CN117651521A - 对组织固定时间的实时预测 - Google Patents

对组织固定时间的实时预测 Download PDF

Info

Publication number
CN117651521A
CN117651521A CN202280049614.1A CN202280049614A CN117651521A CN 117651521 A CN117651521 A CN 117651521A CN 202280049614 A CN202280049614 A CN 202280049614A CN 117651521 A CN117651521 A CN 117651521A
Authority
CN
China
Prior art keywords
calculated
tof
confidence
time
biological sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280049614.1A
Other languages
English (en)
Inventor
D·R·宝尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ventana Medical Systems Inc
Original Assignee
Ventana Medical Systems Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ventana Medical Systems Inc filed Critical Ventana Medical Systems Inc
Publication of CN117651521A publication Critical patent/CN117651521A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
    • G01N29/04—Analysing solids
    • G01N29/07—Analysing solids by measuring propagation velocity or propagation time of acoustic waves
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
    • G01N29/02—Analysing fluids
    • G01N29/024—Analysing fluids by measuring propagation velocity or propagation time of acoustic waves
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
    • G01N29/44—Processing the detected response signal, e.g. electronic circuits specially adapted therefor
    • G01N29/4409—Processing the detected response signal, e.g. electronic circuits specially adapted therefor by comparison
    • G01N29/4427—Processing the detected response signal, e.g. electronic circuits specially adapted therefor by comparison with stored values, e.g. threshold values
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
    • G01N29/44—Processing the detected response signal, e.g. electronic circuits specially adapted therefor
    • G01N29/4472—Mathematical theories or simulation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B8/00—Diagnosis using ultrasonic, sonic or infrasonic waves
    • A61B8/52—Devices using data or image processing specially adapted for diagnosis using ultrasonic, sonic or infrasonic waves
    • A61B8/5215—Devices using data or image processing specially adapted for diagnosis using ultrasonic, sonic or infrasonic waves involving processing of medical diagnostic data
    • A61B8/5223—Devices using data or image processing specially adapted for diagnosis using ultrasonic, sonic or infrasonic waves involving processing of medical diagnostic data for extracting a diagnostic or physiological parameter from medical diagnostic data
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2291/00—Indexing codes associated with group G01N29/00
    • G01N2291/01—Indexing codes associated with the measuring variable
    • G01N2291/011—Velocity or travel time
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2291/00—Indexing codes associated with group G01N29/00
    • G01N2291/02—Indexing codes associated with the analysed material
    • G01N2291/024—Mixtures
    • G01N2291/02475—Tissue characterisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2291/00—Indexing codes associated with group G01N29/00
    • G01N2291/02—Indexing codes associated with the analysed material
    • G01N2291/025—Change of phase or condition
    • G01N2291/0256—Adsorption, desorption, surface mass change, e.g. on biosensors

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Acoustics & Sound (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mathematical Optimization (AREA)
  • Mathematical Physics (AREA)
  • Pure & Applied Mathematics (AREA)
  • Mathematical Analysis (AREA)
  • Algebra (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本公开提供了有助于预测一种或多种流体将最优地扩散至生物学样本例如源自人类受试者的组织样品中的估计时间的系统(200)及方法。在一些实施方案中，本公开提供了有助于预测直至生物学样本将以一种或多种固定剂最优地固定为止的估计时间的系统(200)及方法。在其他实施方案中，对所述生物学样本将被最优地固定的未来时间的预测是基于在所述生物学样本的固定期间的特定时间点获取的飞行时间数据，所述飞行时间数据被认为足够准确以预测所述生物学样本将以固定剂最优地扩散的时间。

