CN110073194B - 用于样本保存的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种方法，所述方法准许在样本浸入试剂中并且试剂扩散到组织样本中时计算组织样本内随时间和空间的试剂浓度。在该方法中，通过将实验飞行时间值与模型飞行时间值进行比较来获得样本的扩散率常量和样本的孔隙度。所公开的方法已经产生如下结果：一旦在冷+热固定协议的冷步骤期间组织样本内的所有点处的甲醛浓度超过约90mM，就可以开始固定协议的热步骤以提供对分子靶的可靠检测和在下游分析中的组织形态的保存。

Description

用于样本保存的系统和方法
对相关申请的交叉引用
本公开内容要求2016年12月22日提交的申请号为62/437,962的美国临时专利申请的权益，以及2016年12月22日提交的申请号为62/438,152的美国临时专利申请的权益，这二者通过引用以其全部被并入本文中。
技术领域
本公开内容一般地涉及用于确保生物样本被恰当地保存以用于分析的系统和方法。更具体地，本公开内容涉及用于确保细胞样本被充分固定以提供组织和/或细胞组分的一致良好的着色的系统和方法。
背景技术
生物样本（例如手术切除）的适当保存对其后续分析非常重要。目前，没有用于固定样本的标准过程，并且这种标准化的缺乏导致后续分析中的各种品质问题。例如，在从受试物移除组织样本后，通常将样本放置于液体中，该液体将中止细胞的代谢活性并保存其形态。该过程通常被称为“固定”，并且可以通过几种不同类型的液体来实现。然而，用于保存样本用于随后的制备和分析的最常见的固定剂是10％中性缓冲福尔马林（NBF）。
10％NBF中的“固定”用于通过蛋白质和核酸的交联来保存组织。交联保存了组织的特性，诸如组织结构、细胞结构和分子完整性。通常，用10％NBF固定需要几个小时，并且可以被认为两个分离的步骤。第一是福尔马林向组织中的扩散步骤。在第二步骤中，福尔马林分子与组织中的生物分子相互作用以形成交联。这些交联可以在随后的处理步骤（诸如组织脱水、清除、包埋在石蜡中、切分、去石蜡化和着色）期间帮助保持细胞结构完整。
然而，如果组织被“过度固定”，则由于过度扩展的交联分子网络限制扩散的路径，可能难以使处理液体扩散通过组织。这可能导致后续处理液的渗透不足。如果处理液体是着色剂，则缓慢的扩散速率可能导致不均匀和不一致的着色。如果“着色剂”包括相对较大的分子，则可能增加这些类型的问题。例如，轭合的生物分子（诸如抗体或核酸探针分子）可能相对较大，通常具有几百千道尔顿的质量，导致它们缓慢扩散到实体组织中，特别是在组织被过度固定的情况下。虽然过度固定有时可以通过扩展的抗原和靶修复程序来补救，但是这样的程序是耗时的并且不总是成功的，特别是对于修复不稳定的生物标记物（诸如磷酸化蛋白质）。
如果组织固定不足，则组织可能会降解，例如通过自催化破坏，导致组织和细胞形态的丧失以及具有诊断意义的蛋白质和核酸标记物的丧失。此外，在样本不完全固定后的处理也可能导致丧失具有诊断意义的形态特征。例如，没有足够的交联分子网络，细胞、细胞核和细胞质在脱水步骤期间可能会收缩。因此，固定不足的组织可能不适合用于检查并且经常被丢弃。
传统的病理学实践通常基于预定的固定设置，该预定的固定设置基于样本尺寸（例如，厚度）和组织类型的处理时间的经验知识。在不知道这些信息的情况下，通常难以恰当地着色组织；因此经常测试组织以获得这样的信息。不幸的是，测试可能是耗时的，破坏了大部分样本，并导致试剂浪费。举例来说，可以执行利用针对IHC/ISH着色的不同抗原修复设置的多次迭代，以匹配和/或补偿未知的固定状态和未知的组织组成。重复着色运行导致额外的样本材料消耗和长时段的诊断。
发明内容
公开了一种用于在生物样本内在（一个或多个）特定时间在（一个或多个）特定空间点处的试剂（诸如甲醛）的浓度而不是作为跨整个样本剖面的平均值的系统和方法。该系统和方法基于与扩散模型相关联的声学飞行时间（TOF）信息来重建随着试剂扩散到样本中随时间的组织样本内（一个或多个）特定点处的试剂（诸如甲醛）的浓度。
在本公开内容的一个方面中提供了一种方法，所述方法用于确定在给定时间在浸入试剂内的样本内的（一个或多个）特定点处的试剂浓度，所述方法包括：模拟在多个时间点上并且针对多个候选扩散率常量中的每一个的向样本中的扩散的空间相关性，以生成模型飞行时间，以及将模型飞行时间与实验飞行时间进行比较以获得误差函数，其中误差函数的最小值产生针对该样本的扩散率常量。所述方法还包括提供多个候选组织孔隙度并使用这些候选组织孔隙度中的每一个来使用扩散率常量生成模型飞行时间并将模型飞行时间与实验飞行时间进行比较，从而获得第二误差函数，其中误差函数的最小值产生样本的孔隙度。根据确定的扩散率常量和样本的孔隙度，可以计算在特定时间在样本内的一个或多个特定点处的浓度。
所述方法产生令人惊讶的结果，一旦在组织样本中达到高于约100mM（诸如高于90mM）的甲醛浓度，分子靶的品质检测（“着色”）和可靠的形态完整性（如由病理学家对照行业“黄金标准”的评分所评判的）被可靠地实现，从而产生与针对仅仅建模的扩散率常量的先前结果相比更好的相对真阳性对假阳性的接收器操作特性（ROC）曲线。此外，添加关于真实试剂浓度的空间信息和可理解的SI度量单位使得可以利用诸如放射性标记追踪、mid-IR或磁共振技术之类的其他技术来直接静态地或动态地（例如实时地）确定在特定类型、大小和形状的样本内何时达到该阈值甲醛浓度，以帮助确保在组织样本中的（一个或多个）任何给定点处将获得品质着色。换句话说，使用所公开的方法，可以达到足以保存样本内的形态和生物标记而不会由于过度固定而不适当地使进一步的分析复杂化的组织样本（或其一部分，诸如在中心）的固定水平。
在替换实施例中，一旦在样本的特定空间部分中实现足以保存一种生物标记用于可靠检测的浓度，样本的其他部分就可以被选择为具有更适合于检测一种或多种附加生物标记的更高或更低浓度的福尔马林。在又一替换实施例中，基于在特定时间内在特定形状的特定样本类型的固定期间达到的已知甲醛浓度分布，根据针对特定测试（诸如针对不稳定标记的测试，诸如FoxP3或RNA）的最优甲醛浓度，样本的所选部分（诸如所选的组织切片）可用于不同的测试。固定可以在室温下进行，或者使用如本文中所述的冷+热协议进行。更具体地，在冷+热协议中，在冷步骤期间达到最优甲醛浓度。
在本公开内容的另一方面中是一种系统，所述系统包括：声学监视设备，其检测已经行进通过组织样本的声波；以及计算设备，其通信地耦合到所述声学监视设备，所述计算设备被配置成基于飞行时间来评估声波的速度，并且包括指令，所述指令当被执行的时候使得所述处理系统执行包括以下各项的操作：为组织样本设置候选扩散率常量的范围；针对多个时间点并且针对一系列候选扩散率点中的第一个来模拟组织样本内的试剂的空间相关性；基于所述空间相关性来确定建模的飞行时间；针对所述多个扩散率常量中的每一个重复空间相关性模拟；以及确定针对所述多个扩散率常量的建模的飞行时间与针对组织样本的实验飞行时间之间的误差，其中基于所述误差的误差函数的最小值产生针对组织样本的扩散率常量。所述系统还包括指令，所述指令当被执行的时候使得所述处理系统执行包括以下各项的操作：设置针对组织样本的、包括多个候选孔隙度的候选孔隙度范围（诸如在大约0.05和大约0.50之间，例如在大约0.05和大约0.40之间，或在大约0.05和大约0.30之间）；基于样本的扩散率常量以及所述多个候选孔隙度中的第一个来确定第二建模的飞行时间；以及确定实验飞行时间与第二建模的飞行时间之间的第二误差；重复确定针对所述多个候选孔隙度中其它孔隙度的第二建模的飞行时间以及对应的第二误差，其中误差的最小值标识样本的孔隙度。在另外特定的实施例中，所述系统还包括指令，所述指令当被执行的时候产生特定时间处在样本内的试剂的空间浓度分布。在再另外特定的实施例中，所述系统还包括指令，所述指令当被执行的时候提供在特定时间处在样本中心处的试剂浓度。在又另外特定的实施例中，这样的试剂浓度可以用于当在样本内的特定点或区处（诸如在样本的中心处）达到预定浓度的时候终止利用试剂对样本的注入。
在本公开的又一方面中，提供了一种有形的非暂时性计算机可读介质，用于存储计算机可读代码，所述计算机可读代码由处理器执行以执行包括以下各项的操作：比较针对样本材料的模拟飞行时间与针对样本材料的实验飞行时间；基于模拟飞行时间和声学飞行时间之间的误差函数的最小值获得针对样本材料的扩散率常量；比较使用扩散率常量和实验衰减常量（tau）获得的针对样本材料的第二模拟飞行时间与实验飞行时间；基于第二误差函数的最小值获得样本材料的孔隙度；以及可选地计算试剂浓度的空间分布或在样本的特定点或区的试剂浓度。
附图说明
图1示出了根据本公开内容的示例性实施例的用于经优化的组织固定的组织处理系统100。
图2A和2B分别示出了来自活检胶囊以及来自标准大小的卡盒的超声扫描图案的描绘。
图2C示出了针对本公开内容的示例性实施例的定时图。
图3示出了用于获得针对组织样本的扩散率系数的方法。
图4示出了用于获得针对组织样本的扩散率系数的替换方法。
图5A-5B分别示出了针对第一时间点，以及针对实验进程上的若干时间点的模拟浓度梯度。
图6A和6B分别通过实验进程上的超声以及针对第一候选扩散率常量的模拟TOF信号而描绘了所检测的NBF浓度的模拟量的绘图。
图7描绘了针对所有潜在扩散率所计算的时变TOF信号。
图8A和8B分别描绘了经实验计算的TOF趋势以及从人类扁桃体样本的6mm片段所收集的空间上平均的TOF信号。
图9A和9B分别示出了作为候选扩散率常量的函数的在模拟的和经实验测量的TOF信号之间的所计算的误差函数的绘图以及误差函数的放大视图。
图10描绘了利用在实验TOF旁所绘制的建模的扩散率常量所计算的TOF趋势。
图11A和11B示出了针对多个组织样本的经重构的扩散率常量。
图12A-12B示出了一系统，所述系统包括用于经由相移来测量TOF的传送器和接收器对。
图13示出了试剂向圆柱形对象（诸如圆柱形组织芯）中的扩散的模型。
图14示出了在3小时处和5小时处试剂向组织样本中心中的百分比扩散的典型分布。
图15示出了基于在组织样本中心处的百分比扩散的着色品质（基于敏感性与特异性）的典型ROC曲线。
图16示出了在暴露于试剂的大约3小时与大约5小时之间在组织样本中心处的百分比扩散的差别的典型图表。
图17示出了根据所公开的实施例所确定的扁桃体组织体积孔隙度的原始数据分布。
图18示出了根据所公开的实施例所确定的扁桃体组织体积孔隙度的框须分布。
图19示出了在3小时和5小时处如根据所公开的实施例所确定的在组织样本中心处的甲醛浓度的典型分布。
图20示出了基于在组织样本中心处的甲醛浓度的着色品质（基于敏感性与特异性）的典型ROC曲线。
图21示出了在浸在NBF溶液中3小时与5小时之间在组织样本中心处的甲醛浓度的差别的典型图表。
图22示出了如根据所公开的实施例所确定的针对若干组织类型的原始孔隙度的分布。
图23示出了如根据所公开的实施例所确定的针对若干组织类型的孔隙度的一组框须分布。
图24示出了针对若干组织类型的扩散率常量的分布。
图25示出了针对若干组织类型的扩散率常量的一组框须分布。
图26示出了针对若干组织类型在3、5和6小时处在组织样本中心处的原始百分比扩散的分布。
图27示出了针对若干组织类型在3、5和6小时处在组织样本中心处的百分比扩散的一组框须分布。
图28示出了针对若干组织类型在3、5和6小时处在组织样本中心处的原始甲醛浓度的分布。
