (OD实验组-OD对照组) / OD对照组X100%。
进一步地，S3的MTT溶液浓度为5mg/ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，使用Na+-H+交换器抑制剂，乙基异丙基氨氯吡咪联合顺铂处理卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol,MTT实验、Hochest33258染色分别检测EIPA及顺铂对A2780/Taxol的IC50和调亡形态学变化; Quantative Real-time PCR、Western blot法分别检测磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路中PI3K、Akt-1蛋白及多耐药相关蛋白MRP-1的表达量；流式细胞术检测细胞内Rh123的含量，在卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol中，EIPA 诱导的细胞酸化抑制了PIK3/ Akt信号通路的作用，进而降低MRP-1的表达及其向外转运药物的作用，能够增加抗肿瘤药物在卵巢癌细胞内的积累，提高化疗药物的疗效。
附图说明
图1为本发明的EIPA与DDP对卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol生长抑制作用图；
图2为本发明的细胞凋亡形态学检测图；
图3为本发明的目的基因表达量**与DDP组对比图；
图4为本发明的目的蛋白Western blot结果图；
图5为本发明的目的蛋白相对表达量**与DDP组对比图；
图6为本发明的细胞种Rh123的含量柱状图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，包括如下步骤：
步骤1：准备药物与试剂
材料为：乙基异丙基氨氯吡咪(EIPA, bio-techne)、顺铂(DDP)、紫杉醇(Taxol)、卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol、反转录酶试剂盒、荧光染料SYBR Green real-timePCR反应液、Rh123、Trizol 、Q-PCR引物、兔抗人β-actin、MDR-1抗体、兔抗人PI3K、Akt-1抗体、优质胎牛血清、 Annexin-V細胞凋亡试剂盒、RMP11640培养基；
步骤2：细胞培养及实验分组
卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol培养于含800ng/mlTaxol、10%胎牛血清的RPMI1640培养基(含100U/m1的青霉素和链霉素)中，置于37C、5%CO2培养箱中孵育，实验分4组：空白对照组、顺铂组、乙基异丙基氨氯吡咪组、乙基异丙基氨氯吡咪联合顺铂组；
步骤3：MTT法检测乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC50
取对数生长期的细胞A2780/Taxol，0.25%的胰蛋白酶消化，离心，RPMI1640培养基调整细胞密度为5x105个/m1，接种至96孔细胞培养板中，每孔加100μ1细胞悬液，每个组设6个复孔，培养板放入CO2培养箱中孵育，细胞贴壁后加入EIPA (设6.25μM、12.5μM、 25μM、50pM、100μM 5个浓度)和DDP (浓度设置同EIPA)。24小时和48小时分别取出培养板，每孔加入MTT溶液( 5mg/ml)20μl，放入37摄氏度培养中4小时，吸去孔中液体，每孔加入150μl的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490nm波长检测OD值。计算EIPA和DDP对细胞A2780/Taxol的IC50，抑制率=(OD实验组-OD对照组) / OD对照组*100%；
步骤4：Hoechst 33258染色检测细胞调亡
将灭菌的盖玻片置于6孔板中，接种A2780/Taxol细胞悬液，5x10个/ 孔，37℃培养箱培养24 h，实验组分别加入IC50浓度的乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂，继续培养24 h、36h、48h，除去培养液，用PBS清洗细胞3次，每孔加入1ml的Hoechst 33258染色液，室温放置3-5分钟，吸除Hoechst 33258染色液，用PBS洗涤2-3次，每次3-5分钟，封片后荧光显微镜下观察拍照；
步骤5：Quantative Real-time PCR法检测A2780/Taxol细胞中目的基因的含量
Trizol法提取各组总RNA，酶标仪检测OD260/0D280在1.8-2.0之间的，表明RNA纯度好，按逆转录试剂盒要求合成cDNA，将合成的cDNA稀释后，冰上配置20μl的PCR反应体系，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为95C30s预变性，然后95C5s，60C35s，共35个循环，实验重复3次，以B-actin为内参基因，用2-△△ct法计算各基因mRNA的相对表达量；