Description

对组织固定时间的实时预测
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年5月13日提交的美国临时专利申请第63/187,976号的申请日的权益，该申请的公开内容据此通过引用以其整体并入本文。
背景技术
正确的医疗诊断和患者安全要求在染色前正确地固定组织样品。因此，肿瘤学家和病理学家已经制定了用于适当固定组织样品的操作指南。举例来说，根据美国临床肿瘤学会(ASCO)，针对用于HER2免疫组化分析的中性缓冲福尔马林液中的固定持续时间的现行指南为至少6小时，优选更多，并且多至72小时。
在未充分暴露于或过度暴露于福尔马林的组织中观察到几种效应。如果组织样品没有用福尔马林处理足够长的时间，当组织经受标准组织处理时，组织形态通常非常差。例如，在固定不充分的组织中，随后暴露于乙醇会使细胞结构收缩并使细胞核凝聚，因为组织将没有机会形成适当的交联晶格。如果对未固定下的组织染色，诸如使用苏木精和曙红(H&E)染色时，在细胞和组织结构之间观察到许多白色空间；使用苏木精染液时，凝聚的细胞核和细胞质损失以及样品呈现粉红色且不均衡。暴露于固定剂诸如福尔马林持续过长时间段的组织通常不会很好地用于随后的免疫组化过程，大概是因为核酸和/或蛋白质变性和降解。结果，这些组织的最佳抗原修复条件不能正常发挥作用，因此组织样品看起来是染色不充分的。
监测固定剂在整个组织样品中的扩散对于以下是有用的：确定固定剂是否已输注至整个组织样品中，由此最小化或限制固定不充分的组织或过度固定的组织。如果，举例来说，组织是“过度固定的”，则可能难以将处理液体扩散在整个组织中，因为交联分子的过于广泛的网络限制用于扩散的路径。另一方面，如果组织固定不充分，则可能使组织降解，例如通过自催化破坏，导致组织和细胞形态的丧失以及具有诊断意义的蛋白质和核酸标志物的丧失。已利用算法来确定为了进行正确固定及由此确保正确和理想的染色，生物学样本必须用固定剂扩散至何种程度。举例来说，美国专利号10,620,037(其公开内容据此通过引用以其整体并入本文)描述了用于使用与扩散模型相关的基于声学飞行时间(TOF)的信息来算出样品的扩散常数(即，扩散系数)以重建生物学样本的扩散系数的系统和计算机实现方法。专利'037进一步描述了一种用于对浸没在流体内的生物学样本确定真实扩散常数的方法，该方法包括模拟在多个时间点上以及针对多个候选扩散常数中的每一者的进入样品的扩散的空间相依性，以生成模型TOF，以及将模型TOF与实验TOF进行比较以获得误差函数，其中该误差函数的最小值产生真实扩散常数。
举另一示例来说，PCT公开号WO/2016/097164(其公开内容特此通过引用以其整体并入本文)描述了一种用于准确地算出声学信号穿过材料(例如，生物学样本)的TOF的计算机实现方法，其包括获得声学信号的频率扫描的误差函数，以及生成误差函数的包络，其中飞行时间是基于误差函数的最小值。举例来说，出版物'164描述了通过三种方法中的一种来计算声波的TOF，即：(1)算出误差函数的包络，实现误差函数的最小值的更准确确定；(2)将超声频率扫描数据拟合至多个经模拟的TOF频率扫描，其中直接由最佳拟合算出TOF；以及/或者(3)对超声频率扫描的各个线性部分进行线性回归分析，实现对频率扫描的可以表示算出TOF方面的误差的异常区段的识别。
在整个实验中，随着持续地收集数据点，固定剂在整个组织样本中的扩散速率可能显著地变化。此变化性部分是由于TOF系统中所固有的噪声，但也是由于组织样本所固有的变化性(例如，零星扩散、组织变形等)，它掩盖了组织样本的真实扩散信号。期望拥有能够实时预测TOF信号是否足够有效使得TOF数据可以用于确定组织样本的固定的时间的模型。
发明内容
生物学样本(例如，组织样品或细胞学样品)的固定的变化可能影响下游生物标志物标记和/或染色过程，这可能导致非结论性结果和/或误诊。因此，将有利的是，拥有便于确定生物学样本是否已被充分固定使得可以对经充分固定的样本进行下游染色和/或标记过程的系统和/或方法。
申请人已经开发出便于确定经测量的TOF信号是否准确地反映流体、试剂或溶液(下文统称为“流体”)在整个生物学样本中的实际扩散速率的系统和方法。如此，本公开提供了便于预测流体将最优地扩散至生物学样本中的估计时间(举例来说，特定流体在生物学样本中的特定位置诸如生物学样本的中心区域处达到特定浓度将花费的时间)的系统和方法。在一些实施例中，流体包括一种或多种固定剂(包括本文所描述的那些中的任一种)。在其他实施例中，流体包括脱水剂(诸如经分级的乙醇)、澄清剂(诸如二甲苯)和用于包埋生物学样本的石蜡。本文进一步描述了又一些流体。虽然本公开的某些实施例可以描述估计生物学样本在浸没在一种或多种固定剂中时可以被最佳固定的时间，但是本公开适用于预测任何流体(例如，乙醇、二甲苯、石蜡)最优地扩散至生物学样本中的时间。
在一些实施例中，系统和方法分析经获得的TOF信号的分量以确定经获得的TOF信号是否被认为足够准确以便可以预测流体最优地扩散至生物学样本中的时间。在以一种或多种固定剂来固定生物学样本的上下文中，在一些实施例中，系统和方法分析经获得的TOF信号的不同分量以确定所获得的TOF信号是否被认为足够准确以便预测生物学样本将以一种或多种固定剂最优地扩散的时间，例如，在生物学样本内或在整个生物学样本中(诸如在生物学样本的中心处)达到一定浓度或量的一种或多种固定剂所需的时间。
鉴于前述内容，本公开的实施例中的至少一些涉及用于通过生物学样本(诸如包括在容器中的生物学样本，诸如活检胶囊或活检盒)获取TOF数据并(诸如实时地)分析经获取的TOF数据的系统和方法。在一些实施例中，分析经获取的TOF数据以确定在特定时间点的经获取的TOF数据是否足够准确以便可以使用在该特定时间点的TOF数据来计算流体将最优地扩散至生物学样本中的时间或生物学样本将(诸如以本文所描述的固定剂中的一种或多种)最优地固定的时间。
鉴于前述内容，本公开的一个方面为一种估计流体将理想地扩散至浸没在流体中的生物学样本中或扩散在整个生物学样本中的时间的方法，该方法包括：在沿着浸没在流体中的生物学样本的一个或多个位置处获取声学数据；从经获取的声学数据得出飞行时间(TOF)数据，其中经得出的TOF数据包括一个或多个经计算的TOF数据点、一个或多个经计算的TOF曲线和/或一个或多个经计算的衰减常数；基于经得出的TOF数据来同时计算至少两个置信度模型(例如，其中该至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和/或未来置信度模型)；确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点；以及基于与经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的经确定的时间点相对应的TOF数据，估计流体将理想地扩散至生物学样本中的时间。
在一些实施例中，流体包含一种或多种固定剂。在一些实施例中，一种或多种固定剂为醛基固定剂。在一些实施例中，流体选自由乙醇、二甲苯和石蜡组成的组。
在一些实施例中，经计算的至少两个置信度模型包括过去置信度模型和当前置信度模型。在一些实施例中，经计算的至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型中的每一者。
在一些实施例中，当与多个经得出的TOF数据点相对应的预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数各自经确定在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，经计算的过去置信度模型满足预定的过去置信度模型阈值标准。在一些实施例中，确定预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数是否在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内包括进行收敛测试。在一些实施例中，进行收敛测试包括：(i)计算候选经计算的TOF数据点的候选衰减常数以提供理论值；(ii)基于与随时间计算且在候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点相对应的预定数量的经计算的衰减常数来算出平均衰减常数，以提供实验值；(iii)基于经计算的理论值和算出的实验值来确定实际百分比误差；以及(iv)将确定的百分比误差与预定的阈值百分比值进行比较。在一些实施例中，平均衰减常数是通过以下得出的：(i)检索针对候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点中的每一者的经计算的衰减常数；以及(ii)对检索到的经计算的衰减常数中的每一者求平均。在一些实施例中，候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点为至少约3个。在一些实施例中，预定的阈值百分比值小于约5％。在一些实施例中，预定的阈值百分比值小于约2.5％。
在一些实施例中，当算出的当前置信区间低于预定的当前置信度模型阈值时，经计算的当前置信度模型满足预定的当前置信度模型阈值标准。在一些实施例中，当前置信区间是通过以下算出的：(a)使用经计算的TOF曲线的经计算的TOF数据点的部分或全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；以及(b)基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间。
在一些实施例中，当算出的未来置信区间低于预定的未来置信度模型阈值时，经计算的未来置信度模型满足预定的未来置信度模型阈值标准。在一些实施例中，未来置信区间是通过以下算出的：(a)使用经计算的TOF曲线的经计算的TOF数据点的全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；(b)从时间零至未来时间点基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间；以及(c)算出TOF曲线的平均置信区间。
在一些实施例中，方法进一步包括针对至少一种生物标志物的存在对生物学样本进行染色。在一些实施例中，至少一种生物标志物为癌症生物标志物。
在一些实施例中，方法进一步包括对针对至少一种生物标志物的存在而染色的生物学样本进行评分。
在一些实施例中，方法进一步包括针对至少两种生物标志物的存在对生物学样本进行染色。在一些实施例中，针对至少两种生物标志物的存在对源自生物学样本的单个连续切片进行染色。
本公开的另一方面为一种预测浸没在一种或多种固定剂中的生物学样本的固定完成的时间的方法，该方法包括：在沿着浸没在一种或多种固定剂中的生物学样本的一个或多个位置处获取声学数据；从经获取的声学数据得出飞行时间(TOF)数据，其中经得出的TOF数据包括一个或多个经计算的TOF数据点、一个或多个经计算的TOF曲线和/或一个或多个经计算的衰减常数；基于经得出的TOF数据来同时计算至少两个置信度模型，其中该至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型；确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点；以及基于与经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的经确定的时间点相对应的TOF数据，预测固定完成的时间。
在一些实施例中，生物学样本首先浸没在温度低于约15℃，诸如在14℃或更低、在13℃或更低、在12℃或更低、在11℃或更低、在10℃或更低、在9℃或更低、在8℃或更低、在7℃或更低、在6℃或更低、在5℃或更低、在4℃或更低的一种或多种固定剂中。在一些实施例中，在一种或多种固定剂(被动或主动)温热至大于约15℃的温度(诸如室温)之后获取声学数据。在一些实施例中，在一种或多种固定剂(被动或主动)温热至大于约25℃的温度之后获取声学数据。在一些实施例中，在一种或多种固定剂(被动或主动)温热至大于约35℃的温度之后获取声学数据。在一些实施例中，在一种或多种固定剂(被动或主动)温热至大于约45℃的温度之后获取声学数据。在一些实施例中，在一种或多种固定剂(被动或主动)温热至介于约20℃与约50℃之间的温度之后获取声学数据。在一些实施例中，在一种或多种固定剂(被动或主动)温热至介于约20℃与约45℃之间的温度之后获取声学数据。
在一些实施例中，经计算的至少两个置信度模型包括过去置信度模型和当前置信度模型。在一些实施例中，经计算的至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型中的每一者。
在一些实施例中，当与多个经得出的TOF数据点相对应的预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数各自经确定在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，经计算的过去置信度模型满足预定的过去置信度模型阈值标准。在一些实施例中，确定预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数是否在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内包括进行收敛测试。在一些实施例中，进行收敛测试包括：(i)计算候选经计算的TOF数据点的候选衰减常数以提供理论值；(ii)基于与随时间计算且在候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点相对应的预定数量的经计算的衰减常数来算出平均衰减常数，以提供实验值；(iii)基于经计算的理论值和算出的实验值来确定实际百分比误差；以及(iv)将确定的百分比误差与预定的阈值百分比值进行比较。在一些实施例中，平均衰减常数是通过以下得出的：(i)检索针对候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点中的每一者的经计算的衰减常数；以及(ii)对检索到的经计算的衰减常数中的每一者求平均。在一些实施例中，候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点为至少3个。在一些实施例中，预定的阈值百分比值小于约5％。在一些实施例中，预定的阈值百分比值小于约2.5％。
在一些实施例中，当算出的当前置信区间低于预定的当前置信度模型阈值时，经计算的当前置信度模型满足预定的当前置信度模型阈值标准。在一些实施例中，当前置信区间是通过以下算出的：(a)使用经计算的TOF曲线的经计算的TOF数据点的部分或全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；以及(b)基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间。
在一些实施例中，当算出的未来置信区间低于预定的未来置信度模型阈值时，经计算的未来置信度模型满足预定的未来置信度模型阈值标准。在一些实施例中，未来置信区间是通过以下算出的：(a)使用经计算的TOF曲线的经计算的TOF数据点的全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；(b)从时间零至未来时间点基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间；以及(c)算出TOF曲线的平均置信区间。
在一些实施例中，方法进一步包括针对至少一种生物标志物的存在对生物学样本进行染色。在一些实施例中，至少一种生物标志物为癌症生物标志物。
在一些实施例中，方法进一步包括对针对至少一种生物标志物(包括本文列举的任何生物标志物)的存在而染色的生物学样本进行评分。
在一些实施例中，方法进一步包括针对至少两种生物标志物的存在对生物学样本进行染色。在一些实施例中，针对至少两种生物标志物的存在对源自生物学样本的单个连续切片进行染色。
本公开的另一方面为一种非暂时性计算机可读介质，其存储用于估计流体将理想地扩散至浸没在流体中的生物学样本中的时间的指令，该指令包括：从经获取的声学数据得出飞行时间(TOF)数据；基于经得出的TOF数据来同时计算至少两个置信度模型，其中该至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型；确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点；以及基于与经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的经确定的时间点相对应的TOF数据，估计流体将理想地扩散至生物学样本中的时间。
在一些实施例中，方法进一步包括用于计算一个或多个衰减常数的指令。在一些实施例中，其进一步包括用于进行收敛测试的指令。在一些实施例中，收敛测试包括：(i)计算候选经计算的TOF数据点的候选衰减常数以提供理论值；(ii)基于与随时间计算且在候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点相对应的预定数量的经计算的衰减常数来算出平均衰减常数，以提供实验值；(iii)基于经计算的理论值和算出的实验值来确定实际百分比误差；以及(iv)将经确定的百分比误差与预定的阈值百分比值进行比较。
本公开的另一方面为一种非暂时性计算机可读介质，其存储用于确定至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点的指令，该指令包括：(a)从浸没在流体中的生物学样本的经获取的声学数据得出TOF数据；(b)连续计算过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型，直至过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型中的每一者同时且独立地满足预定的阈值标准；以及(c)识别使过去置信度模型、现在置信度模型和未来置信度模型同时且独立地满足的与经得出的TOF数据相对应的时间点。在一些实施例中，随着接收或获取新数据，对模型进行连续计算，这可以在每约0.2秒与约120秒之间进行，如本文所描述。
在一些实施例中，当与多个经得出的TOF数据点相对应的预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数各自经确定在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，经计算的过去置信度模型满足预定的过去置信度模型阈值标准。在一些实施例中，确定预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数是否在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内包括进行收敛测试。在一些实施例中，进行收敛测试包括：(i)计算候选经计算的TOF数据点的候选衰减常数以提供理论值；(ii)基于与随时间计算且在候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点相对应的预定数量的经计算的衰减常数来算出平均衰减常数，以提供实验值；(iii)基于经计算的理论值和算出的实验值来确定实际百分比误差；以及(iv)将确定的百分比误差与预定的阈值百分比值进行比较。在一些实施例中，平均衰减常数是通过以下得出的：(i)检索针对候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点中的每一者的经计算的衰减常数；以及(ii)对检索到的经计算的衰减常数中的每一者求平均。
在一些实施例中，当算出的当前置信区间低于预定的当前置信度模型阈值时，经计算的当前置信度模型满足预定的当前置信度模型阈值标准。在一些实施例中，当前置信区间是通过以下算出的：(a)使用经计算的TOF曲线的经计算的TOF数据点的部分或全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；以及(b)基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间。
在一些实施例中，当算出的未来置信区间低于预定的未来置信度模型阈值时，经计算的未来置信度模型满足预定的未来置信度模型阈值标准。在一些实施例中，未来置信区间是通过以下算出的：(a)使用经计算的TOF曲线的经计算的TOF数据点的全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；(b)从时间零至未来时间点基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间；以及(c)算出TOF曲线的平均置信区间。
在一些实施例中，非暂时性计算机可读介质进一步包括用于估计流体理想地扩散至生物学样本中的时间的指令。在一些实施例中，流体包含一种或多种固定剂。在一些实施例中，流体选自由乙醇、二甲苯和石蜡组成的组。
本公开的另一方面为一种用于估计流体将理想地扩散至浸没在流体中的生物学样本中的时间的系统，该系统包括：(i)一个或多个处理器，以及(ii)耦接至一个或多个处理器的一个或多个存储器，一个或多个存储器用以存储计算机可执行指令，该计算机可执行指令当由一个或多个处理器执行时，使系统进行操作，该操作包括：从在沿着浸没在流体中的生物学样本的一个或多个位置处获取的声学数据得出飞行时间(TOF)数据；基于经得出的TOF数据来同时计算至少两个置信度模型，其中该至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型；确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点；以及基于与经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的经确定的时间点相对应的TOF数据，估计流体将理想地扩散至生物学样本中的时间。
在一些实施例中，流体包含一种或多种固定剂。在一些实施例中，流体选自由乙醇、二甲苯和石蜡组成的组。
在一些实施例中，当与多个经得出的TOF数据点相对应的预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数各自经确定在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，经计算的过去置信度模型满足预定的过去置信度模型阈值标准。在一些实施例中，确定预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数是否在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内包括进行收敛测试。在一些实施例中，进行收敛测试包括：(i)计算候选经计算的TOF数据点的候选衰减常数以提供理论值；(ii)基于与随时间计算且在候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点相对应的预定数量的经计算的衰减常数来算出平均衰减常数，以提供实验值；(iii)基于经计算的理论值和算出的实验值来确定实际百分比误差；以及(iv)将确定的百分比误差与预定的阈值百分比值进行比较。在一些实施例中，平均衰减常数是通过以下得出的：(i)检索针对候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点中的每一者的经计算的衰减常数；以及(ii)对检索到的经计算的衰减常数中的每一者求平均。在一些实施例中，候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点为至少3个。在一些实施例中，预定的阈值百分比值小于约5％。在一些实施例中，预定的阈值百分比值小于约2.5％。
在一些实施例中，当算出的当前置信区间低于预定的当前置信度模型阈值时，经计算的当前置信度模型满足预定的当前置信度模型阈值标准。在一些实施例中，当前置信区间是通过以下算出的：(a)使用经计算的TOF曲线的经计算的TOF数据点的部分或全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；以及(b)基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间。
在一些实施例中，当算出的未来置信区间低于预定的未来置信度模型阈值时，经计算的未来置信度模型满足预定的未来置信度模型阈值标准。在一些实施例中，未来置信区间是通过以下算出的：(a)使用经计算的TOF曲线的经计算的TOF数据点的全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；(b)从时间零至未来时间点基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间；以及(c)算出TOF曲线的平均置信区间。
申请人惊奇地发现，本公开的系统和方法提供了对生物学样本的固定的时间的准确预测。
附图说明
有关对本公开特征的一般理解，请参考附图。在附图中，整个附图使用相同的附图标记来识别相同的元素。
图1A和图1B展现了提供根据本公开的一个实施例的预测流体(例如，固定剂)进入生物学样本中的扩散时间的本发明所公开的方法的步骤的概览的流程图。
图2展示了根据一些实施例的包括计算机系统的代表性数字病理系统。
图3展现了根据一些实施例的可以在流体扩散和/或固定预测系统中使用的各种模块。
图4展示了根据本公开的一个实施例的算出生物学样本将被最优地固定的时间的方法。
图5A至图5F提供了时间过程，示出了在持续a)0.4小时、b)0.8小时、c)1.2小时、d)2.2小时、e)2.83小时和4.84小时扫描扁桃体组织时如何算出标准。顶部图：TOF曲线，其中黑色圆圈表示单个TOF数据点，最佳拟合曲线用黑色实线来描绘；95％置信区间用虚线或点线来描绘。中上图：TOF曲线的95％置信区间的宽度。中下图：使用经获取的最新数据点算出的候选衰减常数。底部图：衰减常数的95％置信区间。
图6A至图6B展示了确定TOF曲线对于如图5所描绘的同一扁桃体组织样本是否有效的示例。a)顶部图：TOF曲线，其中黑色圆圈表示单个TOF数据点，最佳拟合曲线用黑色实线来描绘；95％置信区间用虚线/点线来描绘。中上图：TOF曲线的95％置信区间的宽度。中下图：使用经获取的最新数据点算出的候选衰减常数。底部图：衰减常数的95％置信区间。b)实验中针对所有时间点的每个单独置信度模型的图，其中高值指示满足标准，并且低值指示不满足标准。在此具体示例中，必须同时满足所有三个标准，TOF信号才被认为表示组织的实际扩散剖面。(顶部图为未来置信度模型，中间图为过去置信度模型，底部图为当前置信度模型)。
图7A和图7B描绘了确定TOF曲线在结肠组织中是否有效的示例。a)顶部图：TOF曲线，其中黑色圆圈表示单个TOF数据点，最佳拟合曲线用黑色实线来描绘；95％置信区间用虚线/点线来描绘。中上图：TOF曲线的95％置信区间的宽度。中下图：使用经获取的最新数据点算出的候选衰减常数。底部图：衰减常数的95％置信区间。b)实验中针对所有时间点的每个单独置信度模型的图，其中高值指示满足标准，并且低值指示不满足标准。必须同时满足所有三个标准，TOF信号才被视为表示组织的实际扩散剖面。(顶部图为未来置信度模型，中间图为过去置信度模型，底部图为当前置信度模型)。
图8A和图8B提供了确定TOF曲线在肾脏组织中是否有效的示例。a)顶部图：TOF曲线，其中黑色圆圈表示单个TOF数据点，最佳拟合曲线用黑色实线来描绘；95％置信区间用虚线/点线来描绘。中上图：TOF曲线的95％置信区间的宽度。中下图：使用经获取的最新数据点算出的候选衰减常数。底部图：衰减常数的95％置信区间。b)实验中针对所有时间点的每个单独置信度模型的图，其中高值指示满足标准，并且低值指示不满足标准。在此具体示例中，必须同时满足所有三个标准，TOF信号才被认为表示组织的实际扩散剖面。(顶部图为未来置信度模型，中间图为过去置信度模型，底部图为当前置信度模型)。
图9A至图9B示出了确定TOF曲线在乳腺组织中是否有效的示例。a)顶部图：TOF曲线，其中黑色圆圈表示单个TOF数据点，最佳拟合曲线用黑色实线来描绘；95％置信区间用虚线/点线来描绘。中上图：TOF曲线的95％置信区间的宽度。中下图：使用经获取的最新数据点算出的候选衰减常数。底部图：衰减常数的95％置信区间。b)实验中针对所有时间点的每个单独置信度模型的图，其中高值指示满足标准，并且低值指示不满足标准。必须同时满足所有三个标准，TOF信号才被视为表示组织的实际扩散剖面。(顶部图为未来置信度模型，中间图为过去置信度模型，底部图为当前置信度模型)。
图10A和图10B提供了来自TOF分析的结果。a)针对多个组织的TOF扩散数据的分布，呈现了声学技术跨多种组织类型奏效。b)标准开发的累积结果，其中用经提出的确定TOF曲线何时有效的方法对跨多种组织类型的105个组织进行分析。在水平时间上绘制有效拟合时间，而在竖直轴线上绘制算出的最优固定时间。
图11A和图11B提供了对所公开的置信度模型的准确度的分析。a)模型预测误差的分布，算出为在确定信号有效时的算出的最优扩散时间与实验的结束之间的差异。b)研究中所有105个组织的针对整个TOF信号的平均95％置信区间以及在模型认为信号有效时的衰减常数。
图12A和图12B展示了NBF扩散时间与染色质量的相关性。a)在NBF中以不同冷浸时间获取的H&E图像。根据基于H&E的形态学，1.5小时、3小时和5小时的冷浸泡时间分别产生严重染色、临界染色和示例性染色。b)将组织浸没在NBF中后立即进行主动NBF扩散的TOF扩散曲线的示例描绘，显示有快速变化的TOF信号。相反，数小时后，随着组织和NBF接近渗透平衡，组织的扩散速率显著减慢。
图13A至图13E展示了用以预测染色质量的扩散度量的调整速率。a)扁桃体组织在冷NBF中3小时和5小时的标准化斜率，此时预计组织分别具有临界染色和理想染色。不同阈值扩散速率，-7.4％/hr、-8.0％/hr和-10.4％/hr，分别用3、2和1来表示。b)来自6mm扁桃体的平均TOF信号，其中指示了阈值扩散速率的近似位置。c)至e)三个经评估的阈值扩散速率中的每一者的预估完成时间的图。
图14A至图14E展现了用以验证TOF扩散信号的统计模型的示例。a)TOF扩散曲线，呈现了验证算法在实时数据获取期间的工作方式。当收集数据时，三种统计算法(本文也称为“置信度模型”)持续监测信号的保真度，侧重于数据的过去方面、当前方面和未来方面(过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型)。满足每种算法(置信度模型)的时间在图上用水平实线按照收敛时间的次序进行标记。一旦满足数据保真度的所有三个条件，数据就表示组织的实际扩散速率，并且算出组织所需的扩散时间。当前算法、未来算法和过去算法的详细视图分别在图14B、14C和14D中示出。e)105个组织的验证扩散信号的时间与预测固定时间的关系图。平均来说(图14E中的星号)，对于检测到的扩散剖面，需要2.04小时来收敛至组织的实际扩散速率上，并且预测组织在冷福尔马林中需要2.96小时的扩散。
图15提供了用于分析福尔马林扩散对FOXP3的功能性IHC染色的影响的径向图像分析工作流程的示意图。
图16展现了不同固定方案的染色结果的比较示例。左列)组织的明视野全载玻片扫描图。左中列)每个组织的FOXP3阳性热图。右中列)每个组织内的径向区的图形描绘，指示染色不足和正确染色的区域，如边缘值的50％内的DAB阳性所定义。右列)FOXP3染色与距组织的边缘的距离的直方图。
图17A至图17C展示了不同固定方案的FOXP3染色的定量分析。a)正确FOXP3染色的穿透深度，如定义为染色降至其边缘值一半时进入组织的距离。b)组织百分比，显示了正确FOXP3染色。c)标准化FOXP3表达与进入组织的距离的图。实线指示根据Welch的2侧t检验，p<0.002。
图18A至图18C描绘了不同固定方案的定量bcl-2表达。a)正确bcl-2染色的穿透深度。b)正确bcl-2染色的面积。c)标准化bcl-2表达与进入组织的距离的图。
图19A至图19B提供了不同固定方案的染色强度的定量分析。a)FOXP3染色的标准化强度与进入组织的距离的图。b)bcl-2染色的标准化强度与进入组织的距离的图。
图20描绘了基于所开发的预测算法的针对多种组织类型的预估最优固定时间。
图21提供了展示在本公开的一些方面中过去置信度模块所承担的步骤的流程图。
图22提供了展示在本公开的一些方面中当前置信度模块所承担的步骤的流程图。
图23提供了展示在本公开的一些方面中未来置信度模块所承担的步骤的流程图。
具体实施方式
还应该理解的是，除非指明是相反情况，否则在本文所要求保护的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不必限于所述方法的所述步骤或动作的所述顺序。
说明书中对“一个实施例”、“实施例”、“说明性实施例”等的引用表示所描述的实施例可以包括特定特征、结构或特性，但是每个实施例可以必定或可以不一定包括该特定特征、结构或特性。此外，这样的短语不一定指相同的实施例。此外，当结合实施例描述具体特征、结构或特性时，需要注意的是，无论是否明确说明，本领域技术人员均知晓结合其他实施例来实现上述特征、结构或特性的效果。
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“该/所述”包括复数个指代物。同样，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“包括”定义为包容性，如“包括A或B”是指包括A、B或A和B。
如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为与上文定义的“和/或”具有相同的含义。举例来说，在分开列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为具有包括性，例如，包括多个元素或元素列表中的至少一个元素，但也包括多于一个元素，以及任选地包括额外的未列出的项目。只有指明与之相反的术语，如“仅其中之一”或“恰好其中之一”，或者在权利要求中使用的“由…组成”，将指包含若干元素或元素列表中的恰好一个元素。一般来说，本文使用的术语“或者”只有在前面有诸如“任一”、“其中之一”、“仅其中之一”或“恰好其中之一”等排他性术语时，才应解释为表示排他性的替代选择(例如，“一个或另一个，但不是两个”)。在权利要求书中使用的“基本上由...组成”应具有在专利法领域使用的普通含义。
“包括”、“包含”、“具有”等术语可互换使用，且含义相同。类似地，“包括”、“包含”、“具有”等可互换使用并且具有相同的含义。具体而言，每个术语的定义都与普通美国专利法对“包括”的定义一致，因此每个术语都可理解为一个开放性术语，其含义为“至少以下”，并且也可理释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如“具有组件a、b和c的装置”是指所述装置至少包括组件a、b和c。同样，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”是指所述方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管本文可以特定的顺序概述步骤和过程，但是本领域技术人员将认识到，所述顺序步骤和过程可能会有所不同。
如本文在说明书和权利要求书中所用，就一个或多个元素的列表而言，短语“至少一个”应理解为选自元素列表中任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，也不排除元素列表中的任何元素组合。除了在短语“至少一个”所涉及的元素列表中具体确定的元素之外，该定义还允许其他元素任选地存在，无论这些元素与具体确定的元素相关与否。因此，作为一个非限制性示例，“A和B中的至少一者”(或者等效地，“A或B中的至少一者”，或者等效地，“A和/或B中的至少一者”)在一个实施例中可以指至少一个，任选地包括多于一个的A，不存在B(并且任选地包括除B以外的元素)；在另一实施例中，指至少一个，任选地包括多于一个的B，不存在A(并且任选地包括除A以外的元素)；在又一实施例中，指至少一个，任选地包括多于一个A，以及至少一个，任选地包括多于一个的B(并且任选地包括其他元素)；等等。
如本文所用，术语“生物学样本”、“组织样本”、“组织样品”或类似的术语是指从包括病毒在内的任何生物体中获得的包括生物分子(诸如蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其组合)在内的任何样品。其他生物体的实例包括哺乳动物(例如人类；兽类动物，如猫、狗、马、牛和猪；以及实验室动物，如小鼠、大鼠和灵长类动物)、昆虫、环节动物、蛛形纲动物、有袋类动物、爬行类动物、两栖类动物、细菌和真菌。生物学样本包括组织样品(诸如组织切片和组织的穿刺活检)、细胞样品(诸如细胞学涂片，诸如子宫颈涂片或血液涂片或通过显微解剖获得的细胞样品)，或细胞级分、碎片或细胞器(诸如通过溶解细胞并通过离心或其他方式分开其组分获得)。生物学样本的其他示例包括血液、血清、尿液、精液、粪便、脑脊液、间质液、粘液、眼泪、汗液、脓液、活检组织(例如，通过手术活检或穿刺活检获得)、乳头抽吸物、耵聍、乳汁、阴道分泌物、唾液、拭子(诸如口腔拭子)或任何含有来源于第一生物学样本的生物分子的材料。在某些实施例中，本文使用的术语“生物学样本”是指从受试者获得的肿瘤或其一部分制备的样品(例如经均质或液化处理的样品)。
如本文所用，术语“生物标志物”或“标志物”是指某些生物学状态或状况的可测量的指示剂。特别地，生物标志物可以为蛋白质或肽，例如，表面蛋白质，其可以被特异性染色，并且其指示细胞的生物学特征，例如，细胞类型或细胞的生理状态。免疫细胞标志物为选择性指示与哺乳动物的免疫应答相关的特征的生物标志物。生物标志物可用于确定身体对疾病或病症的治疗的应答程度或受试者是否易患疾病或病症。在癌症的情况下，生物标志物是指指示体内癌症存在的生物物质。生物标志物可以是由肿瘤分泌的分子或身体对癌症存在的特异性反应。遗传学、表观遗传学、蛋白质组学、糖组学和影像学生物标志物可用于癌症的诊断、预后和流行病学。可以在无创性收集的生物流体(例如血液或血清)中测定此类生物标志物。几种基于基因和蛋白质的生物标志物已用于患者护理中，包括但不限于AFP(肝癌)、BCR-ABL(慢性粒细胞白血病)、BRCA1/BRCA2(乳腺癌/卵巢癌)、BRAF V600E(黑素瘤/结直肠癌)、CA-125(卵巢癌)、CA19.9(胰腺癌)、CEA(结直肠癌)、EGFR(非小细胞肺癌)、HER-2(乳腺癌)、KIT(胃肠道间质瘤)、PSA(前列腺特异性抗原)、S100(黑素瘤)等。生物标志物可用作诊断(鉴定早期癌症)和/或预后(预想癌症的侵袭性和/或预测受试者对特定治疗的应答程度和/或癌症复发的可能性)。
