CN110055160A - 用于纤维素乙醇发酵的连续式梯级固定化反应方法及设备 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于纤维素乙醇发酵的连续式梯级固定化反应方法及设备。该方法包括：包括将木质纤维素水解液连续依次经过可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床，依次进行发酵反应，将发酵产物分为第一部分产物和第二部分产物，所述第一部分产物进行收集，所述第二部分产物与木质纤维素水解液混合后再依次经过可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床，以实现循环。本发明提供的方法和设备可以有效提高发酵体系中微生物对水解液中对糠醛等抑制性物质的耐受性，从而实现乙醇的高效率连续性产出。

Description

用于纤维素乙醇发酵的连续式梯级固定化反应方法及设备

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体地，涉及一种用于乙醇发酵的连续式梯级固定化反应方法及设备。

背景技术

在当前以非食用性的木质纤维素类农业和林业废弃物等作为生产原料的第二代乙醇的生产过程中，木质纤维废物水解物是以戊糖和己糖为主要物质的基质，其中，由于一代生物乙醇的发展，利用酿酒酵母发酵葡萄糖等己糖产乙醇的技术已经成熟并且实现工业化产业化。而木糖等戊糖不能为酿酒酵母发酵产乙醇，限制了纤维素乙醇的产率。为解决同时发酵己糖和戊糖的问题，研究者寻求具备同时发酵己糖和戊糖功能的特定菌种，实现混合底物产乙醇的目的。例如，Sureewan 等利用处理后的油菜秸秆固定化Thermoanaerobacter pentosaceus，70℃下同时发酵葡萄糖和木糖的菜籽秸秆载体体系中乙醇产量最大，为 1.36mol/消耗的糖，与游离细胞相比，乙醇产量提高了11％。然而，葡萄糖和木糖在发酵过程中存在底物竞争现象，混合底物体系的产乙醇效率仍然不够理想。

除此之外，在木质纤维利用过程中存在的另一个重要的问题是水解产生戊糖和己糖的过程中分别伴随着一定浓度糠醛和5-羟甲基糠醛 (5-HMF)，对酿酒酵母等发酵微生物的代谢具有抑制作用。该问题的解决有两个思路：①微生物固定化；②连续式反应器出水回流。首先，微生物固定化是提高反应系统生物量、保护微生物免受有害组分冲击的常用方法，且更易于产物分离和工艺控制，已广泛应用于各类微生物发酵工艺。在常用的固定化方法中，利用甘蔗渣、稻壳、丝瓜瓤等天然木质纤维载体固定微生物细胞，具有成本低、强度高、无毒害、可回用和孔隙度大等多种优势。例如，Sittijunda等利用菜籽秸秆等载体固定极端嗜热菌进行己糖/戊糖的乙醇发酵，发现与游离微生物相比，菜籽秸秆固定能有效提高乙醇产率和浓度。其次，连续式固定化床反应器在乙醇发酵中存在较好的应用前景。例如，Lina等将酵母细胞固定在刨花，甘蔗渣，玉米叶和玉米秸秆芯木质纤维素废物填充床反应器中连续生产乙醇中发现，甘蔗渣为载体时具有相对较好的固定化效果，而玉米秸秆芯体系中可获得更高的乙醇产量。

但在对于解决同时发酵木糖葡萄糖产乙醇和提高发酵过程中微生物耐受性的两个问题既然存在技术难度。对此，本发明提出，在梯级反应体系中同时引入己糖发酵菌和戊糖发酵菌，利用其功能先后进行乙醇发酵；同时采用连续式固定化床反应器形式，划分己糖发酵和戊糖发酵功能分区，避免混合体系的底物竞争，同时降低糠醛、5-HMF 等物质的抑制作用。该发明对提高纤维素乙醇发酵效率提供了创新思路与反应形式。

发明内容

本发明提供了一种能够高效利用木质纤维素水解液产乙醇的连续式反应方法及设备，在高效发酵的同时，既能同时发酵木质纤维水解物中戊糖、己糖产乙醇，又可通过固定化微生物技术提高发酵体系中微生物对水解液中糠醛等抑制性物质的抗性，旨在提高和改善第二代乙醇生产过程中微生物发酵工艺的发酵效率。

该连续式梯级固定化的纤维素乙醇发酵的方法包括将木质纤维素水解液连续依次经过可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床，依次进行发酵反应，将发酵产物分为第一部分产物和第二部分产物，所述第一部分产物进行收集，所述第二部分产物与木质纤维素水解液混合后再依次经过可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床，以实现循环。

