CN110041428B

CN110041428B - 一种抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体及其应用

Info

Publication number: CN110041428B
Application number: CN201910244032.9A
Authority: CN
Inventors: 曾凡力; 段世鑫; 贾艳荣; 曾培; 郝志敏; 董金皋
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2022-01-28
Anticipated expiration: 2039-03-28
Also published as: CN110041428A

Abstract

本发明公开了一种抗人白介素‑1受体辅助蛋白(IL1RAP)的单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区；重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1自N末端3‑120位所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1自N末端127‑238位所示。本发明抗人白介素‑1受体辅助蛋白的单链抗体能够特异性识别并结合IL1RAP，其在炎症反应及慢性/急性髓性白血病治疗，抗淀粉样凝块形成，阿尔兹海默症的恶化疗法以及其他肿瘤治疗方面具有潜在的应用价值。

Description

一种抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术医药领域，更具体的说是涉及一种能够特异性识别并结合人白介素-1受体辅助蛋白IL1RAP的单链抗体及其应用。

背景技术

细胞因子白细胞介素1(IL-1)对体内的免疫、感染和组织损伤产生多种生理反应，其强有力的防御活动需要严格控制，以避免不必要的病理紊乱。IL-1家族共有11个成员，其中有7个都是促炎性因子，可介导多种免疫反应。

白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP/IL1R3/IL-1RAcP)是一种参与多种信号传导途径的共受体。通过IL-1传递信号需要形成一个涉及IL-1、白细胞介素-1受体1型(IL1R1)和IL1RAP的细胞表面受体复合物，缺乏IL1RAP可完全消除细胞对IL-1的反应；即促炎性因子作用于细胞时首先与细胞表面各自受体结合形成受体复合物，该复合物再与IL1RAP结合形成异源三聚体结构，从而具备了向细胞内传递信号的能力。因此可认为，开发针对IL1RAP的抗体从而特异性结合IL1RAP蛋白，使带有促炎性因子的受体复合物无法与IL1RAP结合，使细胞无法接收到促炎性因子的信号，细胞则不发生炎症反应。

有研究表明，IL1RAP在候选CML干细胞的细胞表面表达，但在正常造血干细胞(hscs)上不表达。在急性髓性细胞白血病和骨髓增生异常综合征中的原始细胞上，IL1RAP的表达量也有所升高。此外，IL1RAP抗体可通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)诱导对原始CML和急性髓细胞白血病细胞的杀伤。还有研究表明，IL-1刺激选择性地诱导原始CML细胞的信号传导和表达，这种效应可能被IL1RAP抗体抑制。总之，上述结果表明，以IL1RAP为靶点开发抗体药物杀死白血病干细胞前景可观。

因此，开发针对IL1RAP的单链抗体，从而阻断IL1RAP与IL-1和受体复合物的结合，为依赖IL-1的慢性炎症或自身免疫病的治疗开辟新的可能性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体，可特异性识别并结合人白介素-1受体辅助蛋白。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区；

重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1自N末端3-120位所示；

轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1自N末端127-238位所示。

优选地，上述抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种基因工程抗体，与上述抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体具有80％以上的同源序列，并且与人白介素-1受体辅助蛋白特异性结合。

优选地，上述基因工程抗体包含

(1)Fab片段、F(ab)’片段、Fd片段、Fv片段或Fc片段中的至少一种；

或(2)Fab片段、F(ab)’片段、Fd片段、Fv片段或Fc片段中的至少一种与其它蛋白或肽链形成的衍生物。

优选地，上述基因工程抗体的重链CDR 3区序列为ARSGRIAVADY，轻链CDR3区序列为MQGTHWPGT。

一种抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示。

上述抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体或上述基因工程抗体在制备用于预防或治疗疾病的产品中的应用；所述疾病包括与人白介素-1受体辅助蛋白有关的炎症反应或者肿瘤；所述产品包括药物或试剂盒。

