CN110075095A - 1,4-萘醌在抗结核分枝杆菌感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种针对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)中的异柠檬酸裂解酶(MtbICL)的化合物，该化合物为1,4‑萘醌，对结核分枝杆菌中的异柠檬酸裂解酶具有显著的抑制活性，因此本发明提供的化合物能够用来制备针对结核分枝杆菌中异柠檬酸裂解酶的小分子抑制剂，有望成为抗Mtb感染的潜在药物。

Description

1,4-萘醌在抗结核分枝杆菌感染中的应用

技术领域

本发明涉及药学的技术领域，具体说是1,4-萘醌在抗结核分枝杆菌感染中的应用。

背景技术

结核病(TB)是一种由结核分枝杆菌引起的传染病。结核分枝杆菌可以在人体内生活多年而不会引起疾病-导致一种被称为潜伏性结核病的综合症。结核病的潜伏期比任何其他传染病都要长。据估计，世界上至少有四分之一的人口被细菌感染，其中约有5-10％的人在其一生中会发展为活动性结核病，如果受感染的个体变得免疫受损，这种概率会急剧增加。世界卫生组织结核病战略旨在到2030年将死亡率降低90％，发病率降低80％。治疗潜伏性结核感染，特别是对那些感染艾滋病病毒等高危人群的人来说，是控制这种疾病的可行策略，目前用于治疗潜伏性结核感染的药物治疗方案需要高度的患者依从性。此外，这些药物可引起严重的肝毒性和其他令人不快的副作用。因此，如果要实现世界卫生组织制定的目标，就需要开发更有效和毒性更小的药物来治疗潜伏性结核感染。

异柠檬酸裂解酶(ICL)是一种Mg²⁺依赖性酶，可催化D-异柠檬酸的C-C键可逆裂解形成乙醛酸和琥珀酸。ICL存在于细菌(包括分枝杆菌)，真菌和植物中，但不存在于人或动物中。ICL对于潜伏感染期间结核分枝杆菌的生长和存活非常重要。因此是开发抗结核药物的潜在治疗靶标，所以针对ICL进行抑制剂筛选对结核分枝杆菌感染的相关的药物研发具有很大的意义。

1,4-萘醌，英文名是1,4-Naphthoquinone。1,4-萘醌衍生自萘，是染料和其他工业产品合成中蒽醌的前体。此外1,4-萘醌及其衍生物具有各种生物学相关性质，如抗癌，抗病毒，抗真菌，抗菌等。一些研究已经证明了1,4-萘醌在人类癌症治疗中抑制人单胺氧化酶的能力；且对来自耐药性粘膜炎莫拉氏菌(一种革兰氏阴性病原体，导致上呼吸道和下呼吸道感染)的II型FAS途径的两种重要酶(FabD和FabZ)都有抑制作用。但迄今为止，1,4-萘醌在抗结核分枝杆菌感染中的应用未见报道。

发明内容

针对相关技术中的问题，本发明提供1,4-萘醌在抗结核分枝杆菌感染中的应用。

本发明所涉及1,4-萘醌CAS号为130-15-4，购买于希恩思。在分子水平上，通过设立阴性对照，发现1,4-萘醌对结核分枝杆菌中的异柠檬酸裂解酶有很好的抑制活性，因此该化合物有望作为抑制结核分枝杆菌感染的潜在药物。

本发明提供一种用于预防或治疗结核分枝杆菌中的异柠檬酸裂解酶(MtbICL)感染的抑制剂，其活性成分为1,4-萘醌，该药物包含上述含有1,4-萘醌以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成膏剂、片剂、溶液剂的形式使用。

本发明具有的优点和积极效果是：

本发明的针对结核分枝杆菌中的异柠檬酸裂解酶(ICL)的抑制剂，这种抑制剂为1,4-萘醌。1,4-萘醌对结核分枝杆菌中的异柠檬酸裂解酶活性具有显著的抑制效果。

附图说明

图1是1,4-萘醌对结核分枝杆菌中的MtbICL的抑制作用示意图

图2是1,4-萘醌对结核分枝杆菌的MIC测定

具体实施方式：

为了更好地说明本发明，在下面将详述本发明的具体实施方式。

1.结核分枝杆菌中异柠檬酸裂解酶(ICL)的表达与纯化

根据文献(Lei Ji 1,Quanxin Long 1,Dacheng Yang 2,JianpingXie1.Identification of Mannich Base as a Novel Inhibitor of MycobacteriumTuberculosis Isocitrate by High-Throughput Screening.International Journal ofBiological Sciences 2011；7(3):376-382.)