图29示出了针对若干组织类型在3、5和6小时处在组织样本中心处的甲醛浓度的一组框须分布。
图30示出了在所指示的浸入时间之后针对若干组织类型在组织样本中心处的原始甲醛浓度的分布。
图31示出了在所指示的浸入时间之后针对若干组织类型在组织样本中心处的甲醛浓度的一组框须分布。
图32示出了图31的经标注的版本，其划分了在浸入在大约10%的NBF中5或6小时之后提供最优着色的组织类型。
图33示出了在浸入在大约10%的NBF中6小时之后针对所有组织在组织样本中心处的甲醛浓度的原始分布。
图34示出了在浸入在大约10%的NBF中6小时之后针对所有组织在组织样本中心处的甲醛浓度的框须分布。
图35示出了用于获得在组织样本中心处的扩散率系数、孔隙度和甲醛浓度的方法。
具体实施方式
还应当理解到，除非清楚地相反指示，否则在包括多于一个步骤或动作的本文中所要求保护的任何方法中，所述方法的步骤或动作的次序不一定被限制于用来叙述所述方法的步骤或动作的次序。
如本文中所使用的，单数术语“一”、“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另行清楚地指示。类似地，词语“或”意图包括“和”，除非上下文另行清楚地指示。术语“包括”包含性地限定，使得“包括A或B”意指包括A、B或A和B。
如本文中在说明书中和在权利要求中所使用的，“或”应当被理解成具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中分隔各项的时候，“或”或“和/或”应当被解释为是包含性的，即包括多个元素或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及可选地包括附加的未经列举的项。术语“仅”清楚地相反指示，诸如“……中仅一个”或“……中确切地一个”，或当在权利要求中被使用的时候，“由……组成”将指的是包括多个元素或元素列表中的确切一个元素。通常，如在本文中所使用的术语“或”当在之后有排他性术语（诸如“任一个”、“……中之一”、“……中仅一个”或“……中确切地一个”）的时候应当仅仅被解释为指示排他性的替换方案（即“一个或另一个但不是二者”）。“基本上由……组成”当在权利要求中被使用的时候应当具有其如在专利法领域中所使用的普通含义。
术语“包括”、“包含”、“具有”等等可互换地被使用并且具有相同的含义。类似地，“包括”、“包含”、“具有”等等可互换地被使用并且具有相同的含义。特别地，术语中的每一个被定义成与对“包括”的常见美国专利法定义一致，并且因此被解释成是开放术语，意指“至少以下”，并且还被解释成不排除附加的特征、限制、方面等等。因而，例如，“设备具有组件a、b和c”意指设备至少包括组件a、b和c。类似地，短语：“方法涉及步骤a、b和c”意指方法至少包括步骤a、b和c。此外，虽然步骤和过程在本文中可能按特定的次序被概述，但是技术人员将认识到排序的步骤和过程可变化。
如本文中在说明书中和在权利要求中所使用的，关于一个或多个元素的列表的短语“至少一个”应当被理解成意指从元素列表中的任何一个或多个元素中所选的至少一个元素，但是不一定包括在元素列表内特别列举的每一个元素的至少一个并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许可以可选地存在除了在短语“至少一个”所涉及的元素列表内所特别标识的元素之外的元素，无论与特别标识的那些元素有关还是无关。因而，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”（或等同地“A或B中的至少一个”或等同地“A和/或B中的至少一个”）在一个实施例中可以指至少一个，可选地包括多于一个A，其中不存在B（并且可选地包括除了B之外的元素）；在另一实施例中，指至少一个、可选地包括多于一个B，其中没有A存在（并且可选地包括除了A之外的元素）；在又一实施例中，指至少一个、可选地包括多于一个A，以及至少一个、可选地包括多于一个B（并且可选地包括其它元素）；等等。
I.技术实现方式
本公开内容提供系统和计算机实现的方法用于计算扩散率常量（也称为“扩散系数”）和/或样本孔隙度（例如通过使用与扩散模型相关联的基于声学飞行时间（TOF）的信息来重构跨组织样本的时空浓度简档）。
在一些实施例中，本文中所公开的组织制备系统和方法可以被适配成监视固定剂流体向组织样本中的扩散，直到达到预定浓度水平为止。例如，随着福尔马林渗透到组织中，它使间隙流体位移。该流体交换至少部分地改变组织体积的组成，并且可以监视该改变。作为示例，假设间隙流体和福尔马林各自对于所引入的超声脉冲不同地起反应（即每种流体具有离散的“声速”性质），输出的超声脉冲将累积小的通行时间差别，该通行时间差别随着更多的流体交换发生（即随着更多的福尔马林使间隙流体位移）而增大。这实现诸如以下各项的操作：基于组织样本的几何结构来确定通过扩散所累积的相位差，建模扩散对TOF的影响，和/或使用后期处理算法来使结果相关联以确定扩散率常量。此外，所公开的TOF仪器的灵敏度可以检测小于百万分之10的改变，从而潜在地实现对扩散率常量和孔隙度的更准确的表征。在纳秒TOF尺度上，所有流体和组织将具有离散的声速，因此所公开的操作不限于仅仅量化水扩散，而且可以用于监视所有流体向所有组织中的扩散。例如，用于包埋组织样本的脱水试剂（诸如梯度乙醇）、清除剂（诸如二甲苯）和石蜡的扩散。
可以由声学探测器系统基于经福尔马林浸泡的组织样本的不同声学性质来监视扩散速率。这样的用于扩散监视和实验TOF测量的系统在公开号为2013/0224791、2017/0284969、2017/0336363、2017/0284920和2017/0284859的美国专利公开中被进一步详细地描述，所述专利公开的公开内容各自通过引用以其全部被并入本文中。用于扩散监视和实验TOF测量的另一合适的系统还在2015年12月17日提交的、题为ACCURATELY CALCULATINGACOUSTIC TIME-OF-FLIGHT的国际专利申请中被描述，其中每个的内容由此通过引用以其全部被并入本文中。
用于TOF监视的合适系统和方法的另外的示例在公开号为WO2016/097163的PCT公开以及公开号为2017/0284859的美国专利公开中被描述，它们的内容也通过引用在它们不与本公开内容不一致的程度上被并入本文中。所参考的申请描述固体组织样本与流体固定剂接触，流体固定剂行进通过组织样本并且大体上遍及组织样本的整个厚度扩散，并且基于声学特性来分析固体组织样本，所述声学特性被连续地或周期性地监视以遍及处理评估组织样本的状态和状况。例如，具有比间隙流体更大的体积模量的固定剂（诸如福尔马林）在它使间隙流体位移时可显著变更TOF。基于所获得的信息，固定协议可以被调节以增强处理一致性，减少处理时间，提高处理品质等等。声学测量可以用于非侵入性地分析组织样本。随着流体试剂（例如流体固定剂）行进通过样本，组织样本的声学性质可发生改变。在例如预浸泡过程（例如冷固定剂的扩散）、固定过程、着色过程等等期间，样本的声学性质可发生改变。在固定过程（例如交联过程）中，随着组织样本变得更大量地交联，声学能量的传输速度可发生改变。实时监视可以用于准确地追踪固定剂通过样本的移动。例如，可以基于声波的飞行时间（TOF）来监视生物样本的扩散或固定状态。测量的其它示例包括声学信号幅度、衰减、散射、吸收、声波的相移、或其组合。
在其它实施例中，可以实时地监视固定剂通过组织样本的移动。
II.系统和方法
如本文中所使用的“飞行时间”或“TOF”是例如对于对象、粒子、或声波、电磁波或其它波通过介质行进一段距离所花费的时间。可以例如通过如下方式经验性地测量TOF：确定由传送器所发射的声学信号（“所传送的信号”）与接收器所接收的已经通过被浸在流体中的对象的声学信号（“所接收的信号”）和已仅仅通过流体的声学信号的相位之间的相位差。
如本文中所使用的，术语“生物样本”、“生物试样”、“组织样本”、“样本”等等是指从包括病毒的任何有机体所获得的包括生物分子（诸如蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其组合）的任何样本。有机体的其它示例包括哺乳动物（诸如人类；兽医学动物，比如猫、狗、马、牛和猪；以及实验室动物，比如老鼠、鼠和灵长类）、昆虫、环节动物、蛛形纲动物、有袋类动物、爬行动物、两栖动物、细菌和真菌。生物样本包括组织样本（诸如组织分段和组织的针刺活检）、细胞样本（诸如细胞学涂片、诸如Pap涂片、或血液涂片、或通过显微解剖所获得的细胞样本）、或细胞小部分、片段或细胞器（诸如通过溶解细胞以及通过离心法或以其它方式来分离其组分所获得的）。生物样本的其它示例包括血液、血清、尿、精液、粪便物、脑脊髓流体、间隙流体、黏液、泪液、汗液、脓、活检组织（例如，通过手术活检或针刺活检所获得的）、乳头抽吸物、耳垢、奶、阴道分泌物、唾液、拭子（诸如口腔拭子）、或从第一生物样本得到的包含生物分子的任何材料。在某些实施例中，如本文中所使用的术语“生物样本”是指从获得自受试物的肿瘤或肿瘤的一部分所制备的样本（诸如均质或液化的样本）。样本可以被包含在例如组织样本载玻片上。
“孔隙度”是材料中空隙（即“空的”）空间的度量，并且是空隙体积与对象总体积的分数，其在0与1之间，或作为在0与100%之间的百分比。如本文中所使用的“有孔材料”是指例如具有大于0的孔隙度的3D对象。
如本文中所使用的“扩散系数”或“扩散率常量”是例如在由于分子扩散所引起的摩尔通量与其扩散被观察的对象的浓度中的梯度（或用于扩散的驱动力）之间的比例常量。例如在物理化学方面的菲克定律和众多其它方程中遇到扩散率。扩散率（一个物质相对于另一个的扩散率）越高，它们越快地扩散到彼此中。典型地，化合物的扩散率常量在空气中是在水中的大约10,000倍大。空气中的二氧化碳具有16 mm2/s的扩散率常量，并且在水中其扩散率常量是0.0016 mm2/s。
如本文中所使用的“相位差”是例如在具有相同频率并且参照相同时间点的两个波之间的用度或时间所表述的差。
如本文中所使用的“活检胶囊”是例如用于活检组织样本的容器。典型地，活检胶囊包括用于保持样本并且让液体试剂（例如缓冲剂、固定溶液或着色溶液）围绕并且扩散到组织样本中的网格。活检胶囊可以将样本维持在特定的形状中，所述形状可以有利地为样本提供一种形状，所述形状在计算上更容易根据所公开的方法来建模并且因而更适合用于在所公开的系统中使用。如本文中所使用的“卡盒”是指例如用于活检胶囊或没有被包含在活检胶囊内的组织样本的容器。优选地，卡盒被设计并且被定形使得它可以自动地被选择并且相对于超声传送器-接收器对的射束路径被移动，例如提升和降低，并且卡盒还具有开口，所述开口准许液体试剂移动到卡盒中并且从卡盒移动出去，并且因而进一步移动到其内保持的组织样本中并且从所述组织样本移动出去。可以例如通过机器人臂或卡盒被装载到其上的设备的另一自动化的可移动组件来执行移动。在其它实施例中，卡盒单独用于包含组织样本，并且卡盒的形状可以至少部分地确定组织样本的形状。例如，将比卡盒的深度稍微更厚的矩形组织块放置到卡盒中并且关闭卡盒盖可使得组织样本被压缩并且伸展以填充卡盒的内部空间的更大一部分，并且因而被变换成更薄的一片，该更薄的一片具有更大的高度和宽度，但是具有与卡盒的深度粗略对应的厚度。