如本文所用，术语“细胞”是指原核细胞或真核细胞。细胞可以是贴壁或非贴壁细胞，如贴壁原核细胞、贴壁真核细胞、非贴壁原核细胞或非贴壁真核细胞。细胞可以是酵母细胞、细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或其任何组合。细胞可以是哺乳动物细胞。细胞可以是从受试者获得的原代细胞。细胞可以是细胞系或无限增殖化细胞。细胞可以从哺乳动物，例如人或啮齿动物获得。细胞可以是癌症或肿瘤细胞。细胞可以是上皮细胞。细胞可以是红细胞或白细胞。细胞可以是免疫细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、树突细胞或其它细胞。细胞可以是神经元细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、神经元支持细胞、Schwann细胞或其它细胞。细胞可以是内皮细胞。细胞可以是成纤维细胞或角质形成细胞。细胞可以是周细胞、肝细胞、干细胞、祖细胞或其它细胞。细胞可以是循环癌症或肿瘤细胞或转移细胞。细胞可以是标记特异性细胞，例如CD8+T细胞或CD4+T细胞。细胞可以是神经元。神经元可以是中枢神经元、外周神经元、感觉神经元、中间神经元、神经元内、运动神经元、多极神经元、双极神经元或伪单极神经元。细胞可以是神经元支持细胞，例如Schwann细胞。细胞可以是血脑屏障系统的细胞之一。细胞可以是细胞系，如神经细胞系。细胞可以是原代细胞，例如从受试者的脑获得的细胞。细胞可以是从受试者分离的细胞群体，诸如组织活检、细胞学样本、血液样品、细针抽吸物(FNA)样品或其任何组合。细胞可以获自从体液获得，例如尿、乳汁、汗液、淋巴液、血液，痰液、羊水、房水、玻璃体液、胆汁、脑脊液、乳糜、食糜、渗出液、内淋巴液、外淋巴液、胃酸、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、风湿、唾液、皮脂、浆液、皮脂腺分泌液、痰液、眼泪、呕吐物或其它体液。细胞可包括癌细胞、非癌细胞、肿瘤细胞、非肿瘤细胞、健康细胞或其任何组合。
如本文所用，术语“扩散系数”或“扩散常数”是指因分子扩散而产生的摩尔通量与观察到其扩散的对象的浓度的梯度(或扩散的驱动力)之间的比例常数。例如在菲克定律和许多其他物理化学方程中遇到扩散率。(一种物质相对于另一物质)的扩散率越高，它们扩散至彼此中的速度就越快。典型地，化合物在空气中的扩散常数为在水中的约10,000倍。举例来说，二氧化碳在空气中具有16mm2/s的扩散常数，而在水中其扩散常数为0.0016mm2/s。
如本文所用，术语“流体”是指一种或多种液体或液体组合物，包括试剂、溶剂、溶液(例如，极性溶剂、非极性溶剂)、混合物等。流体可以是水性的或非水性的。流体的非限制性示例包括用于对经石蜡包埋的生物学样本或烃(例如，烷烃、异烷烃和芳香族化合物(诸如二甲苯))进行去石蜡的溶剂和/或溶液。流体的更进一步的实例包括用于使生物学样本脱水或再水化的溶剂(及其混合物)。在一些实施例中，流体包括一种或多种二醇醚，诸如一种或多种丙烯基二醇醚(例如，丙二醇醚、二(丙二醇)醚和三(丙二醇)醚、乙二醇基二醇醚(例如，乙二醇醚、二(乙二醇)醚和三(乙二醇)醚)及其功能类似物。又一些溶液描述于美国专利申请公开号2016/0282374中，其公开内容特此通过引用以其整体并入本文。
如本文所用，术语“固定”是指保存细胞样品的分子和/或形态细节的处理。通常有三种固定过程：(1)热固定，(2)灌注；和(3)浸泡。在热固定的情况下，将样品暴露于热源足够的时间段以热杀死样品并将样品粘附到载玻片。灌注包括使用血管系统将化学固定剂分布在整个器官或整个生物体中。浸泡包括将样品浸入一定体积的化学固定剂中并使固定剂扩散到整个样品中。化学固定包括化学物质在整个细胞样品中的扩散或灌注，其中固定剂引起(在化学和结构方面)尽可能将结构保存为接近于活细胞样品的结构的反应。
固定剂(或“固定溶液”)可以基于作用方式分为两个大类：交联固定剂和非交联固定剂。交联固定剂-通常是醛-在组织样品中存在的内源生物分子(诸如蛋白质和核酸)之间产生共价化学键。在一些实施例中，固定剂为醛基交联固定剂，诸如戊二醛基和/或福尔马林基溶液。通常用于浸没固定的醛的示例包括：甲醛(大多数组织的标准工作浓度为约5％至约10％福尔马林，尽管对某些组织使用的浓度高达约20％福尔马林)；乙二醛(标准工作浓度为17至86mM)；戊二醛(标准工作浓度为200mM)。
在一些实施例中，醛常常彼此组合使用。标准醛组合包括10％福尔马林+1％(w/v)戊二醛。非典型醛已用于某些专门的固定应用中，包括：富马醛、12.5％羟基己二醛(pH7.5)、10％巴豆醛(pH 7.4)、5％丙酮醛(pH5.5)、10％乙醛(pH 7.5)、10％丙烯醛(pH 7.6)和5％甲基丙烯醛(pH7.6)。用于免疫组织化学的醛基固定溶液的其他具体示例展现于表1中：
表1
甲醛是组织学中最常用的交联固定剂。甲醛可以以各种浓度用于固定，但其主要用作10％中性缓冲福尔马林(NBF)，其为在磷酸盐缓冲盐水溶液中的约3.7％甲醛。多聚甲醛是甲醛的聚合形式，其在加热时解聚以提供福尔马林。戊二醛以与甲醛类似的方式起作用，但是是具有较慢的跨膜扩散速率的较大分子。戊二醛固定提供更刚性或紧密连接的固定产物，引起快速且不可逆的变化，在4℃下快速且良好地固定，提供良好的整体细胞质和细胞核细节，但对于免疫组化染色是不理想的。一些固定方案使用甲醛和戊二醛的组合。乙二醛和丙烯醛是较不常用的醛。变性固定剂-通常是醇或丙酮-通过置换细胞样品中的水(其使得蛋白质内的疏水键和氢键不稳定)而起作用。这还导致水溶性蛋白质变得不溶于水并沉淀，这在很大程度上是不可逆的。
如本文所用，术语“经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织切片”是指固定在甲醛(例如，3％至5％甲醛的磷酸盐缓冲盐水溶)或Bouin溶液中，包埋在蜡中，切成薄的切片，以及然后安装在平坦表面(例如,显微镜载玻片)上的一块组织，例如，从受试者获得的活检组织。
如本文所用，术语“免疫组化”是指通过检测在样品内抗原与特定结合剂(诸如抗体)的相互作用来测定抗原在样品中的存在或分布的方法。在允许抗体-抗原结合的条件下使样品与抗体接触。可以借助于与抗体缀合的可检测标签(直接检测)或借助于与特异性结合到第一抗体的第二抗体缀合的可检测标签(间接检测)来检测抗体-抗原结合。在一些情况下，间接检测可包括用于进一步增强抗原可检测性的三级或更高级抗体。可检测标记的实例包括酶、荧光团和半抗原，在酶的情况下，它们可以与生色或荧光底物一起使用。
如本文所用，术语“载片”是指任何合适尺寸的、可将生物学样本置于上面进行分析的任何基质(例如，全部或部分由玻璃、石英、塑料、硅等制成的基质)，更特别地是指标准3x 1英寸显微镜载片或标准75mm x25mm显微镜载片等“显微镜载片”。可以置于载片上的生物学标本的实例包括但不限于细胞学涂片、薄的组织切片(例如来自活检)和生物标本阵列，例如组织阵列、细胞阵列、DNA阵列、RNA阵列、蛋白质阵列或其任何组合。因此，在一个实施例中，将组织切片、DNA样品、RNA样品和/或蛋白质置于载片的特定位置上。在一些实施例中，术语“载片”可指SELDI和MALDI芯片，以及硅片。
如本文所用，术语“特异性结合实体”是指特异性结合对的成员。特异性结合对是特征在于彼此结合以实质性地排除与其他分子结合的分子对(例如，特异性结合对的结合常数可以比生物学样本中其他分子的结合对的两个成员中的任一者的结合常数大至少103M-1、104M-1或105M-1)。特异性结合部分的实例包括特异性结合蛋白(例如，抗体、凝集素、链霉亲和素和蛋白A等抗生物素蛋白)。特异性结合部分也可以包括由这种特异性结合蛋白特异性结合的分子(或其部分)。特异性结合实体包括上述一抗或核酸探针。
如本文所用，术语“染色剂”、“染色”或类似的术语通常是指对生物学标本的任何处理，该处理检测和/或区分生物学标本中特定分子(诸如脂质、蛋白质或核酸)或特定结构(诸如正常或恶性细胞、细胞质、细胞核、高尔基氏体或细胞骨架)的存在、位置和/或量(诸如浓度)。例如，染色可以将生物学标本的特定分子或特定细胞结构与周围部分进行比对，并且染色的强度可以测定该标本中特定分子的量。染色不仅可以和明视野显微镜一起使用，而且还可以和相衬显微镜、电子显微镜和荧光显微镜等其他观察工具一起使用，以用于辅助观察分子、细胞结构和生物体。一些由系统进行的染色可以让细胞的轮廓清晰可视。由所述系统进行的其他染色可依赖于染色的且不对其他细胞组分染色或对其他细胞组分相对极少染色的特定细胞组分(例如分子或结构)。由所述系统进行的各类染色方法的实例包括但不限于，组织化学方法、免疫组化方法和基于核酸分子间的杂交反应等分子间反应(包括非共价结合相互作用)的其他方法。染色方法包括但不限于，初级染色方法(如H&E染色、子宫颈染色等)、酶联免疫组化方法，以及原位RNA和DNA杂交方法，例如荧光原位杂交(FISH)。
如本文所用，术语“基本上”意指展现出目标特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。在一些实施例中，“基本上”意指在约20％以内。在一些实施例中，“基本上”意指在约15％以内。在一些实施例中，“基本上”意指在约10％以内。在一些实施例中，“基本上”意指在约5％以内。在一些实施例中，“基本上”意指在约2.5％以内。在一些实施例中，“基本上”意指在约2％以内。在一些实施例中，“基本上”意指在约1.5％以内。在一些实施例中，“基本上”意指在约1％以内。
如本文所用，术语“靶标”是指确定或可以确定存在、位置和/或浓度的任何分子。靶分子的实例包括蛋白质、表位、核酸序列和半抗原，例如与蛋白质共价结合的半抗原。通常，使用一个或多个特异性结合分子的缀合物和一个可检测的标记来检测靶分子。
如本文所用，术语“飞行时间”(“TOF”)是指对象、粒子或波(例如，声波、电磁波等)通过介质传播一距离所花费的时间。可以根据经验，例如，通过确定由发射器发射的声学信号(“经发射的信号”)与由接收器接收的声学信号(“经接收的信号”)的相位之间的相位差异来测量TOF。然后，TOF信息可以用来了解设置在介质中的材料(例如，生物学样本)的属性(诸如材料的组成)。举例来说，TOF可以用来确定固定剂(例如，福尔马林)进入生物学样本(例如，组织样品)的扩散。福尔马林扩散至组织切片中并使蛋白质和核酸交联，从而使代谢中断，保留生物分子并使组织准备好用于石蜡浸润。在一些实施例中，然后可以利用算法来确定为了进行最优固定及由此确保正确和理想的染色，生物学样本必须用固定剂扩散至何种程度。
概述
本公开提供了便于预测流体将最优地扩散至生物学样本中的估计时间(例如，流体在组织样品中的特定位置诸如生物学样本的中心区域处达到特定浓度将花费的时间)的系统和方法。在一些实施例中，流体包括一种或多种固定剂(包括本文所描述的那些中的任一种)。在其他实施例中，流体包括脱水剂(诸如经分级的乙醇)、澄清剂(诸如二甲苯)和用于包埋生物学样本的石蜡。
在一些实施例中，流体包括10％NBF。在一些实施例中，流体包括约70％乙醇。在一些实施例中，流体包括约80％乙醇。在一些实施例中，流体包括约90％乙醇。在一些实施例中，流体包括约100％乙醇。在一些实施例中，流体包括二甲苯。在一些实施例中，流体包括石蜡。
据信，流体扩散至生物学样本中的程度可能对下游处理和分析方法具有影响。举例来说，且在生物学样本的固定质量的上下文中，在目前的临床实践中，重要的是控制固定持续时间以实现组织形态的保存与抗原性的丧失之间的折衷。实际上，过短或过长的固定持续时间可能不利地影响下游样品处理。因此，仍然存在对准确预测生物学样本在下游处理之前(例如，在使生物学样本与一种或多种特异性结合实体接触之前)将被最优地固定的时间的需求。申请人惊奇地发现，本公开的系统和方法提供了对流体(例如，一种或多种固定剂)最优地扩散至生物学样本(例如，组织样本或细胞学样本)中的时间的准确预测。
鉴于前述内容，并且在固定生物学样本的上下文中，本公开提供了便于预测生物学样本(例如，来源于人类受试者的组织样品)将被最优地固定的估计时间(本文也称为“固定的时间”或“固定完成的时间”)的系统和方法。在一些实施例中，对生物学样本将被最优地固定的时间的预测是基于在固定过程(例如，单温度固定过程或双温度固定过程)期间的特定时间点获取的TOF数据，该TOF数据被认为足够准确(即，在特定时间点的TOF数据满足指示其有效且适合于下游处理的预定标准)以便可以预测在生物学样本内达到一定浓度或量的固定剂所需的时间。本文进一步描述了“固定完成的时间”的确定(诸如使用预测模块204)以及确定什么TOF数据“被认为足够准确”(诸如使用信号建模模块203)以便进行预测。
参考图1A和图1B，本公开的至少一些实施例涉及系统和方法，该系统和方法用于：(i)通过生物学样本，诸如在跨生物学样本的多个位置处获取TOF数据(步骤101)；以及(ii)在生物学样本浸没在流体(例如，一种或多种固定剂)中时，(例如实时地)分析经获取的TOF数据。在一些实施例中，流体包含一种或多种固定剂，并且生物学样本浸没在一种或多种固定剂中，同时收集，诸如连续地收集(例如，在每约0.2秒与约120秒之间连续地收集)声学数据。在一些实施例中，实时地分析经获取的TOF数据以确定在特定时间点的经获取的TOF数据是否被认为足够准确(步骤102)以便可以使用在该特定时间点的TOF数据来估计流体最优地扩散至生物学样本中的时间，例如，当流体包含一种或多种固定剂时，估计生物学样本将被最优地固定的时间(步骤105)。
在一些实施例中，确定在特定时间点的经获取的TOF数据是否被认为足够准确以便可以使用在该特定时间点的TOF数据来估计流体最优地扩散至生物学样本中的时间或生物学样本将被最优地固定的时间包括计算至少两个不同的置信度模型，例如，过去置信度模型和当前置信度模型。在一些实施例中，计算三个不同的置信度模型(参见步骤103A、103B和103C)。在一些实施例中，每次收集新的TOF数据时重新算出至少两个置信度模型。当满足(例如，通过确定经接收的数据是否独立地满足针对模型中的每一者的预定的阈值标准来同时满足)置信度模型中的至少两者(步骤104)时，信号被认为是准确的并且可以估计流体最优地扩散至生物学样本中的时间或生物学样本将被最优地固定的时间(步骤105)。
在一些实施例中，当满足置信度模型中的至少两者时，本文所描述的系统和方法便于确定来自生物学样本的TOF信号真正表示(当前和未来的)实际扩散速率的时刻以及预测流体将在什么时间最优地扩散至生物学样本中或生物学样本将被正确地固定的时间。在一些实施例中，如果与TOF数据被认为足够准确的时间点相比，TOF数据被认为足够准确的时间点在未来，则将生物学样本留在流体，诸如一种或多种固定溶液中。在其他实施例中，如果与TOF数据被认为足够准确的时间点相比，TOF数据被认为足够准确的时间点在过去，则将生物学样本从流体，诸如一种或多种固定溶液移除。在一些实施例中，然后可以通过将模型对真实值的确定与实验上有效的真实值进行比较来确定预测的准确度，即，在模型预测其稳定之后拟合变化的程度。
参考图2和图3，系统200包括信号获取模块201，该信号获取模块包括一个或多个发射器和/或一个或多个接收器(本文进一步描述的)。在一些实施例中，信号获取模块201通信地耦接至计算机100。计算机系统100可以包括台式计算机、膝上型计算机、平板电脑或类似物、数字电子电路系统、固件、硬件、一个或多个存储器205、计算机存储介质(例如，存储模块240)、计算机程序或指令集(例如，其中程序存储在存储器或存储介质内)、一个或多个处理器206(包括编程处理器)，以及任何其他硬件、软件或固件模块或其组合(诸如本文进一步描述的)。在一些实施例中，信号获取模块201可以在本地或经由网络120耦接至计算机100。
在一些实施例中，本文所描述的系统200可以通信地耦接至附加部件，例如，服务器、数据库、显微镜、成像装置、扫描仪、其他成像系统、自动化载玻片制备装备等。本文描述了这些附加部件。举例来说，系统200可以耦接至自动化载玻片制备装备，使得可以针对一种或多种生物标志物(本文描述了合适的生物标志物的限制性示例)的存在对最优固定的生物学样本(根据本公开的方法来确定的)进行染色，诸如以免疫酶法的方式。
举另一示例来说，系统200可以进一步包括成像设备(例如，用以在生物学样本被最优地固定之后，获取已经针对一种或多种生物标志物的存在进行免疫酶法染色的生物学样本的图像)并且从成像装置捕捉的图形可以以二进制形式存储以供进一步处理和/或分析(诸如在本地或在服务器上)。在一些实施例中，成像设备(或包括存储在存储器中的经预扫描的图像的其他图像源)可以包括但不限于一个或多个图像捕捉装置。图像捕捉装置可以包括但不限于照相机(如模拟相机、数字相机等)、光学器件(如一个或多个透镜、传感器聚焦透镜组、显微镜物镜等)、成像传感器(如电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器等)、感光胶片等。在数字实施例中，所述图像捕捉装置可以包括多个镜头，这些镜头可协作证明具备即时对焦功能。图像传感器，例如，CCD传感器可以捕获样本的数字图像。在一些实施例中，成像设备是明视野成像系统、多光谱成像(MSI)系统或荧光显微镜系统。在一些实施例中，可以例如由图像扫描系统，诸如VENTANA MEDICAL SYSTEMS，Inc.(Tucson,Arizona)的VENTANA DP200扫描仪或其他合适的成像设备生成图像数据。本文将进一步描述其他成像设备和系统。本领域技术人员将认识到，由成像设备采集的数字彩色图像通常是由基本彩色像素组成。每个彩色像素均可以在三种数字成分上进行编码，每种成分均包含相同数量的比特数，且每种成分均对应于一种原色，一般是红、绿或蓝，也用术语“RGB”成分表示。
图3提供了本公开的系统200以及在系统200内使用的各种模块的概览。在一些实施例中，系统200采用具有一个或多个处理器206和一个或多个存储器205的计算机装置或计算机实现方法，一个或多个存储器205存储用于由一个或多个处理器执行的非暂时性计算机可读指令，以使一个或多个处理器执行如本文所述的指令。如上文所指出，本公开的系统200可以用于预测生物学样本的固定时间，即，生物学样本被最优地固定的时间。同样地，本公开的系统200可以用于预测流体最优地扩散至生物学样本(例如，组织样品)中的时间。
参考图3和图4，在一些实施例中，系统200包括信号获取模块201，该信号获取模块适于获取声学数据集(步骤401)。在一些实施例中，本公开的系统200进一步包括信号处理模块202，该信号处理模块从信号获取模块201(或从与其通信的存储器205或存储子系统240)接收声学数据并处理接收到的声学数据(例如，信号处理模块202可以处理声学数据集以生成TOF数据，包括一个或多个TOF数据点、一个或多个TOF曲线、一个或多个衰减常数等)(步骤402)。在一些实施例中，TOF数据(例如，信号处理模块202的呈TOF数据和/或TOF曲线形式的输出)存储在存储器205或存储子系统240中，使得该TOF数据可以作为输入由信号建模模块203或者预测模块204接收。
在一些实施例中，系统200进一步包括信号建模模块203，以评定经获取的TOF数据(在一些实施例中，包括一条或多条TOF曲线)是否准确地反映流体(例如，一种或多种固定剂)在整个生物学样本中的实际扩散速率。在一些实施例中，信号建模模块203从信号处理模块202(或与其通信的存储器205或存储子系统240)接收TOF数据点(例如，预定数量的TOF数据点)、一个或多个经得出的TOF曲线和/或一个或多个经计算的衰减常数并计算至少两个不同的置信度模型(步骤403)。
在一些实施例中，信号建模模块203计算至少两个不同的置信度模型或者计算所有三个不同的置信度模型。在一些实施例中，基于新接收的TOF数据，例如，随着时间的推移获取的新生成的TOF数据或包括新获取的TOF数据点的新生成的TOF曲线，连续地(例如，每0.2秒、每0.5秒、每1秒、每5秒、每10秒、每20秒、每30秒、每60秒等等)重新计算至少两个不同的置信度模型。在一些实施例中，信号建模模块203连续地评定至少两个经计算的置信度模型以识别置信度模型中的至少两者何时独立地满足预定的阈值标准(步骤404)。如本文所指出，信号建模模块203用于实时地(诸如在流体扩散至生物学样本中期间或在生物学样本的固定期间)确定TOF数据是否有效且满足预定的阈值标准。
在一些实施例中，系统200进一步包括预测模块204，该预测模块适于基于从信号建模模块203接收的数据来预测流体最优地扩散至生物学样本中的估计时间或者预测固定的估计时间(步骤405)。随后，可以对生物学样本应用进一步的下游处理步骤。本文进一步描述了这些模块中的每一者以及确定固定剂进入生物学样本的扩散时间使得生物学样本变得最优固定的步骤。
信号获取模块
在一些实施例中，系统200包括信号获取模块201。在一些实施例中，信号获取模块201适于生成声学数据或声学数据集，诸如在生物学样本已浸没在流体(例如，一种或多种固定溶液)内之后。在一些实施例中，声学数据是通过以下生成的：(i)发射声学信号，使得声学信号遇到浸没在流体(诸如本文所描述的任何固定剂或美国公开号2017/0336363中描述的那些，该美国公开的公开内容通过引用以其整体并入本文)中的生物学样本，以及(ii)在声学信号已遇到生物学样本之后检测声学信号。在一些实施例中，重复地和/或连续地(例如，每0.2秒、每0.5秒、每1秒、每5秒、每10秒、每20秒、每30秒、每60秒等等)获取和/或生成声学数据。在一些实施例中，在生物学样本内的单个点处重复地和/或连续地获取和/或生成声学数据。在其他实施例中，沿着生物学样本内的或沿着生物学样本的多个点，例如，2个或更多个点、3个或更多个点、4个或更多个点、5个或更多个点、6个或更多个点、10个或更多个点等等重复地和/或连续地获取和/或生成声学数据。
在一些实施例中，信号获取模块201通过频率扫描生成声学数据。如本文所用，术语“频率扫描”是指一系列声波，其以固定的频率间隔通过介质(例如，包含一种或多种固定剂的介质)来发射，使得第一组声波以固定频率通过介质发射持续第一固定持续时间，并且随后的声波组以固定频率间隔发射持续随后的持续时间。在一些实施例中，持续时间为相等的持续时间。
在一些实施例中，信号获取模块201包括一个或多个发射器和接收器，其中一个或多个发射器和接收器布置成使得由发射器生成的声学信号由接收器接收并且变换成计算机可读信号。在一些实施例中，信号获取模块201包括超声波发射器和超声波接收器。如本文所用，“发射器”为能够将电信号转换成声能量的装置，并且“超声波发射器”为能够将电信号转换成超声波声能量的装置。如本文所用，“接收器”为能够将声波转换成电信号的装置，并且“超声波接收器”为能够将超声波声能量转换成电信号的装置。
可用于从电信号生成声能量的某些材料也可用于从声能量生成电信号。因此，发射器和接收器不必需要为单独的部件，尽管它们可以。在一些实施例中，发射器和接收器布置成使得接收器在经发射的波已遇到目标材料(例如，生物学样本)之后检测由发射器生成的声波。在一些实施例中，接收器布置成检测已由目标材料(例如，生物学样本)反射的声波。在其他实施例中，接收器布置成检测已通过目标材料(例如，生物学样本)发射的声波。在一些实施例中，提供了至少两组发射器和接收器，其中至少两组中的至少一组定位成通过流体(例如，固定溶液)和生物学样本发射声信号，并且至少第二组定位成通过流体(例如，固定溶液)但不通过生物学样本发射声信号。在此实施例中，第一组用于测量生物学样本中的TOF变化，并且第二组用于检测穿过流体(例如，固定溶液)的TOF的变化(举例来说，由环境波动诸如温度引起的变化)。
在一些实施例中，发射器包括与换能器可操作地连接的波形生成器，该波形生成器用于生成传送至换能器的电信号，该换能器用于将电信号转换成声信号。在某些实施例中，波形生成器是可编程的，使得使用者可以修改频率扫描的某些参数，包括举例来说：开始和/或结束频率、频率扫描的频率之间的步长、频率步数和/或发射每个频率的持续时间。在其他实施例中，波形生成器预编程为生成一个或多个预定的频率扫描模式。在其他实施例中，波形生成器可以适于发射经预编程的频率扫描和定制的频率扫描两者。在一些实施例中，发射器还可以包含聚焦元件，该聚焦元件允许由换能器生成的声能量被可预测地聚焦并引导至特定区域。
在操作中，发射器通过介质发射频率扫描，该频率扫描随后由接收器检测并变换成声学数据集以存储在非暂时性计算机可读存储介质中和/或发射至信号分析器以供分析。在声学数据集(例如，物理声波)包括表示经发射的声波与经接收的声波之间的相位差的数据的情况下，声学监测系统还可以包括相位比较器，该相位比较器生成对应于经发射的声波与经接收的声波之间的相位差的电信号。在一些实施例中，声学监测系统包括与发射器和接收器通信地连接的相位比较器。在相位比较器的输出为模拟信号的那些实施例中，信号获取模块201还可以包括用于将相位比较器的模拟输出转换成数字信号的模数转换器。在一些实施例中，数字信号然后可以记录在例如非暂时性计算机可读介质(存储器201或存储子系统240)上或者可以直接传送至信号处理模块202以供分析。
在一些实施例中，声学数据表示频率扫描的在频率扫描遇到生物学样本之后检测到的至少一部分。在一些实施例中，频率扫描的检测到的部分构成由生物学样本反射的声波。在其他实施例中，频率扫描的检测到的部分构成已经穿过生物学样本的声波。
在一些实施例中，可以由信号获取模块201在生物学样本中的单个点处(举例来说，在组织样品的几何中心处或附近)获取声学数据。在其他实施例中，可以在生物学样本内的多个位置(例如，等距的位置间隔)处捕捉声学数据。在从组织样品内的多个位置收集声学数据的实施例中，可以提供设备，用于使组织样品相对于发射器和接收器平移或者使组织样品相对于发射器和接收器平移，使得发射器和接收器的公共焦点移动至生物学样本上的不同位置。在一些实施例中，信号获取模块201可以装备多个发射器和接收器，多个发射器和接收器中的每一者具有不同的公共焦点，使得每组在生物学样本内的不同位置处捕捉声学数据。
美国专利公开号2017/0284859进一步描述了跨多个不同位置捕捉声学数据的方法，并且另外描述了用以获取此类声学数据的可移动盒保持器。举例来说，“不同位置”可以为组织样品内或其表面上的位置。根据一些实施例，可以通过活检胶囊和声波束路径的相对移动将样品定位在不同的“样品位置”处。相对移动可以包括使接收器和/或换能器移动，以便以逐步或连续的方式在样品上进行“扫描”。替代性地，可以凭借可移动盒保持器来重新定位盒。举例来说，为了对盒中的所有组织进行成像，可以将盒保持器依次竖直升高约1mm，并在每个新位置处获取TOF值。如本文所用，“盒”是指例如用于活检胶囊或未包含在活检胶囊内的组织样品的容器。优先地，盒的设计和形状被确定成使得能够相对于超声波发射器-接收器对的波束路径自动地选择和移动，例如，升高和降低该盒，并且进一步具有开口，该开口容许液体剂移动进出该盒，从而进一步进出保持在内的组织样品。该移动可以例如通过盒装载在其上的机械臂或装置的另一自动化可移动部件来进行。在其他实施例中，盒单独用于容纳组织样品，并且盒的形状可以至少部分地决定组织样品的形状。举例来说，将比盒的深度稍厚的矩形组织块放置到盒中并闭合盒盖可以使组织样品经压缩和展开以填充盒的内部空间的更大部分，并且因此经变换成具有较大高度和宽度，但具有大致对应于盒的深度的厚度的较薄件。美国专利公开号2017/0284859的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。
PCT公开号WO/2011/071727中描述了用于在流体的扩散期间或在固定期间保持生物学样本的又一些容器，该公开的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，生物学样本提供在活检胶囊内。如本文所用，“活检胶囊”为例如用于活检组织样品的容器。典型地，活检胶囊包括用于保持样品并使液体剂(例如，缓冲液、固定溶液或染色溶液)包围组织样品并扩散至其中的网格件。活检胶囊可以将样品维持在特定形状下，该形状可以有利地为样品提供在计算上更容易根据所公开的方法来建模并因此更适合在所公开的系统中使用的形状。
在一些实施例中，在扩散过程的至少一部分期间(例如在如下文更详细讨论的双温度固定过程期间)，可以将固定溶液保持在特定温度下或特定温度范围内。在一些实施例中，用于保持一定体积的固定剂的设备可以适于将固定剂溶液维持在特定温度下或特定温度范围内。在一些实施例中，可以使设备隔热以大大减少固定溶液与周围环境之间的热传递。在一些实施例中，设备可以配置有加热或冷却装置，该加热或冷却装置设计成将组织样品浸没在其中的固定溶液保持在特定温度下或特定温度范围内。
在一些实施例中，系统和方法将对生物学样本的双温度浸没固定方法并入。如本文所用，“双温度固定方法”为其中首先将组织浸没在冷固定溶液中持续第一时间段，接着加热(被动或主动)生物学样本持续第二时间段的固定方法。“冷”扩散步骤容许固定溶液扩散在整个组织中而基本上不引起交联。在一些实施例中，将固定溶液的温度保持在冷温度下至少足够长的时间以确保固定剂已扩散在整个组织样品中。在一些实施例中，允许扩散的最小时间量可以根据经验经以下来确定：在冷固定剂中使用各种时间和温度组合，并通过免疫组织化学(举例来说，如果分析物为蛋白质或磷酸化蛋白)或原位杂交(如果靶标分析物为核酸，诸如miRNA或mRNA)考虑各因素(诸如组织结构的保存以及靶标分析物的保存的损失)来评估所得到的组织样品。替代性地，允许扩散的最小时间量可以通过以下来确定：使用例如在Bauer等人，Dynamic Subnanosecond Time-of-Flight Detection forUltra-precise Diffusion Monitoring and Optimization of BiomarkerPreservation,Proceedings of SPIE，第9040卷，90400B-1(2014年3月20日)中概述的方法来监测扩散。
在一些实施例中，本文所描述的系统和方法可以用于估计冷固定剂最优地扩散至生物学样本(诸如生物学样本的中心)中(并且在以相对较高的温度下，诸如至少在室温下固定之前)的时间。然后，一旦组织已充分扩散在整个组织中，加热(或允许生物学样本和/或流体温热至室温)步骤导致通过固定剂进行交联。在一些实施例中，本文所描述的系统和方法可以用于确定双温度浸没固定方法的此第二步骤期间的固定的时间。
相比通过使用标准方法，冷扩散接着加热步骤(被动或主动加热)的结合产生更完全固定的组织样品。因此，在实施例中，组织样品是通过以下固定的：(1)将未固定的组织样品浸没在冷固定溶液中，并通过使用如本文所公开的系统和方法监测组织样品中的TOF来监测固定剂进入组织样本的扩散(扩散步骤)；以及(2)在已测量阈值TOF之后允许组织样品的温度升高(固定步骤)。在一些实施例中，扩散步骤是在固定溶液中进行的，该固定溶液低于约20℃，低于约15℃，低于约12℃，低于约10℃，低于约8℃，低于约6℃，低于约4℃，在约0℃至约10℃的范围内，在约0℃至约12℃的范围内，在约0℃至约15℃的范围内，在约2℃至约10℃的范围内，在约2℃至约12℃的范围内，在约2℃至约15℃的范围内，在约5℃至约10℃的范围内，在约5℃至约12℃的范围内，在约5℃至约15℃的范围内。在一些实施例中，扩散步骤可以在任何上述温度下进行，并且样品可以在低于约20℃，诸如低于约15℃，或诸如低于约10℃的温度下储存在固定剂中持续最多约72小时之间的时间段。在其他实施例中，允许包围组织样品的固定溶液的温度在固定步骤期间上升在约20℃至约55℃的范围内，诸如在约20℃至约50℃的范围内，诸如在约20℃至约45℃的范围内，诸如在约20℃至约40℃的范围内，诸如在约250℃至约55℃的范围内，诸如在约25℃至约50℃的范围内，诸如在约25℃至约45℃的范围内，或诸如在约25℃至约50℃的范围内。用于固定生物学样本的方法，包括并入双温度固定方案的方法，进一步描述于美国专利公开号2012/0214195中，公开内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施例中，双温度固定过程对于检测组织样品中的某些易变生物标志物(包括，举例来说，磷酸化蛋白、DNA和RNA分子(例如miRNA和mRNA))的方法尤其有用。参见PCT/EP2012/052800(通过引用并入本文)。因此，在某些实施例中，可以针对此类易变标志物的存在对使用这些方法获得的经固定的组织样品进行分析。在一些实施例中，提供了一种检测样品中的易变标志物的方法，该方法包括根据如本文所公开的双温度固定来固定组织，以及使经固定的组织样品接触能够与易变标志物诸如FOXP3特异性结合的分析物结合实体。分析物结合实体的示例包括：抗体及抗体片段(包括单链抗体)，其与靶标抗原结合；T细胞受体(包括单链受体)，其与MHC:抗原复合物结合；MHC:肽多聚体(其与特异性T细胞受体结合)；适配体，其与特异性核酸或肽靶标结合；锌指，其与特异性核酸、肽和其他分子结合；受体复合物(包括单链受体和嵌合受体)，其与受体配体结合；受体配体，其与受体复合物结合；和核酸探针，其与特异性核酸杂交。举例来说，提供了一种检测组织样品中的磷酸化蛋白的免疫组织化学方法，其包括将根据前述双温度固定方法获得的经固定的组织与对磷酸化蛋白具有特异性的抗体接触，以及检测抗体与磷酸化蛋白的结合。在一些实施例中，提供了一种检测核酸分子的原位杂交方法，其包括将根据前述双温度固定方法获得的经固定的组织与对目标核酸具有特异性的核酸探针接触，以及检测探针与目标核酸的结合。
信号处理模块
本公开的系统200进一步包括信号处理模块202。在一些实施例中，信号处理模块202为信号获取模块201的一部分。在其他实施例中，信号处理模块202与信号获取模块201分开。
在任一实施例中，信号处理模块202从信号获取模块201(或从与其通信的存储器201或存储子系统240)接收声学数据并处理该经接收的声学数据以生成一个TOF数据点、一个或多个TOF曲线和/或一个或多个衰减常数(本文统称为“TOF数据”)。在一些实施例中，声学数据是连续地(诸如以预定的时间间隔)生成的，并且信号处理模块202在接收声学数据时对其进行处理，由此在连续地获取声学数据时提供TOF数据。在一些实施例中，信号处理模块202在从信号获取模块201接收声学数据时实时地对进行处理。
在一些实施例中，信号处理模块202利用检索到的声学数据作为输入来计算一个或多个TOF数据点。在一些实施例中，“TOF数据点”为在一个时间点本体流体与生物学样本之间的TOF差异。在一些实施例中，每个经收集的TOF数据点表示以下两者之间的声波渡越时间的经计算的差异：(i)声波穿过流体传播的算出的绝对渡越时间；以及(ii)声波穿过流体和生物学样本两者传播的算出的绝对渡越时间，如下文所进一步描述。
在其他实施例中，信号处理模块202利用检索到的声学数据和/或经计算的TOF数据点作为输入来计算“TOF曲线”，该TOF曲线包括随着时间的推移而收集的“TOF数据点”的向量。在一些实施例中，TOF曲线描述了外源流体历经一段时间并且直至特定时间点(即，收集最后的TOF数据点的时间点)进入生物学样本的扩散。当随着时间的推移收集更多的TOF数据点时，可以计算新的TOF曲线，包括“新的”TOF数据点。在一些实施例中，信号处理模块202包括用以将经得出的TOF曲线拟合至单指数曲线的指令。
在又一些实施例中，信号处理模块202包括用以基于经接收的声学数据和/或TOF数据点来计算衰减常数或平均衰减常数(τ平均)的指令。本文进一步描述由信号处理模块202进行的操作。
在一些实施例中，提供一个或多个TOF数据点、一个或多个TOF曲线和/或一个或多个经计算的衰减常数作为对信号建模模块203和/或预测模块204的输出。在一些实施例中，一个或多个TOF数据点、一个或多个TOF曲线和/或一个或多个经计算的衰减常数存储在存储器201或存储子系统240中，使得它们可以作为输入由信号建模模块203或预测模块204检索到。
经接收的声学数据
在一些实施例中，信号处理模块202利用检索到的声学数据来算出声波在信号获取模块201内的换能器之间传播所花费的绝对时间量(“绝对渡越时间”)。在一些实施例中，绝对渡越时间为如在发射器与接收器之间测量的声波穿过流体传播的绝对渡越时间。在其他实施例中，绝对渡越时间为如在发射器与接收器之间测量的声波穿过流体和生物学样本(例如，设置在组织学盒内的生物学样本)传播的绝对渡越时间。
在一些实施例中，信号处理模块202进一步利用算出的绝对渡越时间来算出与穿过流体和生物学样本传播相比，声波仅穿过流体传播要快多少。在这些实施例中，计算以下两者之间的渡越时间差异：(i)声波穿过流体传播的算出的绝对渡越时间；以及(ii)声波穿过流体和生物学样本传播的算出的绝对渡越时间。在一些实施例中，随着时间的推移重复此过程。在其他实施例中，当由信号获取模块201获取新的数据时，连续地重复此过程，使得信号处理模块202实时地计算从信号获取模块201接收的数据。在一些实施例中，每0.5秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每1秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每1.5秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每2秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每5秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每10秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每15秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每20秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每30秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每40秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每50秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。在一些实施例中，每60秒至少一次从信号获取模块201接收新的数据。
在一些实施例中，随着时间的推移而计算的差异表示TOF的变化。在一些实施例中，生物学样本(例如，当生物学样本在暴露于包括一种或多种固定剂的溶液的情况下变得固定时该生物学样本的固定状态)随时间的变化可能改变经计算的差异。举例来说，当生物学样本固定在包括一种或多种固定剂的流体内时，声波可以随着时间的推移更快地穿过该生物学样本传播。基于此，并且在一些实施例中，随着时间的推移而计算的差异可以帮助预测生物学样本的固定状况、固定状况随时间的变化，或者可以用于预测在充分地固定生物学样本之前必须继续进行固定的时间量。
TOF数据点计算
在一些实施例中，信号处理模块202用于计算一个或多个TOF数据点。在一些实施例中，由信号处理模块202通过比较经发射的声波和经接收的声波的相位来估计TOF。在一些实施例中，实验频率扫描由发射器通过介质发射并由接收器检测。在一些实施例中，比较经发射的波和经接收的波的相位并将其变换成时间相移。在一些实施例中，然后运行模拟以对各种候选TOF处的候选时间相移进行建模，并且生成候选时间相移与实验时间相移之间的误差并将其绘制为误差函数。在一些实施例中，选择产生误差函数的最小值的TOF作为“观察到的”TOF。在一些实施例中，TOF是通过以下来算出的：记录经发射的超声波信号与经接收的超声波信号之间的经发射的相移并将经记录的相移拟合至不同候选TOF处的多个经模拟的相移。
在一些实施例中，TOF是使用以下来算出的：(i)算出TOF的包络方法；(ii)算出TOF的线性回归方法；或(iii)算出TOF的曲线拟合方法。算出TOF的包络方法、算出TOF的线性回归方法和算出TOF的曲线拟合方法中的每一者描述如下，并在PCT公开号WO/2016/097164中进一步描述，该公开的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。
算出TOF的包络方法
在算出TOF的包络方法中，TOF是基于算出的误差函数的最小值的包络。要算出包络，必须首先生成误差函数。误差函数生成通常需要进行以下两者之间的比较：(1)由经记录的频率扫描生成的时间相移；和(2)基于多个候选TOF模拟的多个候选时间相移。针对频率扫描的每个频率对此进行重复。算出观察到的时间相移与候选时间相移中的每一者之间的误差并将其绘制为误差函数。然后将包络函数应用于误差函数。选择包络函数的最小值作为观察到的TOF。
算出TOF的线性回归方法
算出TOF的线性回归方法算出TOF信号，找出超声波频率扫描的各个线性区段，对每个区域进行线性回归，并对每个区域的斜率求平均以确定真实的TOF。这可以与前述实施例形成对比，在前述实施例中，确定频率扫描的理想相位以找到理想频率，其中重建该频率的斜率并使其等同于TOF，而在此实施例中，直接计算相位频率扫描的斜率。