步骤6：Western blot法检测PI3K、Akt蛋白及MRP-1的表达量
参照SDS-聚丙烯酰胺快速凝胶试剂盒说明制备5%的浓缩胶及10%的分离胶，调整各组蛋白样品上样量20μg，按照浓缩胶60V，分离胶100V的电压将蛋白质进行垂直凝胶电泳后，半干法转移至NC膜，洗膜后，快速封闭液封闭15 分钟，分别加入稀释的PI3K、Akt及MRP-1的兔抗人抗体，4C孵育过夜，洗涤3次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育1.5小时，再次洗涤3次，每次3分钟，超敏化学发光试剂盒(ECL)检测信号，内参为β-actin，以目的蛋白条带的灰度值/内参条带的灰度值表示目的蛋白的相对表达量；
步骤7：细胞内Rh123的积累
取对数生长期的A2780/Taxol细胞，实验分组同上，继续培养24h小时，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤离心后，在含有5μM Rh123的RMPI1640培养基中37C孵育60分钟，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，流式细胞仪激发波长488nm、发射波长530nm检测细胞内细胞内平均荧光强度，以此观察细胞内Rh123的的含量；
步骤8：统计学分析
采用SPSS16.0统计软件包，对数据进行检验，所有数据均采用mean+SD方式表示，用单因素方差分析(one-wayANOVA)检验总体均数差异性，有显著性差异者再进行两两比较(Student-New man-KeulsTest)，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异极显著性。
本发明的结果如下：
（1）EIPA与DDP对卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol生长抑制的IC50
图1表示EIPA与DDP对卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol生长抑制作用，MTT实验结果显示，EIPA与DDP对卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol的生长抑制率，随药物浓度的升高而增加(如图1)，经计算测得EIPA与DDP的IC50，分别为6. 35μM和126.5uM，因此选取略低于此浓度的剂量(EIPA6. 25μM,DDP100μM)进行后续的实验。
（2）细胞凋亡形态学检测
使用EIPA和DDP分别单独及联合作用于细胞A2780/Taxol24小时后，使用Hoechst33258染色法对细胞凋亡进行形态学检测结果显示，荧光显微镜下对照组细胞核呈现均匀的蓝色荧光，实验组细胞核碎块化且呈致密浓染的蓝色荧光，联合作用组细胞调亡率明显高于单独作用组（图2）。a 对照组 ；b EIPA组；c DDP 组；d EIPA+DDP 组。
（3）Q-PCR检测目的基因的含量
如图3，卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol在半致死剂量的DDP和EIPA的作用下，抗调亡信号通路中的重要信号分子PIK3和AKT-1的基因表达量明显下降，多耐药相关蛋白MRP-1的mRNA也显著降低。DDP与EIPA联合作用组中，上述三种基因的mRNA表达量与DDP组相比差异极显著(P<0.01)， 说明EIPA抑制NatH交换泵导致的细胞酸化作用明显降低了PIK3/AKT抗调亡信号通路以及多耐药相关蛋白MRP-1的作用。
（4）Western blot法检测目的蛋白的表达量
Westem blotting结果显示，EIPA与DDP作用后的细胞中，PIK3、 AKT-1、MRP-1蛋白的表达量较对照组而言均有下降(图4)，且朕合作用组细胞中三种目的蛋白与DDP组的表达量相比，有极显著差异性(P<0.01，图5)。说明EIPA导致的细胞酸化明显抑制了抗调亡信号通路中关键蛋白和多耐药相关蛋白MRP-1的表达。
（5）细胞内Rh123的积累
Rh123是细胞耐药相关蛋白MRP-1特异性作用的底物，肿瘤细胞内Rh123的含量直接反应了耐药相关蛋白转运功能的变化。卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol在DDP和EIPA的作用下，细胞内Rh123的含量明显增高。联合作用组细胞中的Rh123含量增高明显(图6).说明EIPA联合抗肿瘤药物DDP能够明显抑制多耐药相关蛋白的向细胞外转运药物的功能。