在一些实施例中，提供了一种计算甲醛或其它试剂的系统，所述系统包括信号分析器，所述信号分析器具有处理器以及被耦合到所述处理器的存储器，所述存储器用于存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令当被处理器执行的时候使得处理器执行操作，所述操作包括根据如下面进一步详细讨论的声学数据集来计算福尔马林浓度。
在一些实施例中，被输入到信号分析器中的数据是由声学监视系统所生成的声学数据集，其中所述声学数据集通过如下方式生成：传送声学信号使得声学信号遇到感兴趣的材料，然后在声学信号已遇到感兴趣的材料之后检测声学信号。在一些实施例中，提供一种系统，该系统包括如本文中公开的信号分析器和如下面进一步详细讨论的声学监视系统。附加地或替换地，可以提供一种系统，所述系统包括如本文中公开的信号分析器和非暂时性计算机可读介质，非暂时性计算机可读介质包括从如本文中公开的声学监视系统获得的声学数据集。在实施例中，通过由声学监视系统所传送和接收的扫频来生成声学数据。如本文中所使用的，术语“扫频”应当指一系列声波，其以固定的频率间隔被传送通过介质，使得通过介质以固定的频率在第一固定的持续时间内发射第一声波集，并且以固定的频率间隔在后续的优选相等的持续时间内发射后续声波集。
在一些实施例中，系统被适配用于监视流体向有孔材料中的扩散。在这样的实施例中，可以提供一种系统，该系统包括：（a）信号分析器；（b）如本文中公开的声学监视系统和/或非暂时性计算机可读介质，非暂时性计算机可读介质包括由所述声学监视系统所生成的声学数据集；以及（c）用于保持被浸在流体体积中的有孔材料的装置。在一些实施例中，所述系统被适配为监视固定剂向组织样本中的扩散。
在一些实施例中，确定福尔马林浓度或其它试剂浓度，以用于表征试剂已渗透进有孔对象的程度。例如，所述方法可以用于监视对象（例如织物、塑料、陶瓷、组织或其它）的着色过程，以用于监视固定过程或其它组织处理步骤，诸如脱水、清除和石蜡包埋。
在一些实施例中，本公开内容提供一种用于收集声学数据集的声学监视系统，所述声学监视系统包括传送器和接收器，其中所述传送器和接收器被布置使得由传送器生成的声学信号被接收器接收并且被变换成计算机可读信号。在一些实施例中，所述系统包括超声传送器和超声接收器。如本文中所使用的，“传送器”是指能够将电信号转换成声学能量的设备。如本文中所使用的，“超声传送器”是指能够将电信号转换成超声声学能量的设备。如本文中所使用的，“接收器”是能够将声波转换成电信号的设备，并且“超声接收器”是能够将超声声学能量转换成电信号的设备。
在一些实施例中，对于从电信号生成声学能量有用的某些材料对于从声学能量生成电信号也是有用的。在一些实施例中，传送器和接收器不一定需要是分离的组件，尽管它们可以是。在一些实施例中，传送器和接收器被布置使得在所传送的波已经遇到感兴趣的材料之后接收器检测传送器所生成的声波。在一些实施例中，接收器被布置成检测已经被感兴趣的材料反射的声波。在其它实施例中，接收器被布置成检测已经被传送通过感兴趣的材料的声波。
在一些实施例中，所述传送器至少包括可操作地链接到换能器的波形生成器，所述波形生成器被配置为生成被传送到换能器的电信号，所述换能器被配置用于将电信号转换成声学信号。在一些实施例中，波形生成器是可编程的，从而使得用户可以修改扫频的某些参数，包括例如起始和/或结束频率、在扫频的频率之间的步长大小、频率步长的数目、和/或传送每个频率的持续时间。在其它实施例中，波形生成器被预编程以生成一个或多个预定的扫频图案。在其它实施例中，波形生成器可以被配置成传送经预编程的扫频和经定制的扫频二者。传送器还可以包含聚焦元件，聚焦元件允许由换能器生成的声学能量被可预测地聚焦并且被引导到对象的特定区域。
在一些实施例中，传送器可以将扫频传送通过介质，所述扫频然后被接收器检测并且被变换成声学数据集，所述声学数据集将被存储在非暂时性计算机可读存储介质中和/或被传送到信号分析器以用于分析。在一些实施例中，在声学数据集包括表示所传送的声波与所接收的声波之间的相位差的数据的情况中，所述声学监视系统还可以包括相位比较器。在一些实施例中，所述相位比较器生成电信号，所述电信号对应于所传送的和所接收的声波之间的相位差。在一些实施例中，所述声学监视系统包括相位比较器，所述相位比较器被通信地链接到传送器和/或接收器。在一些实施例中，在相位比较器的输出是模拟信号的情况中，声学监视系统还可以包括模数转换器，模数转换器用于将相位比较器的模拟输出转换成数字信号。在一些实施例中，数字信号然后可以被记录在例如非暂时性计算机可读介质上，或可以被直接传送到信号分析器以用于分析。替换地，并且在一些实施例中，传送器能以特定的频率传送声学能量，并且由接收器所检测到的信号被存储并且针对其峰值强度被分析。
在一些实施例中，提供了一种信号分析器，该信号分析器包含处理器以及被耦合到所述处理器的存储器，所述存储器存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令当被处理器执行的时候使得处理器至少部分地基于由如以上所讨论的声学监视系统所生成的声学数据集来计算福尔马林浓度。
术语“处理器”包括用于处理数据的所有种类的装置、设备和机器，包括例如可编程微处理器、计算机、芯片上系统、或者前述各项中的多个或其组合。所述装置可以包括专用逻辑电路，例如FPGA（现场可编程门阵列）或ASIC（专用集成电路）。所述装置除了硬件之外还可以包括为讨论中的计算机程序创建执行环境的代码，例如构成以下各项的代码：处理器固件、协议栈、数据库管理系统、操作系统、交叉平台运行时环境、虚拟机、或它们中一个或多个的组合。所述装置和执行环境可以实现各种不同的计算模型基础设施，诸如web服务、分布式计算和网格计算基础设施。
计算机程序（还称为程序、软件、软件应用、脚本或代码）可以用任何形式的编程语言来被编写，所述编程语言包括经编译或解译的语言、声明式或过程性语言，并且它可以用任何形式来被部署，包括作为独立的程序或作为模块、组件、子例程、对象、或适合用于在计算环境中使用的其它单元。计算机程序可以但是不必对应于文件系统中的文件。程序可以被存储在保持其它程序或数据（例如被存储在标记语言文档中的一个或多个脚本）的文件的一部分中，专用于讨论中的程序的单个文件中，或多个经协调的文件（例如存储一个或多个模块、子程序、或代码部分的文件）中。计算机程序可以被部署为在一个计算机上或在多个计算机上执行，所述多个计算机位于一个地点或跨多个地点分布并且通过通信网络被互连。
在本说明书中所描述的过程和逻辑流可以由一个或多个可编程处理器来执行，所述可编程处理器执行一个或多个计算机程序通过对输入数据进行操作并且生成输出来执行动作。过程和逻辑流还可以由以下各项执行，并且装置也可以被实现为以下各项：专用逻辑电路、例如FPGA（现场可编程门阵列）或ASIC（专用集成电路）。
适合用于执行计算机程序的处理器例如包括：通用和专用微处理器二者，以及任何种类的数字计算机的任何一个或多个处理器。通常，处理器将从只读存储器或随机存取存储器或二者接收指令和数据。计算机的基本元件是用于根据指令而执行动作的处理器以及用于存储指令和数据的一个或多个存储器设备。通常，计算机还将包括一个或多个大容量存储设备（例如磁盘、磁光盘或光盘）或被操作地耦合以从一个或多个大容量存储设备接收数据或向一个或多个大容量存储设备传递数据或这二者，所述大容量存储设备用于存储数据。然而，计算机不必具有这样的设备。此外，计算机可以被嵌入在另一设备中，所述另一设备仅举几例的话例如是移动电话、个人数字助理（PDA）、移动音频或视频播放器、游戏控制台、全球定位系统（GPS）接收器、或便携式存储设备（例如通用串行总线（USB）闪速驱动器）。适合用于存储计算机程序指令和数据的设备包括所有形式的非易失性存储器、介质和存储器设备，例如包括半导体存储器设备，例如EPROM、EEPROM、和闪速存储器设备；磁盘，例如内部硬盘或可移除盘；磁光盘；以及CD-ROM和DVD-ROM盘。处理器和存储器可以由专用逻辑电路补充或被并入在专用逻辑电路中。
为了提供与用户的交互，在本说明书中所描述的主题的实施例可以被实现在计算机上，所述计算机具有：用于向用户显示信息的显示设备，例如LCD（液晶显示器）、LED（发光二极管）显示器、或OLED（有机发光二极管）显示器；以及用户可以用来向计算机提供输入的键盘和指示设备，例如鼠标或追踪球。在一些实现方式中，触摸屏可以用于显示信息并且从用户接收输入。其它种类的设备也可以用于提供与用户的交互；例如，被提供给用户的反馈可以是以任何形式的感觉反馈，例如视觉反馈、听觉反馈或触觉反馈；并且来自用户的输入可以以任何形式（包括声学的、话音的或触觉的输入）被接收。另外，计算机可以通过如下方式与用户交互：向用户所使用的设备发送文档并且从用户所使用的设备接收文档；例如响应于从web浏览器所接收的请求而将网页发送到用户的客户端设备上的web浏览器。
在本说明书中所描述的主题的实施例可以被实现在计算系统中，所述计算系统包括后端组件（例如作为数据服务器）；或包括中间件组件（例如应用服务器）；或包括前端组件（例如客户端计算机），前端组件具有图形用户界面或Web浏览器，通过这些，用户可以与本说明书中所描述的主题的实现方式交互；或者包括一个或多个这样的后端、中间件或前端组件的任何组合。系统的组件可以通过数字数据通信的任何形式或介质（例如通信网络）互连。通信网络的示例包括局域网（“LAN”）和广域网（“WAN”）、互联网络（例如因特网）、以及对等网络（例如自组织的对等网络）。
计算系统可以包括任何数目的客户端和服务器。客户端和服务器通常远离彼此，并且典型地通过通信网络进行交互。客户端和服务器的关系通过在相应的计算机上运行并且彼此具有客户端-服务器关系的计算机程序而产生。在一些实施例中，服务器将数据（例如HTML页面）传送到客户端设备（例如为了向与客户端设备交互的用户显示数据并且从该用户接收用户输入）。可以在服务器处从客户端设备接收在客户端设备处所生成的数据（例如用户交互的结果）。
在一些实施例中，信号分析器接受从测试材料所记录的声学数据集作为输入。声学数据集表示在扫频遇到感兴趣的材料之后所检测到的扫频的至少一部分。在一些实施例中，所检测到的扫频的部分构成被感兴趣的材料反射的声波。在其它实施例中，所检测到的扫频的部分构成已通过感兴趣的材料的声波。替换地，声学数据集表示被反射或已通过感兴趣的材料的单个频率的声学能量的突发。
图1示出了根据本公开内容的示例性实施例的对于组织处理（例如用于优化的组织固定、脱水、清除或包埋）有用的系统100的实施例。系统100包括声学监视设备102，所述声学监视设备102被通信地耦合到存储器110，所述存储器110用于存储多个处理模块或逻辑指令，处理模块或逻辑指令由被耦合到计算机101的处理器105执行。声学监视设备102可以包括先前提及的声学探测器，声学探测器包括一个或多个传送器以及一个或多个接收器。组织样本可以被浸在液体固定剂中，而传送器和接收器进行通信以检测声波的飞行时间（TOF）。