算出TOF的曲线拟合方法
算出TOF的“曲线拟合方法”利用通过频率扫描进行的累积相位比较的线性度。两个超声波换能器之间的TOF可以通过针对频率扫描获得的相位频率曲线的斜率来算出。然而，随着对完整循环进行累积，相位返回至0，因此相位与超声波频率看起来像三角波。此算法产生具有给定振幅、频率和相位的候选三角波。改变候选三角波的振幅、频率和相位，并将其与来自频率扫描的根据实验检测到的三角进行比较。然后，利用三角波的频率与其斜率的绝对值之间的已知关系，使用候选波与实验波之间的最接近的匹配来直接算出观察到的TOF。然后使用斜率来算出TOF。
作为算出TOF的示例，申请人已开发一种能够稳健地检测浸没在流体(例如，一种或多种固定剂)中的组织样品中的亚纳秒TOF值的方法。在一些实施例中，用可编程波形生成器编程的发射换能器发射3.7MHz正弦信号持续600μs。在一些实施例中，该脉冲列在穿越流体和组织之后由接收换能器检测到，并且然后用数字相位比较器对经接收的超声正弦波和经发射的超声正弦波进行电子比较。在一些实施例中，用模数转换器查询相位比较器的输出并记录平均值。在一些实施例中，以多个声频率(ν)重复该过程。在一些实施例中，考虑到换能器的中心频率(约4.0MHz)和分数带宽(约60％)，典型的扫描范围为从约3.7至约4.3MHz，其中每约600Hz对相位比较器进行查询。在一些实施例中，来自相位比较器的电压转换成时间相移，其称为根据实验确定的相位接下来，使用暴力模拟来算出对于不同的TOF值，观察到的相位频率扫描会是什么样。在一些实施例中，根据等式1来算出随输入正弦频率变化的候选时间相位值：
其中TOF候选是以纳秒为单位的候选TOF值，T是以纳秒为单位的输入正弦的周期，rnd表示舍入至最接近的整数函数，并且|…|为绝对值符号。在一些实施例中，对于给定的候选TOF和频率值(即，周期)，右侧的项表示出现最近数量的循环需要花费多长时间。在一些实施例中，从TOF候选减去该值以算出进入或直至下一完整循环的时间相位。在一些实施例中，因此针对初始范围为10至30μs的具有200ps间隔的多个候选TOF值来计算相位值。在一些实施例中，对于各个候选TOF值，通过等式2在最小二乘的意义上算出实验频率扫描与候选频率扫描之间的误差：
其中N为扫描中的频率总数。在一些实施例中，随候选TOF变化的归一化误差函数类似于光学干涉图。举例来说，每个特征具有一个声学周期的宽度(T＝1/4MHz＝250ns)。最大误差函数指示候选相位频率扫描具有等同的波长，但与实验相位频率扫描异相。相反，当误差最小化时，两者完全协调，并且因此根据公式3将经重建的TOF记录为误差函数的全局最小值：
在一些实施例中，对声波进行数字比较的这种技术由于中心波谷的锐利度而产生高精度，并且产生异常良好匹配的候选相位频率扫描和实验相位频率扫描。
在一些实施例中，当新的声学数据由信号处理模块202接收和处理时，连续地(例如，每0.2秒、每0.5秒、每1秒、每5秒、每10秒、每20秒、每30秒、每60秒等等)计算TOF数据点。在一些实施例中，TOF数据点存储在存储器201中和/或与信号处理模块202通信的存储子系统240中。在一些实施例中，提供TOF数据点或TOF曲线作为对信号建模模块203和/或预测模块204的输入。
扩散速率和衰减常数的计算
在一些实施例中，信号处理模块202适于计算扩散速率和/或衰减常数。在一些实施例中，提供经计算的衰减常数作为对信号建模模块203和/或预测模块204的输入。在一些实施例中，为了算出扩散速率，将TOF曲线拟合至单指数曲线以得出TOF衰减振幅(A)和衰减常数(τ)。在一些实施例中，单指数曲线具有根据等式(4)的形式：
TOF(t,r)＝C(r)+Ae-t/τ(r) (4),
其中C为常数偏移，A为衰减的振幅(即，未扩散的组织样品和完全扩散的组织样品之间的TOF值差值)，τ为衰减常数，t为扩散时间，并且r为空间相依度(这是明确说明的)。在一些实施例中，常数偏移C表示组织样品与本体溶液(例如，组织流体或样品缓冲液)之间的TOF差值。在一些实施例中，为了可见，可以将常数C设定为零。
在其中在生物学样本内或沿着生物学样本的多个空间位置处收集声学数据的实施例中，可能期望算出空间平均TOF曲线(即，表示样品内的多个空间位置处的TOF的单个曲线)并通过将空间平均TOF曲线拟合至单指数曲线来获得平均TOF振幅(A平均)和平均衰减常数(τ平均)。在一些实施例中，将空间平均TOF曲线拟合至具有根据等式(5)的形式的单指数曲线：
其中TOF平均为空间平均TOF曲线，N为在其处获取TOF曲线的空间位置的数量，C平均为平均常数偏移，A平均为衰减的平均振幅(即，未扩散的组织样品与完全扩散的组织样品之间的平均TOF值差值)，并且τ平均为平均衰减常数。在此上下文中，“平均值”是指已经从针对样品中的不同点处的特定共享时间点获得的数据值得出的“空间平均值”。
在一些实施例中，将时间t处的扩散速率算出为单指数曲线在时间t的导数。在一些实施例中，根据等式(6)来算出针对非空间平均TOF曲线的扩散速率：
其中A为衰减的振幅(即，未扩散的组织样品与完全扩散的组织样品之间的TOF值差值)，τ为衰减常数，并且t0为扩散时间。在一些实施例中，根据等式(7)来算出针对空间平均TOF曲线的扩散速率：
其中A平均为衰减的平均振幅(即，未扩散的组织样品与完全扩散的组织样品之间的TOF差值的空间平均值)，τ平均为平均衰减常数，并且t0为扩散时间。在一些实施例中，通过以下将扩散速率算出为振幅归一化的扩散速率：将曲线的导数除以样品在时间t0的振幅(A或A平均)。在一些实施例中，根据等式(8)针对非空间平均TOF曲线来算出振幅归一化的扩散速率：
其中τ为衰减常数，t0为扩散时间，并且中括号指示扩散速率的单位，其中时间为根据τ的时间单位。在一些实施例中，根据等式(9)针对空间平均TOF曲线来算出振幅归一化的扩散速率：
其中τ平均为平均衰减常数，t0为扩散时间，并且中括号指示扩散速率的单位，其中时间为根据τ平均的时间单位。
在一些实施例中，当新的声学数据由信号处理模块202接收和处理时，连续地(例如，每0.2秒、每0.5秒、每1秒、每5秒、每10秒、每20秒、每30秒、每60秒等等)计算衰减常数。在一些实施例中，经计算的衰减常数存储在存储器205中和/或与信号处理模块202通信的存储子系统240中。在一些实施例中，提供经计算的衰减常数或其平均值作为对信号建模模块203和/或预测模块204的输入。
得出TOF数据的另外的方法描述于美国公开号2017/0284920、2017/0284859和2017/0284969中，其公开内容特此通过引用以其整体并入本文。
信号建模模块
系统200还包括信号建模模块203，用以评定经测量的TOF信号是否准确地反映流体(例如，一种或多种固定剂)在整个生物学样本中的实际扩散速率。在一些实施例中，信号建模模块203从信号处理模块202或与其通信的存储器205或存储子系统240接收TOF数据(例如，预定数量的TOF数据点、经得出的TOF曲线和/或经计算的衰减常数)并计算至少两个不同的置信度模型(步骤403)。在一些实施例中，经计算的至少两个不同的置信度模型为过去置信度模型和当前置信度模型，如本文所描述。在其他实施例中，经计算的至少两个不同的置信度模型为过去置信度模型和未来置信度模型。在其他实施例中，经计算的至少两个不同的置信度模型为当前置信度模型和未来置信度模型。在其他实施例中，信号建模模块203计算三个不同的置信度模型(步骤403)。在一些实施例中，三个经计算的不同的置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型，如本文所描述。
在一些实施例中，一旦计算至少两个置信度模型(步骤403)，就将至少两个置信度模型中的每一者独立地与预定的阈值标准进行比较，以确定是否使置信度模型各自独立地“满足”(步骤404)。在一些实施例中，一旦计算至少两个置信度模型并且一旦使至少两个置信度模型独立地且/或同时满足(步骤404)，就使用预测模块204来估计流体最优地扩散在整个生物学样本中的时间或固定的时间(步骤405)。在一些实施例中，使用与使至少两个置信度模型独立地且/或同时满足的时间点相对应的TOF数据来估计流体最优地扩散在整个生物学样本中的时间或固定的时间。
在其他实施例中，计算三个置信度模型(步骤403)，并且一旦使三个经计算的置信度模型中的至少两个置信度模型满足(步骤404)，就使用预测模块204来估计流体最优地扩散在整个生物学样本中的时间或固定的时间。在一些实施例中，使用与使(三个经计算的置信度模型中的)至少两个置信度模型独立地且/或同时满足的时间点相对应的TOF数据来估计流体最优地扩散在整个生物学样本中的时间或固定的时间。
在又一些实施例中，计算三个置信度模型(步骤403)，并且一旦使全部三个置信度模型独立地且/或同时满足(步骤404)，就使用预测模块204来估计流体最优地扩散在整个生物学样本中的时间或固定的时间(步骤405)。在一些实施例中，使用与使三个置信度模型独立地且/或同时满足的时间点相对应的TOF数据来估计流体最优地扩散在整个生物学样本中的时间或固定的时间。
本文进一步描述了不同的置信度模型中的每一者以及独立地“满足”不同的置信度模型的预定的阈值标准的示例。展示过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型及其预测能力的示例时间过程描述于实例1中且展示于图5至图9中。
在一些实施例中，在每个新的相继TOF数据点由信号处理模块202得出并由信号建模模块203接收之后，基于新接收的TOF数据点来更新(重新计算)置信度模型中的每一者。在一些实施例中，当新的TOF数据作为输入来接收时，连续地(例如，每0.2秒、每0.5秒、每1秒、每5秒、每10秒、每20秒、每30秒、每60秒等等)重新计算至少两个置信度模型。在其他实施例中，当新的TOF数据作为输入来接收时，连续地(例如，每0.2秒、每0.5秒、每1秒、每5秒、每10秒、每20秒、每30秒、每60秒等等)重新计算三个置信度模型中的每一者。
在一些实施例中，每0.2秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据(例如，以新接收的TOF数据点)重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每0.5秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每0.7秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每1秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每1.5秒至少接收一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每2秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每3秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每4秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每5秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每10秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。
在一些实施例中，每15秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每20秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每25秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每30秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每35秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每40秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每45秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每50秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每55秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每60秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每65秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。
在一些实施例中，每70秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每80秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每90秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每100秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每110秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。在一些实施例中，每120秒接收至少一次新的TOF数据，并且然后以新接收的TOF数据重新计算置信度模型中的每一者。
过去置信度模型
过去置信度模型确定一种或多种流体(包括一种或多种固定剂)在整个生物学样本中的经测量的扩散速率已否已经由TOF系统一致解析。换句话说，过去置信度模型用于确立候选TOF数据点与一个或多个先前收集的TOF数据点一致。举例来说，过去置信度模型可以用于确立以例如时间间隔12记录的候选TOF数据点与以时间间隔11、10、9、8、7和6中的每一者记录的经收集的TOF数据点一致。
根据菲克第一定律，预计流体(包括一种或多种固定剂)在整个生物学样本中的扩散可以通过单个参数(即扩散常数)来描述。在一些实施例中，生物学样本的扩散可以由如由经计算的衰减常数(参见例如，使用信号处理模块202来计算的衰减常数)支配的单指数衰减来表征。在一些实施例中，如果经计算的衰减常数随着时间的推移显著地改变(例如，对于随着时间的推移而接收的经相继接收的TOF数据点)，则表明扩散剖面不能收敛至“真实”剖面。换句话说，并且在生物学样本的固定的上下文中，随着时间的推移(例如历经预定数量的经相继接收的TOF数据点)而计算的经相继计算的衰减常数的广泛改变表明算出的扩散速率尚未表示固定剂在整个生物学样本中的真实扩散速率；而随着时间的推移(例如历经预定数量的经相继接收的TOF数据点)相对一致的衰减常数表明经计算的扩散速率表示固定剂在整个生物学样本中的真实扩散速率。
在一些实施例中，过去置信度模型从信号处理模块202或与其通信的存储器201或存储子系统240检索到一个或多个经得出的TOF数据点和/或一个或多个衰减常数作为输入，并确定经测量的扩散速率是否已经历经预定数量的经接续得出的TOF数据点在某个预定的阈值裕度内得到一致解析。在一些实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达3个经接续得出的TOF数据点。在其他实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达4个经接续得出的TOF数据点。在又一些实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达5个经接续得出的TOF数据点。在进一步的实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达6个经接续得出的TOF数据点。在又进一步的实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达7个经接续得出的TOF数据点。在更进一步的实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达8个经接续得出的TOF数据点。在甚至更进一步实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达9个经接续得出的TOF数据点。在其他实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达10个经接续得出的TOF数据点。在又一些实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达12个经接续得出的TOF数据点。在进一步的实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达15个经接续得出的TOF数据点。在又进一步的实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达18个经接续得出的TOF数据点。在更进一步的实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达21个经接续得出的TOF数据点。在甚至更进一步实施例中，经测量的扩散速率必须在预定的阈值裕度内得到一致解析达24个经接续得出的TOF数据点。
在一些实施例中，当与多个经接续得出的TOF数据点相对应的预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数各自经确定在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，使经计算的过去置信度模型满足(即，满足预定的过去置信度模型阈值标准)。在一些实施例中，使用一种或多种收敛测试算法来确定经计算的候选衰减常数是否符合或满足预定的过去置信度模型阈值标准。在一些实施例中，收敛测试算法选自绝对收敛、交错级数测试、直接比较测试、积分测试、极限比较测试、p级数收敛、比率测试、根测试、柯西并项测试、阿贝尔测试、狄利克雷测试、拉贝-杜哈梅测试、伯特兰测试和高斯测试。
在一些实施例中，收敛测试包括：(i)计算候选TOF数据点的候选衰减常数以提供“理论值”；(ii)基于与随时间计算且在候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点相对应的预定数量的经计算的衰减常数来算出平均衰减常数，以提供“实验值”；(iii)基于经计算的理论值和算出的实验值来确定实际百分比误差；以及(iv)将经确定的百分比误差与预定的阈值百分比值进行比较。在一些实施例中，实际百分比误差是通过等式(10)算出的：
％误差＝((算出的理论值–经计算的实验值)/算出的理论值)x 100(10)
在一些实施例中，平均衰减常数是通过以下得出的：(i)从存储器202或存储子系统240检索针对候选TOF数据点之前的预定数量的经接续得出的TOF数据点中的每一者的经计算的衰减常数；以及(ii)对检索到的经计算的衰减常数中的每一者求平均。在一些实施例中，候选TOF数据点为最近接收的经得出TOF数据点；并且平均衰减常数基于针对候选TOF数据点之前的预定数量的经接续得出的TOF数据点的经计算的衰减常数。举例来说，候选TOF数据点可以处于时间间隔10，而平均衰减常数是基于在时间间隔9、8、7、6和5获取的TOF数据点来计算的。
在一些实施例中，基于候选TOF数据点之前的至少2个TOF数据点来计算平均衰减常数。在其他实施例中，基于候选TOF数据点之前的至少3个TOF数据点来计算平均衰减常数。在其他实施例中，基于候选TOF数据点之前的至少4个TOF数据点来计算平均衰减常数。在其他实施例中，基于候选TOF数据点之前的至少5个TOF数据点来计算平均衰减常数。在其他实施例中，基于候选TOF数据点之前的至少6个TOF数据点来计算平均衰减常数。在其他实施例中，基于候选TOF数据点之前的至少7个TOF数据点来计算平均衰减常数。在其他实施例中，基于候选TOF数据点之前的至少8个TOF数据点来计算平均衰减常数。在其他实施例中，基于候选TOF数据点之前的至少9个TOF数据点来计算平均衰减常数。在其他实施例中，基于候选TOF数据点之前的至少10个TOF数据点来计算平均衰减常数。
在一些实施例中，预定的阈值百分比值小于约5％。在其他实施例中，预定的阈值百分比值小于约4％。在又一些实施例中，预定的阈值百分比值小于约3％。在一些实施例中，预定的阈值百分比值在约1％与约3％之间。在其他实施例中，预定的阈值百分比值在约1.5％与约3％之间。在又一些实施例中，预定的阈值百分比值在约1.75％与约2.5％之间。在进一步的实施例中，预定的阈值百分比值在约1.75％与约2.25％之间。在一些实施例中，预定的阈值百分比值为约2％。
在一些实施例中，当与至少5个经接续得出的TOF数据点相对应的至少5个经计算的候选衰减常数各自在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，使过去置信度模型满足。在其他实施例中，当与至少6个经接续得出的TOF数据点相对应的至少6个经计算的候选衰减常数各自在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，使过去置信度模型满足。在其他实施例中，当与至少7个经接续得出的TOF数据点相对应的至少7个经计算的候选衰减常数各自在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，使过去置信度模型满足。在其他实施例中，当与至少8个经接续得出的TOF数据点相对应的至少8个经计算的候选衰减常数各自在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，使过去置信度模型满足。在其他实施例中，当与至少9个经接续得出的TOF数据点相对应的至少9个经计算的候选衰减常数各自在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，使过去置信度模型满足。在其他实施例中，当与至少10个经接续得出的TOF数据点相对应的至少10个经计算的候选衰减常数各自在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，使过去置信度模型满足。
当前置信度模型
当前置信度模型用于确立存在预测未来TOF数据点的高统计置信度。虽然过去置信度模型确定跨预定数量的经接续得出的TOF数据点的扩散速率是否一致，但当前的置信度模型确定当前的TOF数据点是否与先前收集的TOF数据中的至少一些一致，从而有利于消除由过去置信度模型产生的误检。举例来说，如果当前置信度模型重复地计算相同的衰减常数但置信度较低，则当前置信度模型将正确地确定信号足够有效进行预测。
在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少20％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少30％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少40％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少50％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少60％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少70％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少80％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少90％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少95％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少98％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与至少99％的先前收集的TOF数据一致。在一些实施例中，当前置信度模型确立当前的TOF数据点是否与全部的先前收集的TOF数据一致。
在一些实施例中，当前置信度模型(i)从信号处理模块202或与其通信的存储器201或存储子系统240检索到经得出的TOF曲线(其包括直至当前置信度模型被计算的时间的一些或所有TOF数据点)和/或一个或多个经得出的衰减常数作为输入，(ii)基于检索到的经得出的TOF曲线和/或衰减常数来计算置信区间，并(iii)评定经计算的置信区间是否低于预定阈值。举例来说，当前置信度模型可以基于与经获得的TOF曲线内的所有TOF数据点相对应的经得出的衰减常数来计算95％置信区间，并评定经计算的置信区间是否低于预定的当前置信度模型阈值。
在一些实施例中，当前置信度模型的置信区间是通过以下来计算的：(a)使用TOF曲线的经获取的TOF数据点的部分或全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；以及(b)基于经进行的非线性回归拟合来算出检索到的经计算的衰减常数的置信区间。在一些实施例中，所有经计算的TOF数据点用于算出当前置信度模型。换句话说，直至置信区间被计算的时间点为止而计算的所有TOF数据点用于经计算的TOF曲线的非线性回归拟合；并且衰减常数的置信区间是由拟合算出的。在一些实施例中，算出非线性拟合和置信区间可以使用在以下处描述的过程来确定：https://www.astro.rug.nl/software/kapteyn/kmpfittutorial.html。
在其他实施例中，使用协方差矩阵和均方误差计算来训练matlab中的“nlpredci.m”算法(“非线性回归预测置信区间”)。
在一些实施例中，在得出每个新的TOF数据之后，例如在得出每个新的TOF数据点、TOF曲线和/或衰减常数之后，连续地计算当前置信度模型。当得出新的TOF数据时，重复上文所指出的拟合和统计分析。
如上文所指出，然后将经计算的置信区间与当前置信度模型阈值进行比较以确定是否满足条件。在一些实施例中，当前置信度模型阈值的范围在约0.1小时与约2小时之间。在一些实施例中，当前置信度模型阈值的范围在约0.1小时与约1.8小时之间。在一些实施例中，当前置信度模型阈值的范围在约0.1小时与约1.6小时之间。在一些实施例中，当前置信度模型阈值的范围在约0.2小时与约1.4小时之间。在其他实施例中，当前置信度模型阈值的范围在约0.3小时与约1.3小时之间。在其他实施例中，当前置信度模型阈值的范围在约0.4小时与约1.1小时之间。在其他实施例中，当前置信度模型阈值的范围在约0.5小时与约0.9小时之间。在其他实施例中，当前置信度模型阈值的范围在约0.6小时与约0.8小时之间。在又一些实施例中，当前置信度模型阈值为约0.7小时。
非线性回归为其中因变量或标准变量经建模为模型参数和一个或多个自变量的非线性函数。在一些实施例中，非线性回归分析将趋势建模为非线性函数，作为非限制性示例，该非线性函数可以为指数函数、对数函数、三角函数、幂级数函数或这些函数中的一者或多者的组合。非线性函数的具体参数可以通过以下来确定：将该函数“拟合”至图，诸如通过应用曲线拟合技术(最小二乘技术，作为非限制性示例)来最小化图与非线性函数之间的残差。在一些实施例中，非线性回归选自渐近回归/增长模型、逻辑斯谛群体增长模块或渐近回归/衰减模型。
未来置信度模型
未来置信度模型算出整个实验中信号(包括过去、当前和未来检索到的信号)的置信度。在此方面，未来置信度模型分析经接收的TOF数据点和/或TOF拟合与TOF信号的整体扩散剖面的一致程度。未来置信度模型与过去置信度模型和当前置信度模型不一样，因为该未来置信度模型考虑了扩散的幅度以及未来预测能力。过去置信度模型和当前置信度模型两者均适于着眼于如由衰减常数定义的TOF曲线的时间剖面。衰减常数(即，扩散速率)独立于流体交换的幅度或总量。未来模型着眼于模型在预测新的TOF数据点方面的置信程度，但涉及扩散速率和扩散的幅值。
因为据信已经收集到的数据的置信度往往很高，所以未来置信度模型被认为在实验开始时很难满足，并且随着实验在时间上前进，即，随着扩散在时间上继续进行，会得到改善。因此，该未来置信度模型针对在实验中过早确定TOF数据点是否有效提供了质量检查。举例来说，据信未来置信度模型可以用于阻止系统在错误的衰减速率经连续解析的情况下过早地将经接收的TOF数据点算作有效的。因此，据信未来置信度模型还可以改善系统对于异常大的样品的质量，该异常大的样品相比更标准的样品可能具有显著更多的流体交换。
在一些实施例中，对未来置信度模型的输入为从信号处理模块202或与其通信的存储器201或存储子系统240检索到的TOF曲线。在一些实施例中，未来置信度模型基于检索到的TOF曲线来计算置信区间并评定经计算的置信区间的平均值是否低于预定阈值。举例来说，在一些实施例中，置信区间是通过以下算出的：(a)使用经计算的TOF曲线的经计算的TOF数据点的全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；(b)从时间零至未来时间点基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间；以及(c)算出TOF曲线的平均置信区间。在一些实施例中，未来置信度模型可以计算跨长达预定时间量(例如，4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时等)的所有时间TOF曲线的95％置信区间的平均值。在一些实施例中，可以利用非线性回归拟合(如上文所描述)以基于检索到的TOF曲线来得出置信区间。
在一些实施例中，预定的未来置信度模型阈值为0.7ns。在一些实施例中，阈值为0.6ns。在其他实施例中，预定的未来置信度模型阈值为0.55ns。在其他实施例中，预定的未来置信度模型阈值为0.5ns。在其他实施例中，阈值为0.45ns。在其他实施例中，预定的未来置信度模型阈值为0.4ns。在其他实施例中，预定的未来置信度模型阈值为0.35ns。在其他实施例中，预定的未来置信度模型阈值为0.3ns。在其他实施例中，预定的未来置信度模型阈值为0.25ns。在其他实施例中，预定的未来置信度模型阈值为0.2ns。在其他实施例中，预定的未来置信度模型阈值为0.15ns。在其他实施例中，预定的未来置信度模型阈值为0.1ns。
预测模块
在一些实施例中，系统200进一步包括预测模块204，该预测模块适于基于从信号建模模块203接收的数据来预测流体最优地扩散在整个生物学样本中的估计时间或固定的估计时间。在计算至少两个置信度模型(步骤403)以及确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地和/或同时满足预定的阈值标准(步骤404)之后，然后使用预测模块204来算出流体最优地扩散在整个生物学样本中的估计时间或固定完成的估计时间(步骤405)。在一些实施例中，预测模块204使用使置信度模型中的至少两者独立地和/或同时满足的时间点处的TOF数据。举例来说，如果在2.5小时的时间，使至少两个置信度模型独立地满足，则预测模块204将使用在2.5小时的时间收集的TOF数据(例如，TOF数据点、TOF曲线和/或衰减常数)，因为这会是TOF数据将被视为有效的时间。换句话说，并且在生物学样本的固定的上下文中，一旦置信度模型中的至少两者独立地和/或同时满足预定的阈值标准，系统200就在该时刻确定来自生物学样本的TOF信号真正表示实际扩散速率，并预测组织将在何时正确固定。
在一些实施例中，使用本文所描述的TOF曲线来算出对流体最优地扩散至生物学样本中的时间的估计或对固定完成的时间的估计。在一些实施例中，在生物学样本内的单个位置处测量TOF曲线(参见等式(11))。在其他实施例中，以生物学样本在多个位置处测量TOF曲线(空间平均TOF曲线)(参见等式(12)。
在其中在单个位置处测量TOF曲线的实施例中，根据等式(11)估计流体最优地扩散至生物学样本中的时间或固定完成的时间：
其中t完成为扩散或固定完成的估计时间，并且符号|…|指示绝对值。在一些实施例中，T完成表示组织将以固定剂充分扩散的预测时间(以小时为单位)。
在其中使用空间平均TOF曲线的实施例中，可以根据等式(12)来算出流体最优地扩散至生物学样本中的时间或固定完成的时间：
其中t完成为扩散固定完成的时间(并且表示预测组织将充分扩散的时间(以小时为单位))，τ平均为组织的空间平均衰减常数；并且m为TOF曲线的归一化阈值斜率(“阈值”意味着当斜率减小至“阈值”的值时，扩散已经减慢到足以使组织足够正确地扩散，以便我们的模型预测该组织将正确染色)。在一些实施例中，m阈值为0.074。
在一些实施例中，并且在生物学样本的固定的上下文中，在确定固定的预测时间之后，使生物学样本浸没在固定剂中，直至达到预测固定时间，当然假设固定的预测时间在未来。另一方面，如果固定的预测时间在当前或在过去，则从固定溶液取出生物学样本。一旦经最优固定，生物学样本就可以用在进一步的下游处理中。
生物学样本内的一种或多种生物标志物的标记
一旦生物学样本已充分固定，生物学样本就可以用在一个或多个下游过程中，例如，抗原修复、染色等。在一些实施例中，可以针对一种或多种生物标志物的存在来标记生物学样本且/或一旦固定完成(或估计完成)，就可以对其进行复染。举例来说，可以针对Ki-67和p16INK4a生物标志物的存在来对生物学样本进行染色。在一些实施例中，可以对针对一种或多种生物标志物的存在而染色的生物学样本进行成像，并随后使用一种或多种自动化图像分析算法(包括机器学习算法和/或“人工智能”)对其进行分析。
标记生物学样本内的一种或多种生物标志物的方法是本领域已知的。在一些实施例中，可检测部分(例如，半抗原、发色团、荧光团等)沉积至生物学样本内的靶标上或其近侧。在一些实施例中，发色团或可检测部分的共价沉积是使用酪酰胺信号放大(TSA)完成的，该TSA也称为催化报告沉积(CARD)。美国专利第5,583,001号(其公开内容据此通过引用整体并入本文)公开了一种使用分析物依赖性酶活化系统检测和/或定量分析物的方法，该系统依赖催化报告沉积来放大可检测标记物信号。通过使带标记的苯酚分子与酶反应来增强CARD或TSA方法中酶的催化作用。利用TSA的现代方法有效地增加了从IHC和ISH测定中获得的信号，同时不产生显著的背景信号放大(参见例如美国申请公开第2012/0171668号，其有关与酪酰胺扩增试剂的公开内容据此通过引用全文并入本文)。用于这些扩增方法的试剂正被应用于临床上重要的靶标，以提供先前无法实现的稳定的诊断能力(VENTANAOptiView扩增试剂盒，Ventana Medical Systems，Tucson AZ，目录号760-099)。
TSA利用作用于酪酰胺的辣根过氧化物酶(HRP)所催化的反应。在H2O2存在下，酪酰胺转化为高反应性和短寿命的自由基中间体，该自由基中间体优先与蛋白质上的富电子氨基酸残基反应。然后可以通过各种显色可视化技术和/或荧光显微镜检测共价结合的可检测部分。在IHC和ISH中，其中空间和形态学背景受到高度重视，自由基中间体的短寿命导致酪酰胺在靠近生成位点处与组织共价结合，从而在蛋白质和核酸靶标位置处产生离散的特异性信号。
在其他实施例中，使用醌甲基化物化学来执行发色团或可检测部分的共价沉积。于2019年1月1日授权的名称为“Quinone Methide Analog Signal Amplification”的美国专利号10,168,336(其公开内容特此通过引用以其整体并入本文)描述了一种与TSA一样可用于增加信号放大而不显著增加背景信号的技术(“QMSA”)。特别地，美国专利号10,168,336描述了新颖的醌甲基化物类似物前体以及使用这些醌甲基化物类似物前体检测生物学样本中的一个或多个靶标的方法。在特定实施例中，检测方法包括使样品与检测抗体或探针接触，然后使样品与包含碱性磷酸酶(AP)和结合部分的标记缀合物接触，其中该结合部分识别抗体或探针(例如，通过与半抗原或物种特异性抗体表位或其组合结合)。标记缀合物的碱性磷酸酶与包含可检测部分的醌甲基化物类似物前体相互作用，从而形成反应性醌甲基化物类似物，该反应性醌甲基化物类似物与生物学样本在靶标近侧或直接在靶标上共价结合。然后检测(诸如目视或通过成像技术)可检测标记物。美国专利第10,168,336号全文以引用方式并入本文。
另一种用于沉积可检测部分的技术采用“点击”化学来形成样品中可检测部分与形态学标志物或生物标志物之间的共价键。“点击化学”是一种化学原理，其由Sharpless和Meldal的研究组独立地定义，描述了定制以通过将小单元连接在一起而快速可靠地生成物质的化学过程。“点击化学”已应用于一组可靠并且自主的有机反应(Kolb,H.C.；Finn,M.G.；Sharpless,K.B.Angew.Chem.Int.Ed.2001,40,2004-2021)。在将可检测标记物共价沉积到生物学样本上的背景下，US2019/0204330中描述了一种点击化学技术，该专利通过引用以其整体并入本文。在该技术中，利用如上所述的酪酰胺沉积或同样如上所述的醌甲基化物沉积将能够参与点击化学反应的第一反应性基团共价锚定至生物学样本。该检测系统的第二组分具有对应的能够参与点击化学反应的第二反应性基团，其然后与第一反应基团反应以使该第二组分与生物学样本共价结合。
在特定实施例中，该技术包括使生物学样本与对第一靶标特异的第一检测探针接触。第一检测探针可以为一抗探针或核酸探针。随后，使样品与第一标记缀合物接触，该第一标记缀合物包含第一酶。在一些实施例中，第一标记缀合物为二抗，该二抗特定于一抗(诸如由其获得抗体的物种)或缀合至核酸探针的标记物(诸如半抗原)。接下来，使生物学样本与点击缀合物对的第一成员接触。第一酶切割具有酪酰胺或醌甲基化物前体的点击缀合物对的第一成员，从而将该第一成员转化为反应性中间体，该反应性中间体与生物学样本在第一靶标近侧或直接在第一靶标上共价结合。接下来，使点击缀合物对的第二成员与生物学样本接触，该点击缀合物对的第二成员包括第一报告部分(例如，发色团)和第二反应性官能团，其中第一击缀合物对的第二成员的第二反应性官能团能够与该点击缀合物对的第一成员的第一反应性官能团反应。最后，检测来自第一报告部分的信号。
生物标志物的示例
如本文所述，使用从多个差异地固定的训练生物学样本获取的训练光谱数据集来训练固定估计引擎。在一些实施例中，通过功能性IHC测试来验证已知固定持续时间的类别标签。以下鉴定的是生物标志物的非限制性实例，其表达可以通过功能性IHC染色来测定。某些标志物是特定细胞的特征，而其他标志物已鉴定为与特定疾病或病症相关联。已知预后标志物的实例包括酶标志物，例如半乳糖基转移酶II、神经元特异性烯醇酶、质子ATPase-2和酸性磷酸酶。激素或激素受体标志物包括人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促肾上腺皮质激素、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、雌激素受体、孕激素受体、雄激素受体、gC1q-R/p33补体受体、IL-2受体、p75神经营养受体、PTH受体、甲状腺激素受体和胰岛素受体。