顺铂和紫杉醇是常用的妇科肿瘤化疗物质，能够与DNA结合形成链内或链间链加合物造成遗传物质的损伤，诱发一系列信号蛋白的改变，启动复杂的诱导细胞死亡的机制。临床中对化疗药物的耐药性也是卵巢癌治疗中的一个瓶颈问题，卵巢癌的化疗耐药常常表现MDR，实验表明，肿瘤细胞MDR产生的机制是多方面的，与正常组织细胞相比较，几乎所有的、不论何种起源和遗传背景的肿瘤组织和细胞，都存在异常的质子动力学异常所导致的细胞内PH值的升高，在哺乳动物，细胞内pH值的调节途径主要包括:空泡质子泵(V-ATPase)，钠氢交换蛋白(Na+-H+ exchanger, NHE)，碳酸氢盐转运体(BCT)和单羧酸转运体(MCT). 其中NHE是广泛存在于哺乳动物细胞膜上的一种转运蛋白，可高效率的将细胞内的H与细胞外的Nat以1: 1的比例相互交换，是细胞内pH值调节的一种重要机制。它有7个亚型，其中I型是研究最广泛、作用最突出的一类。本发明针对肿瘤耐药的这个共性问题，使用了NHEI的抑制剂EIPA，联合临床中最常使用的化疗药物顺铂，作用于卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol，来探讨是否能够通过诱导细胞内酸化来降低耐药细胞对化疗药物的外排率，从而降低肿瘤耐药细胞的抗调亡作用。
肿瘤细胞MDR产生的众多原因中，ABC(adenosine riphosphate -bindingcassette, ABC)膜转运蛋白的过表达是最重要的原因。与MDR有关的ABC家族成员有48个，其中其中P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、多药耐药相关蛋白家族(MRPs)和乳 腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)最为重要。多耐药蛋白1 (RP1/ABCC1)是MRPs家族中耐药谱最为广的蛋白，广泛分布在正常组织细胞中，是一种依赖于ATP能量跨膜转运蛋白，可选择性或特异性的将药物泵出细胞外，使细胞具有毒性保护作用，有研究表明，MRP-1的表达与肿瘤细胞中重要的抗调亡信号通路PIK3/ Akt信号通路有关，该通路的异常激活与肿瘤的发生发展、侵袭转移密切相关。Akt在PIK3调节作用下发生磷酸化而激活，Akt 的异常表达与肿瘤的发生、发展以及对放化疗产生的耐受密切相关。本研究发现，DDP作用下，辅以EIPA抑制NHEI后，A2780/Taxol细胞中PIK3、AKT-1、MRP-1基因和蛋白表达量比DDP组显著降低，表明在卵巢癌耐药细胞系中，细胞内的酸化抑制了PIK3/ Akt信号通路的作用，进而降低了MRP-1的表达及其向外转运药物的作用，使多耐药相关蛋白特异性底物Rh123在细胞内的含量增加，本发明的结果与文献报道一致。说明改变细胞内的酸碱环境可以增加抗肿瘤药物在卵巢癌细胞内的积累，提高化疗药物的疗效。
综上所述，本发明提出的Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，使用Na+-H+交换器抑制剂，乙基异丙基氨氯吡咪联合顺铂处理卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol,MTT实验、Hochest33258染色分别检测EIPA及顺铂对A2780/Taxol的IC50和调亡形态学变化; Quantative Real-time PCR、Western blot法分别检测磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路中PI3K、Akt-1蛋白及多耐药相关蛋白MRP-1的表达量；流式细胞术检测细胞内Rh123的含量，在卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol中，EIPA 诱导的细胞酸化抑制了PIK3/ Akt信号通路的作用，进而降低MRP-1的表达及其向外转运药物的作用，能够增加抗肿瘤药物在卵巢癌细胞内的积累，提高化疗药物的疗效。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：准备药物与试剂
材料为：乙基异丙基氨氯吡咪（EIPA）、顺铂(DDP)、紫杉醇(Taxol)、卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol、反转录酶试剂盒、荧光染料SYBR Green real-timePCR反应液、Rh123、Trizol 、Q-PCR引物、兔抗人β-actin、MDR-1抗体、兔抗人PI3K、Akt-1抗体、优质胎牛血清、Annexin-V細胞凋亡试剂盒、RMP11640培养基；
S2：细胞培养及实验分组
卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol培养于含800ng/mlTaxol、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37C、5%CO2培养箱中孵育，实验分4组：空白对照组、顺铂组、乙基异丙基氨氯吡咪组、乙基异丙基氨氯吡咪联合顺铂组；
S3：MTT法检测乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC50