在一些实施例中，所述系统100采用一个或多个处理器105以及至少一个存储器110，所述至少一个存储器110存储非暂时性计算机可读指令以用于供一个或多个处理器执行，以使得所述一个或多个处理器执行一个或多个模块中的指令（或所存储的数据），所述模块包括：组织分析模块111，其用于经由用户输入或电子输入接收与组织块相关的信息，并且用于确定组织特性，诸如组织的声速；TOF建模模块112，其用于模拟针对各种时间和模型扩散率常量的相对固定剂或试剂浓度的空间相关性以生成时变的（“所预期的”或“所建模的”）TOF信号，以及输出模型衰减常量；TOF测量模块113，其用于确定组织的实际TOF信号，计算空间平均值，以及生成实验衰减常量，所述实验衰减常量取决于组织特性（例如实际细胞类型、细胞密度、细胞大小、以及样本制备和/或样本着色的效应）以及来自声学监视设备102的输入；以及关联模块114，其用于关联（例如比较）实验和建模的TOF数据，基于关联的误差函数的最小值来确定组织样本的扩散率常量，使用建模模块112中所确定的扩散率常量连同针对组织样本的候选孔隙度值来生成第二模型TOF信号，以及再次使用关联模块114在基于所确定的扩散率常量和样本的候选孔隙度的第二模型TOF信号和实验TOF数据之间进行第二关联，基于在实验TOF数据与使用所确定的扩散率常量所生成的模型TOF信号之间的第二关联的误差函数的最小值来确定组织样本的孔隙度，以及基于实验TOF信号、所确定的扩散率常量和所确定的孔隙度来确定在特定的空间和时间点处在样本内的试剂的浓度。
由这些模块所执行的这些和其它操作可导致向用户操作计算机101输出定量的或图形的结果。因此，尽管没有在图1中示出，但是计算机101还可以包括用户输入和输出设备，诸如键盘、鼠标、触控笔、和显示器/触摸屏。
如上所述，模块包括由处理器105所执行的逻辑。如在本文中并且遍及本公开内容所使用的“逻辑”是指可以被应用以影响处理器操作的、具有指令信号和/或数据的形式的任何信息。软件是这样的逻辑的一个示例。处理器的示例是计算机处理器（处理单元）、微处理器、数字信号处理器、控制器和微控制器等等。逻辑可以由被存储在计算机可读介质（诸如存储器110）上的信号形成，所述计算机可读介质在示例性实施例中可以是随机存取存储器（RAM）、只读存储器（ROM）、可擦除/电可擦除可编程只读存储器（EPROM/EEPROM）、闪速存储器等等。逻辑还可以包括数字和/或模拟硬件电路，例如包括“与”、“或”、“异或”、“与非”、“或非”和其它逻辑运算的硬件电路。逻辑可以由软件和硬件的组合形成。在网络上，逻辑可以被编程在服务器或服务器的复合体上。特定的逻辑单元不限于网络上的单个逻辑位置。此外，不必以任何特定的次序来执行模块。当需要被执行的时候，每个模块可以调用另一模块。
在一些实施例中，声学监视设备102可以被改造到商用“浸入”组织处理器（诸如Electron Microscopy Sciences（RTM）的Lynx II）上。在一些实施例中，使用Solidworks®软件所设计的机械头可以配合在标准试剂筒周围并且密封该标准试剂筒。一旦被密封，外部真空系统就可以启动以对大块试剂以及卡盒的内容（包括组织）进行脱气。在一些实施例中，可以利用卡盒保持器，所述卡盒保持器被设计供标准大小的组织学卡盒（诸如CellPath（RTM）的CellSafe 5）或用于较小组织样本的活检胶囊（诸如CellPath（RTM）的CellSafe活检胶囊）使用。每个保持器将安全地保持组织以防止样本在实验期间滑动。卡盒保持器可以被附连到竖直平移臂，所述竖直平移臂将会在一个方向上使卡盒保持器滑动。在一些实施例中，机械头可以被设计为在组织卡盒的任一侧上具有两个金属支架，其中一个支架容纳5个传送换能器，并且另一个支架容纳5个接收换能器，所述接收换能器与其相应的传送换能器在空间上对准。在一些实施例中，接收支架还可以容纳被定向成与其它换能器的传播轴正交的一对换能器。在每个采集之后，正交传感器可以计算参照TOF值，以检测对声速具有深远影响的流体的时空变化。另外，在每次2D采集结束时，卡盒可以被提高并且第二参照采集可以被采集。在一些实施例中，这些参照TOF值可以用于补偿福尔马林的环境引发的波动。福尔马林或任何其它固定剂的环境引发的波动可以是例如包括有孔材料、振动和其它的容器中的温度波动。
图2A和2B分别描绘了来自活检胶囊以及来自标准大小卡盒的超声扫描图案的示例。本文中针对组织样本所描述的测量和建模过程可以同样地被应用在其它形式的有孔材料上。因而，虽然本公开内容可以在组织样本的情境中说明建模，但是这样的示例是非限制性的，并且技术可以被应用到其它材料、诸如任何有孔材料。
如本文中所描述的，来自声学监视设备中的声学传感器的测量值可以用于追踪通过组织样本的声学信号的TOF的改变和/或改变速率。这包括随时间监视不同位置（例如多个不同位置，诸如至少2个不同位置，诸如至少3个不同位置，诸如至少4个不同位置，诸如至少8个不同位置）处的组织样本，以确定随时间的扩散或扩散速率。
例如，“不同位置”，也被称为“候选扩散率位置”可以是组织样本内或其表面上的位置。根据一些实施例，可以通过活检胶囊和声学射束路径的相对移动而将样本定位在不同的“样本位置”处。所述相对移动可以包括以步进或连续的方式移动接收器和/或换能器以在样本上进行“扫描”。替换地，可以借助于可移动的卡盒保持器来重定位卡盒。
例如，为了对卡盒中的所有组织进行成像，卡盒保持器可以循序地被竖直提升≈1mm，并且在每个新的位置处采集TOF值，如图2A和2B中所描绘的。所述过程可以被重复以覆盖卡盒的整个开放孔隙。参考图2A，当对活检胶囊220中的组织进行成像的时候，根据所有5个换能器对来计算信号，从而导致在图2A中所描绘的扫描图案。替换地，当对图2B中所描绘的标准大小的卡盒221中的组织进行成像的时候，第2和第4换能器对可以被关断，并且在位于标准大小的卡盒221的三个中间细分部分的相应中心处的第1、第3和第5换能器对之间采集TOF值。在一些实施例中，两个组织芯然后可以被放置在每列中，一个在顶部并且一个在底部，从而使得来自6个样本（2行x3列）的TOF迹线能够被同时获得，并且实现显著减小的随运转的变化以及增大的吞吐量。在该示例性实施例中，超声射束的半高宽是2.2mm。
在一些实施例中，声学监视设备中的声学传感器可以包括4MHz聚焦的换能器对，诸如CNIRHurricane Tech (深圳)有限公司(RTM)的TA0040104-10，它们在空间上被对准，其中组织样本被放置在其公共焦点处。被指定为传送器的一个换能器可以发出声学脉冲，所述声学脉冲穿过耦合流体（即福尔马林）和组织，并且被接收换能器检测到。
图2C示出了针对本公开内容的示例性实施例的定时图。初始地，传送换能器可以被编程有波形生成器（诸如Analog Devices(RTM)的AD5930），用于在数百微秒内传送正弦波。该脉冲序列在穿过流体和组织之后然后可以被接收换能器检测到。可以使用例如数字相位比较器（诸如Analog Devices的AD8302）来比较所接收的超声正弦和所传送的正弦。在一些实施例中，在所传送的和所接收的脉冲之间的时间重叠区期间，相位比较器的输出产生有效读数。允许相位比较器的输出在利用微控制器上所集成的模数转换器（诸如Atmel(RTM)的ATmega2560）来查询该输出之前稳定。所述过程然后可以跨换能器的带宽在多个声学频率处重复，以跨频率范围构建输入和输出正弦之间的相位关系。该声学相位-扫频直接用于使用后处理算法计算TOF，所述后处理算法类同于声学干涉法，并且能够以亚纳秒的准确率来检测通行时间。
在一些实施例中，针对特定时间点和特定候选扩散率点所获得的“所测量的TOF”（即“所测量的TOF值”）根据在所传送的超声信号与对应的、所接收的超声信号之间所测量的相移来计算，由此，超声信号的射束路径穿过特定的候选扩散率点，并且由此，在特定的时间点处测量到相移。
图3示出了根据本公开内容的示例性实施例的用于获得针对组织样本的扩散率系数的方法。关于本实施例所公开的操作可以由任何基于电子或计算机的系统，包括图1的系统来执行。在一些实施例中，操作可以被编码在计算机可读介质（诸如存储器）上并且被处理器执行，从而导致输出，所述输出可以被呈现给人类操作员或被用在后续的操作中。此外，假如本公开内容的精神被维持，则操作可以用除了本文中所公开的次序之外的任何次序来执行。
在一些实施例中，所述方法包括计算组织样本的声速（S330）。该操作包括计算组织样本被浸在其中的试剂中的声速。例如，在超声换能器之间的距离d sensor （即在传送换能器与接收换能器之间的距离）可以被准确地测量，并且在纯试剂中在超声传送器和超声接收器之间的通行时间t reagent 被测量，其中试剂中的声速r reagent 通过如下来被计算：
Figure 700939DEST_PATH_IMAGE001
在一些实施例中，还可以经由测量或用户输入来获得组织厚度。各种合适的技术可用于获得组织厚度，包括超声、机械和光学方法。最后，声速通过如下方式来被确定（S330）：使用以下方程从未经扩散的组织（即固定溶液尚未被应用于的组织样本）获得相对于大块试剂（例如固定溶液）的相位延迟：
Figure 555763DEST_PATH_IMAGE002
以及
Figure 804342DEST_PATH_IMAGE003
在一些实施例中，基于组织样本的已知几何结构来得到特定方程，并且通常，该方程表示在未经扩散的组织样本（即没有试剂，例如没有固定溶液的组织样本）中在时间t=0处的声速。在实验实施例中，例如，组织样本的声速可以通过如下方式来计算：首先基于两个超声换能器（其在本文中还被称为“传感器”）之间的距离（d sensor ）来计算试剂中的声速，所述距离（d sensor ）如利用经校准的卡尺被准确测量。在该示例中，传感器间隔利用卡尺来测量，并且传感器间隔d sensor = 22.4 mm。接下来，声学脉冲穿过传感器之间的试剂（没有组织）所需要的通行时间（t reagent ）可以利用可应用的程序来被准确记录。在实验示例中，针对10%的NBF（中性缓冲福尔马林）的大块试剂，t reagent =16.71μs。试剂中的声速（r reagent ）然后可以被计算为：
Figure 402813DEST_PATH_IMAGE004
在该实验中，利用6mm组织学活检芯冲压来使扁桃体的样本片段成芯，以确保准确并且标准化的样本厚度（d tissue =6mm），并且在组织存在的情况下（t tissue+reagent ）和没有组织存在的情况下（t reagent ）计算声学传感器之间的TOF差（Δt）：
Figure 420448DEST_PATH_IMAGE005
时间t reagent 是超声信号穿过从传送换能器到接收换能器的距离所需要的时间，由此，信号经过试剂体积但是不经过组织样本。所述穿过时间可以例如通过如下方式来测量：将具有与组织相同的直径（例如6mm）的活检胶囊放置在两个传感器之间，并且为仅仅经过试剂而没有经过组织的信号执行TOF测量。
时间t tissue 是超声信号穿过从传送换能器到接收换能器的距离所需要的时间，由此，信号通过不包括试剂并且没有被试剂围绕的组织样本。所述穿过时间可以例如通过如下方式来测量：在将试剂添加到胶囊之前将活检胶囊放置在两个传感器之间，并且为仅仅经过组织的信号执行TOF测量。
由组织以及组织的厚度和试剂中的声速所引起的时间差（或“TOF差”）Δt可以用于利用以下方程来计算未经扩散的组织的声速（t tissue （t=0）），所述方程根据样本的已知几何结构（例如柱形、立方形、箱形等等）得出：
Figure 711752DEST_PATH_IMAGE006