淋巴标志物包括α-1-抗胰凝乳蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、B细胞标志物、bcl-2、bcl-6、B淋巴细胞抗原36kD、BM1(髓样标志物)、BM2(髓样标志物)、半乳凝素-3、颗粒酶B、HLA I类抗原、HLA II类(DP)抗原、HLA II类(DQ)抗原、HLA II类(DR)抗原、人中性粒细胞防御素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、κ轻链、κ轻链、λ轻链、淋巴细胞/组织细胞抗原、巨噬细胞标志物、胞壁酸酶(溶解酵素)、p80间变性淋巴瘤激酶、浆细胞标志物、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、T细胞抗原受体(JOVI 1)、T细胞抗原受体(JOVI 3)、末端脱氧核苷酸转移酶、非簇状B细胞标志物。
肿瘤标志物包括甲胎蛋白、载脂蛋白D、BAG-1(RAP46蛋白)、CA19-9(唾液酸化路易斯)、CA50(癌相关粘蛋白抗原)、CA125(卵巢癌抗原)、CA242(肿瘤相关粘蛋白抗原)、嗜铬粒蛋白A、凝聚素(载脂蛋白J)、上皮膜抗原、上皮相关抗原、上皮特异性抗原、表皮生长因子受体、雌激素受体(ER)、巨囊性病变液蛋白-15、肝细胞特异性抗原、HER2、调蛋白、人胃粘蛋白、人乳脂肪球、MAGE-1、基质金属蛋白酶、黑色素A、黑色素瘤标志物(HMB45)、间皮素、金属硫蛋白、小眼转录因子(MITF)、Muc-1核心糖蛋白。Muc-1糖蛋白、Muc-2糖蛋白、Muc-5AC糖蛋白、Muc-6糖蛋白、髓过氧化物酶、Myf-3(横纹肌肉瘤标志物)、Myf-4(横纹肌肉瘤标志物)、MyoD1(横纹肌肉瘤标志物)、肌红蛋白、nm23蛋白、胎盘碱性磷酸酶、前白蛋白、孕激素受体、前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、前列腺抑制肽、PTEN、肾细胞癌标志物、小肠粘液抗原、四连蛋白、甲状腺转录因子-1、基质金属蛋白酶组织抑制剂1、基质金属蛋白酶组织抑制剂2、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1、绒毛蛋白、血管假性血友病因子、CD34、CD34、II类、CD51 Ab-1、CD63、CD69、Chk1、Chk2、卡环C-met、COX6C、CREB、细胞周期蛋白D1、细胞角蛋白、细胞角蛋白8、DAPI、肌间线蛋白、DHP(1-6二苯基-1,3,5-己三烯)、E-钙粘蛋白、EEA1、EGFR、EGFRvIII、EMA(上皮膜抗原)、ER、ERB3、ERCC1、ERK、E-选择蛋白、FAK、纤连蛋白、FOXP3、γ-H2AX、GB3、GFAP、巨蛋白、GM130、高尔基体蛋白97、GRB2、GRP78BiP、GSK3β、HER-2、组蛋白3、组蛋白3_K14-Ace[抗乙酰基-组蛋白H3(Lys 14)]、组蛋白3_K18-Ace[组蛋白H3-乙酰基Lys18)、组蛋白3_K27-TriMe、[组蛋白H3(三甲基K27)]、组蛋白3_K4-diMe[抗二甲基组蛋白H3(Lys 4)]、组蛋白3_K9-Ace[乙酰基-组蛋白H3(Lys 9)]、组蛋白3_K9-triMe[组蛋白3-三甲基Lys 9]、组蛋白3_S10-Phos[抗磷酸组蛋白H3(Ser 10),有丝分裂标志物]、组蛋白4、组蛋白H2A.X—5139-Phos[磷酸组蛋白H2A.X(Ser139)抗体]、组蛋白H2B、组蛋白H3_二甲基K4、组蛋白H4_三甲基K20-Chip grad、HSP70、尿激酶、VEGF R1、ICAM-1、IGF-1、IGF-1R、IGF-1受体β、IGF-II、IGF-IIR、IKB-αIKKE、IL6、IL8、整合素αVβ3、整合素αVβ6、整合素αV/CD51、整合素B5、整合素B6、整合素B8、整合素β1(CD 29)、整合素β3、整合素β5、整合素B6、IRS-1、Jagged 1、抗蛋白激酶Cβ2、LAMP-1、轻链Ab-4(Cocktail)、λ轻链,κ轻链、M6P、Mach 2、MAPKAPK-2、MEK 1、MEK 1/2(Ps222)、MEK 2、MEK1/2(47E6)、MEK1/2阻断肽、MET/HGFR、MGMT、线粒体抗原、有丝分裂跟踪器绿色FM、MMP-2、MMP9、E-钙粘蛋白、mTOR、ATP酶、N-钙粘蛋白、肾病蛋白、NFKB、NFKB p105/p50、NF-KB P65、Notch 1、Notch 2、Notch 3、OxPhos复合物IV、p130Cas、p38 MAPK、p44/42MAPK抗体、P504S、P53、P70、P70S6K、Pan钙粘蛋白、桩蛋白、P-钙粘蛋白、PDI、pEGFR、磷酸AKT、磷酸CREB、磷酸EGF受体、磷酸GSK3β、磷酸H3、磷酸HSP-70、磷酸MAPKAPK-2、磷酸MEK1/2、磷酸p38 MAP激酶、磷酸p44/42MAPK、磷酸p53、磷酸PKC、磷酸S6核糖体蛋白、磷酸Src、磷酸-Akt、磷酸-Bad、磷酸-IKB-a、磷酸-mTOR、磷酸-NF-κB p65、磷酸-p38、磷酸-p44/42MAPK、磷酸-p70 S6激酶、磷酸-Rb、磷酸-Smad2、PIM1、PIM2、PKCβ、足细胞标志蛋白、PR、PTEN、R1、Rb-4H1、Rb钙粘蛋白、核糖核苷酸还原酶、RRM1、RRM11、SLC7A5、NDRG、HTF9C、HTF9C、CEACAM、p33、S6核糖体蛋白、Src、存活蛋白、突触素、多配体蛋白聚糖4、踝蛋白、张力蛋白、胸苷酸合酶、结核菌素、VCAM-1、VEGF、波形蛋白、凝集素、YES、ZAP-70和ZEB。
细胞周期相关标志物包括凋亡蛋白酶启动因子-1、bcl-w、bcl-x、溴脱氧尿苷、CAK(cdk启动激酶)、细胞凋亡易感蛋白(CAS)、半胱天冬酶2、半胱天冬酶8、CPP32(半胱天冬酶-3)、CPP32(半胱天冬酶-3)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白G、DNA片段化因子(N-末端)、Fas(CD95)、Fas-相关死亡域蛋白、Fas配体、Fen-1、IPO-38、Mc1-1、微染色体保持蛋白、错配修复蛋白(MSH2)、聚(ADP-核糖)聚合酶、增殖细胞核抗原、p16蛋白、p27蛋白、p34cdc2、p57蛋白(Kip2)、p105蛋白、Stat 1α、拓扑异构酶I、拓扑异构酶IIα、拓扑异构酶IIIα、拓扑异构酶IIβ。
神经组织和肿瘤标志物包括αB晶状体蛋白、α-互联蛋白、α突触核蛋白、淀粉样前体蛋白、β淀粉样蛋白、钙结合蛋白、胆碱乙酰转移酶、兴奋性氨基酸转运蛋白1、GAP43、胶质纤维酸性蛋白、谷氨酸受体2、髓鞘碱性蛋白、神经生长因子受体(gp75)、神经母细胞瘤标志物、神经丝68kD、神经丝160kD、神经丝200kD、神经元特异性烯醇酶、烟碱乙酰胆碱受体α4、烟碱乙酰胆碱受体β2、外周蛋白、蛋白质基因产物9、S-100蛋白、SNAP-25、突触蛋白I、突触素、τ、色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、泛素。
聚类分化标志物包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CDw93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDw119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CDw125、CD126、CD127、CDw128a、CDw128b、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CDw150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166和TCR-ζ。
其他细胞标志物包括着丝粒蛋白-F(CENP-F)、巨蛋白、外皮蛋白、核纤层蛋白A&C[XB 10]、LAP-70、粘蛋白、核孔复合蛋白、p180层状体蛋白、ran、r、组织蛋白酶D、Ps2蛋白、Her2-neu、P53、S100、上皮标志物抗原(EMA)、TdT、MB2、MB3、PCNA和Ki67。
用于检测的又一些适合的标志物包括下表2中展现的标志物：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
表2
其他下游处理步骤和系统部件
本公开的系统200可以与生物学样本处理设备关联，该生物学样本处理设备可以对组织样本进行一个或多个制备过程，诸如在确定固定的估计时间之后和/或在生物学样本已经根据本公开来固定之后。制备过程可以包括但不限于标本去石腊、调理标本(例如，细胞调理)、标本染色、进行抗原检索、进行免疫组化染色(包括标记)或其他反应，和/或进行原位杂交(例如，SISH、FISH等)染色(包括标记)或其他反应，以及其他制备用于显微镜检查、显微分析、质谱方法或其他分析方法的标本的过程。
所述处理设备可以将固定剂涂在所述标本上。固定剂可以包括交联剂(例如醛类，如甲醛、聚甲醛和戊二醛，以及非醛类交联剂)、氧化剂(如金属离子和络合物，例如四氧化二锇和铬酸)、蛋白质变性剂(如乙酸、甲醇和乙醇)、机理不明的固定剂(如氯化汞、丙酮和苦味酸)、组合试剂(如Carnoy固定剂、Methacarn、Bouin液、B5固定剂、Rossman液和Gendre液)、微波以及其他固定剂(如排除体积固定和蒸汽固定)。
如果该标本为包埋在石蜡中的样品，则可以使用一种或多种适当的去石蜡流体对样品进行去石蜡。去除石蜡后，可在所述标本上连续涂抹任意数量的化学物质。这些物质可以用于预处理(如逆转蛋白质交联、暴露细胞酸等)、变性、杂交、洗涤(如严格洗涤)、检测(如将显示或标志物分子与探针连接)、扩增(如扩增蛋白质、基因等)、复染色、盖玻片等。
标本处理设备可以将各种不同的物质应用到标本。这些化学物质包括但不限于染色剂、探针、试剂、漂洗剂和/或调节剂。这些化学物质可以是流体(如气体、液体或气体/液体混合物)或类似物质。所述流体可以是溶剂(如极性溶剂、非极性溶剂等)、溶液(如水溶液或其他类型的溶液)或类似物质。试剂可以包括但不限于染色剂、润湿剂、抗体(如单克隆抗体、多克隆抗体等)、抗原回收液(如水基或非水基抗原修复液、抗原回收缓冲液等)或类似物质。探针可以是分离的细胞酸或分离的合成寡核苷酸，附接到可检测标签或报道分子上。标记可以包括放射性同位素、酶底物、辅助因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。如本文所用，术语“流体”是指任何液体或液体组合物，包括水、溶剂、缓冲液、溶液(例如，极性溶剂、非极性溶剂)和/或混合物。流体可以是含水的或非水的。流体的非限制性实例包括洗涤溶液、漂洗溶液、酸性溶液、碱性溶液、转移溶液和烃(例如烷烃、异烷烃和芳族化合物，诸如二甲苯)。在一些实施例中，洗涤溶液包含表面活性剂以促进洗涤液在载玻片的样本承载表面上的扩散。在一些实施例中，酸溶液包括去离子水、酸(例如乙酸)和溶剂。在一些实施例中，碱性溶液包括去离子水、碱和溶剂。在一些实施例中，转移溶液包括一种或多种二醇醚，例如一种或多种丙烯基二醇醚(例如丙二醇醚、二(丙二醇)醚和三(丙二醇)醚、乙二醇基二醇醚(例如，乙二醇醚、二(乙二醇)醚和三(乙二醇)醚)及其功能类似物。缓冲液的非限制性实例包括柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸、三(羟甲基)甲胺(TRIS)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(TAPS)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)及其组合。在一些实施例中，去掩蔽剂是水。在其他实施例中，缓冲溶液可以由三(羟甲基)甲胺(TRIS)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(TAPS)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)或其组合构成。美国专利申请公开号2016/0282374中描述了另外的洗涤溶液、转移溶液、酸溶液和碱性溶液，其公开内容通过引用以其全文并入本文。
染色可以用组织化学染色模块或单独的平台，诸如自动化IHC/ISH载玻片染色器来进行。自动IHC/ISH载玻片染色器通常至少包括：染色方案中使用的各种试剂的储液器、与储液器流体连通的用于将试剂分配到载玻片上的试剂分配单元、用于从载玻片上去除使用的试剂或其他废物的废物清除系统，以及用于协调试剂分配单元和废物清除系统的动作的控制系统。除了执行染色步骤外，许多自动载玻片染色器还可以执行染色辅助步骤(或与执行此类辅助步骤的单独系统兼容)，包括：载玻片烘烤(用于将样品粘附到载玻片上)、脱蜡(也称为脱石蜡)、抗原修复、复染、脱水和清除以及盖玻。全文以引用方式并入本文的Prichard,Overview of Automated Immunohistochemistry,Arch Pathol Lab Med.,第138卷,第1578–1582页(2014)描述了自动化IHC/ISH载玻片染色器的几个具体实例及其各种特征，包括intelliPATH(Biocare Medical)、WAVE(Celerus Diagnostics)、DAKO OMNIS和DAKO AUTOSTAINER LINK 48(Agilent Technologies)、BENCHMARK(Ventana MedicalSystems,Inc.)、Leica BOND和Lab Vision Autostainer(Thermo Scientific)自动化载玻片染色器。此外，Ventana Medical Systems,Inc.是公开用于执行自动分析的系统和方法的多项美国专利的受让人，包括美国专利号：5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029，以及美国公开专利申请号：20030211630和20040052685，它们中各自的全文以引用方式并入本文。如本文所用，术语“试剂”是指包含一种或多种能够与另一实体共价或非共价反应、偶联、相互作用或杂交的一种或多种试剂的溶液或悬浮液。此类试剂的非限制性实例包括特异性结合实体、抗体(第一抗体、第二抗体或抗体缀合物)、核酸探针、寡核苷酸序列、检测探针、带有反应性官能团或受保护官能团的化学部分、酶、染料或染色剂分子的溶液或悬浮液。
市售染色装置通常按照以下原理之一运行：(1)打开单个载玻片染色，其中载玻片水平放置，并且试剂作为包含组织样品的载玻片表面上的潭(puddle)分配(诸如在DAKOAUTOSTAINER Link 48(Agilent Technologies)和intelliPATH(Biocare Medical)染色器上实现)；(2)液体覆盖技术，其中试剂被沉积在样品上的惰性流体层覆盖或通过沉积在样品上的惰性流体层分配(诸如在VENTANA BenchMark和DISCOVERY染色器上实现)；(3)毛细间隙染色，其中将载玻片表面放置靠近另一个表面(其可能是另一个载玻片或盖板)以形成狭窄的间隙，毛细管力通过该间隙吸引液体试剂并使液体试剂与样品接触(诸如DAKOTECHMATE、Leica BOND和DAKO OMNIS染色器所使用的染色原理)。毛细管间隙染色的一些迭代不会将间隙中的流体混合(诸如，在DAKO TECHMATE和Leica BOND上)。在称为动态间隙染色的毛细管间隙染色的变体中，使用毛细管力将样品施加到载玻片上，然后将平行表面彼此相对平移以在孵育期间搅动试剂以实现试剂混合(诸如，在DAKO OMNIS载玻片染色器(Agilent)上实施的染色原理)。在平移间隙染色中，可平移头部位于载玻片上。该头部的下表面与载玻片间隔开足够小的第一间隙，以允许在载玻片平移期间由载玻片上的液体形成液体弯液面。横向尺寸小于载玻片宽度的混合延伸部从可平移头部的下表面延伸以在混合延伸部和载玻片之间限定小于第一间隙的第二间隙。在头部平移期间，混合延伸部的横向尺寸足以在载玻片上的液体中产生沿基本上从第二间隙延伸到第一间隙的方向的横向运动。参见WO 2011-139978 A1。最近有提议使用喷墨技术在载玻片上沉积试剂。参见WO2016-170008 A1。染色技术列表并不旨在全面，并且可以将用于执行生物标志物染色的任何全自动或半自动系统整合到组织化学染色平台中。
在还需要形态学染色样品的情况下，可以使用自动化H&E染色平台。用于执行H&E染色的自动化系统通常按照以下两种染色原理之一运行：批量染色(也称为“浸泡”)或单独载玻片染色。批量染色器通常使用在其中同时浸入许多载玻片的桶或槽。另一方面，单独载玻片染色器直接将试剂施加至每个载玻片，并且没有两个载玻片共享相同等分的试剂。市售的H&E染色器的实例包括：来自罗氏公司的VENTANA SYMPHONY(单独载玻片染色器)和VENTANA HE 600(单独载玻片染色器)系列H&E染色器；来自Agilent Technologies的DakoCoverStainer(批量染色器)；来自Leica Biosystems Nussloch GmbH的Leica ST4020小型线性染色器(批量染色器)、Leica ST5020多级染色器(批量染色器)和Leica ST5010自动染色器XL系列(批量染色器)H&E染色器。
在样本被染色之后，可以在显微镜上手动分析被染色的样本，和/或可以获取被染色的样品的数字图像用于存档和/或数字分析。数字图像可以经由可以20x、40x或其他放大倍数扫描被染色的载玻片的扫描平台(诸如载玻片扫描仪)来捕获数字图像，以产生高分辨率的全载玻片数字图像。在基本层面上，典型的载玻片扫描仪包括至少：(1)带透镜物镜的显微镜，(2)光源(诸如卤素、发光二极管、白光和/或多光谱光源，具体取决于染料)，(3)可四处移动载玻片或在载玻片周围移动光学器件或两者的自动装置，(4)一个或多个用于图像捕获的数码相机，(5)可控制自动装置并操纵、管理和查看数字载玻片的计算机和关联软件。载玻片上多个不同X-Y位置处(以及在某些情况下，在多个Z平面处)的数字数据由相机的电荷耦合装置(CCD)捕获，并将图像结合在一起形成整个扫描表面的合成图像。实现这一点的常用方法包括：
(1)基于平铺的扫描，其中载玻片台或光学器件以非常小的增量移动以捕获方形图像帧，这些方形图像帧与相邻的方块有轻微程度的重叠。然后将捕获的方块自动相互匹配以构建合成图像；以及
(2)基于线的扫描，其中载玻片台在采集期间沿单轴移动，以捕获多个合成图像“条”。然后可以将图像条相互匹配以形成更大的合成图像。
各种扫描仪(荧光和明场两者)的详细概述可见于Farahani等人，Whole slideimaging in pathology:advantages,limitations,and emerging perspectives,Pathology and Laboratory Medicine Int’l，第7卷，第23–33页(2015年6月)，该文献的内容全文以引用方式并入本文。市售载玻片扫描仪的示例包括：3DHistech PANNORAMIC SCANII；DigiPath PATHSCOPE；Hamamatsu NANOZOOMER RS、HT和XR；Huron TISSUESCOPE 4000、4000XT和HS；Leica SCANSCOPE AT、AT2、CS、FL和SCN400；Mikroscan D2；Olympus VS120-SL；Omnyx VL4和VL120；PerkinElmer LAMINA；Philips ULTRA-FAST SCANNER；SakuraFinetek VISIONTEK；Unic PRECICE 500和PRECICE 600x；VENTANA ISCAN COREO和ISCANHT；以及Zeiss AXIO SCAN.Z1。其他示例性系统和特征可见于例如WO2011-049608或于2011年9月9日提交的题为“IMAGING SYSTEMS,CASSETTES,AND METHODS OF USING THE SAME”美国专利申请号61/533,114，上述文献的内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施例中，任何成像可以使用美国专利第10,317,666和10,313,606号中公开的任何系统来实现，该美国专利的公开内容通过引用全文并入本文。成像设备可以是明场成像仪，诸如由Ventana Medical Systems公司出售的iScan CoreoTM明场扫描仪或DP200扫描仪。
在某些情况下，可以在图像分析系统或模块上分析获取的图像。图像分析系统可以包括一个或多个计算装置，诸如台式计算机、膝上型计算机(笔记本电脑)、平板电脑、智能手机、服务器、专用计算装置或任何能够执行本文描述的技术和操作的其他一种或多种类型的一个或多个电子装置。在一些实施例中，图像分析系统可以实现为单个装置。在其他实施例中，图像分析系统可以实现为一起实现本文讨论的各种功能的两个或更多个装置的组合。例如，图像分析系统可以包括通过一个或多个局域网和/或广域网(诸如因特网)彼此通信联接的一台或多台服务器计算机和一台或多台客户端计算机。图像分析系统通常至少包括存储器、处理器和显示器。存储器可包括任何类型的易失性或非易失性存储器的任何组合，诸如随机存取存储器(RAM)、只读存储器(诸如电可擦可编程的只读存储器(EEPROM)、闪存、硬盘驱动器、固态驱动器、光盘等)。可以理解，存储器可以包含在单个装置中并且也可以分布在两个或更多个装置上。处理器可包括一个或多个任何类型的处理器，诸如中央处理器(CPU)、图形处理器(GPU)、专用信号或图像处理器、现场可编程门阵列(FPGA)、张量处理器(TPU)等等。可以理解，处理器可以包含在单个装置中并且也可以分布在两个或更多个装置上。显示器可以使用任何合适的技术来实现，诸如LCD、LED、OLED、TFT、等离子等。在一些实现方案中，显示器可以是触敏显示器(触摸屏)。图像分析系统还通常进一步包括存储在存储器上的软件系统，该软件系统包括可在处理器上实施的一组指令，该指令包括各种图像分析任务，诸如对象识别、染色强度量化等。可用于实现如本文所公开的模块的示例性市售软件包包括：VENTANA VIRTUOSO；Definiens TISSUE STUDIO、DEVELOPER XD和IMAGEMINER；以及Visopharm BIOTOPIX、ONCOTOPIX和STEREOTOPIX软件包。
标本处理完毕后，用户可以将标本载片运送到成像设备上。在一些实施例中，所述成像设备是明视野成像器载片扫描仪。一种明场成像器是由Ventana Medical Systems,Inc.销售的iScan Coreo明场扫描仪。在自动化实施例中，成像设备是题为“IMAGINGSYSTEM AND TECHNIQUES”的国际专利申请第PCT/US2010/002772号(专利公开号：WO/2011/049608)或于2011年9月9日提交的题为“IMAGING SYSTEMS,CASSETTES,AND METHODS OFUSING THE SAME”的美国专利公开第61/533,114号中公开的数字病理装置。国际专利申请第PCT/US2010/002772号和美国专利申请第61/533,114号的公开内容通过引用整体并入本文。
本说明书描述的主题和操作的实施例可以在数字电子电路，或在计算机软件、固件或硬件中实现，包括本说明书公开的结构及其类似结构，或它们中的一个或多个组合。本说明书所述主题的实施例可作为一个或多个计算机程序来实现，例如作为一个或多个计算机程序指令模块来实现，所述一个或多个计算机程序指令模块可在计算机存储介质上编码，以便由数据处理设备执行或控制数据处理设备的操作。本文所述的任何模块均可以包括由所述处理器执行的逻辑。本文所使用的“逻辑”是指具有任何形式的可影响处理器操作的指令信号和/或数据的信息。软件是逻辑的一个实例。
计算机存储介质可以是或可包含在计算机可读存储设备、计算机可读存储基片、随机或串行存取存储器阵列或设备，或它们的一个或多个组合中。此外，尽管计算机存储介质不是传播信号，但它可以是在人工生成的传播信号中编码的计算机程序指令的源或目的。所述计算机存储介质也可以是或可包含在一个或多个单独的物理组件或介质(如多个CD、磁盘或其他存储设备)中。本说明书中所述的操作可以以由数据处理设备对存储在一个或多个计算机可读存储设备上或从其他来源接收的数据进行的操作来实现。
术语“编程处理器”涵盖处理数据的各种设备、装置和机器，例如包括可编程微处理器、计算机、芯片上系统、或上述的多个或组合。所述设备可以包括特殊用途的逻辑电路，如FPGA(现场可编程门阵列)或ASIC(特定用途集成电路)。除硬件外，所述设备还可以包括为所述有关计算机程序创建执行环境的代码，例如，构成处理器固件、协议栈、数据库管理系统、操作系统、跨平台运行时环境、虚拟机或它们的一个或多个组合的代码。设备和执行环境可以实现各种不同的计算模型基础架构，例如，网络服务、分布式计算和网格计算基础架构。
计算机程序(也称为程序、软件、软件应用程序、脚本或代码)可以用任何形式的编程语言编写，包括编译型或解释型语言、说明性语言或程序化语言，并且它可以任何形式部署，包括作为独立程序或作为模块、组件、子程序、对象或其他适合在计算环境中使用的单元。计算机程序可以但不必与文件系统中的文件相对应。程序可以存储在保存其他程序或数据的文件的部分(如存储在标记语言文件中的一个或多个脚本)中，也可以存储在专门用于有关程序的单个文件中，或者存储在多个协调的文件(如存储一个或多个模块、子程序或代码部分的文件)中。计算机程序可以部署在一台计算机上执行，也可以部署在多台计算机上执行，这些计算机位于一个站点或分布在多个站点，并通过一个通信网络相互连接。
本说明书中描述的过程和逻辑流程可以由一个或多个执行一个或多个计算机程序以通过对输入数据的运算并产生输出结果完成操作的可编程处理器来执行。所述过程和逻辑流程也可以由特殊用途的逻辑电路执行，如FPGA(现场可编程门阵列)或ASIC(特定用途集成电路)，并且，设备也可实现为特殊用途的逻辑电路。
例如，适用于执行计算机程序的处理器包括通用和专用微处理器，以及数字计算机的任何一种或多种的处理器。一般来说，处理器将从只读存储器或随机存取存储器或两者接收指令和数据。计算机的基本元件是一个按照指令执行操作的处理器和一个或多个存储指令和数据的存储设备。一般来说，计算机还将包括或操作性地耦接至一个或多个用于存储数据的大容量存储装置(磁盘、磁光盘或光盘)以从其接收数据或向其传输数据，或者两者兼有。但是，计算机不需要这样的装置。此外，计算机可以嵌入另一个装置，如移动电话、个人数字助理(PDA)、移动音频或视频播放器、游戏控制器、全球定位系统(GPS)接收器或便携式存储设备(如通用串行总线(USB)闪存驱动器)等。适合存储计算机程序指令和数据的装置包括各种形式的非易失性存储器、介质和存储器装置，包括举例来说半导体存储器装置，例如，EPROM、EEPROM和闪速存储器装置；磁盘，例如，内部硬盘或可移动盘；磁光盘；以及CD-ROM和DVD-ROM盘。处理器和存储器可以由特殊用途的逻辑电路系统补充，或并入其中。
为了方便与用户的交互，本说明书所述主题的实施例可以在计算机上实现，所述计算机具有向用户显示信息的显示装置，如LCD(液晶显示器)、LED(发光二极管)显示器或OLED(有机发光二极管)显示器，以及键盘和定点设备，如鼠标或轨迹球，所述用户可以通过它们实现对计算机的输入。在一些实施方式中，触摸屏可用于显示信息和接收用户的输入。其他种类的装置也可用于方便与用户的交互；例如，向用户提供的反馈可以是任何形式的感觉反馈，如视觉反馈、听觉反馈或触觉反馈；并且可以以任何形式接收用户的输入，包括声音、语音或触觉输入。此外，计算机可以通过向用户使用的装置发送文件以及从该装置接收文件实现与用户的交互；例如，通过响应从用户客户端设备上的网络浏览器接收的请求而向所述网络浏览器发送网页。
本说明书所述主题的实施例可以在计算系统中实现，所述计算系统包括后端组件，如作为数据服务器，或者包括中间软件组件，如应用服务器，或者包括前端组件，如具有图形用户界面或Web浏览器的客户端计算机，用户可以通过所述浏览器与本说明书所述主题的实施方式进行交互，或者一个或多个此类后端、中间软件或前端组件的任意组合。所述系统的各组件可以通过数字数据通信的任何形式或介质(如通信网络)相互连接。通信网络的实例包括局域网(“LAN”)和广域网(“WAN”)、互联网络(如互联网)和对等网络(如专设对等网络)。例如，图2的网络20可以包括一个或多个局域网。
所述计算系统可以包括任何数量的客户端和服务器。通常，客户端和服务器之间彼此是远程设置，并且一般情况下通过一个通信网络进行交互。借助运行在各自计算机上的计算机程序以及彼此之间的客户端-服务器关系产生客户端和服务器之间的关系。在一些实施例中，服务器将数据(如HTML页面)传输到客户端设备(如用于向与所述客户端设备交互的用户显示数据和接收该用户的输入)。在所述客户端设备上产生的数据(如用户交互的结果)可以在所述服务器上从所述客户端设备接收。
对浸没在一种或多种固定剂中的样品计算TOF的其他方法
在一些实施例中，可以由声学探针系统基于福尔马林浸泡的组织样品的不同声学属性来监测扩散速率。用于扩散监测和实验TOF测量的此类系统进一步详细描述于美国专利公开号2013/0224791、2017/0284969、2017/0336363、2017/0284920和2017/0284859中，其公开内容各自通过以其整体引用并入本文。
用于TOF监测的合适系统和方法的进一步示例描述于PCT公开号WO2016/097163和美国专利公开号2017/0284859中，其内容也在它们与本公开不矛盾的范围内通过引用并入本文。所引用的申请描述了将实体组织样品与行进穿过组织样品并基本上在组织样品的整体厚度中扩散的液体固定剂接触，并基于经连续或周期性监测的声学特性对其进行分析，以评估组织样品在整个处理中的状态和状况。举例来说，相比间质流体具有更大的体积模量的固定剂诸如福尔马林可以在其置换间质液体时显著地改变TOF。组织样品的声学属性可能在液体剂(例如，液体固定剂)行进穿过该样品时发生变化。样品的声学属性可能在例如预浸泡过程(例如，冷固定剂的扩散)、固定过程、染色过程等期间发生变化。在固定过程(例如，交联过程)中，声能的传导速度可能随着组织样品变得交联更严重而发生变化。实时监测可以用于准确地追踪固定剂在整个样品中的移动。
实例
实例1-过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型中的每一者的时间过程示例
图5中展现了示出TOF数据收集的多个时间点的示例时间过程。在该系列图中，最初TOF曲线的预测能力非常差，如明显偏离最佳拟合黑线的大虚线所指示(参见顶部图)。随着收集更多的TOF数据，所有三个参数均发生相当大的改变(a至d)。在约2.83小时的主动扩散之后，模型确定组织的TOF曲线被认为是有效的，并预测在4.41小时的扩散之后，组织样品将正确染色。模型继续收集更多的数据，并将估计稍微延长至4.7小时，此时样品将被视为是良好固定的。
图6中呈现了过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型中的每一者的更详细版本，其中针对所有三个置信度模型的标准均相对于时间来绘制。从图中可以看出，最初使未来置信度模型和当前置信度模型满足，但随着收集更多的数据，标准被逆转。因此，在实验开始时不满足过去标准对于在TOF信号实际上无效时不将其算作有效是至关重要的。
图7呈现了针对结肠组织样品的标准选择的另一示例。在此特定示例中，在较早的时候使未来置信度模型和过去置信度模型满足，并且不认为组织有效，因为仍未使当前置信度模型满足。
图8示出了针对肾组织样品的标准选择的进一步示例。在此种情况下，未来置信度模型为最后要满足的置信度模型，而几乎立即使当前置信度模型满足。最初使过去置信度模型满足，但随后发生逆转。因此，不使未来置信度模型满足阻止组织在大约1.5小时的时间点被算作有效。
图9描绘了针对乳腺组织样品的标准选择的又一示例。在此种情况下，过去置信度模型和当前置信度模型来回“反弹”，但未来置信度模型直到2小时才得到满足，并且阻止信号在其实际有效之前被算作有效。
上述示例说明了三个置信度模型如何协同工作来创建其中TOF信号直到其实际有效时才经确定有效的系统和/或方法。TOF已被用于许多不同类型的组织，如已经公开的，并且已在(参见图10A)中得到证明。在此，使用来自多种类型的组织的105个样品来评估置信度模型的准确度并因此评估本文所描述的系统和方法的准确度。累积结果示出于图10B中，在该图中对接收有效拟合所需的时间与算出的最优固定时间进行绘图。平均来说，在105个样品中的102个(97％)中样品达到最优拟合之前，样本拟合收敛至有效拟合。平均来说，在2.04小时时组织经确定具有有效贴合，并且需要2.96小时的平均固定时间。这是重要的发现，因为这表明，平均来说，组织将在TOF信号被证明有效之后0.92小时是正确的。
评定采用本文所描述的三个置信度模型的系统和方法的准确度的另一方法为回顾性地比较收敛时与实验结束时的预测最优固定时间。这些结果绘制在图11A中。平均来说，作为收敛时间的最优固定时间与实验结束时仅相差0.45h，这指示高的准确度，因为两个值之间没有显著差异。另外，在收敛时，TOF曲线具有仅0.44ns的95％置信区间，并且衰减常数具有仅7分钟的95％置信区间(参见图11B)。这两个数字均非常低，并且与TOG信号被认为有效时的高保真度拟合一致。
实例2
说明书摘要
现代组织病理学建立在组织固定的基础原理之上，其在传统上使用室温甲醛水性甲醛(福尔马林)来将组织保存在栩栩如生的状态。尽管其至关重要，但目前还没有检测固定的分析方法，并且因此，在临床实践中，固定高度易变并且是重要的误差源。先前已表明，浸没在冷福尔马林中，接着浸没在经加热的福尔马林中，有利于组织形态的保存，因为在经加热的相中快速引发交联之前，冷相使甲醛能够畅通无阻且彻底地扩散。另外，新颖的双温度固定已经与可以主动检测扩散至组织中的福尔马林的超灵敏声学监测技术相结合。在此，已开发用以基于实时TOF信号来确定组织何时正确扩散的预测统计模型。已基于30个扁桃体核心的形态和特性扩散曲线来训练该模型。在测试模型中，用四种不同的方案来固定一组87个不同的扁桃体样品：根据所公开的预测算法进行动态固定(C/H:动态，N＝18)，黄金标准24小时室温(RT:24hr，N＝24)，在冷福尔马林中6小时，接着在经加热的福尔马林中1小时(C/H:6+1，N＝21)，以及在冷福尔马林中2小时，接着在经加热的福尔马林中1小时(N＝24)。对于使用动态固定方案来固定的样品，数字病理学分析揭示FOXP3染色在空间上是均匀的，其中染色覆盖水平在统计上相当于RT:24hr和C/H:6+1固定方案。为了进行比较，有意固定不充分的C/H:2+1样品显著抑制了FOXP3染色(p<0.002)。此外，所公开的动态固定方案产生与标准固定技术一致的bcl-2染色。经动态固定的样品平均仅浸没在冷福尔马林中持续4.2小时，代表显著的工作流程改进。这些结果证实所公开的经开发的系统可以正确地预测样品何时经充分固定并且将产生高质量的组织化学染色。事实上，已经成功地证明所公开的系统和方法允许实时地评定固定质量。最终，相信未来的组织学实验室可以利用此分析方法来标准化和优化组织固定，作为快速且经完整记录的分析前工作流程的一部分。
前言
临床组织处理技术用交联剂来“固定”组织，该交联剂关闭细胞内的新陈代谢并保存清晰明了的细胞形态。最流行的固定剂为10％中性缓冲福尔马林(NBF)，其为缓冲液中的甲醛水溶液，并且已使用持续一个多世纪(Fox等人，1985)。目前，正确的固定方案是通过针对正确形态特征检查经组织学染色的组织来根据经验确定的。取决于操作者、机构、组织类型和目标生物标志物，结果是形态充足和不良的混合体。此外，到检查形态时，提高组织的质量为时已晚，因此第一次正确的固定至关重要。
组织固定是耗时的过程，取决于组织的类型和大小，该过程通常需要花费数小时到数天。随着减少患者护理的周转时间的压力越来越大，正在引入快速固定方案。所采用的一个此类技术为提高固定剂的温度以增加交联速率(Ferris等人，2009；Iesurum等人，2006；Antunes等人，2006；Looi和Loh，2005；Hafajee和Leong，2004；Adams，2004；Morales等人，2002；Arber，2002；Ruijter等人，1997；Boon，1996；Ainley和Ironside，1994；Boon和Marani，1991；Kok和Boon，1990；Leong，1988；Boon等人，1988；Leong和Duncis，1986；Kok等人，1986；Boon、Kok和Ouwerkerk-Noordam，1986；Leong、Daymon和Milios，1985)。虽然这实际上是有效的，但使用增加的固定温度已引发许多对基于苏木精和伊红(H&E)染色的不令人满意的组织形态以及其他分子分析的变异性的报告，诸如常规免疫组织化学(IHC)染色(Durgun-Yucel等人，1992；Dawson，1972；Ericsson和Biberfeld，1967)。从生物学上讲，使用经加热的固定剂促使组织样品之外的蛋白质交联，同时损害固定剂尚未渗透的中间的蛋白质结构。一种产生优异的组织固定的更有前途的快速方法在两个温度区(冷+热)中使用10％NBF(Chafin等人，2013；Theiss等人，2014)。冷步骤允许甲醛正确地扩散至组织内部中，接着是短暂的经加热的阶段，其快速形成基于甲醛的交联。
当前还没有既定的主动监测甲醛进入组织的扩散或交联的实际形成的方法。扩散不充分的组织只会在固定剂已渗透的位置交联并固定，形成固定良好的组织的外环。不充分的固定是解剖病理学实验室中所报告的错误的主要原因(Mathews、Newbury和Housser，2011；Engel和Moore，2011；De Marzo等人，2002；Plebani等人，2015；Plebani，2015；Bonini等人，2002)。由于当前的组织固定方案缺乏实时监测，因此没有办法保证组织中有足够的甲醛浓度或者相反没有办法了解样品是否过度固定，这也会对染色质量产生不利影响(Singhal等人，2016；Arber，2002)。简单来说，当前的固定技术无法为组织处理实验室提供质量保证或追踪能力。这意味着当样品固定不正确时，如果完全能够再次采购另一样品，则需要花费巨大的返工。尽管存在数种静态检测扩散的方法，包括光学、超声和MRI，但这些检测机制尚未实行于组织处理以更好地保存癌症指标(Partridge等人，2012；Uhl M.，2014；Tanimoto等人，2007；和Schwille，2008；DuMond和Youtz，2004)。一些研究人员将组织浸泡在放射性甲醛中，并在暴露于照相胶片后测量流体穿透，作为扩散速率的测度(Helander，1994)。然而，实际上只有很少的放射物被并入组织，而且长暴露时间产生模糊且不可靠的结果。其他人员使用超声波监测来通过比较未经固定和经固定的组织的样品来查看交联(Oldenburg和Boppart，2010；Hall等人，2000；Bamber、Hill和King，1981；Bamber和Hill，1981；Bamber等人，1979；Bamber和Hill，1979)。最终，这些技术中没有一者实现实时地监测何时可以实施更改以保证出色的组织固定和正确的功能性染色。
因此，为了确保整个组织中存在足够的甲醛以保证正确的染色，开发了一种使用对福尔马林扩散的实时检测来优化组织固定的动态方法(诸如本文中所描述)。先前已经描述一种自动化系统，其可以使用声学飞行时间(TOF)技术来检测固定剂进入原始生物学组织的穿透，该声学飞行时间技术利用间质流体和福尔马林的离散声速(Bauer等人，2016)。当福尔马林扩散至组织样本中并取代可交换流体(例如，间质流体)时，组织的整体成分发生物理改变，产生TOF差异。随着福尔马林更快地扩散至样品中，组织的净声速增加，导致TOF信号的单调下降。本公开涉及一种实时统计模型和经定制修改的组织处理器系统，其确定样品何时足够充分扩散以从下游IHC测定产生高质量染色。
方法
组织获取和固定
