CN110036913A - 降低芦笋花药培养污染率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开降低芦笋花药培养污染率的方法，其包括控制芦笋的花蕾期至花期的雄花蕾的发育温度；向芦笋施用磷肥和/或钾肥，并保持花期的土壤湿润；采集芦笋的顶端无开口的花蕾，并对花蕾表面进行消毒，剥离花药接种到培养基上进行低温预处理。本发明的方法促进了花蕾更好的发育，不仅有利于降低花药培养过程中污染率，而且能提高花药培养成功率。

Description

降低芦笋花药培养污染率的方法
技术领域
本发明涉及组织培养领域，具体地涉及降低芦笋花药培养污染率的方法。
背景技术
芦笋(Asparagus officinalis L.)是天门冬科天门冬属草本植物。芦笋是典型的雌雄异株植物，其性染色体处于植物性染色体进化途径的中间位置，性别表现出多种类型，包括雌株(XX)、雄株(XY)、超雄株(YY)和雄性雌型株(简称两性株，基因型为XY)。已有研究证明芦笋雄株产量比相同生长条件下同期雌株高。采用花药培养不仅可以快速获得基因型纯合的亲本，缩短育种年限，还能获得基因纯合的超雄株，以其作为父本与优良雌株杂交可获得许多高产的全雄新品种。因此，花药培养已经是用于创制芦笋育种新材料的重要方法。但目前芦笋花药培养工作中污染率较高的问题极大的限制了花药愈伤组织和再生植株的获得。
目前芦笋花药培养过程中通常采用先4℃低温预处理花蕾3～10d，然后再用0.1％升汞处理15min，以此对花药进行消毒。据张园等报道芦笋花蕾在0.1％升汞里处理15min，污染率高达34％以上。延长消毒时间，可以降低污染率，但对花蕾及其体内活细胞的伤害加重，影响花药培养效果。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种有效降低芦笋花药培养过程中污染率的方法。具体地，本发明包括以下内容。
一种降低芦笋花药培养污染率的方法，其包括以下步骤：
(1)控制芦笋雄株、超雄株和两性株蕾期至花期的花蕾发育温度；
(2)向芦笋施用磷肥和/或钾肥，并保持花期的土壤湿润；
(3)采集所述芦笋的顶端无开口的花蕾，并对花蕾表面进行消毒，剥离花药接种到培养基上进行低温预处理。
优选地，本发明的降低芦笋花药培养污染率的方法中，所述步骤(1)和(2)同时进行。
优选地，本发明的降低芦笋花药培养污染率的方法中，所述步骤(1)包括使芦笋在白天处于20～28℃之间的温度环境，和在夜晚处于10℃～18℃的温度环境。
优选地，本发明的降低芦笋花药培养污染率的方法中，所述步骤(2)包括在出笋前施加60～70kg/hm2的硫酸钾和60～70kg/hm2的过磷酸钙，在现蕾期追施90～105kg/hm2硫酸钾；其中所述硫酸钾包含45～55wt％的K2O，所述过磷酸钙包含15～25wt％的P2O5。
优选地，本发明的降低芦笋花药培养污染率的方法中，所述步骤(2)中保持花期的土壤湿润是指保持花期的土壤田间持水量在70～80wt％之间。
优选地，本发明的降低芦笋花药培养污染率的方法中，所述步骤(3)包括第一消毒和第二消毒，其中第一消毒为用醇水混合液浸泡花蕾10～20s，第二消毒为用升汞消毒液或次氯酸钠溶液浸泡花蕾8～10min。
优选地，本发明的降低芦笋花药培养污染率的方法中，在第一消毒前后和在第二消毒后分别包括使用无菌水清洗花蕾表面的步骤。
优选地，本发明的降低芦笋花药培养污染率的方法中，所述醇水混合液为70～80重量份酒精和20～30重量份水的混合液。
优选地，本发明的降低芦笋花药培养污染率的方法中，所述低温预处理包括使花药在培养基中于2～6℃温度环境保持2～6天。
优选地，本发明的降低芦笋花药培养污染率的方法进一步包括使低温预处理后的花药在培养基中于26±1℃下进行暗培养。
本发明的方法可以使花蕾开口率低于3％，甚至能达到零开口。本发明方法促进了花蕾更好的发育，不仅有利于降低花药培养过程中污染率，而且能提高花药培养成功率。
附图说明
图1为雄花蕾开口情况的图片。其中，左侧为长度为2mm的开口雄花蕾；右侧为长度为2mm的无口雄花蕾。
图2为花药培养过程中花药污染的变化图。其中，左则为花药培养过程中被污染的花药；右侧为花药培养过程中零污染的花药。