随后，建模过程被执行以在各种候选扩散率常量上对TOF进行建模。候选扩散率常量包括从获得自文献的组织性质的已知或在先知识中所选择（S331）的一系列常量。候选扩散率常量不精确，而是简单地基于对于在观察下的特定组织或材料而言可以是什么范围的粗略估计。这些所估计的候选扩散率常量被提供给建模过程（步骤S332-S335），其中误差函数的最小值被确定（S337）以获得组织的真实扩散率常量。换言之，方法追踪实验测量的TOF扩散曲线与具有不同的扩散率常量的一系列建模的扩散曲线之间的差异。
例如，在选择多个候选扩散率常量之一时，基于对作为时间和空间的函数的试剂浓度C reagen 的计算，使用对于圆柱形对象的热方程的解，来模拟组织样本中的试剂浓度的空间相关性（S332）：
Figure 447627DEST_PATH_IMAGE007
其中x是组织的深度方向上的空间坐标，R0是样本半径，D是候选扩散率常量，t是时间，J0是第一种并且0阶的贝塞尔函数，J1是第一种并且1阶的贝塞尔函数，αn是0阶贝塞尔函数的ｎ次方根的位置，并且cmax是试剂的最大浓度。换言之，这些贝塞尔函数（高阶微分方程）中每一个的系数的求和根据空间、时间和速率而提供所述常量，即扩散率常量。尽管该方程特定于在这些实验实施例中所公开的圆柱形组织样本，并且该方程将会取决于形状或边界条件而改变，但是针对任何形状的热方程的解可以为该形状提供扩散率常量。例如，在所公开的方法中还可以利用针对具有球形、立方形或矩形块形状的对象的热方程。
在一些实施例中，该步骤针对多个时间点被重复（S333-S334），以获得时变的TOF（其对应于预期的试剂浓度，因为在特定时间点处预期的试剂浓度的积分可以用于计算声速差）（S335）。例如，可以针对至少2个时间点，针对至少3个时间点，针对至少4个时间点，或针对至少8个时间点重复所述步骤。例如，确定扩散时间是否结束。该扩散时间可以基于所使用的系统的类型或硬件。对于每个时间间隔T，重复步骤S333、S334和S332直到建模时间结束，在建模时间结束后将建模的试剂浓度转换成时变TOF信号（S335）。
在实验实施例中，所使用的候选扩散率常量Dcandidate中的每一个被包含在以下值范围中：
Figure 725155DEST_PATH_IMAGE008
在一些实施例中，利用圆柱形活检芯冲压来使组织样本成芯，并且因此可以很好地通过圆柱体来近似。在一些实施例中，以上热方程的解然后用于计算组织样本中的试剂的预期浓度（creagent），并且对于实验中的第一时间点，即在104秒扩散（基于在执行所公开的实验的系统中所使用的TOF采集之间的时间间隔）之后，在图5A中描绘表示组织的深度方向上的试剂浓度的解。例如，特定系统可以为多个不同空间位置中的每一个规律地测量新TOF值，所述空间位置在此处也被称为“像素”。每个“像素”因而可以具有赋予新TOF值的更新速率，例如每104秒。
图5A示出了在大约104秒的被动扩散之后10%的NBF向大约6mm组织样本中的模拟浓度梯度，如根据实验实施例中的热方程所计算的。此外，这些步骤被重复以在实验进程（在实验实施例中为8.5小时长）内每104s重复地确定遍及组织的试剂浓度，并且结果在图5B中被描绘。
图5B示出了creagent(t,r)的绘图，该绘图显示在组织中所有位置处（水平轴）以及在所有时间处（曲线向上移动）试剂的（“预期的”、“建模的”或“基于热方程的”）浓度。
参考回到图3，试剂建模步骤（S332-S334）的结果可以用于基于以下事实来预测对超声信号的贡献：超声检测机制在组织的整个深度上线性地累积相位延迟。
在一些实施例中，由于超声检测来自深度方向上（即沿着US射束的传播轴）的所有组织的积分信号，并且因而将对深度方向上流体交换的积分量敏感，因此可以计算“积分预期的”试剂浓度cdetected，其也被称为“所检测的试剂浓度”。“所检测的试剂浓度”因此不是评经验检测的值。相反，它是导数值，通过对针对特定时间点t和针对特定候选扩散率常量所计算的所有预期的试剂浓度进行空间上的积分而被创建。空间积分可覆盖例如组织样本的半径。
例如可以使用如下方程来计算所检测的试剂浓度cdetected：
Figure 394034DEST_PATH_IMAGE009
在一些实施例中，经积分的试剂浓度cdetected用于计算特定时间点处试剂的总量。例如，样本的附加体积和/或重量信息可以用于计算绝对试剂量。替换地，试剂量用相对单位来计算，例如作为指示例如已经被试剂扩散的样本的体积分数的百分比值[%]。
在针对给定候选扩散率常量和给定时间点模拟（即基于热方程模型计算）了所检测的试剂浓度之后，该所检测的浓度然后可以使用如下方程被转换成TOF信号（S335），作为未经扩散的组织和试剂的线性组合：
Figure 997185DEST_PATH_IMAGE010
其中rtissue(t=0)是未经扩散的组织的声速，并且ρ是组织的体积孔隙度，其表示能够与大块试剂进行流体交换的组织样本的体积分数。该方程因此对来自扩散的TOF信号的改变进行建模，作为两个不同的声速（组织和试剂）的线性组合。由于一方面的纯组织和另一方面的纯试剂的相应的声速的TOF可以容易经验性地被确定（例如通过基于相应相移的TOF测量），所以可以容易地确定在特定时间点处已经扩散到样本中的试剂的量。
在一些实施例中，纯组织样本的TOF贡献（无大块流体（诸如样本缓冲剂或组织流体）的TOF贡献）可以通过如下方式来获得：从针对已经穿过仅填充有所述大块流体的对应换能器间距离的超声信号所测量的TOF贡献中减去针对包括大块流体和/或被大块流体围绕的组织样本所测量的TOF贡献。
图6A和6B分别描绘了在实验的整个进程上按照超声的经模拟的、“经检测的”或“经积分的”NBF浓度的绘图（图6A），以及针对第一候选扩散率常量的经模拟的（或“所预期的”）TOF信号的绘图（图6B，其中D=0.01μm2/ms）。图6B中的TOF信号被计算为试剂的相应积分浓度的导数。
在该点处，该方法一般使建模的（或“所模拟的”或“预期的”）TOF与实验TOF相关联（S336），所述实验TOF通过如下方式来确定：测量组织样本内不同的空间感兴趣区（ROI）（也被称为“候选扩散率点”），并且确定误差函数的最小值以获得真实的扩散率常量。在该示例中，针对在由（S322）所指定的范围中选择的特定扩散率常量的每个建模的TOF与实验TOF相关联（S336），并且确定误差是否被最小化（S337）。如果误差没有被最小化，则选择下一个扩散率常量（S338），并且针对新的扩散率常量重复建模过程（S332-S335）。如果确定基于相关联（S336）最小化误差（S337），那么真实的扩散率常量被确定（S339）并且方法结束。
图4示出了替换方法，其中所有候选扩散率常量首先用于基于步骤S446-S447执行建模，并且在所有扩散率常量被处理之后执行相关联（S448）。在图7中示出了针对所有潜在扩散率常量所计算的时变TOF信号的描绘。例如，图7描绘了在8.5小时的实验内针对6mm组织样本在范围从0.01到2.0μm2/ms的扩散率常量情况下经模拟的TOF迹线。在图4的实施例中，在真实扩散率常量确定步骤S439内执行误差最小化。
在任一情况中，必须确定实验TOF，以使得相关联发生。在一些实施例中，可以通过如下方式来确定实验TOF：测量组织内不同的空间感兴趣区（ROI）。每个信号具有来自背景试剂的贡献，所述贡献被减掉以从向组织中的主动扩散中隔离所述贡献。经由滤波而使个体TOF趋势在时间上被平滑。这些空间上不同的TOF趋势然后在空间上被求平均以确定10%NBF向组织中扩散的平均速率。
图8A和8B分别描绘了从人类扁桃体样本的6mm片段所收集的经实验计算的TOF趋势（图8A）以及空间上平均的TOF信号（图8B），其表示10% NBF向组织中的流体交换的平均速率和量。
向组织中扩散的平均速率与单个指数信号（其通过图8B中的虚线描绘）高度相关联，并且通过如下方程得到：
Figure 751514DEST_PATH_IMAGE011
其中A是以纳秒为单位的TOF的幅度（即在未经扩散的与全扩散的组织样本之间的TOF差），τexperimental是样本的衰减常量，表示对于TOF衰减到其幅度的37%或等同地被63%衰减所需要的时间，并且偏移是以上给定的衰减函数的竖直偏移。
63%可以通过以下计算来得到：在时间
Figure 488526DEST_PATH_IMAGE012
处，
Figure 11911DEST_PATH_IMAGE013
Figure 176176DEST_PATH_IMAGE014
。
在一些实施例中，由此假定：TOF随着样本中试剂浓度的增大而减小，但是所述方法将同样可应用于在向样本中扩散时使所测量的TOF增大的试剂。在实验实施例的人类扁桃体的6mm片段中，
Figure 886643DEST_PATH_IMAGE015
小时。因而，根据已经针对多个相继时间点实验确定的多个TOF，可以计算组织样本的衰减常量，例如通诺随时间绘制TOF信号的幅度，分析绘图以用于标识偏移以及对衰减常量的上述解进行求解。
在一些实施例中，误差相关联（图3中的S336，图4中的S448）被执行以确定建模的（“预期的”）TOF对实验TOF的误差。在已经计算了经模拟的和实验TOF信号情况下，可以计算两个信号之间的差以查看候选扩散率常量是否使两个信号之间的差最小化（S337）。
在一些实施例中，可以用几种不同的方式来计算误差函数，例如使用以下方程之一：
Figure 630609DEST_PATH_IMAGE016
在一些实施例中，第一误差函数计算经模拟的（“建模的”、“预期的”）和实验测量的TOF信号之间的逐点差。
在一些实施例中，通过计算在每个衰减常量之间的平方相加差别，第二误差函数专门比较经模拟的和建模的TOF信号之间的扩散速率。在一些实施例中，实验衰减常量τexperimental可以如上所述那样根据实验获得。在一些实施例中，可以类似地根据也遵循衰减函数的相继时间点的建模的（“预期的”）TOF信号得到“建模的”、“预期的”或“经模拟的”衰减常量τsimulated。
在一些实施例中，基于误差函数的输出，可以确定真实扩散率常量（S339）。在一些实施例中，所述真实扩散率常量被计算为误差函数的最小值，例如：
Figure 742921DEST_PATH_IMAGE017
该方程使得能够确定候选扩散率系数，该确定产生尽可能接近于实验数据的TOF信号。
例如，关于图3中所描绘的方法，可以为每个候选扩散率常量确定误差函数，直到误差被最小化为止（S337）。替换地，在图4的方法中，在所有候选扩散率常量被处理之后可以执行与实验TOF的相关联，在此时，对真实扩散率常量的确定（S439）包括确定误差函数的最小值。在一些实施例中，误差函数的最小值理想地是零，或尽可能地接近于零。本领域中已知的任何误差函数可以在如下目标下被使用：最小化本文中所公开的建模的系数对实验系数之间的误差。
图9A和9B分别示出了作为候选扩散率常量的函数的在经模拟的TOF信号和实验测量的TOF信号之间的所计算的误差函数的绘图（图9A，
Figure 546929DEST_PATH_IMAGE018
）以及误差函数的放大视图（图9B）。在实验实施例中，误差函数的最小值被计算为处于D = 0.1618 μm2/ms。经重构的常量的有效性被测试并且用于反向模拟TOF趋势。图10描绘了TOF趋势，其利用该扩散率常量计算并且沿着在人类扁桃体的6mm片段情况下所测量的实验TOF被绘制。在图10中，绘图示出了来自10% NBF中的6mm人类扁桃体片段的根据实验计算的TOF趋势（虚线）以及针对Dreconstructed = 0.168 μm2/ms的建模的TOF趋势（实线）。在该实施例中，τexperimental=2.830小时，并且τsimulated=2.829小时。