优选地，所述疾病包括类风湿性关节炎、肠炎、脓毒性休克、移植物排斥、牛皮癣、哮喘、Ⅰ型糖尿病、脑淀粉样血管病、阿兹海默症、急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病。

一种用于治疗炎症反应或者肿瘤的药物，以上述抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体或上述基因工程抗体作为活性成份。

由上述技术方案可知，本发明抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体是经过多轮噬菌体筛选及酵母表面展示筛选得到的重组单链抗体，单链抗体是将抗体与抗原发生特异性结合的部位，即重链可变区与轻链可变区通过柔性连接片段人为组合创制。与IgG类抗体相比，其具有不同于IgG的生化特性和更为简单的结构，且分子量更小。通过亲和力实验验证，本发明单链抗体能够特异性识别并结合IL1RAP。因此，其在炎症反应及慢性/急性髓性白血病治疗，抗淀粉样凝块形成，阿尔兹海默症的恶化疗法以及其他肿瘤治疗方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1所示为抗原蛋白IL1RAP的生物素化验证；

图2所示为抗体库与抗原结合酶联免疫吸附反应检测；

图3所示为单链抗体酵母筛选结果：

A.EBY100空白对照；

B.第一轮流式分选结果；

C.第二轮流式分选结果；

D.第三轮流式分选结果；

图4所示为利用酵母细胞验证单链抗体亲和力：

左图为阴性对照，即表面展示单链抗体的酵母不作相应处理；

右图为实验组，表面展示单链抗体的酵母与生物素化的抗原、SAPE、Anti-c-mycchicken IgY、Goat anti-chicken IgY(H+L)FITC抗体孵育后的结果。

图5所示为利用哺乳动物细胞验证单链抗体亲和力：

A.空白对照，293F细胞不作任何处理；

B.阴性对照，敲除IL1RAP的293F-KO细胞与带有Fc段的Anti-IL1RAP-02以及Gtanti-Ms IgG Fc PE抗体孵育后的结果；

C.实验组，293F细胞与带有Fc段的Anti-IL1RAP-02以及Gt anti-Ms IgG Fc PE抗体孵育后的结果；

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1噬菌体展示技术筛选单链抗体

1.所用材料：

抗原IL1RAP，抗原购自义翘神州公司，货号10121-H08H。

全人源单链抗体噬菌体展示库，实验室自有，以25份健康人外周血为样本，提取淋巴细胞，并通过逆转录PCR扩增全套抗体可变区基因，经重叠PCR技术获得单链抗体文库序列,将文库序列克隆入噬粒载体获得。

链霉亲和素化的磁珠购自赛默飞公司。

高吸附酶联免疫反应微孔板购自康宁公司。

Anti-M13HRP抗体购自赛默飞公司。

辅助噬菌体购自Life Technologies，货号18311019。

XL1-Blue细菌购自Agilent Technologies，货号200228。

显影液ABTS溶液购自赛默飞公司，货号002024。

2.实验方法：

(1)抗原蛋白IL1RAP的生物素化

对IL1RAP抗原蛋白进行生物素化：取200μL 2mg/mL IL1RAP抗原蛋白加入10μLSulfo-NHS-SS-Biotin室温结合2h。将生物素化的蛋白加入zeba脱盐柱1500g离心2min，收集蛋白。银染检测其生物素化效果如图1所示，其中泳道1为与链霉亲和素磁珠结合后的蛋白上清液(验证抗原蛋白是否完全被生物素化)，泳道2为PBS洗磁珠(验证抗原蛋白生物素化的程度)，泳道3为磁珠上洗脱下的蛋白，大小正确。上述结果表明抗原蛋白生物素化程度好，与链霉亲和素的结合稳定，抗原蛋白被完全生物素化，可进行后续的筛选工作。