优选地，所述第二部分与所述木质纤维素水解液的体积比为 1:1～5:1，优选为4:1。

优选地，所述秸秆水解液为葡萄糖和木糖浓度比为2:1～1.5:1的木质纤维素发酵液。

优选地，所述可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床的高度比为2:1。

本发明还提供了一种用于纤维素乙醇发酵的连续式梯级固定化反应设备，包括：发酵反应器和用于储存培养基或秸秆水解液的储液池；所述发酵反应器内从下至上依次设有可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床；所述发酵反应器与所述储液池通过进液管道和进液泵连接；所述进液泵驱动所述储液池中的培养基或秸秆水解液经所述进液管道从下至上依次进入所述可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床中；所述发酵反应器上含有设置在所述可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床上方的出液口，所述出液口通过管道经内循环泵与所述进液管道相通。

优选地，所述内循环泵和进液泵的入液比为1:1～5:1，优选为4:1。

优选地，所述发酵反应器的底部设有多孔板以实现均匀布水。

优选地，所述发酵反应器的上部设有插有出气管的出气口，所述出气管的另一端与所述多孔板上的孔相连。

优选地，所述发酵反应器上含有设置于所述可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床上方的集液口；所述集液口用于收集所述发酵反应器中的液相产物；所述集液口通过管道与出液储存池连通；所述集液口高出所述出液储存池的出样口1～2cm。

优选地，还包括用于控制所述发酵反应器中发酵温度的水浴蓄水槽，所述发酵反应器设在所述水浴蓄水槽中；所述水浴蓄水槽经由管道和水浴加热入水泵与水浴加热装置连通。

优选地，所述水浴蓄水槽的壁厚与所述发酵反应器的直径比为 1:3～1:4。

优选地，所述发酵反应器的上部设有进行温度监测的温度计口。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

利用该用于乙醇发酵的连续式梯级固定化反应方法和设备：1)能够通过连续性进料、出液循环以及固定化微生物床提高了微生物的对糠醛等抑制性物质的耐受性，从而实现乙醇的高效率连续性产出；2) 能够通过定量的统计液相产物和气相产物实现实验室规模下的物质平衡，提高研究的数据质量；3)该反应设备温度适用范围大，可实现嗜热微生物的高温发酵的需求；4)由于戊糖酵母在发酵水解液的过程中葡萄糖对木糖的代谢阻碍导致木糖代谢慢效率低，而利用己糖酵母先进行发酵可解除葡萄糖的抑制作用且会产生利于木糖发酵的丙酮酸，进一步提高木糖的发酵效率，因此基于该原理该发酵反应器中通过自下而上的己糖发酵菌及戊糖发酵菌实现发酵过程中木质纤维水解液中己糖和戊糖的先后发酵，大大提高了发酵效率，应用前景广阔。

附图说明

为了更清楚地说明本工艺发明的技术方案，下面将对现有技术描述中所需要使用的附图作一简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个优选实施方式中用于乙醇发酵的连续式梯级固定化反应设备的结构示意图；

图中，1-储液池；2-进液泵；3-发酵反应器；4-多孔板；5-内循环泵；6-出液储存池；7-温度计；8-流量计；9-水浴加热入水泵；10-水浴加热装置；11-出气口；12-内循环液出液口；13-集液口；14-可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床；15-可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床； 16-水浴蓄水槽；17-出样口。

具体实施方式

为使本工艺发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种连续式梯级固定化的纤维素乙醇发酵的方法，该方法包括将木质纤维素水解液连续依次经过可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床，依次进行发酵反应，将部发酵产物分为第一部分产物和第二部分产物，所述第一部分产物进行收集，所述第二部分产物与木质纤维素水解液混合后再依次经过可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床，以实现循环。

其中，所述第二部分产物与所述木质纤维素水解液的体积比为 1:1～5:1，优选为4:1，在可有效缓解水解液中抑制性物质的抑制作用的同时又保证整个反应体系的发酵效率。

在本发明一个优选实施方式中，木质纤维素水解液为葡萄糖和木糖浓度比为2:1～1.5:1的木质纤维素发酵液。可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床的高度比为2:1～1:1, 优选为2:1。

在本发明的实施例中，固定化反应床中可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床15中优选填充的是固定化可利用葡萄糖产乙醇的啤酒酵母菌(CGMCC 2.0116)，可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床14中填充的是可利用木糖产乙醇的树干毕赤酵母(CGMCC 2.3492)。

在本发明的一个优选实施方式中，木质纤维素发酵液中葡萄糖和木糖浓度比为2:1～1.5:1，那么填充有固定化可利用葡萄糖产乙醇的啤酒酵母菌(CMGCC 2.0116)和填充有可利用木糖产乙醇的树干毕赤酵母(CMGCC 2.3492)反应床的高度比最优为2:1。