此外，该相同的过程针对6mm人类扁桃体样本的若干试样被重复，利用为所有样本所成功重构的扩散率常量，如图11A和11B中所描绘的。图11A示出了针对6mm人类扁桃体的23个样本的经重构的扩散率常量。线1151表示平均值。图11B示出了框须绘图，其显示经重构的扩散率常量的分布。线1152表示中值，并且框1153从百分之25-75开始延伸，其中须1154从百分之5-95开始延伸。总体上，算法预测的6mm扁桃体样本具有0.1849 μm2/ms的平均扩散率常量，具有相对紧密的分布，产生0.0545μm2/ms的标准偏差。
图12A示出了根据本公开内容的实施例的用于监视超声信号的飞行时间的系统。在一些实施例中，基于超声的飞行时间（TOF）监视系统可以包括一对或多对换能器（例如CNIRHurricane Tech的TA0040104-10），换能器用于基于超声信号的相移执行飞行时间测量。在图12A中所描绘的实施例中，所述系统包括由超声（“US”）传送器902和超声接收器904组成的至少一对换能器，超声（“US”）传送器902和超声接收器904在空间上与彼此对准，使得被放置在从传送器到接收器的射束路径914中的组织样本910位于靠近所述两个换能器902、904的公共焦点处。组织样本910可以被包含在例如样本容器912（例如标准组织学卡盒（比如CellPath的“CellSafe 5”）或活检胶囊（比如CellPath的“CellSafe活检胶囊”））中，所述样本容器912填充有固定溶液。在活检胶囊912被填充有固定溶液之前和之后以及当溶液缓慢扩散到样本中的时候执行基于相移的TOF测量。充当传送器的那一个换能器发出声学脉冲，所述声学脉冲穿过组织并且被充当接收器的另一个换能器检测到。构成传送器-接收器换能器对的两个换能器之间的总距离被称为“L”。超声信号穿过传送器902与接收器904之间的距离所需要的总时间可以被称为所述信号的飞行时间。传送器902可以例如以大约4MHz聚焦，并且支持处于大约3.7和大约4.3MHz之间的扫频范围。
在一些实施例中，距离L被假定是已知的，至少近似已知。例如，换能器的距离可以被准确地测量（例如通过基于光学、超声的技术或其它测量技术）或可以被声学监视系统的制造商公开。
传送换能器902可编程有波形生成器（例如来自Analog Devices的AD5930），用于在所限定的时间间隔（例如数百微秒）内针对所限定的频率传送正弦波（或“正弦信号”）。该信号在穿过流体和/或组织之后被接收换能器904检测到。所接收的超声信号922和所发射的（还被称为“所传送的”）正弦信号920利用数字相位比较器（例如Analog Devices的AD8302）被以电子方式比较。
如本文中所使用的“所接收的”“信号”（或波）是其性质（相位、幅度和/或频率等等）被接收所述信号的换能器（例如接收器904）标识并且提供的信号。因而，在所述信号已经经过样本或任何其它种类的材料之后标识信号性质。
如本文中所使用的“所传送的”或“所发射的”“信号”（或波）是指其性质（相位、幅度和/或频率等等）被发射所述信号的换能器（例如传送器902）标识的信号。因而，在信号已经经过样本或任何其它种类的材料之前标识信号性质。
例如，所传送的信号可以通过由传送换能器所标识的信号性质来表征，所接收的信号可以通过由接收换能器所测量的信号性质来表征，由此，传送和接收换能器被操作地耦合到声学监视系统的相位比较器。
图12B描绘了针对纯试剂的TOF的确定，根据所述确定可以推断针对穿过没有样本的纯试剂的射束路径的声波的速度。在该实施例中，所述一个或多个换能器对902、904和样本容器912可以相对于彼此移动。优先地，所述系统包括容器保持器，容器保持器能够重定位容器912使得US射束穿过仅仅包括固定溶液而不包括组织的容器的区914。
在时间A处，当组织尚未被浸在固定溶液中的时候，经由所测量的相移
Figure DEST_PATH_IMAGE020A
而获得穿过换能器之间的距离的声信号的TOF，如针对图12A所描述的那样。在该情况中，射束路径穿过无试剂的样本。由于L已知，所以所测量的TOF可以用于计算在存在未经扩散的样本的情况下声信号穿过所述距离的速度。
在时间B处，当组织被浸在固定溶液中的时候，经由所测量的相移
Figure DEST_PATH_IMAGE020AA
而获得穿过换能器之间的距离的声信号的TOF。在该情况中，射束路径穿过仅包括试剂而没有样本的样本容器（或在无样本的位置处穿过样本容器）。由于L已知，所以所测量的TOF可以用于计算在仅存在试剂（和样本容器）的情况下（即在射束路径中不存在样本的情况下）声信号穿过所述距离的速度。
在另外的换能器对被配置用于并行地执行两个测量的情况中，时间A和时间B可以表示相同的时间点。
III.示例
实施对所公开的方法的调查，所述方法跨样本内的空间和时间以及跨组织样本类型确定试剂浓度。在NBF中的冷浸入期间使用如上所述的TOF系统来监视样本，并且获得随时间所提取的实验TOF数据。在TOF分析之后，样本被加热以固定组织，然后在组织处理器中被处理以制备样本石蜡块。所述块在切片机上被切片，并且被封固在显微镜载玻片上，并且根据标准协议来被着色，并且在一些实例中由合格的载玻片读取器来读取，以评定着色品质。
图13示出了试剂向圆柱形对象（诸如圆柱形组织芯）中的扩散的模型。如可看到的，试剂浓度首先在组织样本的边缘处迅速增大，并且中心处的试剂浓度起初缓慢增大（如果有增大的话），从而使在样本边缘处所见的浓度改变滞后，然后在稍后的时间点处加速，然后再次开始减慢。在该模型中：
Figure 980578DEST_PATH_IMAGE021
相比于图5B，随时间的浓度改变在速率上比针对扩散百分比所见的改变更易变。这并非没有被预期，因为百分比扩散是跨整个样本所测量的平均值，而浓度改变是位置特定的。此外，由于样本孔隙度随A缩放，在以下方程中：
Figure 997075DEST_PATH_IMAGE022
一旦扩散率常量已知，候选孔隙度就可以用于计算经模拟的TOF曲线，并且与实验TOF曲线相比较以生成误差，所述误差可以被最小化。可以用不同的方式来计算误差函数，例如使用以下各项之一：
Figure 963894DEST_PATH_IMAGE023
第一误差函数计算在经模拟的（“建模的”、“预期的”）TOF信号和实验测量的TOF信号之间的逐点差。
第二误差函数通过计算在每个衰减常量之间的平方和差别来专门比较经模拟的TOF信号和建模的TOF信号之间的扩散速率。实验衰减常量τexperimental可以如上所述那样根据实验获得。可以类似地根据也遵循衰减函数的相继时间点的建模的（“预期的”）TOF信号得到“建模的”、“预期的”或“经模拟的”衰减常量τsimulated。
基于误差函数的输出，可以确定真实孔隙度。所述真实孔隙度被计算为误差函数的最小值，例如：
Figure 204383DEST_PATH_IMAGE024
一旦确定了样本的孔隙度，就可以使用以下方程来计算在特定的空间和时间点处的试剂浓度：
Figure DEST_PATH_IMAGE025
图14为了比较而示出了在3小时处和5小时处福尔马林溶液向扁桃体组织芯样本（近似6mm圆柱体）的中心中的百分比扩散的典型分布，其中样本的3小时的浸入产生相当好的着色，而5小时的浸入产生“理想”着色。平均地，经受3小时浸入的样本将在组织中心处达到52.6%的百分比扩散，并且经受5小时浸入的样本将达到76.9%扩散的平均百分比扩散。在5小时处的95%预测区间指示：样本在中心处需要至少52.45%的扩散，以实现如通过病理学家审阅所评判的“理想”着色。
图15示出了比较基于在组织样本中心处的百分比扩散的着色品质（敏感性与特异性）的“ROC”曲线。在该实例中，使用组织中心处的百分比扩散产生0.8926的曲线下面积（AUC），以用于基于组织中心处的扩散百分比的测量来预测着色品质。
图16示出了比较在暴露于试剂的大约3小时和大约5小时之间在组织样本中心处所测量的扩散百分比的差别的典型图表，其中结果为：在大约3小时和大约5小时扩散之间的平均差异在组织中心处为大约24.3%。
现在转到使用根据TOF数据来确定组织样本内的特定空间点处的试剂浓度的所公开方法所获得的结果，图17示出了针对若干样本所确定的扁桃体组织体积孔隙度的原始数据分布。图18示出了针对所确定的扁桃体组织体积孔隙度的图17的数据的对应框须分布。如可见的，扁桃体组织尤其展现大约0.15的平均孔隙度。
图19示出了在3小时和5小时处针对扁桃体组织芯样本（近似6mm圆柱体）的组织样本中心处的甲醛浓度的典型分布，其中大约3小时的样本浸入产生相当好的着色，而5小时的浸入产生“理想”着色。平均地，经受大约3小时浸入的样本将在组织中心处达到92.3mM的甲醛浓度，并且经受5小时浸入的样本将达到137.5mM的组织中心处平均浓度。在5小时处的95%预测区间指示：样本在固定期间在组织中心处应已实现至少91.07mM的福尔马林，以实现如通过病理学家审阅所评判的“理想”着色。
图20示出了基于组织样本中心处的甲醛浓度的着色品质（敏感性与特异性）的ROC曲线。在该情况中的AUC是0.9256，其说明了与使用组织中心处扩散的百分比作为着色品质的预测值（AUC-0.8926）（如图15中所示）相比将组织中心处的甲醛浓度用作着色品质的预测值的优越性。
同样地，图21说明了组织中心处的试剂浓度作为着色品质的预测值的优越性。它示出了在浸在NBF溶液中的大约3小时与大约5小时之间在组织样本中心处的甲醛浓度的差别的图表。总体上，所见的浓度平均差是45mM。相比于扩散的百分比的差（24%；图16），在大约3小时和大约5小时之间在组织中心处的浓度的差处于大约33%（45 mM/137 mM x 100%），更引人注目，反映了在浸入中稍后发生的、对组织中心处的着色品质可能有影响的试剂浓度的差。再次，这说明了使用提供在样本体积内位置和时间特定的度量（在该情况中为浓度）的方法相对于跨整个样本体积的平均度量（如在仅有扩散百分比的测量的情况中）的优点。
在已经确立了所公开的方法可以用于确定扁桃体组织的孔隙度情况下，针对10个不同的组织类型（80个样本）测量孔隙度，并且结果被示出在图22中，图22示出了针对若干组织类型的原始孔隙度的分布。图23示出了针对若干组织类型的孔隙度的一组框须分布。如可见的，对于大多数组织类型，平均孔隙度（框中的线）在大约0.1和大约0.2之间，而皮肤具有多于大约0.3的高得多的孔隙度。
为了比较，图24示出了针对若干组织类型的所确定的扩散率常量的分布，并且图25示出了针对若干组织类型的扩散率常量的一组框须分布。相比于在若干组织类型之间所确定的平均孔隙度，扩散率常量更加易变。
图26示出了针对若干组织类型所确定的在3、5和6小时处在组织样本中心处的原始百分比扩散的分布，并且图27示出了针对若干组织类型的在3、5和6小时处在组织样本中心处的百分比扩散的一组框须分布。图28示出了针对若干组织类型的在3、5和6小时处在组织样本中心处所确定的原始甲醛浓度的分布，并且图29示出了针对若干组织类型的在3、5和6小时处在组织样本中心处的甲醛浓度的一组框须分布。根据基于测量百分比扩散的原始数据和框须分布以及基于确定组织中心处的试剂浓度的那些的比较，可见，当利用浓度的时候，数据倾向于更紧密地群聚。