(2)噬菌体展示技术筛选单链抗体

表达全人单链抗体的噬菌体展示库200μL(含有噬菌体粒约1×10¹¹个)与5μg生物素化的抗原混合后室温孵育30min，再加入50μL链霉亲和素化的磁珠。与抗原结合的噬菌体被链霉亲和素化的磁珠捕获，未结合的噬菌体经PBST漂洗后去除，用200μL 0.2M盐酸-甘氨酸(pH 2.2)溶液将与磁珠稳定结合的噬菌体洗脱并加入45μL 1M Tris中和pH值待用。

接种XL1-Blue细菌到200mL 2YT培养基中，待OD达到0.6后，加入上述洗脱的噬菌体于37℃静置30min，后在30℃条件下过夜扩增，3000g离心10min收集细菌后，取10OD菌体重悬至100mL 2YT中37℃培养至0.5OD/mL，加入30μL辅助噬菌体(含有辅助噬菌体粒1×10¹¹个)30℃过夜扩增后5000g离心收集上清，上清液与5×20％PEG/2.5MNaCl混合，冰浴1h，在9000r离心30min，弃上清，沉淀中加入4mL 1％BSA-PBS即为经过一轮筛选后的噬菌体库，再进行下一轮淘选。重复上述筛选步骤，取2轮筛选所得的噬菌体库，通过噬菌体酶联免疫反应对淘选后的各轮噬菌体库进行验证。

噬菌体酶联免疫反应步骤为：

用PBS将生物素化的抗原稀释到2ng/μL，取96低透平底微孔板，每孔25μL，4℃静置包被过夜，阴性对照组不加入噬菌体，实验组各自加入1轮和2轮筛选下来的噬菌体库各50μL，室温孵育2h，再加入Anti-M13-HRP抗体室温孵育30min，最后各加50μL的底物ABTS，避光静置20min，405nm波长下测OD值整理得图2。

3.实验结果

由抗原的酶联免疫反应结果可以看出随着淘选的进行，酶联免疫反应的信号升高，而对照抗原的信号仍然比较低，在第二轮淘选后，实验组的信号远高于第一轮结果，说明经过2轮淘选，能够表达与抗原特异性结合抗体的噬菌体被富集。

实施例2酵母表面展示技术筛选单链抗体

1.所用材料：

限制性核酸内切酶Sfi I与T4连接酶购自NEB公司。

Anti-c-myc，chicken IgY购自Invitrogen，货号A21281。

SA-PE购自Thermo，货号S866。

Goat anti-chicken IgY(H+L)FITC购自Thermo，货号PA1-28794。

2.实验方法：

利用第二轮筛选所得的噬菌体库侵染XL1-Blue细菌，涂2YT固体培养基37℃过夜培养。待克隆长出后提取质粒，所得质粒即带有单链抗体的噬菌粒载体。

利用酶切连接的方式(用Sfi I酶分别酶切噬菌粒载体和pCTcon2质粒，酶切后的片段用T4连接酶进行连接)将单链抗体库构建到酵母质粒pCTcon2上，得到重组质粒。

将构建的重组质粒利用电转仪电转化到酵母EBY100中，在SDCAA固体培养基(见表1)上长出克隆后，用SDCAA液体培养基(见表1，不添加琼脂)刮板，混匀测OD600，取10OD酵母用SDCAA液体培养基稀释，30℃，220rpm摇床过夜培养；第二天，测OD600，用新鲜SDCAA液体培养基稀释至1OD/mL，30℃继续培养4-6h；当OD至3-5时，更换为新鲜的SGCAA液体培养基(见表1，不添加琼脂)重悬酵母至1OD/ml，放在20℃摇床中培养18-24h。通过上述诱导培养使重组质粒在酵母中表达，同时单链抗体蛋白展示在细胞表面。