(1)将含有编码ICL基因的pET-28a(+)载体质粒转入Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，并用含有50mg/L卡那霉素抗性的LB固体培养基筛选阳性克隆。

(2)在平板上挑取单个阳性克隆并转入含有卡那霉素抗性的5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，将其转接于含卡那霉素抗性的0.8L LB液体培养基，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)于16℃培养18小时。

(3)用4000rpm离心15min收集菌体细胞，加入缓冲液A液(20mM Tris,0.5M NaCl,pH 7.8)重悬菌体沉淀，低温超声破碎，于4℃高速(1000rpm)离心30min并收取上清。

(4)将上清液挂于预先用缓冲液A液平衡过的HisTrap亲和预装层析柱，使目的蛋白与Ni离子充分结合。

(5)之后将HisTrap亲和预装层析柱接入AKTA FPLC系统，其中将系统A泵头放于缓冲液A液中，系统B泵头放于缓冲液B液(20mM Tris,0.5M NaCl,1M咪唑，pH 7.8)中，使用A泵对其进行平衡。当系统中的紫外基线走平时，使用A泵+3％B泵对蛋白进行洗脱，以除去未结合或结合不牢的杂蛋白；随后改用25％B泵洗脱目的蛋白，收集蛋白洗脱液并用50kD的浓缩管浓缩换液，用凝胶过滤层析色谱进行纯化来获得具有电荷均一性的目的蛋白。

2.ICL的活性测定

采用纯度大于95％的异柠檬酸钠盐(购买自希恩思)作为底物；紫外吸收强度测定的仪器为VARIOSKAN FLASH全波长酶标仪仪，波长为324nm。

蛋白缓冲液组分为MOPS缓冲液，用缓冲液配置ICL(终浓度150nM)，加入溶解于DMSO(二甲基亚砜)的化合物(终浓度为25μM)，37℃放置5min，迅速加入底物异柠檬酸钠盐，底物浓度为2mM。每2min记录一次读数，共测定50min。654rpm震荡5s，检测吸收值。阴性对照不加备选样品，其它实验条件均相同

以时间为X轴，光吸收值为Y轴可得酶活动力学曲线。通过酶标仪记录的酶反应的相关参数，根据紫外吸收强度以及反应时间，采用GraphPad Prism5软件分析前30min的酶促反应的速率。设定V₀为不加抑制剂的酶促反应的初速度，V_i为加抑制剂的酶促反应的初速度。根据酶促反应速率，计算出每个化合物的剩余活性Ra(Residual Activity,Ra)(Vi/V0)以及抑制率Ir(Inhibition Rate,Ir)(1-Vi/V0)。

对于抑制率﹥70％的化合物进行复筛，排除因操作失误造成的假阳性的可能。

3.测定化合物对结核分枝杆菌(H₃₇Ra)的最小抑菌浓度

(1)菌液培养

在超净台中将100μL H₃₇Ra甘油菌接种至5mL 7H9液体培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝1.0，并将其作为种子液4℃保存。在超净台中以1:100比例将种子液转接至5mL 7H9液体培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5，取菌液将其调整到OD₆₀₀＝0.15，并稀释100倍使用。

(2)药物1,4-萘醌的稀释

进行倍比稀释，依次为：488μM、244μM、122μM、61μM、30.5μM、15.25μM、7.625μM、3.3125μM。

(3)向96孔板中加40μL7H9(含有Tween-80与ADS)液体培养基,之后加等倍稀释后不同浓度的抗菌药物溶液，再加稀释好的菌液40μL，轻轻吹打混匀，同时每个药物浓度设三个平行实验。将其放置于37℃培养箱孵育一周。

本发明涉及药学的技术领域,具体说是1,4-萘醌在抗结核分枝杆菌感染中的应用。本发明中,1,4-萘醌对H₃₇Ra的MIC为9.64μg/mL。本发明专利的新颖性在于我们筛选出一种异柠檬酸裂解酶抑制剂-1,4-萘醌，有望成为抗分枝杆菌感染的潜在药物。

以上所使用的方法,如无特殊说明,均为本领域常用的方法。

以上仅为本发明的具体实施方式,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.1,4-萘醌在治疗结核分枝杆菌感染中的应用。

2.1,4-萘醌是结核分枝杆菌中异柠檬酸裂解酶的小分子抑制剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，1,4-萘醌的结构式为：

4.一种治疗结核分枝杆菌感染的药物，其特征在于它包含权利要求书1或2所述的1,4-萘醌以及一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。

5.根据权利要求书4所述的治疗结核分枝杆菌感染的药物，其特征是它是含有所述药物的悬浮剂或乳剂。