图30示出了在所指示的浸入时间之后针对若干组织类型在组织样本中心处的原始甲醛浓度的分布，并且图31示出了在所指示的浸入时间之后针对若干组织类型在组织样本中心处的甲醛浓度的一组框须分布。这些结果确认在大约90mM以上（诸如100mM以上）的组织中心甲醛浓度与“理想”着色的关联，因为较早前的研究示出了在冷+热固定协议的冷步骤中在至少6小时（针对扁桃体5小时）内的固定确保“理想”着色。通过显微镜分析进一步确认了结果，其中合格读取器确定在图32中所指示的组织确实说明了在所指示的时间之后的“理想（最优）”着色。
图33示出了在浸入在10%的NBF中6小时之后跨所有组织类型在组织样本中心处的甲醛浓度的原始分布，并且图34示出了在浸入在10%的NBF中6小时之后针对所有组织在组织样本中心处的甲醛浓度的框须分布。跨所有组织类型确认用于实现“理想着色”的90mM（或100mM）甲醛浓度水平。基于TOF数据来计算组织中心处的甲醛浓度与简单地使用标准固定时间协议之间的差异是：虽然6小时的浸入可能不足以实现针对直径大于大约6mm的样本的理想着色，但是足以实现组织中心处至少90mM（或100mM）甲醛的时间将确保对样本的“理想”着色。相反，能够潜在地使用6小时的标准固定时间来被过度固定的较小样本（例如针芯活检）可以被处理仅到组织中心处的浓度达到至少大约90mM为止，因而导致更短的总体分析时间。
图35示出了用于获得组织样本中心处的扩散率系数、孔隙度和甲醛浓度的所公开的方法的实施例。在S430处，测量样本的声速，如先前在图3的情境中所描述的。还如同图3的实施例，执行操作和判定S431、S432、S433、S434、S435、S436、S437和S438以限定扩散率常量。一旦在S439处确定了扩散率常量，在S440处就设置用于对试剂溶液向样本中的扩散进行建模的孔隙度的范围。该范围可以默认设置或由用户录入。例如，基于以上关于图22所讨论的根据实验确定的孔隙度值，0.05到0.50（或更窄）的范围应覆盖大多数——如果不是全部的话——组织类型。当组织类型已经在先被检查的时候可以设置更窄的范围，并且例如，用户可以录入组织类型来为模型提供适当范围的值用于探索。在S441、S442和S443处，来自S439的扩散率常量和在S440处所设置的候选孔隙度用于在一系列时间点T到T+n上对试剂的空间相关性进行建模。在该系列时间点上所构建的模型然后用于在S444处生成预期的TOF曲线，并且在S445处与实验TOF曲线相关联。在S446处，预期的TOF曲线和实验TOF曲线之间的误差被检查以查看它是否处于最小值，并且如果是，则在S448处将候选组织孔隙度确定成是实际组织孔隙度。如果否，则在S447处以第二候选孔隙度重复所述过程。一旦限定了扩散率常量（S439）和孔隙度（S448）二者，在S449处就可以生成跨时间的试剂浓度的空间模型。一旦确立了随时间的试剂浓度的空间模型，就可以从模型提取在特定时间在样本内特定点处（诸如在样本中心处）的浓度。
IV.另外的实施例
在另一方面，本公开内容涉及一种系统，所述系统包括检测已经行进通过有孔材料的声波的声学监视设备和通信地耦合到声学监视设备102的计算设备。该计算设备包括指令，当所述指令被执行时使计算设备执行包括以下各项的操作：
（i）根据检测到的声波的所测量的声学数据计算一组实验TOF，每个实验TOF指示在多个时间点中的相应时间点处已经行进通过有孔材料的候选扩散率点的声波的TOF；候选扩散率点是有孔材料中或表面处的位置；
（ii）设置针对有孔材料的候选扩散率常量的范围；
（iii）针对每个候选扩散率常量，针对多个时间点并且针对候选扩散率点模拟有孔材料内的试剂的预期浓度的空间相关性浓度模型，试剂的预期浓度是时间、空间和所述候选扩散率常量的函数；
（iv）使用空间相关性浓度模型来计算针对有孔材料的空间相关性TOF模型，TOF模型针对多个时间点中的每个时间点并且针对每个候选扩散率常量为候选扩散率点分派分别建模的TOF；表达“建模”、“模拟”和“预期”在本文中可互换使用；例如，“使用”可以包括将空间相关性浓度模型转换为空间相关性TOF模型；和
（v）确定候选扩散率点的误差函数，该误差指示分派给所述候选扩散率点的每个建模的TOF与对应的实验TOF之间的距离（也可以被认为并且称为“误差”）。实验TOF由声学监视设备在与用于对其对应的建模的TOF进行建模的相同时间点处测量；
（vi）使用误差函数来标识具有距对应的实验TOF的最小距离的一个或多个建模的TOF；
（vii）输出根据标识的一个或多个建模TOF的候选扩散率常量针对有孔材料计算的扩散率常量。
（viii）设置有孔材料的候选孔隙度范围；
（ix）对于每个候选孔隙度，针对多个时间点和输出的扩散率常量来模拟有孔材料内试剂的预期浓度的空间相关性浓度模型，试剂的预期浓度是时间、空间、扩散率常量和候选孔隙度的函数；以及
（x）确定针对候选孔隙度的误差函数，该误差指示分派给所述候选孔隙度点的每个建模的TOF与对应的实验TOF之间的距离（也可以被认为并且称为“误差”）。实验TOF由声学监视设备在与用于对其对应的建模的TOF进行建模的相同时间点处测量。
在另一方面，本公开涉及对应的方法。
根据其他实施例，计算空间相关性TOF模型包括通过求解有孔材料的热方程来确定每个建模的TOF。
根据特定实施例，声学数据包括：在用试剂进行扩散之前声波在有孔材料中的速度；和/或在试剂向有孔材料的扩散期间在多个时间点处声波通过有孔材料的实验TOF；和/或用于根据实验相移数据计算实验TOF的实验相移数据；和/或在不具有有孔材料的试剂中声波的速度；和/或有孔材料的厚度。例如，根据实施例，使用脉冲回波超声来确定所述厚度。
根据其他实施例，空间相关性TOF模型的计算包括：
（i）选择多个候选扩散率常量中的第一个；
（ii）根据所选择的候选扩散率常量，针对多个时间点中的每个时间点计算有孔材料中的多个候选扩散率点中的每一个处的预期试剂浓度creagent；
（iii）通过将针对所述时间点和在有孔材料的半径上的所述候选扩散率常量计算的预期试剂浓度creagent进行积分，针对多个时间点中的每一个和针对每个候选扩散率常量计算积分试剂浓度cdetected；
（iv）通过计算在利用试剂扩散之前有孔材料中的声波速度和在不具有有孔材料的试剂中声波的速度的线性组合，将积分试剂浓度转换为空间相关性TOF模型的建模的TOF；和
（v）选择下一个候选扩散率常量并针对被选择的下一个候选扩散率常量重复该步骤和前三个步骤，直到达到终止标准，以得到样本的扩散率常量；
（vi）选择针对有孔材料的多个候选孔隙度中的第一个孔隙度；
（vii）基于得到所述多个候选孔隙度中的上述第一个孔隙度的扩散率常量来计算针对样本的第二建模的TOF
（viii）选择针对有孔材料的候选孔隙度中的下一个孔隙度并重复该步骤和前一步骤，直到达到终止准则，以得到样本的孔隙度；和
（ix）计算有孔材料中的每个候选扩散率点处的实际试剂浓度。
总之，可以通过如下方式来提供具有任何样本材料的确定试剂浓度：在给定温度、压强等处计算试剂中的声速，利用标准脉冲回波超声确定样本的厚度，通过超声相位延迟确定在未经扩散的样本中的绝对声速，然后根据候选扩散率常量生成模拟的TOF趋势，首先模拟向样本中的试剂扩散的空间相关性，将由超声射束检测到的总试剂浓度相加，把检测到的试剂浓度转换为TOF差，并针对多个扩散时间重复这些步骤。然后，通过如下方式来确定建模的TOF趋势：针对多个候选扩散率常量（诸如由从文献中得知的范围提供的范围内）重复空间相关性模拟并且在所有时间处并且针对所有扩散率常量计算实验和模拟TOF差之间的误差，从而得到作为扩散率常量的函数的实验TOF和建模的TOF之间的误差函数。计算真实的扩散率常量作为误差函数的最小值会得到输出。然后，使用真实扩散率常量和针对样本的多个候选孔隙度（例如从预期的组织孔隙度范围中选择的）来生成随时间的第二建模的TOF趋势，计算在所有时间处在第二建模的TOF趋势和实验TOF趋势之间的第二误差函数，以及计算样本的真实孔隙度作为第二误差函数的最小值。然后可以将真实孔隙度与真实扩散率常量一起输入回到针对试剂扩散的空间相关性的模型中，以获得在扩散过程期间在样本内在任何时间在任何空间点处的试剂浓度。替代地，试剂浓度在特定时间在特定空间点以摩尔为单位的试剂浓度根据以下方程基于在特定时间的扩散百分比。
试剂浓度=（扩散百分比）（孔隙度）（g试剂/ L）（1摩尔/ MW试剂）
此外，本公开内容适用于生物和非生物情境二者，从而提供基于声学TOF曲线来重构任何物质的扩散率常量。与现有技术方法相比，所公开的方法更灵敏和准确。尽管所公开的操作提供了将TOF曲线拟合到包括贝塞尔函数的求和的单指数函数，但是取决于情境，双指数或二次函数可以是更适当的。因此，方程本身可以改变，而当被本领域普通技术人员阅读的时候，本文中所公开的新颖特征可以维持其发明精神和范围。
扩散率常量和孔隙度计算已知对于许多应用（包括组分分析）而言是有用的。本系统和方法被设想成用在利用扩散率常量和孔隙度测量值的任何系统中。在一个特定的实施例中，本系统和方法被应用到监视流体向有孔材料中的扩散的领域。
在一些实施例中，有孔材料是组织样本。在许多常见的组织分析方法中，组织样本被扩散有流体溶液。例如，Hine (Stain Technol.1981 Mar；56(2):119-23)公开了一种方法，该方法通过如下方式来对整个组织块进行着色：在固定之后并且在包埋和切分之前将组织样本浸在苏木精溶液和曙红溶液中。另外，经常通过将未经固定的组织样本浸到一定体积的固定剂溶液来执行固定，并且允许固定剂溶液扩散到组织样本中。如Chafin等人(PLoS ONE 8(1): e54138. doi:10.1371/journal.pone.0054138 (2013))所说明的，未能确保固定剂已经充分扩散到组织中可能有损组织样本的完整性。因而，在一个实施例中，本系统和方法被应用以确定固定剂向组织样本中的扩散的充足时间。在这样的方法中，用户选择在组织样本中的特定点（诸如组织样本的厚度的中心）处要实现的最小固定剂浓度。在至少知道组织厚度、组织几何结构、和所计算的真实扩散率的情况下，可以确定在组织样本的中心处达到最小相对（相对于周围流体）固定剂浓度的最小时间。固定剂因而将被允许向组织样本中扩散达至少所述最小时间。然而，为了将这扩展到可以用于实时监视的方法，如本文中所公开的对组织样本孔隙度的确定准许确定需要被实现以确保样本完整性的实际固定剂浓度。因而，基于本文中所公开的系统和方法，其它技术（诸如放射性标记追踪、中间IR评估和MRI）可以用于确定利用特定试剂（诸如固定剂）的特定处理的适当时间。