表1

取10OD诱导后的酵母与生物素化的IL1RAP抗原一同孵育，一部分抗体能够与抗原发生特异性结合，从而使得表达该抗体的酵母表面带上了抗原蛋白。用4μLAnti-c-myc检测单链抗体的表达，同时孵育2μL SA-PE(检测抗原的结合)以及2μLGoat anti-chicken IgY(H+L)FITC(检测抗体的表达)，通过流式细胞仪分选出双阳性的酵母，此时分选得到的酵母所能够表达的抗体即为与抗原发生特异性结合的抗体。按照上述方法共进行三轮酵母分选得到结果如图3所示，A为阴性对照，不与任何抗原抗体进行孵育；BCD分别为三轮筛选的实验组，其中第一轮加入抗原浓度为100nM，第二轮抗原浓度为10nM，第三轮抗原浓度为1nM。

经三轮筛选双阳性酵母有明显富集后，将分选下的酵母进行培养并提取质粒，再将酵母中提取的质粒转化到大肠杆菌中，将大肠杆菌平板随机测序100个，挑选出重复率高的序列。

3.实验结果：

由酵母筛选每一轮的流式结果可以看出，随着抗原浓度的不断降低，高亲和力的抗体被逐渐富集，最终通过测序并分析得到一条与IL1RAP特异性结合的高亲和力单链抗体序列，即为：Anti-IL1RAP-02，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链CDR 3区序列为ARSGRIAVADY，轻链CDR3区序列为MQGTHWPGT；编码该单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例3利用酵母表面展示验证亲和力

1.实验方法：

取连接有本发明单链抗体Anti-IL1RAP-02DNA序列的质粒，分别转入EBY100中，克隆长出后，刮平板，取5OD菌体放到5mL SDCAA液体培养基中30℃培养至OD约为3；各取出5OD菌体离心，分别用5mL SGCAA液体培养基重悬，20℃培养20h。

诱导结束测OD600，各取1OD菌体，5000rpm离心，FACS buffer洗两遍，每个样品均分为两份：阴性对照组和实验组，其中阴性对照组加400μLFACS buffer重悬置于4℃；

实验组：41.4μLFACS buffer+2μL生物素化的IL1RAP(0.1mg/mL)+1μL IgYanti-c-myc抗体，室温结合1h；FACS buffer洗两遍，再加入100μLFACS buffer+1μL SA-PE+1μLGoat anti-chicken IgY(H+L)FITC，4℃避光结合1h；

离心去上清，FACS buffer洗两遍，300μL重悬，进行流式分析得结果图4。

2.实验结果：

本发明单链抗体Anti-IL1RAP-02在酵母表面上与抗原蛋白IL1RAP具有很好的亲和力。

实施例4纯化带有Fc段的Anti-IL1RAP-02

1.所用材料：

293 freestyle培养液购自赛默飞公司，货号12338026。

Opti-MEM I购自赛默飞公司，货号51985049。

293 fectin转染试剂购自赛默飞公司，货号12347019。

293F细胞系购自ATCC。

2.实验方法：

利用酶切连接的方式(用Sfi I酶分别酶切pFuse-mFc质粒和带有Anti-IL1RAP-02的pCTcon2质粒，酶切后的片段用T4连接酶进行连接)将单链抗体序列构建到质粒pFuse-mFc上，得到重组质粒。

在CO₂摇床培养箱中培养30mL293F细胞至浓度为1×10⁶个/mL，待用。

取30μg重组质粒用Opti-MEM I稀释至1mL，取60μL 293fectin用Opti-MEM I稀释至1mL，室温放置5min后二者混合静置20min，缓慢加入到293F细胞中，在CO₂摇床培养箱中培养4天进行蛋白的表达。

结合proteinA蛋白柱亲和层析原理，利用AKTA系统进行蛋白纯化。

3.实验结果

纯化出含Fc段的Anti-IL1RAP-02，可用于后续抗原抗体亲和力的验证。

实施例5利用哺乳动物细胞验证亲和力

1.实验方法：

293F细胞表面有抗原蛋白IL1RAP的表达，实验室冻存293F-KO细胞系，即利用CRISPR/Cas9技术对293F细胞的IL1RAP基因进行编辑使细胞表面不表达IL1RAP。分别复苏并培养293F与293F-KO细胞。