本发明还提供了一种用于纤维素乙醇发酵的连续式梯级固定化反应设备，包括：发酵反应器3和用于储存木质纤维素水解液的储液池1；所述发酵反应器3内从下至上依次设有可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床15和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床14；所述发酵反应器 3与所述储液池1通过进液管道和进液泵2连接；

所述进液泵2驱动所述储液池中的木质纤维素水解液经所述进液管道从下至上依次进入可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床15和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床14中；

所述发酵反应器3上含有设置在所述可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床上方的出液口，所述出液口通过管道经内循环泵5与所述进液管道相通。

木质纤维素水解液在进液泵2的驱动下从储液池1中流经进液管道至发酵反应器3中，木质纤维素水解液在发酵反应器3中依次进入可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床15和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床14中，依次进行发酵。其中，可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床15中可以使木质纤维素水解液中的戊糖发酵产乙醇，可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床14中可以使木质纤维素水解液中的己糖发酵产乙醇。其中，设置在发酵反应器3上且在可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床上方的出液口为内循环出液口12，发酵后的第二部分产物通过内循环出液口和管道以及内循环泵运输至进液管道，与新的木质纤维素水解液一起进入发酵反应器中再发酵，实现出水循环。

通过将木质纤维素水解液依次经过微生物固定化床15和微生物固定化床14，依次使得木质纤维素水解液中戊糖和己糖发酵产乙醇，同时结合出水循环，可以有效提高发酵体系中微生物对水解液中对糠醛等抑制性物质的耐受性，从而实现乙醇的高效率连续性产出。其中，微生物固定化床14和15的高度可以按照发酵底物中己糖和戊糖的浓度及微生物特性确定。

在本发明的实施例中，木质纤维素水解液的来源为培养基或是秸秆水解液。

其中，内循环泵和进液泵的入液比优选为1:1～1:5，进一步优选为 1:4，在可有效缓解水解液中抑制性物质的抑制作用的同时又保证整个反应体系的发酵效率。

本发明的发酵反应器可以由本领域中常用的材料制成，可以使用玻璃烧制而成，其耐高温性能优良。在具体反应中，反应器高度可以为350mm，高径比可以为6:1，布水更加均匀，利于水解液与固定化微生物床的接触从而提高发酵效率。

本发明中，可以使用三通接头将出液口的管道与进液泵的管道合流，再与发酵反应器相连。

在本发明的一个优选实施方式中，发酵反应器的底部可以设有多孔板4，以实现均匀布水的目的。

在本发明的一个优选实施方式中，发酵反应器3的上部设有插有出气管的出气口11，所述出气管的另一端与一个多孔板4相连，以达到能收集发酵气体的同时能够调节反应器的体积。在本发明中，可以通过上下滑动出气管来调节固定化反应床中可装载载体的总高度。

在本发明的一个优选实施方式中，发酵反应器3上含有设置于所述可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床上方的集液口13；所述集液口用于收集所述发酵反应器中的液相产物；集液口13通过管道与出液储存池6连通。通常将出液储存池置于集液口一侧，防止发酵产物通过出液口流出，集液口13通常高出出液储存池6的出样口17 1～2cm。其中，集液口13和内循环液出液口12可以设在发酵反应器的不同方向的壁上。

在本发明一个优选实施方式中，可以使用本发明的常用的方法来控制发酵反应器中发酵的温度。在本发明中，通常根据不同发酵菌的特性将控制发酵温度，对于常温发酵菌温度设定为25～37℃，对于嗜热发酵菌温度设定为50～55℃，对于极端嗜热发酵菌温度设定为65～70℃。在本发明的一个优选实施方式中，使用水浴蓄水槽16来控制发酵反应器3中发酵温度，常温发酵菌温度优选为30℃，嗜热发酵菌温度优选为55℃，极端嗜热发酵菌温度优选为70℃。在具体的工艺过程中，可以将水浴蓄水槽的厚度与发酵反应器直径比设为1:3～1:4，优选为1:4，理论工作体积为500mL。

在本发明一个优选实施方式中，可以使用水浴加热装置为水浴蓄水槽提供热水，水浴蓄水槽16经由管道和水浴加热入水泵9与水浴加热装置10连通。水浴加热槽与水浴加热装置和水浴加热入水泵通过管道形成回路以控制发酵反应器中发酵反应的温度。

在本发明一个优选实施方式中，还可以在发酵反应器的上部设有用于温度监测的温度计口和进行流量监测的流量计口，以实现实时监测。可以在温度计口插入温度计7，在流量计口通过管道与流量计8 相连以实现产气总流量监测。