图3为示例性示出本发明的花药培养过程图。其中，从左向右依次为：花药接种到诱导培养基后诱导出愈伤组织；愈伤组织接种到分化培养基上开始分化成苗；愈伤组织分化出苗子后开始生根。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明的术语“芦笋”是指天门冬科天门冬属的草本植物，其为典型的雌雄异株植物，其性染色体处于植物性染色体进化途径的中间位置，性别表现出多种类型，包括雌株(XX)、雄株(XY)、超雄株(YY)和雄性雌型株(简称两性株，基因型为XY)。
本发明的术语“药花培养”是指用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上，以改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化，并连续进行有丝分裂，形成细胞团，进而形成团状无分化的薄壁组织(也称作愈伤组织)，或分化成胚状体，随后使愈伤组织分化成完整的植株。
本发明的降低芦笋花药培养污染率的方法至少包括以下三个步骤：
(1)控制芦笋雄株、超雄株和两性株蕾期至花期的花蕾发育温度；
(2)向芦笋施用磷肥和/或钾肥，并保持花期的土壤湿润；
(3)采集所述芦笋的顶端无开口的花蕾，并对花蕾表面进行消毒，剥离花药接种到培养基上进行低温预处理。
下面详细说明各步骤。
步骤(1)：
本发明的步骤(1)为控制芦笋花蕾的发育温度。此处的花蕾是指花蕾期至花期之间的花蕾。此处的芦笋为雄株、超雄株和两性株中的至少一种。此处的发育温度优选指白天在20～28℃之间，夜晚在10℃～20℃。白天的温度更优选为21～26℃，进一步优选22～25℃。夜晚的温度更优选10～18℃，进一步优选10～15℃。优选地，白天的温度高于夜晚的温度。本发明发现通过如上所述控制发育温度可以促进芦笋花蕾的发育，减少花蕾开口率，降低花药培养污染率。
本发明中，发育温度的控制可采用本领域已知的方法。例如提前留母茎和增强通风等措施。还可利用浇水、空调或风扇控温等措施。在示例性措施包括白天通过增强通风的措施降低温度，夜间通过关闭通风口，闭棚等措施保温。
步骤(2)：
本发明的步骤(2)包括向芦笋施用磷肥和/或钾肥，并保持花期的土壤湿润。发明人发现磷肥和/或钾肥的施用，以及土壤湿润程度能够影响花蕾开口率，进而降低污染率。
本发明的磷肥是指以磷元素为主要养分的肥料。磷肥中五氧化二磷(P2O5)的含量一般为15～25wt％，优选16～20wt％，更优选18-20wt％。磷肥可以是天然磷肥，也可以是化学磷肥。天然磷肥的实例包括但不限于海鸟粪、兽骨粉和鱼骨粉等。化学磷肥的实例包括但不限于过磷酸钙、重过磷酸钙、钙镁磷肥和磷矿粉等。本发明可以使用上述磷肥中的一种或多种。优选地，本发明的磷肥为过磷酸钙，其中五氧化二磷含量为15～25wt％，优选为18wt％。磷肥的施用量一般为60～70kg/hm2，优选62～68kg/hm2，更优选64～66kg/hm2。
本发明的磷肥施用时机是重要的。对于本发明的目的而言，应在出笋前施用。只要出笋前施用，则施用的次数不特别限定。例如可以一次性施用上述量的磷肥，也可多次分批施用至上述范围的总量范围。
本发明的钾肥是指以钾为主要养分的肥料。钾肥中氧化钾(K2O)的含量一般为45～55wt％，优选46～54wt％，更优选48～52wt％。钾肥的实例包括但不限于氯化钾、硫酸钾、草木灰、钾泻盐和磷酸一钾(磷酸二氢钾)等。本发明可使用上述物质中的一种或多种。优选地，本发明的钾肥为硫酸钾，其中氧化钾的含量为45～55wt％，优选为52wt％。
本发明中钾肥的施用时机也是重要的。对于本发明的目的而言，钾肥至少在不同的时间段内两次施用。即，在出笋前进行第一施用。在现蕾期进行追施(即，第二施用)。需要说明的是，术语“第一施用”和“第二施用”各自的含义不仅仅包括一次性施用所需量的钾肥，还包括多次小量施用钾肥至所需量。第一施用的总量一般为60～70kg/hm2，优选62～68kg/hm2，更优选64～66kg/hm2。第二施用的总量一般为90～105kg/hm2，优选95～100kg/hm2，更优选95～98kg/hm2。
本发明中磷肥的施用和钾肥的第二施用可同时进行，也可以在不同的时间以分开的方式施用。