在一些实施例中，本文中所公开的系统和方法结合在组织样本上的双温度浸入固定方法使用。如本文中所使用的，“双温度固定方法”是如下固定方法：组织首先被浸在冷固定剂溶液中达第一时间段，然后加热组织达第二时间段。冷步骤准许固定剂溶液扩散遍及组织，而大体上不引起交联。然后，一旦组织已充分地扩散遍及组织，加热步骤就导致通过固定剂的交联。冷扩散与之后的加热步骤的组合导致比通过使用标准方法更完全固定的组织样本。因此，在一些实施例中，组织样本通过如下步骤来被固定：（1）将未经固定的组织样本浸在冷固定剂溶液中，并且通过使用如本文中所公开的系统和方法来监视组织样本中的TOF来监视固定剂向组织样本中的扩散（扩散步骤）；以及（2）允许组织样本的温度在已经测量到阈值TOF之后提升（固定步骤）。在示例性实施例中，在如下固定剂溶液中执行扩散步骤：所述固定剂溶液在20℃以下、在15℃以下、在12℃以下、在10℃以下、在大约0℃到大约10℃的范围中、在大约0℃到大约12℃的范围中、在大约0℃到大约15℃的范围中、在大约2℃到大约10℃的范围中、在大约2℃到大约12℃的范围中、在大约2℃到大约15℃的范围中、在大约5℃到大约10℃的范围中、在大约5℃到大约12℃的范围中、或者在大约5℃到大约15℃的范围中。在示例性实施例中，允许围绕组织样本的环境在固定步骤期间在大约20℃到大约55℃的范围内提升。在某些实施例中，固定剂是基于醛的交联固定剂，诸如基于戊二醛和/或福尔马林的溶液。经常用于浸入固定的醛的示例包括：
甲醛（针对大多数组织的5-10%福尔马林的标准工作浓度，尽管如20%福尔马林那么高的浓度已经用于某些组织）；乙二醛（标准工作浓度17到86mM）；戊二醛（200mM的标准工作浓度）。
醛通常被彼此结合地使用。标准醛组合包括10%福尔马林+1%（w/v）戊二醛。非典型的醛已经被用于某些专门化的固定应用中，包括：富马醛（fumaraldehyde）、12.5%氢氧己二醛（pH 7.5）、10%丁烯醛（pH 7.4）、5%丙酮醛（pH 5.5）、10%乙醛（pH 7.5）、10%丙烯醛（pH7.6）和5%异丁烯醛（pH 7.6）。用于免疫组织化学的基于醛的固定剂溶液的其它特定示例在表1中被阐明：
溶液 标准组分
中性缓冲福尔马林 5-20%福尔马林+磷酸盐缓冲剂（pH值约6.8）
福马尔钙 10%福尔马林+10g/L氯化钙
福马尔盐溶液 10%福尔马林+9g/L氯化钠
锌福尔马林 10%福尔马林+1g/L硫酸锌
Helly固定剂 50mL 100%福尔马林 + 包含25g/L重铬酸钾+10g/L硫酸钠+50g/L氯化汞的1L水溶液
B-5固定剂 2mL 100%福尔马林+包含6g/L氯化汞+12.5g/L醋酸钠（无水）的20mL水溶液
Hollande溶液 100mL 100%福尔马林+15mL醋酸+包括25g醋酸铜和40g苦味酸的1L水溶液
Bouin溶液 250mL 100%福尔马林+750mL饱和的含水苦味酸+50mL冰状醋酸
表2。
在某些实施例中，从表1中选择固定剂溶液。在一些实施例中，所使用的醛浓度高于以上提及的标准浓度。例如，可以使用高浓度的基于醛的固定剂溶液，该固定剂溶液的醛浓度是用于固定所选组织以用于大体上类似的组分情况下的免疫组织化学的标准浓度的至少1.25倍高。在一些示例中，高浓度的基于醛的固定剂溶液选自：大于20%福尔马林、大约25%福尔马林或更大、大约27.5%福尔马林或更大、大约30%福尔马林或更大、从大约25%到大约50%福尔马林、从大约27.5%到大约50%福尔马林、从大约30%到大约50%福尔马林、从大约25%到大约40%福尔马林、从大约27.5%到大约40%福尔马林、以及从大约30%到大约40%福尔马林。如本在这种情境中所使用的，术语“大约”应包括如下浓度：所述浓度不导致如通过Bauer等人的Dynamic Subnanosecond Time-of-Flight Detection for Ultra-preciseDiffusion Monitoring and Optimization of Biomarker Preservation, Proceedingsof SPIE，Vol.9040，90400B-1 (2014-Mar-20)所测量的在4℃处的扩散中的统计上显著的差异。
双温度固定过程对于检测组织样本中的某些易变生物标记的方法特别有用，所述组织样本包括例如磷酸化蛋白质、DNA和RNA分子（诸如miRNA和mRNA）。参见PCT/EP2012/052800（通过引用被并入本文中）。因而，在某些实施例中，使用这些方法所获得的经固定的组织样本可以针对这样的易变标记的存在而被分析。因而，在实施例中，提供了检测样本中的易变标记的方法，所述方法包括：根据如本文中所公开的双温度固定来固定组织，以及利用能够专门结合到易变标记的分析物结合实体（诸如FOXP3）来接触经固定的组织样本。分析物结合实体的示例包括：抗体和抗体片段（包括单链抗体），其结合到目标抗原；t-细胞受体（包括单链受体），其结合到MHC:抗原复合物；MHC:肽多聚体（其结合到特定的T-细胞受体）；寡核苷酸适配子，其结合到特定的核酸或肽靶；锌指，其结合到特定的核酸、肽和其它分子；受体复合物（包括单链受体和嵌合受体），其结合到受体配基；受体配基，其结合到受体复合物；以及核酸探针，其杂交到特定的核酸。例如，提供了一种检测组织样本中的磷酸化蛋白质的免疫组织化学方法，所述方法包括：利用特定用于磷酸化蛋白质的抗体来接触根据前述双温度固定方法所获得的经固定的组织，以及检测抗体与磷酸化蛋白质的结合。在其它实施例中，提供了一种检测核酸分子的原位杂交方法，所述方法包括：利用特定用于感兴趣的核酸的核酸探针来接触根据前述双温度固定方法所获得的经固定的组织，以及检测探针与感兴趣的核酸的结合。
已经为了说明和描述的目的呈现了本公开内容的示例性实施例的前述公开内容。不意在是穷举的或者将本公开内容限制于所公开的确切形式。鉴于以上公开内容，本文中所述的实施例的许多变型和修改对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。本公开内容的范围将仅仅通过被附于此的权利要求以及通过其等同物来限定。
此外，在描述本公开内容的代表性实施例时，说明书可能已经将本公开内容的方法和/或过程呈现为特定的步骤序列。然而，在方法或过程不依赖于本文中所阐明的特定步骤次序的意义上，所述方法或过程不应被限于所描述的特定的步骤序列。如本领域普通技术人员将领会的，其它的步骤序列可以是可能的。因此，在说明书中所阐明的特定的步骤次序不应当被解释为对权利要求的限制。另外，针对本公开内容的方法和/或过程的权利要求不应当被限制于其步骤按所撰写的次序的执行，并且本领域技术人员可以容易地领会到序列可以变化并且仍保持在本公开内容的精神和范围内。

Claims (15)

1.一种用于确定试剂浓度的方法，包括：
将样本浸入在试剂中；
获得针对浸入在试剂中的样本的实验飞行时间；
提供多个候选扩散率常量；
模拟向样本中的扩散的空间相关性以生成在多个时间点上的模型飞行时间，其中针对每个候选扩散率常量实施所述模拟；
将模型飞行时间与实验飞行时间进行比较以获得误差函数，其中误差函数的最小值产生针对样本的扩散率常量；
提供多个候选组织孔隙度；
模拟向样本中的扩散的空间相关性，以生成在多个时间点上的模型飞行时间，其中针对每个候选孔隙度实施所述模拟；
将模型飞行时间与实验飞行时间进行比较以获得第二误差函数，其中误差函数的最小值产生样本的孔隙度；以及
使用针对样本的扩散率常量和样本的孔隙度计算在特定时间在样本内一个或多个特定空间点处的试剂浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，模拟向样本中的扩散的空间相关性以生成在多个时间点上的模型飞行时间利用针对样本的扩散率常量。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中计算在特定时间在样本内一个或多个特定空间点处的试剂浓度包括：根据扩散率常量和时间计算在所述特定时间在所述一个或多个特定空间点处的百分比扩散，以及在以下方程中使用百分比扩散来产生所述浓度
Figure 826977DEST_PATH_IMAGE001
。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述试剂选自由以下各项组成的分组：甲醛、乙醇、二甲苯和石蜡。
5.根据权利要求4所述的方法，其中石蜡的分子量选自由以下各项组成的分组：数目平均分子量、重量平均分子量、粘度平均分子量和它们的组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂包括甲醛溶液，并且其中一旦在所述样本中心处的点处甲醛溶液的浓度至少高于90mM，就从所述试剂中移除所述样本。
7.根据权利要求6所述的方法，其中将样本浸入在所述试剂中作为冷步骤被执行，并且一旦在所述样本中心处的所述点处所述浓度至少高于90mM，所述试剂的温度就在热步骤中被提升。
8.一种用于组织处理的系统，包括：
声学监视设备，其检测已经行进通过组织样本的声波；
处理器，通信地耦合到声学监视设备，其中所述处理器被配置为基于飞行时间评估声波的速度；
存储器，其通信地耦合到处理器，所述存储器具有存储在其上的指令，所述指令在被执行时使处理器执行包括以下各项的操作：为组织样本设置候选扩散率常量的范围；针对多个时间点并且针对一系列候选扩散率点中的第一个来模拟组织样本内的试剂的空间相关性；基于所述空间相关性来确定建模的飞行时间；针对所述多个扩散率常量中的每一个重复空间相关性模拟；确定针对所述多个扩散率常量的建模的飞行时间与针对组织样本的实验飞行时间之间的误差，其中基于所述误差的误差函数的最小值产生针对组织样本的扩散率常量；设置针对组织样本的、包括多个候选孔隙度的候选孔隙度范围；基于样本的扩散率常量以及所述多个候选孔隙度中的第一个来确定第二建模的飞行时间；以及确定实验飞行时间与第二建模的飞行时间之间的第二误差；重复确定针对所述多个候选孔隙度中其它孔隙度的第二建模的飞行时间以及对应的第二误差，其中误差的最小值标识样本的孔隙度；以及根据所标识的扩散率常量和所标识的样本的孔隙度来计算在特定时间在样本内试剂浓度的空间相关性。
9.根据权利要求8所述的系统，其中所述存储器还包括指令，所述指令在被执行时输出在特定时间处在所述样本中心处的试剂浓度。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述存储器还包括指令，所述指令在被执行时使得当在组织中心处的试剂浓度超过预定浓度阈值的时候终止利用试剂对样本的注入。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述试剂包括甲醛，并且所述预定浓度阈值为至少90mM。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的系统，其中所述系统还包括警报器，并且所述存储器还包括指令，所述指令在由所述处理器执行时使得一旦在组织中心处的试剂浓度超过预定阈值所述警报器就发出声音。
13.根据权利要求10或11所述的系统，其中所述系统还包括用于从所述试剂中移除所述样本的机构，并且所述存储器还包括指令，所述指令当在组织中心处的试剂浓度超过预定阈值的时候使所述机构从所述试剂中移除所述样本。
14.根据权利要求10所述的系统，其中所述试剂包括温度低于大约20℃的冷的甲醛溶液，并且所述注入的终止包括将所述甲醛溶液的温度提升至处于大约20℃至大约55℃之间的温度，以提供热的甲醛溶液，其中所述系统还包括加热器，用于将冷的甲醛溶液加热至热的甲醛溶液，并且其中存储器还包括指令，所述指令使加热器当组织中心处的甲醛浓度超过大约90mM时加热冷的甲醛溶液以形成热的甲醛溶液。
15.一种有形非暂时性计算机可读介质，具有存储在其上的指令，所述指令使处理器执行包括权利要求1的步骤的操作。
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