取对数生长期的细胞A2780/Taxol，0.25%的胰蛋白酶消化，离心，RPMI1640培养基调整细胞密度为5x105个/m1，接种至96孔细胞培养板中，每孔加100μ1细胞悬液，每个组设6个复孔，培养板放入CO2培养箱中孵育，细胞贴壁后加入乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂 ，24小时和48小时分别取出培养板，每孔加入MTT溶液20μl，放入37摄氏度培养中4小时，吸去孔中液体，每孔加入150μl的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490nm波长检测OD值，计算乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC50；
S4：Hoechst 33258染色检测细胞调亡
将灭菌的盖玻片置于6孔板中，接种A2780/Taxol细胞悬液，5x10个/孔，37℃培养箱培养24 h，实验组分别加入IC50浓度的乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂，继续培养24 h、36h、48h，除去培养液，用PBS清洗细胞3次，每孔加入1ml的Hoechst 33258染色液，室温放置3-5分钟，吸除Hoechst 33258染色液，用PBS洗涤2-3次，每次3-5分钟，封片后荧光显微镜下观察拍照；
S5：Quantative Real-time PCR法检测A2780/Taxol细胞中目的基因的含量
Trizol法提取各组总RNA，酶标仪检测OD260/0D280在1.8-2.0之间的，表明RNA纯度好，按逆转录试剂盒要求合成cDNA，将合成的cDNA稀释后，冰上配置20μl的PCR反应体系，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为95C30s预变性，然后95C5s，60C35s，共35个循环，实验重复3次，以B-actin为内参基因，用2-△△ct法计算各基因mRNA的相对表达量；
S6：Western blot法检测PI3K、Akt蛋白及MRP-1的表达量
参照SDS-聚丙烯酰胺快速凝胶试剂盒说明制备5%的浓缩胶及10%的分离胶，调整各组蛋白样品上样量20μg，按照浓缩胶60V，分离胶100V的电压将蛋白质进行垂直凝胶电泳后，半干法转移至NC膜，洗膜后，快速封闭液封闭15 分钟，分别加入稀释的PI3K、Akt及MRP-1的兔抗人抗体，4C孵育过夜，洗涤3次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育1.5小时，再次洗涤3次，每次3分钟，超敏化学发光试剂盒检测信号，内参为β-actin，以目的蛋白条带的灰度值/内参条带的灰度值表示目的蛋白的相对表达量；
S7：细胞内Rh123的积累
取对数生长期的A2780/Taxol细胞，实验分组同上，继续培养24h小时，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤离心后，在含有5μM Rh123的RMPI1640培养基中37C孵育60分钟，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，流式细胞仪激发波长488nm、发射波长530nm检测细胞内细胞内平均荧光强度，以此观察细胞内Rh123的的含量；
S8：统计学分析
采用SPSS16.0统计软件包，对数据进行检验，所有数据均采用mean+SD方式表示，用单因素方差分析检验总体均数差异性，有显著性差异者再进行两两比较，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异极显著性。
2.根据权利要求1所述的Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，其特征在于，S2的10%胎牛血清的RPMI1640培养基含100U/m1的青霉素和链霉素。
3.根据权利要求1所述的Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，其特征在于，S3的乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂均设置6.25μM、12.5μM、 25μM、50pM、100μM 5个浓度。
4.根据权利要求1所述的Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，其特征在于，S3的抑制率= (OD实验组-OD对照组) / OD对照组X100%。
5.根据权利要求1所述的Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，其特征在于，S3的MTT溶液浓度为5mg/ml。
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