本发明还发现保持花期土壤湿润对于本发明的目的而言是重要的。其中土壤湿润的标准为土壤田间持水量在70～80wt％之间，优选72～88wt％。
步骤(3)：
本发明的步骤(3)为采集所述芦笋的顶端无开口的花蕾，并对花蕾表面进行消毒，剥离花药接种到培养基上进行低温预处理。
本发明中无开口花蕾的采集和鉴定可使用本领域已知的方法进行。其顶端无开口花蕾的鉴别包括但不限于肉眼、放大镜或体视显微镜观察芦笋的花蕾，优选为雄株、超雄株或两性株的花蕾。例如，通过仔细鉴定单核靠边期花蕾顶端开口情况，筛选顶端无开口的花蕾。单核靠边期花蕾的长度一般为1.5～2.5mm。在示例性鉴定方法中，顶端无开口的花蕾标准为：花蕾花瓣包裹紧实，里面花药不可见。顶端开口花蕾标准为：花蕾花瓣包裹松散，有大小为100～1000μm的孔隙，里面花药可见。
本发明中得到顶端无开口的花蕾后需立即对花蕾表面进行消毒。由此可避免低温预处理期间花蕾表面病原菌的繁殖，降低花药培养污染率。得到顶端无开口的花蕾后如果不及时进行消毒，则会不利地影响污染率。本发明的消毒方法为化学消毒法，其实施包括但不限于醇水混合液消毒、升汞消毒和次氯酸钠消毒的方法。优选地，本发明的消毒包括第一消毒和第二消毒。第一消毒和第二消毒为不同的消毒方式，由此增强消毒效果。其中第一消毒优选用醇水混合液浸泡花蕾，浸泡时间一般为10～20秒(s)。第二消毒包括用升汞浸泡8～10min，优选8～9min。第二消毒还可包括用次氯酸钠溶液作为消毒液浸泡10～14min，优选10～12min。
本发明的醇水混合液一般是指70～80重量份酒精和20～30重量份水的混合液，优选75wt％酒精和水的混合液。本发明的升汞浓度一般为0.05wt％～0.5wt％，优选为0.08wt％～0.2wt％，更优选为0.08wt％～0.1wt％。本发明的次氯酸钠消毒液浓度为1～10wt％，优选2～6wt％，更优选5wt％。
本发明中，在第一消毒前后优选还包括使用无菌水清洗花蕾表面的步骤，和在第二消毒后优选还包括使用无菌水清洗花蕾表面。无菌水清洗的次数不限定，本领域技术人员可根据需要而自由设定。
本发明的消毒方法相比其他已有的消毒方法所用消毒时间更短，极大地降低了对花蕾及其体内活细胞的伤害。利用本发明的消毒方法芦笋花药愈伤组织诱导率比用其他已有的消毒方法提高10.5～21.6％。
本发明的花蕾进行消毒后，优选用无菌水冲洗后(例如5～6次后)，进行干燥。例如放到灭菌后烘干的滤纸上，将表面水分吹干，立即剥离，将花药接种到培养基上，再低温预处理。
本发明中，低温预处理包括使花药在培养基中于2～6℃，优选2～5℃温度环境保持2～6天，优选3～5天。
本发明的步骤(3)进一步还包括使低温预处理的花药在培养基中于26±1℃下进行暗培养。暗培养的时间不特别限定，例如可为20～70天，优选40～60天。
实施例1
本实施例研究温度对花蕾开口率的影响
玻璃温室内栽培的用于芦笋花药培养的三年生芦笋品种为格兰德、冠军、鲁芦笋7号。在3月中下旬留母茎，设置3个处理温度。处理1：白天温度20℃，夜间温度10℃；处理2：白天温度28℃，夜间温度15℃；处理3：白天温度38℃，夜间温度15℃；分别调查每个处理的20株雄株的花蕾，每个单株调查50个1.5～2.5mm的花蕾。经过体视显微镜观察、统计花蕾开口率。结果表明，白天温度在20～28℃，夜间温度15℃左右，开口率低于3％。结果如表1所示。
表1-不同温度条件下花蕾开口率
实施例2
本实施例研究水肥对花蕾开口率的影响
大棚内栽培的用于芦笋花药培养的三年生芦笋品种为格兰德、冠军、鲁芦笋7号。在3月中下旬留母茎，白天温度25～35℃，夜间温度10～20℃；肥料实验设置3个处理。处理1：不使用肥料；处理2：在春季出笋前施硫酸钾(含K2O 52％)70kg/hm2、过磷酸钙(含P2O518％)65kg/hm2。在现蕾期施硫酸钾90kg/hm2。处理3：在春季出笋前施硫酸钾(含K2O 52％)70kg/hm2、过磷酸钙(含P2O5 18％)70kg/hm2。3个处理的其它管理一致。经过显微镜观察发现，肥料对花蕾开口率有较大的影响。处理2获得的花蕾开口率最低。结果如表2所示。
表2-不同营养条件下花蕾开口率
实施例3
本实施例研究花蕾开口率对芦笋花药培养污染率的影响
3.1芦笋花蕾的采集