空白对照：取2×10⁵个293F细胞，离心并用300μLFACS buffer重悬，放4℃待用；

阴性对照：取2×10⁵个293F-KO细胞，离心并用100μLFACS buffer重悬，加2μL实施例4中纯化好的含Fc段的Anti-IL1RAP-02，4℃孵育1h；

实验组：取2×10⁵个293F细胞，离心并用100μLFACS buffer重悬，加2μL实施例4中纯化好的含Fc段的Anti-IL1RAP-02，4℃孵育1h；

孵育结束后，取阴性对照组与实验组离心收集细胞并分别用100μLFACS buffer重悬，加1μL Gt anti-Ms IgG Fc PE，4℃孵育30min；

FACS buffer洗去未结合的抗体，将细胞重悬至300μL进行流式分析，得结果图5。

2.实验结果：

利用哺乳动物细胞验证筛选所得的单链抗体与IL1RAP具有很好的亲和力。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 一种抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 239

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Met Ala Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Val Leu Leu Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Leu Val Ser Cys Leu Ala Ser Gly Thr Thr Pro Thr

20 25 30

Gly Thr Thr Met His Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Ala Gly Leu Gly

35 40 45

Thr Met Gly Thr Ile Ala Pro Ala Ser Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly

50 55 60

Leu Pro Gly Gly Ala Val Thr Met Thr Ala Ala Thr Ser Ile Ser Thr

65 70 75 80

Ala Thr Met Gly Leu Ser Ala Leu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Thr

85 90 95

Thr Cys Ala Ala Ser Gly Ala Ile Ala Val Ala Ala Thr Thr Gly Gly

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr

115 120 125

Thr Leu Thr Gly Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gly Pro

130 135 140

Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Val Ala Ser Ala Gly

145 150 155 160

Ala Thr Thr Leu Ala Thr Pro Gly Gly Ala Pro Gly Gly Ser Pro Ala

165 170 175

Ala Leu Ile Thr Leu Val Ser Ala Ala Ala Ser Gly Val Pro Ala Ala

180 185 190

Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile Ser Ala

195 200 205

Val Gly Ala Ala Ala Val Gly Val Thr Thr Cys Met Gly Gly Thr His

210 215 220

Thr Pro Gly Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu Ala

225 230 235

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

atggcacagg tgcagctggt ggagtctggg gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg 60

aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc ttcaccggct actatatgca ctgggtgcga 120

caggcccctg gacgagggct tgagtggatg ggatggatta accctaacag tggtggcaca 180

aactatgcac agaagtttca gggcagggtc accatgacca gggacacgtc catcagcaca 240

gcctacatgg agctgagcag gctgagatct gacgacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga 300

agcgggagga tagcagtggc tgactactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360

ggcggcggcg gcggatccga aacgacactc acgcagtctc cactctccct gcccgtcacc 420

cttggacagc cggcctccat ctcctgtagg tctagtcaaa gcctcgtgcg cagtgacgga 480

aacacctact tgaattggtt tcagcagagg ccaggccaat ctccaaggcg cctaatttat 540

aaggtttcta accgggactc tggggtccca gacagattca gcggcagtgg ctcaggcact 600

gatttcacac tgaaaatcag cagggtggag gctgacgatg ttggggttta ttactgcatg 660

caaggtacac actggcctgg gacttttggc caggggacca aggtggaaat caaacgt 717

Claims

1.一种抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体，其特征在于，编码所述单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的一种抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体在制备用于预防或治疗疾病的产品中的应用；所述疾病包括与人白介素-1受体辅助蛋白有关的炎症反应或者肿瘤；所述产品包括药物或试剂盒。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病包括类风湿性关节炎、肠炎、脓毒性休克、移植物排斥、牛皮癣、哮喘、Ⅰ型糖尿病、脑淀粉样血管病、阿兹海默症、急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病。

4.一种用于治疗炎症反应或者肿瘤的药物，其特征在于，以权利要求1所述的一种抗人白介素-1受体辅助蛋白的单链抗体作为活性成份。