在本发明一个优选实施方式中，将上述方法与设备相连，即该方法包括将木质纤维素水解液连续依次经过可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床进行发酵反应，第一部分产物通过集液口进行收集，第二部分产物通过内循环泵5与入液泵2中的水解液混合再依次经过两个固定化床，从而实现反应体系的循环。

实施例1

如图1所示，本实施例提供了一种用于乙醇发酵的连续式梯级固定化反应设备，包括：发酵反应器3和用于储存木质纤维素水解液的储液池1。所述发酵反应器3内从下至上依次设有可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床15和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床14。发酵反应器3与储液池1通过进液管道和进液泵2连接。进液泵2驱动所述储液池中的木质纤维素水解液经所述进液管道从下至上依次进入可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床15和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床14中。发酵反应器3上含有设置在所述可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床上方的出液口，所述出液口通过管道经内循环泵5以及三通接口与进液管道相通，用于将第二部分产物与新的进液木质纤维素水解液一起再循环，第二部分产物与进液木质纤维素水解液的体积比为1:4。发酵反应器的高度为350mm，高径比可以为6:1。其中，木质纤维素发酵液中葡萄糖和木糖浓度比为2:1～1.5:1，可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床15和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床14的高度比最优为2:1。发酵反应器的底部可以设有多孔板4，以实现均匀布水的目的。发酵反应器3的上部设有插有出气管的出气口11，出气管的另一端与多孔板4相连。发酵反应器3上含有设置于所述可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床上方的集液口13；集液口13用于收集所述发酵反应器中的第一部分产物；集液口13通过管道与出液储存池6连通。出液储存池置于集液口一侧，集液口13高出出液储存池6的出样口17 1～2cm。其中，集液口13和内循环液出液口12设在发酵反应器的两边对应的壁上。在发酵反应器的上部设有用于温度监测的温度计口和进行流量监测的流量计口，以实现实时监测。可以在温度计口插入温度计7，在流量计口通过管道与流量计8相连以实现流量监测。将发酵反应器3设在水浴蓄水槽16中，水浴蓄水槽16经由管道和水浴加热入水泵9与水浴加热装置10连通。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种连续式梯级固定化的纤维素乙醇发酵的方法，其特征在于，包括将木质纤维素水解液连续依次经过可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床，依次进行发酵反应，将发酵产物分为第一部分产物和第二部分产物，所述第一部分产物进行收集，所述第二部分产物与木质纤维素水解液混合后再依次经过可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床，以实现循环。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二部分产物与所述木质纤维素水解液的体积比为1:1～5:1。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素水解液为葡萄糖和木糖浓度比为2:1～1.5:1的木质纤维素发酵液。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床的高度比为2:1～1:1。

5.一种用于纤维素乙醇发酵的连续式梯级固定化反应设备，其特征在于，包括：发酵反应器和用于储存木质纤维素水解液的储液池；所述发酵反应器内从下至上依次设有可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床；所述发酵反应器与所述储液池通过进液管道和进液泵连接；

所述进液泵驱动所述储液池中的木质纤维素水解液经所述进液管道从下至上依次进入所述可发酵己糖产乙醇的微生物固定化床和可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床中；

所述发酵反应器上含有设置在所述可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床上方的出液口，所述出液口通过管道经内循环泵与所述进液管道相通。

6.根据权利要求5所述的连续式梯级固定化反应设备，其特征在于，所述内循环泵和进液泵的入液比为1:1～5:1。

7.根据权利要求5或6所述的连续式梯级固定化反应设备，其特征在于，所述发酵反应器的底部设有多孔板以实现均匀布水；所述发酵反应器的上部设有出气管的出气口，所述出气管的另一端与多孔板相连。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的连续式梯级固定化反应设备，其特征在于，所述发酵反应器上含有设置于所述可发酵戊糖产乙醇的微生物固定化床上方的集液口；所述集液口用于收集所述发酵反应器中的液相产物；所述集液口通过管道与出液储存池连通。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的连续式梯级固定化反应设备，其特征在于，还包括用于控制所述发酵反应器中发酵温度的水浴蓄水槽，所述发酵反应器设在所述水浴蓄水槽中；所述水浴蓄水槽经由管道和水浴加热入水泵与水浴加热装置连通。

10.根据权利要求9所述的连续式梯级固定化反应设备，其特征在于，对于常温发酵菌，发酵温度为25～37℃；对于嗜热发酵菌，发酵温度为50～55℃；对于极端嗜热发酵菌，发酵温度为65～70℃；

和/或，所述水浴蓄水槽的壁厚与所述发酵反应器的直径比为1:3～1:4。