以三年生芦笋品种冠军、格兰德为材料，从雄株上摘取1.5～2.5mm的花蕾，体视显微镜或肉眼观察，将开口花蕾与未开口花蕾分开。并将实验材料分为三个处理。处理一：30个未开口花蕾；处理二：27个未开口花蕾和3个开口花蕾。处理三：24个未开口花蕾和6个开口花蕾。每个处理3次重复。
3.2芦笋花蕾消毒
将每个样品先用75％酒精溶液浸泡20s，倒去酒精后用无菌水冲洗2次，再用0.1％升汞溶液浸泡10min，期间不停摇晃，最后用无菌水清洗6次，在超净台内剥取花药，接种于诱导培养基上，盖好培养瓶。每瓶接种完好无损的花药30枚。
3.3芦笋花药的低温预处理
将4℃冰箱用消毒后，将接种花药后的培养瓶放于冰箱内低温预处理5d。然后取出培养瓶置于26±1℃的黑暗条件下进行暗培养30d。
3.4花药消毒的效果
采用相同的消毒方法处理不同开口率的花蕾样品，发现开口率为20％的花蕾样品污染率最高，其中格兰德的污染率达到44.3％。开口率为零的花蕾样品污染率均很低，其中冠军的污染率只有13.5％。
表3-不同开口率花蕾的污染率
综上所述，通过本发明的方法可以有效控制芦笋花蕾开口，通过肉眼或体视显微镜鉴定、剔除开口花蕾，确保用于花药培养的花蕾开口率为零。即使在夏季花蕾开口率较高的情况下，通过鉴定、剔除开口花蕾的方法可以使花药的污染率低于15％，比常规方法大大降低了污染率，缩短了消毒时间，极大地降低了对花蕾及其体内活细胞的伤害，提高了芦笋花药培养的成功率。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (10)

1.一种降低芦笋花药培养污染率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)控制芦笋雄株、超雄株和两性株蕾期至花期的花蕾发育温度；
(2)向芦笋施用磷肥和/或钾肥，并保持花期的土壤湿润；
(3)采集所述芦笋的顶端无开口的花蕾，并对花蕾表面进行消毒，剥离花药接种到培养基上进行低温预处理。
2.根据权利要求1所述的降低芦笋花药培养污染率的方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)同时进行。
3.根据权利要求1所述的降低芦笋花药培养污染率的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括使芦笋在白天处于20～28℃之间的温度环境，和在夜晚处于10～18℃的温度环境。
4.根据权利要求1所述的降低芦笋花药培养污染率的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括在出笋前施加60～70kg/hm2的硫酸钾和60～70kg/hm2的过磷酸钙，在现蕾期追施90～105kg/hm2硫酸钾；其中所述硫酸钾包含45～55wt％的K2O，所述过磷酸钙包含15～25wt％的P2O5。
5.根据权利要求4所述的降低芦笋花药培养污染率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中保持花期的土壤湿润是指保持花期的土壤田间持水量在70～80wt％之间。
6.根据权利要求1所述的降低芦笋花药培养污染率的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括第一消毒和第二消毒，其中第一消毒为用醇水混合液浸泡花蕾10～20s，第二消毒为用升汞消毒液或次氯酸钠溶液浸泡花蕾8～10min。
7.根据权利要求6所述的降低芦笋花药培养污染率的方法，其特征在于，在第一消毒前后和在第二消毒后分别包括使用无菌水清洗花蕾表面的步骤。
8.根据权利要求6所述的降低芦笋花药培养污染率的方法，其特征在于，所述醇水混合液为70～80重量份酒精和20～30重量份水的混合液。
9.根据权利要求8所述的降低芦笋花药培养污染率的方法，其特征在于，所述低温预处理包括使花药在培养基中于2～6℃温度环境保持2～6天。
10.根据权利要求9所述的降低芦笋花药培养污染率的方法，其特征在于，进一步包括使低温预处理的花药在培养基中于26±1℃下进行暗培养。
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