根据带有批准方案的合同协议，从亚利桑那州图森当地的医院获得新鲜且未固定的人类扁桃体组织。来自当天的手术的整个扁桃体在生物危害品袋中的湿冰上运送至罗氏组织诊断公司。通过使用直径6mm的活检打孔器(Miltex#33至36)来获得精确大小的扁桃体组织样品。对于冷+热固定，将6mm扁桃体核心放置到预先冷却至4°的10％NBF(来自德克萨斯州休斯顿Fisher Scientific的饱和水性甲醛，用100mM磷酸盐缓冲液缓冲至pH 6.8至7.2)中。然后取出样品并将其放置到45℃NBF中持续另外的1小时以引发交联。其他打孔器放置到室温NBF中持续24小时，以作为针对固定良好的组织的阳性对照。额外的活检打孔器固定在组织盒中，并放置在自动化固定装置上的TOF传感器之间。固定后，将样品在商用组织处理机中进行处理，设定为过夜循环并且包埋至蜡中。
飞行时间测量
简单来说，将成对的4MHz聚焦换能器在空间上对齐，并将组织样品放置在它们的共同焦点处。将一个换能器编程为发出正弦脉冲，该正弦脉冲在穿过福尔马林和组织后由随附的换能器检测到，并且使用经接收的脉冲来算出渡越时间。通过测量仅穿过福尔马林的信号来获取初始校准TOF读数。在组织存在的情况下从TOF减去该基线读数，以将相位改变与组织分离。该检测方法同时分离了因扩散引起的声学TOF偏移，并补偿了福尔马林的环境诱导的波动。在每个组织样本中记录多次TOF测量，并记录空间平均信号作为组织的福尔马林扩散总体速率的代表。在实践中，来自多种组织类型的TOF扩散信号的形式与单指数衰减函数密切相关。(Lerch等人，2017)。
组织学
将石蜡组织块切成4μm厚的切片并放置于FisherbrandTM SuperfrostTM Plus显微镜载玻片(Thermo Fisher Scientific)上。在Ventana Medical Systems HE600自动化染色系统上用H&E对一个切片进行染色，以评估组织形态。另外，为了评估IHC染色强度和覆盖率，根据制造商方案在Ventana Benchmark Ultra XT自动化染色系统上，用二氨基联苯胺(DAB)染色剂针对抗FOXP3(SP33)或抗bcl-2(SP66)对每个块的连续切片进行染色。
统计建模
用于实时地算出TOF信号何时代表组织的实际扩散速率的统计模型最初是使用在MATLAB(Mathworks)中使用来自统计和机器学习工具箱的多个函数编写的定制开发代码来开发的。当最终模型被转移至实验室以便在我们的TOF扫描硬件上实现时，使用数个库(包括numpy、matplotlib、scipy和kapteyn)将该最终模型翻译成Python。
成像和图像处理
在全载玻片扫描仪(VENTANA iScan HT载玻片扫描仪)上以20倍放大倍率使用DAB染色剂和苏木精复染剂对每个载玻片进行成像。使用以MATLAB编写的定制开发软件包来分析图像。分割算法将整个组织切片与背景区分开来。独立的算法识别组织足迹内包括非染色组织(例如，孔、裂缝、基质)的区域，以产生围绕组织染色百分比的最具代表性的统计数据。对透射图像进行对数变换并进行光谱解混，以将DAB染色与苏木精复染分离。使用经解混的DAB浓度映射以使用全局阈值来确定哪些像素是DAB阳性的。还记录了原始DAB浓度，以便可以分析DAB染色的强度。为了研究不正确固定的影响，编写了算出到最近边缘像素的欧几里德距离以便可以针对不同固定方案研究DAB染色强度和DAB阳性率的算法。
结果
实时预测染色质量的标准
为了构建可以实时地预测最优固定质量的模型，需要了解福尔马林扩散与形态学属性之间的关系。根据菲克扩散定律，扩散主要由浓度梯度和时间支配。使用浸没在4℃NBF中接着在45℃NBF中1小时的人体扁桃体组织的6mm核心来进行数个时间过程实验(Lerch等人，2017)。在对多个实验进行分析后，确定最少3小时的冷NBF(C/H:3+1)产生可接受的组织形态。在冷NBF(C/H:5+1)中5小时后，组织形态得到改善，但另外的冷浸泡时间没有带来额外的益处。然后检查多个核心并证实C/H:5+1方案产生高质量染色，参见图12A中的累积结果。
在上一部分中，根据经验确定了产生高质量H&E染色所需的扩散时间。接下来，对人体扁桃体组织的扩散属性进行定量表征，以开发分析用以确定样品何时正确扩散的分析度量。数个完整的扁桃体组织被去除核心至直径为6mm。在冷(7±0.5℃)10％ NBF中测量总共38个6mm扁桃体样品。在38个样品中，监测14个持续3小时，并监测其余24个样品持续5小时。对于每个样品，(以1mm间隔)测量在整个样品中的扩散并算出空间平均TOF曲线。基于TOF的特性扩散信号与以下形式的单指数曲线高度相关：
其中C为以纳秒为单位的常数偏移，A平均为以纳秒为单位的指数衰减的振幅，并且τ平均为以小时为单位的组织平均衰减常数。经扫描持续3小时和5小时的样品具有分别为2.33小时和2.72小时的平均衰减常数。0.39小时的差值在统计上不显著，表明两个数据集忠实地衡量了同一物理现象。这证实TOF测量系统在长扩散时间和短扩散时间均产生一致且可再现的结果。
验证扩散监测系统后，对三十八(38)个6mm扁桃体样品的数据集进行分析，以找到每个组织的扩散属性与根据经验确定的产生理想下游染色所需的扩散时间之间的相关性。采用了多种分析技术，包括多变量分析、基于聚类的算法、信号导数的表征以及主成分分析。发现基于斜率的分析(物理上表示扩散速率)对在冷福尔马林中持续3小时(即，充分染色)与5小时(即，在整个样品中最优染色)的样品提供理想且有意义的区分。为了显著地减轻噪声并更准确地表示主动扩散速率，基于对单指数函数的拟合来算出TOF信号的导数。另外，通过对每个信号进行振幅归一化来实现两个数据集的理想区分，
其中m为t0时振幅归一化的TOF信号的导数，并且中括号表示每小时扩散的TOF变化百分比的斜率单位。图13A显示了每个样品分别在3小时和5小时时的归一化斜率。3小时时的平均扩散速率为-11.3％/hr，而5小时时的扩散速率显著减慢至-5.3％/hr，其中数个样品接近完全渗透平衡，如接近于零的扩散速率所指示。3小时和5小时时的归一化扩散速率的不同分布具有高度统计显著性(p<2e-15)，表明3小时与5小时时的扩散速率存在巨大且物理上真实的差异。因此，基于TOF的扩散度量与基于H&E的染色质量高度相关，表明我们的扩散监测系统如果经正确校准，基本上就能够预测最终的染色质量。鉴于此验证，针对达到NBF扩散标准速率所需的时间来求解下面的等式，
其中t完成为达到阈值斜率(m阈值)所需的时间，并且符号|…|指示绝对值。对于给定的组织特定衰减常数和归一化扩散速率，该等式可以用于算出样品在其将达到阈值扩散速率之前需要在冷福尔马林中多长时间。为了评估作为染色质量预测因子的扩散速率，选择三个阈值斜率值(m阈值＝-7.4％/hr、-8.0％/hr、-10.4％/hr)进行评估，如图13A中在视觉上所显示。需注意，大的绝对斜率值表示每小时更多的流体交换。因此，当样品的主动扩散减慢时，扩散速率将接近渗透平衡(即，0％/hr)。因此，较大的阈值斜率标准更快地预测样品具有足够的甲醛。这在图13B中针对人类扁桃体的代表性6mm片以图形方式示出，其中降低的扩散速率转化为较长的完成时间。
另外，每个数据集中针对组织的预估完成时间(3小时和5小时)显示在图13C至图13E中，如根据上面提供的等式算出的。举例来说，图13C显示了针对-10.4％/hr的最大阈值斜率的预估完成时间。此斜率标准预测平均完成时间为3.27小时。然而，样品中的六(6)者(16％)的预估完成时间少于3小时，并且根据我们先前的组织学染色结果，已知这些样品未整体充分扩散。另外，通过此斜率标准，会错误地识别一个样品。基于这些发现，当所有样品的扩散速率为-10.4％/hr时，该样品不得有足够的福尔马林来进行可接受的染色。-8.0％/hr的中间阈值斜率值产生两个数据集之间的理想区分，以及3与5小时之间的合理完成时间。然而，为了尽可能具有保守性，选择最低阈值斜率值-7.4％/hr作为样品何时将整体最优染色的标准。通过此度量，预估6mm扁桃体核心花费3.21小时与4.96小时之间的时间，从下游组织学染色来看，这被认为是合理的。基于这些实验和分析，一旦样品的归一化扩散的实时速率减慢至，
样品整体中就会具有足够的福尔马林，以保证理想且均匀的组织学染色。
实时验证TOF信号的统计模型
TOF技术的实际实施例需要在不存在组织真实时间扩散剖面的真实值评定的情况下以时间稀疏数据来分析扩散曲线。举例来说，预测样品何时被最优固定是基于在给定时间检测到的NBF扩散速率。然而，只有当组织的扩散曲线的指数拟合表示组织的实际扩散速率时，此预测才有效。特别是在实验开始时，当数据稀疏时，由于除了算出TOF时所固有的噪声之外的各种来源(例如，组织变形、热噪声、流体变量等)，检测到的扩散速率可能发生显著变化。为了克服这些限制，开发了用以验证TOF曲线何时收敛至组织的真实扩散剖面的统计模型，并且因此该统计模型足够准确以在样品是否充分固定方面进行预测。
所开发的方案为统计模型，其具有查询TOF信号的不同分量的三个独立部件。当在冷NBF扩散期间算出TOF数据点时，连续地重新计算所有三个部件。当使所有三个统计参数同时满足时，判断扩散剖面是准确的。
条件#1(过去置信度模型)：此条件确立目前的TOF拟合与先前收集的数据一致。在此示例中，单指数线的衰减常数必须收敛，如相对于先前6个衰减常数的平均值具有小于2％的差值的10个接续衰减常数所定义。
条件#2(当前置信度模型)：此条件确立当前收集的数据的统计置信度。在此示例中，最近衰减常数的95％置信区间必须低于0.7小时。
条件#3(未来置信度模型)：此条件确立存在足够的统计置信度来预测未来的TOF值。在此示例中，在所有时间(过去、当前和未来)上TOF信号的95％置信区间必须低于2ns。
一旦使所有三个统计条件满足，置信度模型就证实来自组织的TOF信号表示实际扩散速率，并且根据等式14以等式15中描述的阈值条件预测组织将在何时正确固定。实时统计模型的图形描绘显示在图14A中，在该图中TOF扩散信号在3.08小时时被判断为具有代表性，此时预测置信度模型计算出组织将在4.47小时时正确扩散。分别在图14B、图14C和图14D中绘制了对当前置信度模型、未来置信度模型和过去置信度模型的计算，直至使它们满足为止。
在先前收集的105条TOF曲线上测试了该方法的整体功效(Lerch等人，2017)。编写了其中通过统计模型分析先验数据以模拟其将在真实生活经验数据上如何表现的模拟。当模型验证信号时，最优固定的预测时间算出为在真实时间的27分钟以内，如通过在实验结束时的拟合所算出。收敛时衰减常数的统计置信度为±7分钟。这些结果证实模型实时地确定TOF信号何时表示组织的实际扩散速率，并证实基于该数据的预测是准确的。图14E绘制了验证特性扩散曲线的时间与预测的固定时间的图。平均来说，模型在样品正确扩散前55分钟收敛至有效拟合。这些结果详细说明了模型如何能够在生物标本最优扩散前近一小时确定该生物样本何时最优扩散，并且因此确立了基于TOF的扩散监测与固定质量的实时评定相耦合的商业实施例的可行性。
用IHC染色验证固定预测模型
为了确认所开发的预测模型可真正预测最终的染色质量，开发了用以客观且可重复地评估每个载玻片的染色水平的数字病理学工具。以单一标志物的DAB染色以及苏木精复染对IHC载玻片进行数字分析。获取每个载玻片的全载玻片扫描图。软件对组织进行分割，并且识别并去除未染色的区域，诸如结缔组织和基质。对于所有具有活性染色的区域，软件对组织的呈DAB阳性的百分比进行定量。另外，该软件算出边缘距离，定义为距组织样品的边界的最短可能距离。接下来算出组织的径向同心0.33mm“区”，以便可以在具有大致相等的福尔马林浓度的区域中分析染色。组织的此几何表示使得能够明确分析不正确固定的影响，因为福尔马林从外围扩散至组织中，导致组织的核心处逐渐减少的染色。算出直方图，绘制组织染色的百分比与距最近组织边缘的距离的图。最后，通过将经抑制的染色定义为小于边缘/最大阳性一半的DAB阳性，针对正确染色队组织的每个径向区进行分析。图15中呈现了图像分析工作流程的图形描绘。
为了确认所公开的系统和方法可以准确地实时确定组织何时最由扩散，对用四种固定方案中的一种进行差异固定的87个不同扁桃体核心进行大规模研究。对于所有固定方案，在以标准化方式处理固定组织，将其包埋在石蜡块中，并且然后切割载玻片并用DAB针对FOXP3和bcl-2对其进行染色。前三个固定方案为：冷NBF持续2小时，接着是经加热的NBF持续1小时(C/H:2+1，N＝24)；冷NBF持续6小时，接着是经加热的NBF持续1小时(C/H:6+1，N＝21)；以及室温NBF固定持续24小时(RT:24hr，N＝24)。最后，使用冷+热固定方法测试实时固定预测算法，其中将扁桃体放置在冷NBF中，直至我们的系统确定它们充分扩散，此时将它们移至经加热的福尔马林持续1小时以引发交联(C/H:动态，N＝18)。在此实验中，C/H:6+1和RT:24hr方案表示内部对照，因为已知这些固定方法产生高质量染色。替代性地，C/H:2+1样品表示有意固定不充分的组织。每种固定方法的染色模式的代表性图像显示在图16中。两种标准固定方案产生几乎均匀染色的组织，而C/H:2+1组织显著抑制了组织的中心处的染色。重要的是，来自C/H:动态方案的组织产生与两种金标准固定方案一致的均匀FOXP3染色。
此外，整个87个组织的研究的针对FOXP3染色的累积盒须图呈现在图17中。染色穿透深度(如由染色下降至其边缘值一半的距离所定义)绘制在图17A中，并且组织的经正确染色的区域绘制在图17B中。对于这两个度量，与其他三种固定方法相比，C/H:2+1样品表现出显著减少的染色(p<0.002)。重要的是，C/H:动态样品显示出与RT:24hr样品以及C/H:6+1样品一致的染色结果。另外，经动态固定的样品在冷NBF中持续仅4.2小时，意味着TOF预测算法产生与经传统固定的组织同样较佳地染色但速度快数小时的组织。另外，所有四种固定方案的针对FOXP3的平均空间染色剖面绘制在图17C中。经动态固定的样品同样显示出与C/H:6+1和RT:24hr固定一致的染色模式。这与组织中心处相比边缘处染色量少约70％的C/H:2+1样品形成鲜明对比。
讨论
组织学实验室中错误的主要来源是由固定不正确的组织引起的，导致降低的染色强度和不良的形态(Mathews、Newbury和Housser，2011；Engel和Moore，2011；De Marzo等人，2002)。在此项工作中，已表明，开发了首个组织固定系统，其能够实时地确定生物样本何时具有足够的甲醛以保证高质量固定，如来自下游IHC检测的理想且空间均匀的功能性染色所证明。以基于H&E的形态学以及来自扁桃体样品的特性扩散曲线的组合来训练预测算法。最终，我们的系统通过比较来自不同固定方案的染色结果得到验证。与24小时室温固定的目前临床金标准相比，扩散时间由我们的统计模型主动控制的经动态固定的样品发现具有等同的FOXP3和bcl-2染色。
在当今的组织学实验室中，组织固定的过程很大程度上由工作流程考虑，而非科学原理来主导，其中在不同机构，协议可能有显著差异。拥有多个非标准化程序的一个难处为无法跨多个站点轻松共享数据和结果。临床医师将极大地受益于从以相同固定方案处理的标准化样品收集的数据。举例来说，在分析预分析处理不正确的样品时，数字病理学算法可能输出不一致的结果。针对FOXP3和bcl-2染色，对正确固定的组织相比固定不良的样品报告了更一致的染色水平(图19)。标准化组织固定的另一益处为增加的效率，这将减少由于不良的质量或丢失的组织而导致的高成本返工量。此返工的成本通常由测试实验室承担，并且可以通过将标准化系统作为经完整记录的预分析工作流程的一部分来大大降低。
先前已证明，基于两个温度区的新颖固定方案可以更好地保存易变生物标志物，诸如磷蛋白和mRNA(Theiss，2017，Increased detection of RNA species inhistological tissues using a two temperature fixation protocol)。随着样品数量不断增加并且诊断测定依赖于下一代生物标志物，更快速和高效的技术(诸如双温度固定)将变得必要。本公开提供了一种系统，用以利用此通过使甲醛穿透标准化来固定组织的更高效的方法。组织学实践已经存在了几十年，并且这些实践很难改变。本文所描述的方法和器具利用相同的试剂(10％NBF)和程序(甲醛交联)，并且因此不会改变下游测定方案或结果。相反，这种以及其他更高效的组织标准化方法对于实现未来分析物的准确保存和定量是必要的。
在此项工作中，已经使用人类扁桃体样品中的FOXP3表达对系统和方法进行了测试和验证，然而，相信该系统和方法将适用于所有生物标志物和组织类型。举例来说，本文提供了与以我们的新颖固定方法忠实地保存bcl-2相关的附加数据。动态固定方案证明了与临床24小时室温固定相当的染色(比较图18和图19)。bcl-2的表达模式并未表现出对固定质量的严重依赖性，这是预期的，因为该bcl-2已知是强壮的临床生物标志物。这一结果强调，改进的固定对于易变生物标志物特别有益。对经差异固定的组织的染色强度的分析呈现在图20中。另外，先前已经生成34种不同组织类型的扩散数据，并且该扩散数据已表明，每种组织类型具有其自身的特性扩散速率，并且因此所公开的预测统计模型可以应用于多种组织类型(图20)(Bauer等人，2016)。
此技术的后续步骤中的一者为根据经验探索此预测算法在其他组织类型和生物标志物(特别是已知分析前敏感的生物标志物)上的用途。未来的工作将需要将我们目前的用扁桃体组织开发的标准扩展至多种组织类型，以便可以实现通用的固定标准。据推测，可以调整目前的计量学以创建可推广的模型，该可推广的模型可以最优地预测所有类型的组织何时被适当地固定。相信，未来的组织学实验室可以采用此分析方法作为可以确保并记录单独组织样品被最优地固定的随机存取自动化处理单元的一部分，并且真正将组织固定变换为一门科学。
参考文献
Adams,D，2004.“微波辅助快速组织处理(microwave-assisted rapid tissueprocessing)”，AmJ Clin Pathol,122:612-3；作者回复13-4。
Ainley,C.D.和J.W.Ironside.1994.“诊断神经病理学中的微波技术(microwavetechnology in diagnostic neuropathology)”，J Neurosci Methods，55:183-90。
Antunes,L.、K.Montagne、N.Weinbreck、L.Marchal、D.Thiebault、C.Bonnet、D.Gauche和F.Plenat.2006.“组织收缩在高温抗原修复中的可能角色(possible role oftissue shrinkage in high-temperature antigen retrieval)”，Histopathology，48:471-3。
Arber,D.A，2002.“长期福尔马林固定对乳腺标志物的免疫组织化学反应性的影响(effect of prolonged formalin fixation on the immunohistochemicalreactivity ofbreast markers)”，Appl Immunohistochem Mol Morphol,10:183-6。
Bamber,J.C.,和C.R.Hill.1979.“哺乳动物组织中随温度变换的超声波衰减和传播速度(ultrasonic attenuation andpropagation speed in mammalian tissues as afunction oftemperature)”，UltrasoundMedBiol,5:149-57。
“正常和癌变人类肝脏-I的声学属性——对病理状况的依赖性(acousticproperties of normal and cancerous human liver-I.Dependence on pathologicalcondition)”，UltrasoundMedBiol,7:121-33。
Bamber,J.C.、C.R.Hill和J.A.King.1981.“正常和癌变人类肝脏-II的声学属性——组织结构的依赖性”，UltrasoundMedBiol,7:135-44。
Bamber,J.C、C.R.Hill、J.A.King和F.Dunn.1979.“穿过固定和未固定组织的超声波传播(ultrasonic propagation through fixed and unfixed tissues)”，UltrasoundMedBiol,5:159-65。
Bauer,D.R、M.Otter和D.R.Chafin.2018.“组织诊断的新范式：将组织收集、运输和固定标准化的工具和技术(A New Paradigm for Tissue Diagnostics:Tools andTechniques to Standardize Tissue Collection,Transport,andFixation)”，CurrPathobiol Rep,6:135-43。
Bauer,D.R.、B.Stevens、D.Chafin、A.P.Theiss和M.Otter.2016.“利用数字声干涉测量法主动监测甲醛进入组织学组织的扩散”，J Med Imaging(Bellingham),3:017002。
Bonini,P.、M.Plebani、F.Ceriotti和F.Rubboli.2002.“实验室医学中的错误(Errors in laboratorymedicine)”，Clin Chem,48:691-8。
Boon,M.E.1996.“微波抗原修复：修复溶液的pH对MIB-1染色的重要性(microwave-antigen retrieval:the importance of pH of the retrieval solutionforMIB-1staining)”，EurJMorphol,34:375-9。
Boon,M.E.、P.O.Gerrits、H.E.Moorlag、P.Nieuwenhuis和L.P.Kok.1988.“甲醛固定和微波辐射(formaldehyde fixation and microwave irradiation)”，Histochem J,20:313-22。
Boon,M.E、L.P.Kok和E.Ouwerkerk-Noordam.1986.“用于快速处理组织的微波刺激扩散：减少脱水、清除和浸渍时间(microwave-stimulated diffusion for fastprocessing of tissue:reduced dehydrating,clearing,and impregnating times)”，Histopathology,10:303-9。
Boon,M.E.和E.Marani.1991.“温度数据在有关微波技术的出版物中的主要重要性(the major importance of temperature data in publications concerningmicrowave techniques)”，EurJMorphol,29:184-5。
Chafin,D.、A.Theiss、E.Roberts、G.Borlee、M.Otter和G.S.Baird.2013.“快速双温度福尔马林固定”，PLoS One,8:e54138。
道森,I.M.1972。“固定：病理学家应该做什么？(Fixation:whatshouldthepathologist do？)”，Histochem J,4:381-5。
De Marzo,A.M.、H.H.Fedor、W.R.Gage和M.A.Rubin.2002.“不充分福尔马林固定会降低p27免疫组织化学染色的可靠性：使用高密度组织微阵列来探寻最优固定时间(inadequate formalin fixation decreases reliability ofp27 immunohistochemicalstaining:probing optimal fixation time using high-densitytissuemicroarrays)”，HumPathol,33:756-60。
DuMond,Jesse和J.Paul Youtz.2004.“确定固态下的扩散速率的X射线方法(anX-Ray Method of Determining Rates of Diffusion in the Solid State)”。
Durgun-Yucel,B.、F.Dere、A.H.Yucel和O.Oguz.1992.“整体器官标本的快速固定及伴随问题(rapid fixation of whole organ specimens and attendantproblems)”，Acta Med Okayama,46:75-81。
Engel,K.B.和H.M.Moore.2011.“分析前变量对福尔马林固定石蜡包埋组织中蛋白质的免疫组织化学检测的影响(effects ofpreanalytical variables on thedetection of proteins by immunohistochemistry in formalin-fixed,paraffin-embeddedtissue)”，Arch Pathol Lab Med,135:537-43。
Ericsson,J.L.和P.Biberfeld.1967.“醛固定的研究——固定速率及其与肝脏中精细结构和一些组织化学反应的关系(studies on aldehyde fixation.Fixation ratesand their relation to fine structure and some histochemical reactions inliver)”，Lab Invest,17:281-98。
Ferris,A.M.、R.T.Giberson、M.A.Sanders和J.R.Day.2009.“使用微波辐射进行样品处理和免疫标记的先进实验室技术(advanced laboratory techniques for sampleprocessing and immunolabeling using microwave radiation)”，JNeurosci Methods,182:157-64。
Fox,C.H.、F.B.Johnson、J.Whiting和P.P.Roller.1985.“甲醛固定(formaldehyde fixation)”，JHistochem Cytochem,33:845-53。
Hafajee,Z.A.和A.S.Leong.2004.“用结合微波固定的改进方案进行的超快速微波刺激组织处理(ultra-rapid microwave-stimulated tissue processing with amodified protocol incorporating microwave fixation)”，Pathology,36:325-9。
Hall,C.S.、C.L.Dent、M.J.Scott和S.A.Wickline.2000.“对心肌组织中蛋白质交联的时间演化的高频超声波检测(high-frequency ultrasound detection of thetemporal evolution of protein cross linking in myocardial tissue)”，IEEE TransUltrason FerroelectrFreq Control,47:1051-8。
Helander,K.G.1994.“组织中甲醛结合的动力学研究(kinetic studiesofformaldehydebinding intissue)”，BiotechHistochem,69:177-9。
Iesurum,A.、T.Balbi、D.Vasapollo、A.Cicognani和C.Ghimenton.2006.“法医病理学中的微波处理和乙醇基固定(microwave processing and ethanol-based fixationin forensic pathology)”，Am J Forensic MedPathol,27:178-82。
Kok,L.P.和M.E.Boon.1990.“组织化学中微波技术的物理学(physicsofmicrowave technologyin histochemistry)”，Histochem J,22:381-8。
Kok,L.P.、M.E.Boon、E.Ouwerkerk-Noordam和P.O.Gerrits.1986.“应用微波技术从痰制备细胞块(the application ofa microwave technique for thepreparationofcellblocks from sputum)”，JMicrosc,144:193-9。
Leong,A.S.1988.“组织病理学中的微波辐射(microwave irradiation inhistopathology)”，Pathol Annu,23Pt 2:213-34。
Leong,A.S.、M.E.Daymon和J.Milios.1985.“微波辐射作为针对光学显微镜和电子显微镜的固定形式(microwave irradiation as a form of fixation for light andelectron microscopy)”，JPathol,146:313-21。
Leong,A.S.和C.G.Duncis.1986.“使用微波辐射快速固定大型活检标本的方法(amethod ofrapid fixation oflargebiopsy specimens using microwaveirradiation)”，Pathology,18:222-5。
Lerch,M.L.、D.R.Bauer、D.Chafin、A.Theiss、M.Otter和G.S.Baird.2017.“精准医学从预分析法开始：通过超声波飞行时间分析实时评定组织固定质量(PrecisionMedicine Starts With Preanalytics:Real-Time Assessment of Tissue FixationQuality by Ultrasound Time-of-Flight Analysis)，Appl ImmunohistochemMolMorphol,25:160-67。
Looi,L.M.，和K.C.Loh.2005.“实验性肾活检组织的微波刺激甲醛固定：变形伪影的计算机化形态测量分析(microwave-stimulated formaldehyde fixation ofexperimental renal biopsy tissues:computerised morphometric analysisofdistortion artefacts)”，Malays JPathol,27:23-7。
Mathews,M.、J.Newbury和E.M.Housser.2011.“制定政策：加拿大癌症协会和激素受体测试调查(shaping policy:the Canadian Cancer Society andthe HormoneReceptor Testing Inquiry)”，Curr Oncol,18:174-9。
Middleton,L.P.、K.M.Price、P.Puig、L.J.Heydon、E.Tarco、N.Sneige、K.Barr和M.T.Deavers.2009.“在三级护理机构中实施美国临床肿瘤学会/美国病理学家学会HER2指南建议可提高HER2免疫组织化学与荧光原位杂交的一致性并减少不确定病例的数量(implementation of American Society ofClinical Oncology/College ofAmericanPathologists HER2 Guideline Recommendations in a tertiary care facilityincreases HER2immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridizationconcordance and decreases the number of inconclusive cases)”，Arch Pathol LabMed,133:775-80。
Morales,A.R.、H.Essenfeld、E.Essenfeld、M.C.Duboue、V.Vincek和M.Nadji.2002.“连续样本流、高通量、1小时组织处理——用于快速诊断组织制备的系统(continuous-specimen-flow,high-throughput,1-hour tissue processing.A systemfor rapid diagnostic tissue preparation)”，Arch Pathol Lab Med,126:583-90。
Oldenburg,A.L.和S.A.Boppart.2010.“使用嵌入式磁动纳米换能器和光学相干断层扫描的软组织共振声光波谱(resonant acoustic spectroscopy of soft tissuesusing embedded magnetomotive nanotransducers and optical coherencetomography)”，Phys MedBiol,55:1189-201。
Partridge,Savannah C.、Christiane D.Mullins、Brenda F.Kurland、MichaelD.Allain、Wendy B.DeMartini、Peter R.Eby和Constance D.Lehman.2012.“用于区分良性和恶性乳腺MRI病变的表观扩散系数值：病变类型和大小的影响(Apparent DiffusionCoefficient Values for Discriminating Benign and Malignant Breast MRILesions:Effects of Lesion Type and Size)”，American Roentgen Ray Society。
Zdeněk和Petra Schwille.2008.“使用扫描荧光相关光谱精确测量扩散系数(precise Measurement of Diffusion Coefficients using ScanningFluorescence Correlation Spectroscopy)”，Biophysical Journal,94:1437-48。
Plebani,M.2015.“诊断错误和实验室医学——原因和策略(Diagnostic Errorsand Laboratory Medicine-Causes and Strategies)”，EJIFCC,26:7-14。
Plebani,M.、L.Sciacovelli、A.Aita、M.Pelloso和M.L.Chiozza.2015.“预分析阶段的性能标准和质量指标(performance criteria and quality indicators forthepre-analytical phase)”，Clin ChemLab Med,53:943-8。
Ruijter,E.T.、G.J.Miller、T.W.Aalders、C.A.van de Kaa、J.A.Schalken、F.M.Debruyne和M.E.Boon.1997.“整体前列腺切除标本的微波刺激快速固定——Biomed-II MPC研究组(Rapid microwave-stimulated fixation ofentire prostatectomyspecimens.Biomed-II MPC Study Group)”，JPathol,183:369-75。
Singhal,P.、N.N.Singh、G.Sreedhar、S.Banerjee、M.Batra和A.Garg.2016.“评估组织结构与固定方案改变相关的组织形态计量变化——一项体外研究(Evaluation ofHistomorphometric Changes in Tissue Architecture in Relation to Alteration inFixation Protocol-An Invitro Study)”，J Clin Diagn Res,10:ZC28-32。
Tanimoto,A.、J.Nakashima、H.Kohno、H.Shinmoto和S.Kuribayashi.2007.“前列腺癌筛查：弥散加权成像和动态MR成像与T2加权成像相结合的临床价值(prostate cancerscreening:the clinical value of diffusion-weighted imaging and dynamic MRimaging in combination with T2-weighted imaging)”，J Magn Reson Imaging,25:146-52。
Theiss,A.P.、D.Chafin、D.R.Bauer、T.M.Grogan和G.S.Baird.2014.“结直肠癌生物标志物磷酸化的免疫组织化学需要受控的组织固定(immunohistochemistry ofcolorectal cancer biomarker phosphorylation requires controlledtissuefixation)”，PLoS One,9:e113608。
Uhl M.、Altehoefer C.、Kontny U.、II'yasov,K.、Buchert M.、Langer M.2014.“神经母细胞瘤的MRI扩散成像：初步结果和相关性(MRI-diffusion imagingofneuroblastomas:first results and correlation)”，European Radiology。
附加实施例
Hine(Stain Technol.1981年3月；56(2):119-23)公开了一种通过在固定之后及包埋和切片之前将组织样品浸没在苏木精溶液和伊红溶液中来对全组织块进行染色的方法。另外，通常通过将未固定的组织样品浸没在一定体积的固定溶液中来进行固定，并且使固定溶液扩散至组织样品中。如Chafin等人，(PLoS ONE 8(1):e54138.doi:10.1371/journal.pone.0054138(2013))所证明，未能确保固定剂充分扩散至组织中可能损害组织样品的完整性。因此，在一个实施例中，本系统和方法应用于在下游处理(例如，用复染剂(诸如苏木精与曙红)染色和/或标记一种或多种生物标志物)之前确定固定剂扩散至组织样品中的足够时间。
在一些实施例中，本系统和方法用于对组织样品运行双温度浸没固定方法。如本文所用，“双温度固定方法”为其中首先将组织浸没在冷固定溶液中持续第一时间段，接着加热组织持续第二时间段的固定方法。冷步骤容许固定溶液扩散在整个组织中而基本上不引起交联。然后，一旦组织已充分扩散在整个组织中，加热步骤就产生通过固定剂进行的交联。相比通过使用标准方法，冷扩散接着加热步骤的组合产生更完全固定的组织样品。因此，在一些实施例中，组织样品是通过以下固定的：(1)将未固定的组织样品浸没在冷固定溶液中，并通过使用如本文所公开的系统和方法监测组织样品中的TOF来监测固定剂进入组织样本的扩散(扩散步骤)；以及(2)在已测量阈值TOF之后允许组织样品的温度升高(固定步骤)。
本说明书中提到的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请以及非专利公开通过引用整体并入本文。如有必要，可对实施例的各个方面进行修改，从而采用各类专利、申请和公开的概念来提供其他进一步的实施例。
尽管已经参照一些说明性实施例描述了本公开，但应当理解，本领域技术人员可以在本公开原则的精神和范围内设计出许多其他的修改和实施例。更具体地，在不违背本公开的精神的情况下，在上述公开、附图和所附权利要求的范围内，所述主题组合排列的组成部分和/或布置可以进行合理的变化和修改。除了在所述组成部分和/或布置中的变化和修改外，对于本领域技术人员来说，替代用途也将是显而易见的。

Claims (56)

1.一种估计流体将最优地扩散至浸没在所述流体中的生物学样本中的时间的方法，所述方法包括：
(a)在沿着浸没在所述流体中的所述生物学样本的一个或多个位置处获取声学数据；
(b)从经获取的声学数据得出飞行时间(TOF)数据，其中经得出的TOF数据包括一个或多个经计算的TOF数据点、一个或多个经计算的TOF曲线和/或一个或多个经计算的衰减常数；
(c)基于所述经得出的TOF数据来同时计算至少两个置信度模型，其中所述至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型；
(d)确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点；以及
(e)基于与所述经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足所述预定的阈值标准的经确定的时间点相对应的TOF数据，估计所述流体将最优地扩散至所述生物学样本中的所述时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体包含一种或多种固定剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种固定剂为醛基固定剂。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述流体选自由乙醇、二甲苯和石蜡组成的组。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述经计算的至少两个置信度模型包括所述过去置信度模型和所述当前置信度模型。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述经计算的至少两个置信度模型包括所述过去置信度模型、所述当前置信度模型和所述未来置信度模型中的每一者。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当与多个经得出的TOF数据点相对应的预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数各自经确定在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，经计算的过去置信度模型满足预定的过去置信度模型阈值标准。
8.根据权利要求7所述的方法，其中确定所述预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数是否在所述算出的平均衰减常数的所述预定的阈值百分比值内包括进行收敛测试。
9.根据权利要求8所述的方法，其中进行所述收敛测试包括：(i)计算候选经计算的TOF数据点的候选衰减常数以提供理论值；(ii)基于与随时间计算且在候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点相对应的预定数量的经计算的衰减常数来算出平均衰减常数，以提供实验值；(iii)基于经计算的理论值和算出的实验值来确定实际百分比误差；以及(iv)将经确定的百分比误差与预定的阈值百分比值进行比较。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述平均衰减常数是通过以下得出的：(i)检索针对所述候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点中的每一者的经计算的衰减常数；以及(ii)对检索到的经计算的衰减常数中的每一者求平均。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述候选TOF数据点之前的所述预定数量的TOF数据点为至少约3个。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述预定的阈值百分比值小于约5％。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述预定的阈值百分比值小于约2.5％。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当算出的当前置信区间低于预定的当前置信度模型阈值时，经计算的当前置信度模型满足预定的当前置信度模型阈值标准。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述当前置信区间是通过以下算出的：(a)使用所述经计算的TOF曲线的所述经计算的TOF数据点的部分或全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；以及(b)基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当算出的未来置信区间低于预定的未来置信度模型阈值时，经计算的未来置信度模型满足预定的未来置信度模型阈值标准。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述未来置信区间是通过以下算出的：(a)使用所述经计算的TOF曲线的所述经计算的TOF数据点的全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；(b)从时间零至未来时间点基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间；以及(c)算出所述TOF曲线的平均置信区间。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括针对至少一种生物标志物的存在对所述生物学样本进行染色。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种生物标志物为癌症生物标志物。
20.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括对针对所述至少一种生物标志物的存在而染色的所述生物学样本进行评分。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括针对至少两种生物标志物的存在对所述生物学样本进行染色。
22.一种预测浸没在一种或多种固定剂中的生物学样本的固定完成时间的方法，所述方法包括：
(a)在沿着浸没在所述一种或多种固定剂中的所述生物学样本的一个或多个位置处获取声学数据(401)；
(b)从经获取的声学数据得出飞行时间(TOF)数据，其中经得出的TOF数据包括一个或多个经计算的TOF数据点、一个或多个经计算的TOF曲线和/或一个或多个经计算的衰减常数(402)；
(c)基于所述经得出的TOF数据来同时计算至少两个置信度模型，其中所述至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型(403)；
(d)确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点(404)；以及
(e)基于与所述经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足所述预定的阈值标准的经确定的时间点相对应的TOF数据，预测所述固定完成时间(405)。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述生物学样本首先浸没在温度低于约15℃的一种或多种固定剂中。
24.根据权利要求权利要求22和23中任一项所述的方法，其中在所述一种或多种固定剂温热至大于约15℃的温度之后获取所述声学数据。
25.根据权利要求22和23中任一项所述的方法，其中在所述一种或多种固定剂温热至大于约25℃的温度之后获取所述声学数据。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述经计算的至少两个置信度模型包括所述过去置信度模型和所述当前置信度模型。
27.根据权利要求权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述经计算的至少两个置信度模型包括所述过去置信度模型、所述当前置信度模型和所述未来置信度模型中的每一者。
28.一种非暂时性计算机可读介质，其存储用于估计流体将最优地扩散至浸没在所述流体中的生物学样本中的时间的指令，所述指令包括：
a.从经获取的声学数据得出飞行时间(TOF)数据；
b.基于经得出的TOF数据来同时计算至少两个置信度模型，其中所述至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型；
c.确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点；以及
d.基于与所述经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足所述预定的阈值标准的经确定的时间点相对应的TOF数据，估计所述流体将最优地扩散至所述生物学样本中的所述时间。
29.根据权利要求28所述的非暂时性计算机可读介质，其进一步包括用于计算一个或多个衰减常数的指令。
30.根据权利要求28至29中任一项所述的非暂时性计算机可读介质，其进一步包括用于进行收敛测试的指令。
31.根据权利要求30所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述收敛测试包括：(i)计算候选经计算的TOF数据点的候选衰减常数以提供理论值；(ii)基于与随时间计算且在候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点相对应的预定数量的经计算的衰减常数来算出平均衰减常数，以提供实验值；(iii)基于经计算的理论值和算出的实验值来确定实际百分比误差；以及(iv)将经确定的百分比误差与预定的阈值百分比值进行比较。
32.一种非暂时性计算机可读介质，其存储用于确定至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点的指令，所述指令包括：(a)从浸没在流体中的生物学样本的经获取的声学数据得出TOF数据；(b)连续计算过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型，直至所述过去置信度模型、所述当前置信度模型和所述未来置信度模型中的每一者同时且独立地满足预定的阈值标准；以及(c)识别使所述过去置信度模型、所述现在置信度模型和所述未来置信度模型同时且独立地满足的与经得出的TOF数据相对应的所述时间点。
33.根据权利要求32所述的非暂时性计算机可读介质，其中当与多个经得出的TOF数据点相对应的预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数各自经确定在算出的平均衰减常数的预定的阈值百分比值内时，经计算的过去置信度模型满足预定的过去置信度模型阈值标准。
34.根据权利要求33所述的非暂时性计算机可读介质，其中确定所述预定数量的检索到的经计算的候选衰减常数是否在所述算出的平均衰减常数的所述预定的阈值百分比值内包括进行收敛测试。
35.根据权利要求34所述的非暂时性计算机可读介质，其中进行所述收敛测试包括：(i)计算候选经计算的TOF数据点的候选衰减常数以提供理论值；(ii)基于与随时间计算且在候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点相对应的预定数量的经计算的衰减常数来算出平均衰减常数，以提供实验值；(iii)基于经计算的理论值和算出的实验值来确定实际百分比误差；以及(iv)将经确定的百分比误差与预定的阈值百分比值进行比较。
36.根据权利要求35所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述平均衰减常数是通过以下得出的：(i)检索针对所述候选TOF数据点之前的预定数量的TOF数据点中的每一者的经计算的衰减常数；以及
(ii)对检索到的经计算的衰减常数中的每一者求平均。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的非暂时性计算机可读介质，其中当算出的当前置信区间低于预定的当前置信度模型阈值时，经计算的当前置信度模型满足预定的当前置信度模型阈值标准。
38.根据权利要求37所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述当前置信区间是通过以下算出的：(a)使用所述经计算的TOF曲线的所述经计算的TOF数据点的部分或全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；以及(b)基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间。
39.根据权利要求32至38中任一项所述的非暂时性计算机可读介质，其中当算出的未来置信区间低于预定的未来置信度模型阈值时，经计算的未来置信度模型满足预定的未来置信度模型阈值标准。
40.根据权利要求39所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述未来置信区间是通过以下算出的：(a)使用所述经计算的TOF曲线的所述经计算的TOF数据点的全部来进行TOF曲线的非线性回归拟合；(b)从时间零至未来时间点基于经进行的非线性回归拟合来确定检索到的经计算的衰减常数的置信区间；以及(c)算出所述TOF曲线的平均置信区间。
41.根据权利要求32至40中任一项所述的非暂时性计算机可读介质，其进一步包括用于估计所述流体最优地扩散至所述生物学样本中的时间的指令。
42.根据权利要求41所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述流体包含一种或多种固定剂。
43.根据权利要求41所述的非暂时性计算机可读介质，其中所述流体选自由乙醇、二甲苯和石蜡组成的组。
44.一种用于估计流体将最优地扩散至浸没在所述流体中的生物学样本中的时间的系统(200)，所述系统包括：(i)一个或多个处理器(206)，以及(ii)耦接至所述一个或多个处理器(206)的一个或多个存储器(205)，所述一个或多个存储器(205)存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令当由所述一个或多个处理器(206)执行时，使所述系统(200)进行包括以下的操作：
(a)从在沿着浸没在流体中的生物学样本的一个或多个位置处获取的声学数据得出飞行时间(TOF)数据；
(b)基于经得出的TOF数据来同时计算至少两个置信度模型，其中所述至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型；
(c)确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点；以及
(d)基于与所述经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足所述预定的阈值标准的经确定的时间点相对应的TOF数据，估计所述流体将最优地扩散至所述生物学样本中的所述时间。
45.根据权利要求44所述的系统，其中所述流体包含一种或多种固定剂。
46.根据权利要求44所述的系统，其中所述流体选自由乙醇、二甲苯和石蜡组成的组。
47.一种估计一种或多种固定剂将最优地扩散至浸没在流体中的生物学样本中的时间的方法，所述方法包括：
(a)将所述生物学样本浸没在所述一种或多种固定剂中，其中所述一种或多种固定剂维持在小于约15℃的温度；
(b)在沿着浸没在所述流体中的所述生物学样本的一个或多个位置处获取声学数据(401)；
(c)从经获取的声学数据得出飞行时间(TOF)数据，其中经得出的TOF数据包括一个或多个经计算的TOF数据点、一个或多个经计算的TOF曲线和/或一个或多个经计算的衰减常数(402)；
(d)基于所述经得出的TOF数据来同时计算至少两个置信度模型，其中所述至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型(403)；
(e)确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点(404)；以及
(f)基于与所述经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足所述预定的阈值标准的经确定的时间点相对应的TOF数据，估计所述流体将最优地扩散至所述生物学样本中的所述时间(405)。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述温度小于约10℃。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述温度的范围为从约-10℃至约10℃。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述温度的范围为从约-4℃至约4℃。
51.一种预测浸没在一种或多种固定剂中的生物学样本的固定完成时间的方法，所述方法包括：
(a)将所述生物学样本浸没在所述一种或多种固定剂中，其中所述一种或多种固定剂维持在大于约20℃的温度；
(b)在沿着浸没在所述一种或多种固定剂中的所述生物学样本的一个或多个位置处获取声学数据；
(c)从经获取的声学数据得出飞行时间(TOF)数据，其中经得出的TOF数据包括一个或多个经计算的TOF数据点、一个或多个经计算的TOF曲线和/或一个或多个经计算的衰减常数；
(d)基于经得出的TOF数据来同时计算至少两个置信度模型，其中所述至少两个置信度模型包括过去置信度模型、当前置信度模型和未来置信度模型；
(e)确定经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足预定的阈值标准的时间点；以及
(f)基于与所述经计算的至少两个置信度模型各自独立地满足所述预定的阈值标准的经确定的时间点相对应的TOF数据，预测所述固定完成时间。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述温度大于约25℃。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述温度大于约30℃。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述温度大于约35℃。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述温度大于约40℃。
56.根据权利要求51所述的方法，其中所述温度大于约45℃。
CN202280049614.1A 2021-05-13 2022-05-11 对组织固定时间的实时预测 Pending CN117651521A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163187976P 2021-05-13 2021-05-13
US63/187976 2021-05-13
PCT/EP2022/062751 WO2022238467A1 (en) 2021-05-13 2022-05-11 Real-time prediction of tissue fixation time

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117651521A true CN117651521A (zh) 2024-03-05

Family

ID=81984585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280049614.1A Pending CN117651521A (zh) 2021-05-13 2022-05-11 对组织固定时间的实时预测

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240077456A1 (zh)
EP (1) EP4337092A1 (zh)
CN (1) CN117651521A (zh)
WO (1) WO2022238467A1 (zh)

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5196306A (en) 1989-03-29 1993-03-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection or quantitation of an analyte using an analyte dependent enzyme activation system
US5595707A (en) 1990-03-02 1997-01-21 Ventana Medical Systems, Inc. Automated biological reaction apparatus
US20030211630A1 (en) 1998-02-27 2003-11-13 Ventana Medical Systems, Inc. Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters
US6582962B1 (en) 1998-02-27 2003-06-24 Ventana Medical Systems, Inc. Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters
CN102687061B (zh) 2009-10-19 2014-12-10 文塔纳医疗系统公司 成像系统和技术
WO2011071727A2 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Wei-Sing Chu Standardization of tissue specimen preservation by ultrasound and temperature control
US10126216B2 (en) 2011-02-17 2018-11-13 Ventana Medical Systems, Inc. Method for tissue sample fixation
US10539487B2 (en) 2010-03-04 2020-01-21 Ventana Medical Systems, Inc. Systems and methods for monitoring tissue sample processing
WO2011139978A1 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Ventana Medical Systems, Inc. Moving meniscus rinsing and mixing in cell staining
WO2015086534A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Ventana Medical Systems, Inc. Staining reagents and other liquids for histological processing of biological specimens and associated technology
AU2015220750B2 (en) 2014-02-24 2020-04-16 Ventana Medical Systems, Inc. Quinone methide analog signal amplification
GB201409203D0 (en) 2014-05-23 2014-07-09 Ffei Ltd Improvements in digitising slides
GB201409202D0 (en) 2014-05-23 2014-07-09 Ffei Ltd Improvements in imaging microscope samples
AU2015367415B2 (en) 2014-12-17 2019-05-09 Ventana Medical Systems, Inc. Obtaining true diffusivity constant
EP3234583B1 (en) 2014-12-17 2020-08-19 Ventana Medical Systems, Inc. Diffusion monitoring protocol for optimized tissue fixation
EP3865870A1 (en) 2014-12-17 2021-08-18 Ventana Medical Systems, Inc. Accurately calculating acoustic time-of-flight
CA2969982C (en) 2015-02-09 2022-08-02 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for standardizing diffusion of a fluid into tissues
EP3286543B1 (en) 2015-04-20 2023-03-29 Ventana Medical Systems, Inc. Inkjet deposition of reagents for histological samples
JP7128121B2 (ja) 2016-06-28 2022-08-30 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． Ｉｈｃ及びｉｓｈアッセイにおけるシグナル増幅のためのクリックケミストリーの応用
EP4123285A1 (en) * 2016-12-22 2023-01-25 Ventana Medical Systems, Inc. System and method for sample processing

Also Published As

Publication number Publication date
EP4337092A1 (en) 2024-03-20
US20240077456A1 (en) 2024-03-07
WO2022238467A1 (en) 2022-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6995095B2 (ja) 組織試料中で遺伝子を検出するための系
Zafrani et al. High sensitivity and specificity of immunohistochemistry for the detection of hormone receptors in breast carcinoma: comparison with biochemical determination in a prospective study of 793 cases
Cregger et al. Immunohistochemistry and quantitative analysis of protein expression
Dhir et al. Early identification of individuals with prostate cancer in negative biopsies
Kap et al. Histological assessment of PAXgene tissue fixation and stabilization reagents
Thakur et al. The use of automated Ki67 analysis to predict Oncotype DX risk-of-recurrence categories in early-stage breast cancer
Chafin et al. Rapid two-temperature formalin fixation
Leong Pitfalls in diagnostic immunohistology
Leong Quantitation in immunohistology: Fact or fiction?: A discussion of variables that influence results
Zuccari et al. Immunocytochemical study of Ki‐67 as a prognostic marker in canine mammary neoplasia
US20220146418A1 (en) Label-free assessment of biomarker expression with vibrational spectroscopy
Leong et al. Standardization in immunohistology
Tannapfel et al. Apoptosis and proliferation in relation to histopathological variables and prognosis in hepatocellular carcinoma
JP2019534451A (ja) １つ又は複数の組織サンプルにおける細胞組成情報を決定する装置
US20220223230A1 (en) Assessing antigen retrieval and target retrieval progression with vibrational spectroscopy
Oyejide et al. Molecular pathology: Applications in nonclinical drug development
Jarosch et al. Multiplexed imaging and automated signal quantification in formalin-fixed paraffin-embedded tissues by ChipCytometry
Brajkovic et al. Microfluidics for rapid cytokeratin immunohistochemical staining in frozen sections
US20220136971A1 (en) Systems and methods for assessing specimen fixation duration and quality using vibrational spectroscopy
EP3414704A1 (en) Method for quantitative measurement of a biomarker by in situ immunofluorescence and uses thereof
CN117651521A (zh) 对组织固定时间的实时预测
Villarreal et al. Ex vivo confocal microscopy detects basic patterns of acute and chronic lesions using fresh kidney samples
Bauer et al. Making a science out of preanalytics: An analytical method to determine optimal tissue fixation in real-time
JP2024519770A (ja) 組織固定時間のリアルタイム予測
Yang et al. Construction and validation of tissue microarrays of ductal carcinoma in situ and terminal duct lobular units associated with invasive breast carcinoma

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination