CN110022860A - 用于治疗疾病的新的药物递送系统 - Google Patents

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西格丽德·伯格
埃纳尔·苏尔海姆
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Abstract

本发明总体上涉及癌症和中枢神经系统中疾病的治疗的改善。提供了一种新的药物递送系统、其生产方法以及医疗用途。

Description

用于治疗疾病的新的药物递送系统
技术领域
本发明总体上涉及癌症、癌性肿瘤和中枢神经系统中疾病的治疗的改善。提供了一种新的药物递送系统、其制备方法和医学用途。
背景技术
癌症是一组涉及异常细胞生长的疾病，其可能侵入或扩散到身体的其它部位。这种恶性行为经常导致侵入和转移到第二位置。在大多数工业化国家，癌症是导致死亡的主要原因。标准治疗包括单独或组合的手术、化疗、放射、激光和光动力疗法。此外，免疫疗法和激素疗法已被批准用于某些类型的癌症。手术干预用于去除肉眼可见的肿瘤并且肿瘤部位的照射用以治疗剩余的微观肿瘤。化疗用于在手术部位或身体其它部位攻击任何残留或不可切除的疾病。不同治疗的成功率取决于癌症的类型和阶段。尽管近年来有所改善，但许多类型的癌症患者的预后仍然很差。
化疗可以被定义为用一种或多种细胞毒性抗肿瘤药物(化疗剂)作为标准化方案的一部分来治疗癌症。该术语包括多种药物，它们分为广泛的类别，例如烷化剂和抗代谢物。传统的化疗剂通过杀死快速分裂的细胞起作用，快速分裂是大多数癌细胞的关键特性。这是通过损害有丝分裂(细胞分裂)或DNA合成来实现的。
虽然化疗对某些癌症(如，例如白血病)有治疗作用，但对某些癌症仍然无效，并且在其它癌症中则是不需要的。
根据药物和待治疗的癌症类型，化疗剂最通常经肠胃外递送。对于传统的肠胃外化疗，通常只有0.001-0.01％的注射剂量到达肿瘤。不幸的是，许多目前的化疗药物还对健康组织具有过度毒性并且预防转移的能力有限。
近年来，已经在寻找新的肿瘤靶向治疗方面付出了巨大的努力。肿瘤血管系统通常更‘渗漏’，但遭受较高的间质液和渗透压，可阻碍药物在整个肿瘤体内通过。取决于肿瘤类型，已确立的化学治疗剂的摄取可能是高度可变的，并且这种摄取差异可能有助于治疗效果的可变性质。
纳米粒子(NP)作为抗癌药物的载体为这种靶向癌症治疗提供了巨大潜力，因为由于增强的通透性和滞留效应(EPR效应)，观察到了在肿瘤中的一定积累。尽管如此，肿瘤中NP的摄取相对较低且分布不均匀。因此，到目前为止，纳米医学领域显示出的影响有限。纳米医学领域主要依赖的指示EPR效应主要在动物肿瘤模型中进行了研究，患者的实验数据有限。EPR效应显示，肿瘤类型内和之间存在显著的异质性，并且目前在肿瘤学和纳米医学界关于人类中EPR效应的争论仍在继续。增强或绕过EPR效应的新的治疗概念具有很高的临床意义。
众所周知，目前临床上用作超声(US)成像造影剂的充气微泡(MB)与治疗性低频US联合使用可局部增加血管通透性。这是通过放松或制造穿过紧密连接的孔以便于细胞旁摄取、内吞作用增加和/或来自声孔的跨细胞转运而诱导“人工EPR效应”来实现的。然而，经优化用于US成像的市售MB具有非常薄的壳(2-20nm)，易碎且血液循环时间较短(约1分钟)。因此，它们在药物递送系统中用以增强化疗剂向癌组织和肿瘤的摄取的应用是有限的。
因此，需要一种改进的药物递送系统，其可以增加血管通透性并增强肿瘤中治疗剂的摄取。
最近的工作也被激励到解决跨越血脑屏障(BBB)向中枢神经系统中的靶位点递送药物的问题。阻止较大分子进入组织空间的紧密血管内皮连接是血脑屏障的特征。BBB是一种保护大脑并维持其内环境平衡的脑内皮界面，其阻碍了药物的大脑递送，但也限制了98％的小分子药物和几乎所有大分子药物的通过。
纳米粒子(NP)由于其高药物负载能力、掺入难溶性药物和新的治疗剂(如肽和寡核苷酸)、用于持续和控制释放的功能化以及治疗与成像的组合，可以在药物递送方面提供许多益处。在实体瘤的情况下，纳米粒子也可以从增强的通透性和滞留效应中受益，由于肿瘤渗漏的新血管系统和减少的淋巴引流，NP被滞留在肿瘤中。然而，BBB也是NP的一个巨大障碍，并且它们的大脑递送可以受益于多种BBB开放技术。因此，需要探索纳米粒子在向大脑递送药物中的潜在用途。
超声/微泡介导的药物递送的最基本形式是微泡配方与全身给药的药物一起给药。此种途径的一个例子最近已进入临床试验[Kotopoulis et al,Med Phys.,40(7)(2013)]，其中将商业US造影剂Sono Vue(Bracco Spa.)与吉西他滨联合给药，随后进行US照射以治疗胰腺癌。
除了联合给药途径之外，还探索了用于药物递送的几种其它微泡技术[Geers etal,Journal of Controlled Release 164(2012)248-255]。实例是装载药物的微泡、来自纳米滴的原位形成的微泡和靶向微泡。已经报道了将聚焦超声(FUS)和MB与化学疗法相结合的第一个I期临床试验，其中10例不能手术的局部晚期胰腺癌患者接受吉西他滨输注，随后在US治疗期间静脉注射SonoVue(Georg Dimcevski,et al.2016)。然而，多年来，已经认识到所有这些途径都具有基本的局限性，这有效地阻碍了向临床实践的过渡。可能最大的限制是可以掺入微泡系统中的药物量。此外，为了将药物负载附着和/或掺入到微泡系统中，可能需要对药物进行化学修饰，这可能改变生物活性。
因此，需要新的多功能药物递送系统。
本发明是新的多功能药物递送系统的首次成功实证，该系统包含与治疗中的纳米粒子缔合的充气微泡。如本文所证明的，该系统用于治疗，例如治疗癌症和中枢神经系统疾病。将该递送系统与超声结合使用以促进纳米粒子的递送。通过应用声场(诸如通过聚焦超声产生的声场)来实现纳米粒子在靶位点(例如在肿瘤中或脑中的靶位点)的增强摄取。
定义
术语‘微泡，(MB)’在本文中用于描述直径在0.5至30微米范围内的微泡，平均直径通常为1至6μm。
术语‘纳米粒子，(NP)’在本文中用于描述线性尺寸小于800nm的粒子或胶囊。
术语“与纳米粒子缔合的微泡”和“与微泡缔合的纳米粒子”在本文中用于描述纳米粒子以何种方式与微泡界面相互作用。与此相关使用的术语“与…缔合”包括通过任何类型的化学键合的缔合，诸如共价键合、非共价键合、氢键键合、离子键合或任何其它表面-表面相互作用。
术语“全身性给药”和“全身地给药”是本领域公认的术语，并且包括使物质进入循环系统以使整个身体受到影响的给药途径。
术语“肠胃外给药”和“肠胃外地给药”是本领域公认的术语，并且包括除肠内和局部给药之外的给药方式，例如注射，包括但不限于静脉注射、肌内注射、胸膜内、血管内、心包内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内(intradennal)、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下腔、脊柱内和胸骨内注射和输注。
术语“靶位点”和“疾病位点”在本文中可互换使用以描述待治疗的组织。其可以独立地是癌组织、肿瘤如实体瘤、胶质瘤如侵袭性胶质母细胞瘤、或中枢神经系统中的其它疾病。
术语“释放位点”在本文中用于描述其中产生声场以促进纳米粒子的释放并因此将纳米粒子和治疗剂递送至靶位点的位点。
术语“游离纳米粒子”描述了未与微泡缔合的纳米粒子。
术语‘表面活性剂’在本文中用于降低两种液体之间或气体和液体之间的表面张力的化学化合物，例如在微泡分散体中用作稳定剂。
‘声场’是用于描述聚焦超波应用区域的术语，因此是暴露或US治疗的区域。声场产生“热和非热机制”。“非热机制”包括空化、振动和振荡。
“高强度聚焦超声(HIFU)”或“聚焦超声(FUS)”是指使用声透镜将多个交叉的超声波束集中在靶上的医疗技术。每个单独的束以很小的效果穿过组织，但是在束会聚的焦点处，能量可以具有有用的热或机械效果。HIFU或FUS通常通过超声或MRI进行实时成像，以实现治疗靶向和监测(包括MRI热力追踪)。
术语‘空化’用于描述MB在声场中暴露于US时膨胀和压缩的过程。超声波通过高压和低压循环传播，压力差使MB在低压相膨胀并在高压相压缩。这种振荡可以稳定几个循环(稳定的空化)，但也可以以MB的或多或少的剧烈坍塌(惯性空化)结束，这取决于压力幅度和频率。空化相关的机制包括微流动、冲击波、自由基、微射流和应变。由超声波产生的声辐射力也可以将MB推向血管壁。
术语“声孔效应”或“细胞超声”在本文中用于描述声音(通常是超声频率)用于改变细胞质膜的通透性的用途。声孔效应采用微泡的声空化，从而增强纳米粒子向肿瘤和/或释放位点的递送。如本文所用，术语“药物递送”应理解为包括药物分子、治疗剂、诊断剂、基因和放射性同位素的递送。
本文中使用的术语“药物组合物”具有其常规含义，并且特别是以适于哺乳动物给药的形式，尤其是适于通过肠胃外给药的形式，例如注射。
术语“治疗剂”意在包括能够产生治疗效果的每种活性力或物质。在整个说明书中，术语“化疗剂”和“抗癌药物”可互换使用。
术语“诊断剂”用于描述用于揭示、确定和定义病理过程的位置的物质。
如本文所用的术语“药学上可接受的”表示系统或组合物适于施用于受试者(包括人类患者)以实现本文所述的治疗，且鉴于疾病的严重程度和治疗的必要性，没有过度有害的副作用。
术语“疗法”、“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”同义使用，是指为具有疾病风险或患有疾病的患者提供益处的任何动作，包括通过减轻、抑制、压制或消除至少一种症状来改善病情，延迟疾病的进展，预防、延迟或抑制疾病发作的可能性等。
本文使用表达“增强的通透性和滞留(EPR)效应”和‘人工EPR效应’来描述某些尺寸的分子(通常是脂质体、纳米粒子和大分子药物)倾向于在肿瘤组织中累积比在正常组织中累积更多的性质。
如本文所用的术语“血脑屏障”是指高度选择性的通透性屏障，其将循环血液与中枢神经系统(CNS)中的脑细胞外液分离。血脑屏障由脑内皮细胞形成，其通过具有极高电阻率的紧密连接而连接。
发明内容
本发明总体上涉及改善癌症和癌性肿瘤、癌组织以及脑和/或中枢神经系统中疾病的治疗。已经证明，所描述的递送系统可以增强治疗剂向实体瘤的递送，以及选择性地且暂时地打开血脑屏障。
本发明包括填充(或负载)有治疗剂的纳米粒子、充气微泡和两者的组合。公开了一种药物递送系统，其有助于将治疗剂递送至疾病组织。该系统使用超声波来诱导覆盖患病区域的声场。在声场中，可能发生空化和/或振荡。空化或振荡可导致微泡的可能坍塌。气体微泡的坍塌释放出纳米粒子。在声场中，由超声波产生的辐射力将作用在微泡上，并且可在它们坍塌之前将它们推向血管壁。空化和坍塌可以进一步在内皮细胞上产生剪切应力和射流，这两者将一起并独立地改善纳米粒子穿过毛细管壁的运输。
在本发明的第一方面，公开了一种用于在疗法中应用的药物递送系统，其包含至少一种充气微泡、与至少一种微泡缔合的多个纳米粒子和与纳米粒子中的至少一个(atleast one，至少一种)缔合的至少一种治疗剂，其中全身(诸如肠胃外)给予药物递送系统，并且在释放位点(site，部位)产生声场以介导所述纳米粒子和/或至少一种治疗剂向靶位点的递送。
在不同实施方式中，可以通过超声(US)诸如聚焦超声(FUS)或本领域技术人员已知的其它手段来产生声场。声场引起充气微泡的空化、振荡和/或坍塌，从而促进纳米粒子的释放。空化可以进一步改善纳米粒子穿过毛细管壁的运输。因此，这种新的用途增强了EPR效应。
在另一实施方式中，通过辐射力和/或加热介导递送，这也可导致纳米粒子和药物在肿瘤组织中的细胞外基质中的运输增加。
在进一步的实施方式中，通过超声诱导的微泡激活与辐射力和/或加热的组合来介导递送。
在另一实施方式中，微泡在应用聚焦超声于其上时是可破坏的。
在根据第一方面的本发明的一个实施方式中，释放位点与靶位点相同。这种实施方式的一个实例是当药物递送系统用于在治疗癌症中应用时。在该实施方式中，在释放位点产生声场，所述释放位点可以是实体瘤或肿瘤组织，以介导纳米粒子和/或治疗剂向靶位点的递送，所述靶位点可以是所述实体瘤或肿瘤组织。
在另一实施方式中，释放位点与靶位点不同。这方面的一个例子是当药物递送系统用于在治疗中枢神经系统中的疾病中应用时。在这一实施方式中，在释放位点处产生声场，该释放位点可以是血脑屏障，从而介导纳米粒子和/或治疗剂向靶位点的递送，所述靶位点可以是中枢神经系统中的疾病位点，例如脑肿瘤(例如胶质母细胞瘤)或脑中的其它疾病位点。在其中靶位点为实体瘤的情况下，释放位点可以是靶位点的一部分。在此种实施方式中，只有靶位点(例如肿瘤)的一部分暴露于超声波，该超声波产生声场，在该声场下促进药物负载的NP向靶位点的释放和增强的摄取。因此，根据本发明的药物递送系统是多峰和多功能的，并且构成用于治疗癌症(特别是实体瘤)和脑肿瘤以及中枢神经系统中其它疾病的新的医学用途。
在某些实施方式中，纳米粒子可以表面缔合到微泡并且覆盖微泡表面的至少一部分，任选地纳米粒子的至少一种是聚合物，诸如聚(氰基丙烯酸烷基酯)(PACA)纳米粒子。在优选的实施方式中，PACA-粒子是聚(氰基丙烯酸异己酯)或聚(氰基丙烯酸乙基丁酯)(poly(ethyl butyl cyanoacrylate)，聚(乙基丁基氰基丙烯酸酯))。
根据本发明第一方面的一个实施方式，治疗剂负载在纳米粒子内。任选地，纳米粒子也可含有共稳定剂。
在另一实施方式中，根据第一方面的药物递送系统还包含游离纳米粒子和与游离纳米粒子缔合的一种或多种治疗剂。在某些实施方式中，与微泡缔合的纳米粒子与游离纳米粒子是同一种纳米粒子，并且两者都可以填充有至少一种治疗剂。
根据另一实施方式，表面缔合的聚合物纳米粒子稳定微泡。纳米粒子对微泡的稳定将影响微泡在血液中的可能循环时间。
在某些实施方式中，根据本发明的药物递送系统还可任选地包含至少一种或多种靶向剂、药学上可接受的载体，并且纳米粒子可以进一步涂覆有亲水性聚合物如聚乙二醇(PEG)。
在某些实施方式中，具有表面缔合的聚合物纳米粒子的微泡的平均直径在0.5到30μm的范围内。
在某些实施方式中，治疗剂是化疗剂或化疗增强剂(chemopotentiator)。
根据进一步的实施方式，微泡可以充有从全氟化碳、空气、N2、O2、CO2组成的组中选择的气体。
在一个替代方面，根据第一方面的药物递送系统是一种组合物。
在第二方面，本发明还包括一种用于制备根据本发明第一方面的用于在疗法中应用的药物递送系统的方法，包含步骤：
a)合成待负载治疗剂和/或造影剂的纳米粒子。
b)将纳米粒子添加到包含表面活性物质的溶液中。
c)将溶液与气体混合以获得充气气泡。
根据所述方法的一个实施方式，通过在气体-水界面中纳米粒子的自组装来稳定微泡。
在所述方法的某些实施方式中，将c)中的溶液与气体混合所需的时间(诸如约2秒至60分钟，优选1至10分钟)和/或所需的速度(诸如当使用ultraturrax混合时约500至50000rpm，优选1 000至30 000rpm)，以获得所需尺寸的微泡。
根据所述方法的某些实施方式，步骤b)中溶液中的表面活性物质选自于由蛋白质或脂质或聚合物或表面活性剂组成的组。
本发明的第三方面是一种组合物，其包含充气微泡、与微泡缔合的多个纳米粒子和与纳米粒子的一个或多个缔合的一种或多种治疗剂，其中组合物进一步包含游离纳米粒子，即未与微泡缔合的纳米粒子。
在这一方面的某些实施方式中，多个纳米粒子可以表面缔合到充气微泡。进一步地，所述多个纳米粒子可以覆盖微泡表面的至少一部分。任选地，多个纳米粒子和/或游离纳米粒子是聚合物，诸如聚(氰基丙烯酸烷基酯)(PACA)纳米粒子。在一个优选的实施方式中，PACA-粒子是聚(氰基丙烯酸乙基丁酯)纳米粒子。
根据本发明第三方面的一个实施方式，治疗剂负载在纳米粒子内。任选地，纳米粒子还可含有共稳定剂。
在进一步的实施方式中，根据本发明第三方面的组合物用于在疗法中应用。根据这些实施方式，全身(如胃肠外)给予组合物，并且在释放位点处产生声场以介导所述纳米粒子和/或至少一种治疗剂向靶位点的递送。根据本发明第一方面描述的不同特征也适用于根据第三方面的组合物用于在疗法中应用。
本发明的最后一个方面包括治疗癌症的方法，包含向有需要的患者给予根据本发明第一方面的药物递送系统。在一个实施方式中，公开了一种治疗中枢神经系统中疾病的方法，包含向有需要的患者给予根据本发明第一方面的药物递送系统。
治疗剂可以负载在至少一个纳米粒子中，任选地，根据本发明第一方面的系统还可包括负载有诊断剂的纳米粒子。
本发明的某些实施方式包括一种治疗癌症或中枢神经系统中疾病的方法，包含将具有缔合的纳米粒子的微泡递送至患者的治疗部位，其中至少一个纳米粒子填充有治疗剂。在一些实施方式中，该方法包括将超声能量施加到治疗部位。在一些实施方式中，疾病是癌症，如乳腺癌或大脑癌症。
在以下编号的实施方式中找到本发明的进一步的方面：
1.一种药物递送系统，包含充气微泡、与充气微泡缔合的多个纳米粒子和与至少一个纳米粒子缔合的至少一种治疗剂，其用于纳米粒子和/或至少一种治疗剂向肿瘤组织的超声介导的递送。
2.根据编号实施方式1的药物递送系统，其中纳米粒子表面缔合到充气微泡。
3.根据编号实施方式1-2中任一项的药物递送系统，其中至少一种治疗剂负载在纳米粒子内。
4.根据编号实施方式1-3中任一项的药物递送系统，进一步包含至少一个(atleast one，至少一种)游离纳米粒子和与至少一个游离纳米粒子缔合的至少一种治疗剂。
5.根据编号实施方式1-4中任一项的药物递送系统，其中纳米粒子是聚合物。
6.根据编号实施方式1-5中任一项的药物递送系统，其中纳米粒子的至少一种是聚(氰基丙烯酸烷基酯)(PACA)纳米粒子。
7.根据编号实施方式1-6中任一项的药物递送系统，其中与充气微泡缔合的纳米粒子稳定微泡。
8.根据编号实施方式1-7的药物递送系统，其中纳米粒子还包含至少一种靶向剂。
9.根据编号实施方式1-8中任一项的药物递送系统，还包含药学上可接受的载体。
10.根据编号实施方式1-9中任一项的药物递送系统，其中纳米粒子还涂覆有聚乙二醇(PEG)。
11.根据编号实施方式1-10中任一项的药物递送系统，其中与纳米粒子缔合的充气微泡的平均直径在0.5至30μm的范围内。
12.根据编号实施方式1-11中任一项的药物递送系统，其中治疗剂是化疗剂或化疗增强剂。
13.根据编号实施方式1-12中任一项的药物递送系统，其中充气微泡充有从由空气、全氟化碳、N2、O2、CO2组成的组中选择的气体。
14.根据编号实施方式1-13中任一项的药物递送系统，其中超声介导的递送是通过超声例如聚焦超声介导的。
15.根据编号实施方式1-14中任一项的药物递送系统，其中微泡在向其施加聚焦超声时是可破坏的。
16.一种用于制备根据编号实施方式1-15的药物递送系统的方法，包含步骤：
a.合成待负载治疗剂的纳米粒子。
b.将纳米粒子添加到包含表面活性物质的溶液中。
c.将溶液与气体混合以获得充气气泡。
17.根据编号实施方式16的方法，其中通过纳米粒子在气体-水界面中的自组装来稳定微泡。
18.根据编号实施方式16-17中任一项的方法，其中将溶液与气体混合所需的时间和/或所需的速度，以获得所需尺寸的微泡。
19.根据编号实施方式16-18中任一项的方法，其中将c)中的溶液混合2秒至60分钟，优选1至10分钟。
20.根据编号实施方式16-19中任一项的方法，其中在500至50 000rpm，优选1 000至30 000rpm下混合c)中的溶液。
21.根据编号实施方式16-19中任一项的方法，其中表面活性物质是血清、蛋白质或脂质或表面活性剂。
22.一种与用于在治疗癌症中应用的纳米粒子缔合的充气微泡，其中纳米粒子的至少一个负载有治疗剂，并且通过声场(例如通过超声)促进纳米粒子和/或治疗剂向肿瘤组织的递送。
23.根据编号实施方式22的用途，其中纳米粒子表面缔合到微泡并且覆盖微泡表面的至少一部分。
24.根据编号实施方式22-23中任一项的用途，其中表面缔合的纳米粒子稳定微泡。
25.根据编号实施方式22-24中任一项的用途，其中声场引起充气微泡的空化、振荡和/或坍塌。
26.根据编号实施方式22-25中任一项的用途，其中空化改善纳米粒子穿过毛细管壁的运输。
27.根据编号实施方式22-26的用途，其中表面缔合的纳米粒子进一步包含至少一种或多种靶向剂。
28.一种用于在癌症治疗中应用的组合物，包含充气微泡、与微泡缔合的多个纳米粒子和与纳米粒子的一个或多个缔合的一种或多种化疗剂。
29.根据编号实施方式28的用于应用的组合物，其中组合物进一步包含至少一个游离纳米粒子以及与所述纳米粒子缔合的一种或多种化疗剂。
30.根据编号实施方式28的用于应用的组合物，其中组合物包含根据编号实施方式1-15中任一项的药物递送系统。
31.一种治疗癌症的方法，包含向有此需要的患者给予根据编号实施方式1-14的药物递送系统。
附图说明
图1：通过动态光散射测量的PEG化的卡巴他赛-负载的PIHCA NP的尺寸分布。药物载量为10.7wt％。
图2：显示通过光学显微镜和图像分析测量的由PEG化的卡巴他赛-负载的PIHCANP稳定的MB的尺寸分布的直方图。
图3：具有表面缔合的纳米粒子的微泡的电子显微镜图像。
图4.NP的尺寸和电动电位(zetapotential，ζ电位)分别约为170nm和-1mV。通过CLSM证实了乳腺癌细胞系中的细胞摄取(A)。通过包封荧光染料(红色)对NP进行成像。通过FCM定量，90％的细胞在温育3小时后通过内吞作用摄取NP(B)。
图5.发现PEG化NP的体内循环半衰期为136分钟(n＝5只动物)(A)。206160.9e-0.0051x形式的指数衰减拟合数据，R2＝0.67且p值≤0.0001。由自组装NP稳定的MB具有约3μm的尺寸，并且发现其适合于体内对比度增强的US成像和图像引导的药物递送。由超声成像的肿瘤中的气泡流入和循环引起对比度增强(B)。
图6：注射6小时后NP的生物分布。显示了来自一只动物的器官和肿瘤的实例(A)。器官和肿瘤中累积的量化显示为平均值加标准偏差(n＝10只动物，对于脑n＝5)(B)。显示了来自一只动物的未处理的器官和肿瘤的自发荧光。
图7：在这些器官、肿瘤和脑中可以发现剂量的87％。其余的可能存在于尿液、粪便、皮肤、肌肉和其它组织中。剂量的大部分位于肝和脾中，并且剂量的约1％位于肿瘤中(与报告的0.7％中位数相符)。
图8：来自整个肿瘤切片的CLSM平铺扫描的一个例子，以红色显示NP(A)。在来自每只动物的平铺扫描中量化来自NP的具有荧光的像素的数量(B)。当测量像素强度时，观察到类似的结果。没有发现稳定空化的影响，而MB的剧烈坍塌增加了NP向肿瘤的递送，并且随着MI的增加，摄取增加。
图9：切片的分析，PIHCA NP的摄取。
图10：除了导致大量视觉出血的最高MI(G7)外，HES染色肿瘤切片的评估显示所有FUS治疗均被认为是安全的。示出了概览图像的示例(A)，以及未处理和处理的组织的代表性图像(分别为B和C)。
图11：使用CLSM对处理2h后肿瘤中的NP的微分布进行成像。来自未接收任何超声处理的对照组(A)和使用高压处理的组(B)的代表性例子。血管显示为绿色，纳米粒子显示为红色。与对照组相比，在治疗组(G6)中观察到NP的递送增加。施加(b)和未施加(a)超声的肿瘤中的荧光染料的分布。b)中的药物比a)中多250倍。
图12：使用共聚焦显微镜探测聚(氰基丙烯酸烷基酯)纳米粒子的细胞内降解。测量细胞内的药物释放。
图13：体外，细胞中纳米粒子的摄取。
图14：MDA-MB-231细胞(人上皮，乳腺的活力。
图15：MRI造影剂在脑中的摄取。这一特定试剂通常不能穿过BBB。因此，结果说明了瞬态BBB开放。
图16：FUS介导的BBB破坏和NP跨BBB的运输。a)由FUS与PIHCA-MB平台组合介导的BBB开放。b)在FUS暴露后，PIHCA NP跨BBB的运输。红色–PIHCA NP，绿色–血管。
图17：作为时间的函数的动物重量显示为三个不同治疗组的平均值加标准偏差。每组n＝4只动物。第0天是植入肿瘤细胞的当天。在第21天和第29天进行治疗。
图18：作为时间的函数的肿瘤体积显示为三个不同组的平均值加标准偏差。第1组：对照，盐水。第2组：与纳米粒子和细胞抑制药物(卡巴他赛)缔合的微泡。第3组：超声以及与纳米粒子和细胞抑制药物缔合的微泡。每组n＝4只动物。第0天是植入肿瘤细胞的当天。在第21天和第29天进行治疗。
图19：三个不同治疗组中，肿瘤细胞植入后第35天的肿瘤体积，每组n＝4只动物。显示了平均值加标准偏差。
图20：通过使用聚焦超声和纳米粒子稳定的微泡增强向肿瘤组织递送药物的示意图。
图21：在患有皮下乳腺癌的小鼠中的疗效研究。植入细胞后肿瘤体积随时间的变化(第0天)。小鼠用盐水、纳米粒子稳定的微泡(NPMB)和卡巴他赛、或NPMB与卡巴他赛和US进行治疗。在第21天和第29天进行治疗。直至第35天，数据显示为每组n＝4只动物的平均值加标准偏差，并且从第37天开始每组n＝3只动物。
图22：在患有原位乳腺癌的小鼠中的疗效研究。植入细胞后肿瘤体积随时间的变化(第0天)。使用盐水(对照)、含有卡巴他赛的NPMB与FUS组合、或市售MB(SonoVue)与含有卡巴他赛的NP共注射组合FUS治疗小鼠。每组的平均肿瘤体积。
具体实施方式
本发明涉及一种多功能药物递送系统，其包含与FUS介导的药物递送一起使用的MB和多个NP。其是一种创新的药物递送系统，允许在聚焦US(FUS)的协助下控制并增强抗癌药物向肿瘤的递送。因此，该药物递送系统用于在疗法中应用。
根据本发明的药物递送系统包含与纳米粒子缔合的充气微泡，其中纳米粒子的至少一个负载有治疗剂并且通过超声产生的声场来促进纳米粒子向靶位点(如肿瘤)的递送。递送系统用于全身给予。因此，递送系统是全身给予的，同时借助于FUS，局部促进纳米粒子向靶位点的递送。与负载有至少一种治疗剂的NP缔合的充气MB可用于治疗癌症。特别地，根据本发明的与NP缔合的MB用于治疗实体瘤，包括脑中的肿瘤。与负载有至少一种治疗剂的NP缔合的充气MB也可用于疗法，例如用于治疗肿瘤如胶质瘤。通过将NP与MB缔合并且使用根据本发明的系统，可以增强治疗剂的摄取和疗效。
在一个实施方式中，通过NP稳定充气的MB。NP通过MB表面的自组装来稳定气体/水界面，从而产生非常稳定的MB。因此，根据本发明的一个实施方式的纳米粒子稳定的MB的一个优点是提高了稳定性和保存期限。
不受理论所束缚，NP和MB之间的缔合可能是形成所谓的皮克林(Pickering)乳液的结果。众所周知，具有中等疏水性的固体颗粒可以强烈地吸附在不混溶的流体(如油-水)之间的界面处，从而能够形成皮克林乳液，即由纳米或微米尺寸的固体颗粒稳定的乳液。以相同的方式，固体颗粒可用于稳定气体-水界面。然而，很少有材料固有地具有疏水性和亲水性的足够平衡，这对于颗粒稳定作用是必需的。如本文所述，包括在根据本发明的递送系统中的NP可用于通过在MB表面处的自组装来稳定气体-水界面。根据该实施方式，MB通过NP自组装形成为壳。结果是非常稳定的MB。这种纳米粒子稳定的微泡显示出具有长的保存期限。
通过应用超声来增强纳米粒子和治疗剂向靶位点的递送。超声波诱导覆盖患病区域的声场。在释放位点(例如肿瘤或BBB)局部施加超声，将暂时在血管中形成小孔。超声产生的声场将导致气泡振荡和坍塌，导致释放单个NP。从现有技术中已知，用于治疗目的的FUS可用于在组织中产生热或机械效应，例如空化和辐射力(Pitt WG,Husseini GA,Staples BJ:Ultrasonic drug delivery--a general review.Expert Opin Drug Deliv2004,1:37-56和Frenkel V:Ultrasound mediated delivery of drugs and genes tosolid tumors.Adv Drug Deliv Rev 2008,60:1193-1208)。空化是暴露于声场时的气泡产生和振荡。在相对低的压力下，声压波将导致MB的稳定空化；膨胀和压缩的连续振荡与超声(US)压力成反比。这在脉管系统中导致微流，以及当MB与内皮接触时在血管壁上产生剪切应力，导致形成小孔并增加血管通透性，并增强内吞作用。因此，当应用超声时，会引起声孔效应，从而增强血管通透性。由于增强的血管通透性，不再附着于MB的载药NP可随后在肿瘤组织中累积。
通过施加超声或声辐射力来增强纳米粒子和治疗剂向肿瘤组织和/或癌细胞的递送。超声或声辐射力引起覆盖患病区域的声场。通过局部地在肿瘤处施加超声，将瞬时在血管中形成小孔。超声产生的声场将导致气泡振荡并坍塌，从而导致释放单个NP。超声还会引起声孔效应，从而增强血管通透性。然后，由于增强的血管通透性，载药NP可以在肿瘤组织中累积。
本发明是一种用于在疗法中应用的递送系统，并且这是体内动物模型中治疗效果的首次证明。在全身给予药物递送系统后，在释放位点处施加US以介导所述纳米粒子和/或至少一种治疗剂向靶位点的递送。
不受理论束缚，在所述研究中观察到的效果可归因于以下几种机制：
1.已知肿瘤具有渗漏的脉管系统和无功能的淋巴管。这导致增强的通透性和滞留(EPR)效应，这允许NP选择性地在肿瘤中渗出和积累，同时健康组织暴露较少。因此，简单地通过在NP中掺入药物，与常规化学疗法相比，可以潜在地改善药物动力学、增加功效并降低药物的毒性，从而减少剂量限制性副作用。
2.当在释放位点施加超声时，引起气泡的振荡，从而进一步增强EPR效应。在相对低的压力下，声压波将导致MB的稳定空化。稳定空化的特征在于围绕其平衡的持续气泡半径振荡。这会在MB周围产生微流，流体流动。当MB接近或接触内皮时，在血管壁上产生的剪切应力可导致形成小孔，增加血管通透性，并增强内吞作用。
3.超声本身也会将NP推入肿瘤中。
4.增强的EPR效应将导致任何游离的NP在肿瘤组织中累积。
在较高压力下，振荡将增加振幅，变为非线性并导致气泡剧烈坍塌。这种惯性空化将在脉管系统中导致形成冲击波和射流，这会在毛细血管壁和细胞膜中形成暂时的孔(Lentacker I,De Cock I,Deckers R,De Smedt SC,Moonen CT:Understandingultrasound induced sonoporation:definitions and underlying mechanisms.AdvDrug Deliv Rev 2014,72:49-64)。
介质中惯性空化的概率由机械指数(MI)决定，机械指数由US的频率和峰值负压给出。在中等压力下，NP稳定的MB将振荡并坍塌，但是在剧烈程度不及惯性空化的过程中进行。总而言之，FUS可以因此局部地增加穿过毛细血管壁的外渗并且潜在地改善通过ECM的穿透，从而改善靶位点处NP和药物的摄取和分布。
在本发明的一个实施方式中，递送系统还包含游离纳米粒子(即未与微泡缔合的纳米粒子)和与游离纳米粒子缔合的至少一种治疗剂。
不受理论束缚，本发明的该实施方式的优点是几种机制的结果：
-MB与超声结合产生人工EPR效应，瞬时增加血管壁的通透性。这增强了自由循环的NP(即负载有至少一种治疗剂的游离NP)的积累。
-在通过US破坏气泡后，与MB缔合的NP(NPMB)将导致NP(并因此导致治疗剂)的高局部沉积，并且更深地穿透到肿瘤组织中。
因此，相比于单独的与NP缔合的MB，根据本发明该实施方式的药物递送系统可以沉积甚至更高浓度的治疗剂。
一般原则是本发明利用纳米粒子(NP)来递送药物。纳米粒子通常太大而无法穿透健康的血管，但足够小以经由增强的通透性和滞留(EPR)效应或经由超声诱导的“人工EPR效应”而渗出(肿瘤)血管。根据本发明的NP可以负载治疗剂(例如抗癌剂)和/或诊断剂(例如造影剂)。在一个实施方式中，NP是可生物降解的。可任选地将造影剂进一步并入NP中以监测和跟踪NP。任选地，纳米粒子可任选地含有共稳定剂。
NP通常可具有约1-800nm的尺寸，例如约10-500nm，优选约70-150nm。
NP可进一步被表面官能化。
NP可以进一步涂覆有亲水性聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以避免被免疫细胞识别。用PEG涂覆可以进一步增加血液循环时间。
在另一实施方式中，NP是靶向部分的目标。靶向特定细胞的分子可任选地连接到NP表面，以增加NP在疾病部位的局部沉积。根据本发明的NP被设计用于包封抗癌剂。此外，它们可以成功地用于产生如本文所述的稳定的MB。在某些实施方式中，NP是聚合物类NP，由广泛使用的生物相容和可生物降解的聚(氰基丙烯酸烷基酯)(PACA)聚合物组成。如本文所证明的，根据本发明的NP特别适合于BBB渗透。在一个特定的实施方式中，载药的可生物降解的NP是如WO 2014/191502中所述的聚合物类纳米粒子。
NP可以如WO2014/191502中所述的一步合成中制备，具有或不具有靶向部分。PACA可以以高负载能力封装一系列药物，并且可以很容易地进一步用聚乙二醇(PEG)功能化。与PACA NP的壳缔合的MB的平均直径在以下范围内：0.5至30μm，诸如1-10μm。
在不同的实施方式中，可以使用聚(氰基丙烯酸丁酯)(PBCA)NP、聚(氰基丙烯酸异己酯)(PIHCA)NP和/或聚(氰基丙烯酸2-乙基-丁酯)(PEBCA)。由于较长和支化的烷基单体链，如实施例6中所述在研究中应用PEBCA。PEBCA具有较慢的降解速率，这可能在治疗上是有利的。
纳米技术开创了工程化多功能NP的新时代，其将成像造影剂和治疗药物并入所谓的治疗性NP中，以改善各种疾病的诊断和治疗。在癌症治疗中，将药物包封到NP中，如本文所述，将改善药代动力学并减少由于肿瘤中的毛细血管渗漏引起的全身暴露。根据本发明的NP还显示出具有治疗中枢神经系统(CNS)疾病的潜力，因为它们可以通过BBB。分子向CNS的进入受到形成构成BBB的血管的内皮细胞之间的专门和紧密连接的严格控制。
在一个实施方式中，包含在本发明的系统中纳米粒子是聚(氰基丙烯酸烷基酯)(PACA)NP。PACA NP已显示出作为向实体瘤并跨越BBB的药物载体的前景。这部分是由于系统的灵活性允许在一个步骤中进行表面官能化和药物包封。此外，通过选择不同的单体，可以调节这些纳米粒子(NP)的降解和药物释放。在一个实施方式中，通过WO 2014/191502中描述的方法制备NP。
如本文所述，纳米粒子与MB缔合使用。在某些实施方式中，NP可以通过在MB气/液界面处自组装来稳定MB，从而在MB周围形成稳定壳。结果是具有改善技术特征的非常稳定的微泡。在某些实施方式中，通过加入另外的稳定剂如表面活性剂来制备MB。稳定剂可以是选自血清、蛋白质、聚合物、脂质或表面活性剂中的表面活性剂。可以通过使用ultra-turrax、摇动、超声或本领域技术人员已知的其它方法将包含纳米粒子的溶液与气体混合来制备MB。在某些实施方式中，NP将在气/液界面自组装，并在MB周围形成稳定壳。在某些实施方式中，与市售的MB相比，纳米粒子稳定的MB降低了MB的脆性。
为了改善NP在患病组织中的摄取和分布，根据本发明的NP的施用与促进递送的治疗组合，例如通过应用超声来建立声场。不受理论束缚，假设是超声能够通过不同的机制改善药物递送。在声场中，可能发生空化，这是气体微泡的振荡和可能的坍塌。然后，空化可以在内皮细胞上产生剪切应力和射流，从而改善NP跨越毛细管壁的转运。在某些实施方式中，肿瘤中NP的改善外渗和分布可通过非热机制实现，但加热和辐射力也可进一步增强递送。
在某些实施方式中，本发明包括三个要素：
1.单独或组合含有治疗剂和造影剂的NP
2.通过载药NP稳定的充气MB
3.使用NP稳定的MB的超声介导的药物递送的超声技术。
根据本发明该实施方式的这种新的多峰多功能药物递送系统已显示通过超声介导的NP递送改善了治疗剂向癌细胞的递送。将这些NP缔合的MB与聚焦超声相结合，产生NP在肿瘤生长中的较高摄取和改善分布，从而改善癌症治疗。如实施例3和图14所示，与对照相比，本发明导致肿瘤生长减少。
新的NP-缔合的MB还可以用来穿透BBB，如通过磁共振成像和脑组织中荧光标记的NP的定位所记录的(见图15、16和17)。因此，新的NP-缔合的MB平台在治疗脑癌方面显示出有前景的临床潜力。
超声和MB可以改善非包封药物的递送，最近在超声联合共注射吉西他滨和市售MB来治疗胰腺癌的临床研究中证明了这一点。超声和MB的组合还可以促进血脑屏障的瞬时和局部打开，从而允许各种药物进入脑并因此治疗中枢神经系统(CNS)障碍。超声和MB导致血脑屏障破坏的确切机制尚不完全清楚，但据推测，空化(即超声场中MB的体积振荡)可能是一个重要因素。
根据本发明的一个实施方式，将单独的载药NP和与MB缔合的NP的混合物注入血流中，会迅速分布在整个循环系统中。这些MB和游离NP太大而不能穿过健康组织的血管壁。当进入在肿瘤部位或释放位点局部施加的声场时，MB将经历大体积振荡。在此过程中，由于来自振荡MB的机械刺激在血管壁中形成小孔，血管通透性将暂时增加。聚焦于释放位点的US还会诱导气泡坍塌，从MB壳中释放单个NP以用于高度靶向治疗。在MB破坏时，因此获得了非常高局部浓度的载药NP。由此促进了NP向靶位点的递送。
NP缔合的MB的声学活性在体外和体内均得到证实。因此，它们在治疗应用中具有巨大潜力。进一步表明US可破坏MB，如本文所述，从而释放单个NP并增强荷瘤小鼠的模型药物摄取。在细胞中也证实了增强的模型药物摄取。
在研究细胞中NP摄取的实验中，发明人发现，与共注射商业MB和PACA NP或单独的PACA NP相比，当使用NP稳定的MB(也称为NPMB)时，细胞中PACA NP的摄取显著增加。这说明MB表面上NP的存在可以进一步改善NP向疾病部位的有效递送和声孔效应，因此有助于所显示的根据本发明系统的增强效果。
此外，表明使用新的MB与NP和US一起可以安全地瞬时打开大鼠的BBB。最后，通过实施例5、7和8中描述的体内研究，在癌症治疗中证明了与NP缔合的MB的作用。该研究首次证明了所述药物递送系统在癌症治疗中的适用性，结果证明了与对照相比显著降低肿瘤生长的能力。最后，实施例9中已经证明了用于治疗中枢神经系统疾病的递送系统的适用性。
显然需要新的药物递送系统，其包含具有高药物有效负载的MB和NP，专门设计用于US介导的药物递送应用。目前，市场上还没有这样的产品。根据本发明的系统填充空隙，因此与使用现有化学治疗技术未有效治疗的肿瘤相关。
本发明的独特之处在于其简单性和多功能性，仍然导致非常适用于US介导的癌症治疗的声学和生物学特性。与今天描述的研究系统相比，本发明的优点是：
·本发明在一个简单的配方中提供了多功能性，其构成了用于临床应用的创新且有利的药物递送系统。
·本发明可以单独或同时用于US成像、诊断和治疗。
·本发明的循环时间明显长于商业MB。
·本发明包括单独游离NP和NP缔合MB的组合，因此允许将非常高的药物浓度靶向递送至肿瘤组织。
·本发明将掺有高有效药物和MB的NP整合到一个单独的单元中(与NP缔合的MB)。与共注射NP和MB相比，发现将NP和MB整合到单个单元中有可能在US增强的肿瘤摄取中更有效。这可能是与静脉内共注射NP和MB时NP在血流中全身稀释相比，由于MB被破坏的超声处理区域内局部NP浓度较高所致。
·通过NP在气/液界面处的自组装以一步法制备MB。
·NP也是一步法制备的，不使用有机溶剂。这提供了向临床和盈利产品的简单、经济高效且容易的转化。
MB与数千种单一载药NP缔合，与目前市场上由脂质、蛋白质或聚合物的固体壳组成的MB相反。这提供了一种柔软、坚韧且稳定的壳，并能够释放足够小的单个NP到达肿瘤靶和其它靶位点。
根据本发明的新的药物递送系统清楚地解决了对用于增强抗癌剂递送的新的治疗概念的需求。此外，本发明具有显著改善实体瘤以及中枢神经系统疾病治疗的潜力。鉴于实体瘤中小分子的反应通常较差，并且到目前为止基于EPR效应的纳米药物的临床成功较低，本发明可能具有重大的社会影响。可以挽救生命，并且急性和补救治疗的后费用可能会大大降低。由本发明诱导的增强的药物渗透可能影响衰弱手术的必要性。在不同的实施方式中，本发明可特别用于高临床相关性的几个特定领域：
-患有不能手术的癌症患者
-患有原发性肿瘤或脑转移的患者。这里强烈需要新的递送技术，因为大多数抗癌药物由于BBB的紧密连接而不能到达肿瘤。
根据一个实施方式，MB可用于对比度增强的US成像。NP可以含有药物以及造影剂，并且可以任选地用靶向配体进一步功能化。NP可进一步涂覆有亲水性聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以改善其循环时间和生物分布。因此，本发明公开了一种高度通用的系统。
包含在纳米粒子中的化疗剂可以选自但不限于以下组：药物类别：烷化剂，抗代谢物，细胞毒性抗生素，拓扑异构酶抑制剂，抗微管剂或本领域技术人员已知的任何其它已知化疗剂。
用纳米粒子治疗的癌症可以是实体瘤或癌细胞。在特别优选的实施方式中，癌症是乳腺癌。
如本文所述的药物递送系统用于全身给予。如本文所述的药物递送系统的全身给予可优选通过施用到血流中来实现，例如肠胃外给药、注射、静脉内或动脉内给药。
为了成功和充分地将NP递送到靶位点，NP必须在血液中循环足够的时间。与市售微泡诸如Albunex(GE Healthcare)、Optison(GE Healthcare)、Sonazoid(GEHealthcare)、SonoVue(Bracco)等相比，所述发明的一个特别优点是改善了其中MB由NP稳定的递送系统的循环时间。发明人已经发现，所述发明的一个特定实施方式在动物模型(小鼠)中达到长达136分钟的NP体内循环半衰期。例如，这通过使用PEG化的PEBCA来展示的。
NP的体内循环取决于粒子的材料、形状、大小、表面化学和电荷，并且已经证明不同NP配方之间的循环时间可显著不同(Alexis,et al.2008,Longmire,et al.2008)。为了避免在血液中过早降解和释放有效负载，应在粒子释放药物之前清除未递送至靶的NP。增加循环的常见策略是PEG化，其防止聚集并在NP周围产生水冠。通常，水冠会减少蛋白质的吸附和调理作用，从而阻止肝和脾中网状内皮系统的识别。在以前的研究中，已经证明，由于肝和脾中高浓度的吞噬细胞，大多数调理粒子在几分钟内被清除，或者它们被排出体外(Alexis,et al.2008)。然而，最近还报道了PEG可以影响在纳米载体周围形成的蛋白质冠的组成，并且必须存在不同的蛋白质以防止非特异性细胞摄取(Schottler,et al.2016)。已经证明本发明中使用的不同NP的循环半衰期为45min(PBCA)至136min(PEBCA)。因此，与先前的研究相比，本发明的不同实施方式提供了远远增强的循环时间多样性。增加的循环可能是由于PEG化增加引起的，在如WO2014/191502中所述制造PACA NP时实现了这一点。本发明中使用的NP还具有降低的降解速率，并且可能PEG从颗粒表面解离/释放较慢。疏水性更高的聚合物(PEBCA与PBCA)也可以提供更强的PEG锚定，PEG通过疏水相互作用附着。其他人也报道了约几小时的类似半衰期，负载有多柔比星的PBCA NP(Reddy和Murthy 2004)以及氰基丙烯酸十六烷基酯(PHDCA)NP(Fang,et al.2006)。
此外，NP必须从脉管系统中外渗，穿透细胞外基质(ECM)，并将其有效负载递送至细胞内靶标。已经证明了根据本发明使用的NP的几个优点。渗漏的肿瘤脉管系统和非功能性淋巴管导致增强的通透性和滞留(EPR)效应，使NP选择性地渗出并积聚在肿瘤中，而健康组织暴露较少。
在动物模型中展示NP的生物分布，其中小鼠静脉内注射含有染料的NP。当NP几乎从循环中清除时(注射后6小时)测量肿瘤中NP累积的量，发现1％注射的NP剂量位于肿瘤中。与化疗药物的已有报道(其中只有0.01％至0.001％的注射药物到达肿瘤)相比，这是明显的改善(Gerber,et al.2009,Kurdziel,et al.2011)。大部分NP存在于肝和脾中，而较少的NP存在于肾脏中。这表明NP在这段时间内不会降解太多。
通过使用CLSM和流式细胞术测定NP的细胞摄取。用于确定摄取的模型利用乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和封装荧光染料的NP。CLSM图像证实了细胞内的荧光染料。在负载有荧光染料的PEBCA的一个实验中，通过FCM定量显示，90％的细胞在3小时后通过内吞作用摄取NP。
已经观察到PACA NP的摄取在不同细胞系和不同聚合物的NP之间变化。对MDA-MB-231乳腺癌细胞系观察到的PEBCA NP的有效体外摄取表明，一旦NP到达肿瘤间质，它们可通过胞吞作用有效地被乳腺癌细胞摄取。一旦NP被内化，它们将降解以释放细胞抑制物品。用卡巴他赛作为药物的体外毒性证实，细胞系对药物的反应良好，并且包封的药物是有效的。如果NP未被内化，则替代机制将是NP在细胞外降解并释放药物，随后细胞摄取游离药物，或者通过直接接触介导的转移将药物递送到细胞中，已经观察到另一种疏水模型药物的这一现象。已经表征了PACA纳米粒子的降解，并且主要通过聚合物的烷基侧链的酯键水解后的表面侵蚀而发生，产生降解产物烷基醇和聚(氰基丙烯酸)，通过肾脏排出。
还进行了研究以论证MB的体内循环，特别是所描述的与作为表面上的壳的NP缔合的MB。通过使用动物模型，在小鼠中静脉内注射NP缔合的MB。通过US成像的肿瘤中的对比度增强证明了生物分布。
静脉内注射MB，并且可以使用临床前US扫描仪在静脉和动脉循环中成像。在肿瘤组织中，可以检测到NP稳定化的MB约4-5分钟，这与其它商业MB相当。
通过CLSM成像研究NP在肿瘤中的微分布，并且证明各种MI影响肿瘤中NP的微分布。结果表明，与未使用US的对照肿瘤相比，在用US处理的肿瘤中观察到NP的递送增加。
为了确定本发明的递送系统在包括在模型中的动物的最佳治疗，并且为了实现NP在肿瘤组织中的增强递送，研究了各种US治疗。了解空化过程对于最大化US介导的药物递送的效率和安全性至关重要。MB对US的响应在很大程度上取决于频率、压力水平和脉冲持续时间，以及MB的特性(如尺寸、壳厚度和刚度)。US介导的NP递送的效果还取决于肿瘤特征，因为纳米医学的递送障碍在肿瘤类型之间可具有很大差异。
在实施例7中描述的皮下乳腺癌模型中，较低的声压(MI为0.1或0.25)不会增强PEBCA NP的肿瘤摄取。NP稳定的MB的声学表征和体外US造影成像已经表明，NP稳定的MB在声学上是活跃的并且在这些压力水平下振荡，并且在MI为0.25时存在部分破坏。尽管如此，如实施例9中所述，这些低压不能充分地影响血管通透性以允许模型中体内NP的外渗。与递送低分子量药物相比，递送更大的药剂如NP可能需要更高的US压力，相应地可以调整US强度以产生与药物大小相关的孔径。
在较高的声压(MI为0.5和1)下，本文所述的乳腺癌模型中NP向肿瘤的递送得到改善。不受理论束缚，这可能表明NP稳定的MB的完全破坏对于增强的通透性是必需的。在MI为0.5时，肿瘤积聚明显改善；递送的NP数量平均比未治疗组高2.3倍。如果MB位于足够靠近毛细管壁的位置，则振荡和坍塌的MB将通过剪切应力、流体流动、冲击波和射流引起针对内皮细胞的力。因此，NP的外渗和分布的增加可能是由于以下中的一种或组合引起的：通过增加穿孔数量增加血管通透性，增加内皮细胞中NP的内吞作用/胞吐作用，或增加脉管系统和间质中的液体对流。治疗组中NP积累的变化可能是由于不同肿瘤之间的脉管系统的量不同、以及脉管系统的渗漏性差异和不同尺寸坏死核导致的。在实施例9中，短暂的MI 1没有改善NP的摄取，表明需要更长的脉冲。较长的脉冲可将MB推向血管壁，可能导致MB爆裂时更接近内皮细胞。在长脉冲期间，NP稳定的MB将爆裂，并且释放的气体可以形成新的且可能更小的MB，其将再次振荡并可能结合。总而言之，如本文所证明的，长脉冲促进来自振荡气泡的持续生物效应。
与共注射NP和MB相比，当MB被破坏时，NP和MB之间的直接缔合可能会产生更高局部浓度的NP。因此，与共注射NP和MB相比，本发明代表了更有效的递送。
通过以下非限制性实施例说明本发明。
实施例
实施例1
生产载药的PACA NP和NP稳定的微泡
材料和方法：
载药PACA NP的合成及物理化学表征：
通过如下的细乳液法制备PEG涂布且负载卡巴他赛的PIHCA NP：通过在玻璃小瓶中彻底混合制备含有1.50g氰基丙烯酸异己酯(单体)、0.03g Miglyol 812(共稳定剂，非活性油)和0.18g卡巴他赛(细胞毒性药物)的油相。制备溶解于12ml 0.1M HCl中含有0.09gBrij L23(23PEG单位,MW 1225)和0.09g Kolliphor HS15(15PEG单位,MW 960)的水相。通过混合油相和水相，立即在冰上将混合物超声(Branson数字超声波仪450)2分钟(4x30秒间隔,60％振幅)，随后再超声3分钟(6x30秒间隔,30％振幅)，制备水包油乳液。超声处理后，在室温下将溶液以15rpm旋转过夜，然后使用0.1M NaOH将pH调节至5。在旋转(15rpm)的同时在室温下使聚合继续5小时。在室温下将分散体相对于1mM HCl(pH 3)充分透析，以除去非反应的PEG(透析膜,MWCO 100,000Da)。将透析液更换3次。将颗粒储存在4℃下的酸性溶液中。上述方法产生PEG化的载药且非靶向的NP分散体，透析后浓度为75mg NP/ml。当在酸性条件下储存时，颗粒分散体稳定数月，未观察到聚集。
使用Zetasizer(动态光散射)确定PACA纳米粒子的流体动力学尺寸、尺寸分布和表面电荷。为了计算包封药物的量，从粒子中提取药物内容物，并使用LC-MS/MS方法量化卡巴他赛的提取量。
NP-稳定的MB的生产及表征：
如下生产与PACA NP缔合的充气MB：制备含有2wt％酪蛋白的溶液(pH 7)并且通过0.22μm注射器过滤器过滤。将上述卡巴他赛-负载的PEG化的PIHCA NP与酪蛋白溶液和蒸馏水混合至0.5wt％酪蛋白和1wt％NP的最终浓度，总体积为4ml。将混合物置于超声处理批次中10分钟(在环境温度下)，然后用全氟丙烷气体将溶液饱和(约10秒)并且用石蜡膜将小瓶部分密封。然后立即应用Ultraturrax(25,000rpm)2分钟以产生全氟丙烷填充的NP稳定的MB。立即在全氟丙烷气氛下使用隔膜将小瓶密封。
使用20x相差物镜和细胞计数器，从光学显微镜图像确定所得NP稳定的MB的大小和浓度。计数MB并通过分析图像计算尺寸。
结果：
上述方法产生PEG化的载药且非靶向的NP分散体，透析后浓度为75mg NP/ml。当在酸性条件下储存时，颗粒分散体稳定数月，未观察到聚集。
动态光散射法显示NP尺寸为142nm(z-平均值)，多分散指数为0.18(见图1)。测得的电动电位为-1mV。测定的载药效率为72％，且药物有效载荷为10.7％(％wt卡巴他赛/wtNP)。
通过光学显微镜和图像分析测量，得到的NP稳定的MB的平均大小为2.3μm(见图2)且浓度为5.62E+08MB/ml。使用荧光显微镜(使用相同类型的NP，仅包封荧光染料而不是药物)和电子显微镜(图3)确认，与MB缔合的NP形成稳定的(单)层。当储存在4℃时，微泡可稳定长达数月。
实施例2
乳腺癌细胞中包封在纳米粒子(PIHCA)中的荧光染料(“模型药物”)的细胞摄取。
本研究的目的是研究超声介导的递送机制，以确定稳定或惯性空化是否是改善外渗和增强NP递送的主要机制。为了实现成功递送，NP必须在血液中循环足够长的时间，从脉管系统中渗出，穿透细胞外基质并将其有效负载递送至细胞内靶标。
通过Zetasizer确定生物相容性且可生物降解的聚(氰基丙烯酸异己酯)NP的尺寸和电动电位。使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和流式细胞术(FCM)通过包封荧光染料在乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中研究了体外细胞摄取。
图4显示NP的尺寸和电动电位分别约为170nm和-1mV。CLSM证实了乳腺癌细胞系中的细胞摄取(见A)。通过包封荧光染料对NP进行成像。通过FCM定量，90％的细胞在温育3小时后通过内吞作用摄取NP(B)。
在注射10分钟、30分钟和1、2、4、6和24小时后，通过小鼠隐静脉采集血样，测定NP的体内循环半衰期。
图5显示了PEG化NP的体内循环半衰期。发现是136分钟(n＝5只动物)(A)。206160.9e-0.0051x形式的指数衰减拟合数据，R2＝0.67且p值≤0.0001。由自组装NP稳定的MB具有约3μm的尺寸，并且发现其适合于体内对比度增强的US成像和图像引导的药物递送。由超声成像的肿瘤中的气泡流入和循环引起对比度增强(见图5，B)。
通过在气体-水界面处NP的剧烈搅拌和自组装来制备全氟丙烷MB。通过18MHz的超声对肿瘤中微泡的流入和循环进行成像。
在注射6小时后对包封近红外染料的NP的生物分布进行成像。
通过使用近红外全动物扫描仪成像来确定NP的生物分布，并且通过离体定量切下的器官和肿瘤中的积累。这示于图6和7中。
图6显示了注射6小时后NP的生物分布。显示了来自一只动物的器官和肿瘤的实例(A)。器官和肿瘤中累积的量化显示为平均值加标准偏差(n＝10只动物,对于脑n＝5)(B)。显示了来自一只动物的未处理的器官和肿瘤的自发荧光。
图7显示，在这些器官、肿瘤和脑中可以发现剂量的87％。其余的可能存在于尿液、粪便、皮肤、肌肉和其它组织中。剂量的大部分位于肝和脾中，并且剂量的约1％位于肿瘤中(与报告的0.7％中位数相符)。
为了研究MB的稳定与惯性空化如何影响肿瘤组织中的NP摄取，在无胸腺小鼠中生长皮下乳腺癌异种移植物(MDA-MB-231)。当肿瘤长度达到7-8mm时，静脉注射由NP稳定的MB，然后使用1MHz FUS换能器和0.1到1的MI，以六种不同FUS处理中的一种处理肿瘤。通过注射FITC标记的番茄凝集素来染色血管。通过CLSM在冷冻肿瘤切片上对NP的微分布成像。实验装置和不同的处理组如下所示：
·G1：对照组，无超声。
·G2：0.5秒处理，1.5秒中断(总PRF＝0.5Hz)，10.000个循环(10ms)每100ms(局部PRF＝10Hz)，总占空比2.5％,MI 0.1(A)。
·G3：同G2，每次处理后，3个附加的MI 1的瞬间循环(B)。
·G4：同G3，但仅有瞬间的MI 1(C)。
·G5：同G2，但使用MI 0.25。
·G6：同G2，但使用MI 0.5(D)。
·G7：同G2，但使用MI 1。
结果
结果显示在图8、9、10和11中。
图8展示了来自整个肿瘤切片的CLSM平铺扫描的一个例子，以红色显示NP(A)。在来自每只动物的平铺扫描中量化来自NP的具有荧光的像素的数量(B)。当测量像素强度时，观察到类似的结果。没有发现稳定空化的影响，而MB的剧烈坍塌增加了NP向肿瘤的递送，并且随着MI的增加，摄取增加。
图9示出了切片的分析和PIHCA NP的摄取。将G1的结果与G6进行比较。
归一化为G1(对照组)的平均值：
·第1组(n＝来自3只动物的6个切片)CTRL
·第6组(n＝来自3只动物的6个切片)MI 0.5
第6组的平均值为2.5。
对苏木精赤藓红藏红花(HES)染色的切片进行成像以评估治疗的安全性。图10显示了安全性分析的评估。分析除了导致大量视觉出血的最高MI(G7)外。HES染色肿瘤切片的评估显示所有FUS治疗均被认为是安全的。示出了概览图像的示例(A)，以及未处理和处理的组织的代表性图像(分别为B和C)。
使用共聚焦激光扫描显微镜在冷冻肿瘤切片上成像NP的微分布。这显示在图11中，其显示了使用CLSM成像的处理2小时后肿瘤中NP的微分布。来自未接收任何超声处理的对照组(A)和使用高压处理的组(B)的代表性例子。血管显示为绿色，纳米粒子显示为红色。与对照组相比，在治疗组(G6)中观察到NP的递送增加。施加(b)和未施加(a)超声的肿瘤中的荧光染料的分布。图像显示，使用超声的b)中的药物比未使用超声的a)中多约250倍。
结论
发现高压超声和由此MB的剧烈坍塌改善了NP向肿瘤的递送，并且随着MI的增加观察到增加的摄取。然而，在使用的最高MI下观察到出血，表明对于药物递送目的，应谨慎使用高MI与MB组合。
结果表明，该NP-MB平台对于控制药物递送非常有用。
实施例3
细胞内药物的摄取以及空载和载药PACA NP的细胞毒性
为了了解内化后对癌细胞的影响，需要测量细胞内的药物释放。发明人使用包封在聚(氰基丙烯酸丁酯)(PBCA)和聚(氰基丙烯酸辛酯)(POCA)中的模型药物NR668(修饰的尼罗红)来论证NP在内化后也具有不同的药物释放动力学。虽然普通荧光成像几乎没有提供有关降解的信息，但是荧光寿命成像(FLIM)(如图12所示)、共振能量转移(FRET)、发射光谱分析和细胞裂解后的延时成像提供了有价值的信息。
图13显示了乳腺癌细胞中NP的细胞摄取。
在乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞＝人上皮，乳腺腺癌细胞系)上研究了空PBCA NP、具有包封的卡巴他赛的PBCA NP以及游离卡巴他赛的细胞毒作用。使用AlamarBlueR细胞活力测定来评估细胞活力。将细胞以密度为5000个细胞/200μl培养基接种在每个孔中。3天后，从孔中去除旧培养基，并且将包封的卡巴他赛和游离卡巴他赛稀释在培养基中并且加入到孔中。NP的浓度范围为0.1ng/ml至1000ng/ml。选择游离卡巴他赛的浓度以匹配NP中卡巴他赛的浓度。对照孔含有生长培养基中的细胞。对于空NP，粒度为约125nm，而对于两种载药NP，粒度为约160nm。
将孔板在37℃和5％CO2下温育24、48和72小时，在从孔中去除培养基之后，用新鲜生长培养基洗涤3次。向每个孔中加入含有10％alamar蓝测定的生长培养基并且将板在37℃和5％CO2下再温育3小时，并通过酶标仪测量荧光强度(激发/发射为550/590nm)。
结果：
MDA-MB-231细胞以剂量-响应性方式响应于各种浓度下的PBCA中包封的卡巴他赛和游离卡巴他赛的处理(图14)。包封的卡巴他赛的细胞毒作用类似于游离卡巴他赛，证明药物从粒子中成功释放。
使用其它PACA NP(PIHCA和POCA)以及使用其它细胞系(P3胶质瘤和HeLa细胞)看到了类似的效果。
实施例4
FUS介导的BBB开放
方法
对于FUS介导的BBB开放，发明人使用最先进的超声系统，其能够在同一实验期间产生1.1MHz和7.8MHz的FUS，允许非常精确的磁共振成像(MRI)引导选择暴露于FUS的区域。使用较低频率的FUS暴露来破坏BBB。采用7.8MHz较高频率的FUS来实现声辐射力的作用。这种力是由超声波和传播组织之间的动量转移引起的，并且假设它可以促进细胞外基质中的NP转运。在免疫缺陷小鼠中进行实验，该小鼠具有在心内注射患者来源的人黑色素瘤细胞4周后发展的黑色素瘤脑转移。将以形成围绕全氟化碳MB的壳的PIHCA NP为基础的NP-MB平台用于FUS介导的BBB开放。在FUS暴露之前立即注射PIHCA NP-MB。使用基于钆的造影剂评估BBB开放。实验后，将脑冷冻或在福尔马林中固定。使用共聚焦显微镜在冷冻切片中评估穿过BBB的NP转运和脑组织中的分布(见图17)，同时使用福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片评估由FUS引起的组织病理学变化和细胞变化。
结果和结论
图15显示了MRI造影剂染料在脑中的摄取。这一特定试剂通常不能穿过BBB。因此，结果说明了瞬态BBB开放。
图16展示了FUS介导的BBB破坏和NP跨BBB的转运。在a)中，可以看到由FUS与PIHCA-MB平台组合介导的BBB开放。在b)中，在FUS暴露后，PIHCA NP跨BBB的转运。红色–PIHCA NP，绿色–血管。
由MRI验证了成功的BBB开放(如图15所示)。使用我们的NP-MB平台发现FUS介导的BBB破坏的最佳窗口在0.31的机械指数附近。冷冻切片的分析表明，FUS与我们的NP-MB平台的组合允许以÷开放依赖性方式跨越BBB转运NP。组织学评估显示FUS暴露后一定程度的红细胞外渗。目前正在分析NP分布在远离血管的脑实质中的声辐射力的影响，以及FUS暴露对作为BBB不可分割部分的外排转运蛋白P-糖蛋白的影响。总体而言，我们的结果表明，我们基于PIHCA NP和MB的平台可用于穿过BBB提供大量的NP，显示其在NP辅助药物递送到脑的潜力。
实施例5
治疗效果的体内论证
体内研究超声介导的药物递送与负载抗癌药物的NP缔合的MB在肿瘤治疗中的作用。
该研究的目的是研究所描述的药物递送系统在体内模型中治疗癌症的能力，即阻止肿瘤的异常细胞生长和收缩的能力。用于证明本发明潜力的癌细胞是乳腺癌细胞，且治疗剂是卡巴他赛。
·MDA-MB-231乳腺癌细胞在第0天皮下植入裸鼠
·允许肿瘤生长直至它们在最长方向上达到4mm的直径(一些刚好高于4且一些刚好低于4)
·每组包括4只动物。第1组：盐水。第2组：与负载有卡巴他赛的NP缔合的微泡。第3组：与负载有卡巴他赛的NP缔合的微泡以及超声。
·静脉注射体积为200μl，每只动物总共2mg纳米粒子，且卡巴他赛约10mg/kg
·先前优化超声治疗，并且使用0.5的MI。
·在第21天和第29天治疗小鼠
·由于imasonic 1MHz换能器停止工作，因此必须使用FUS设备进行第二次超声治疗。扫描16个斑点(4×4)以覆盖肿瘤区域。由于焦点较小，因此换能器必须扫描。在每个斑点中，给予10000个循环，并且在3.5秒期间扫描16个斑点。总治疗时间从之前的imasonic的2分钟增加到使用FUS设备的3.5分钟。
·使用卡尺测量肿瘤生长
研究结果如图17-19所示。
结论
该研究表明了治疗剂向肿瘤的递送增强，并且显示出根据本发明的药物递送系统的治疗效果。
对照组(盐水)中的肿瘤以一定的速率生长，如图18中的上部(＝蓝色)曲线所示。用含有纳米粒子和细胞抑制药物(卡巴他赛)的微泡治疗的动物显示肿瘤生长减少(中间曲线＝红色曲线)。除了微泡和填充细胞抑制药物的纳米粒子之外，还用超声治疗的动物显示肿瘤生长停止，肿瘤缩小，并且在这个时间点4只动物中有2只被治愈(下面的曲线＝绿色曲线)。图18和19显示了用该处理获得的效果。在治疗期间和治疗后，所有三组动物的体重均稳定(见图17)，证明治疗耐受性良好。
图17：作为时间的函数的动物重量显示为三个不同治疗组的平均值加标准偏差。每组n＝4只动物。第0天是植入肿瘤细胞的当天。在第21天和第29天进行治疗。
图18：作为时间的函数的肿瘤体积显示为三个不同组的平均值加标准偏差。第1组：对照，盐水。第2组：与纳米粒子和细胞抑制药物(卡巴他赛)缔合的微泡。第3组：超声以及与纳米粒子和细胞抑制药物缔合的微泡。每组n＝4只动物。第0天是植入肿瘤细胞的当天。在第21天和第29天进行治疗。
图19：三个不同治疗组中，肿瘤细胞植入后第35天的肿瘤体积，每组n＝4只动物。显示了平均值加标准偏差。
实施例6：生产载药的PEBCA NP和PEBCA稳定的微泡
纳米粒子和微泡的合成与表征
如先前所描述的通过细乳液聚合合成PEG化的PEBCA NP(et al.2015)。简言之，制备由含有0.1wt％甲磺酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)、2wt％Miglyol 812(共稳定剂，Cremer,Cincinnati,OH,USA)和0.8wt％偶氮二甲基戊腈(V65,油溶性自由基引发剂,Waco,大阪,日本)的氰基丙烯酸2-乙基-丁酯(单体，Henkel Loctite,杜塞尔多夫,德国)组成的油相。通过向油相中添加NR668(修饰的尼罗红(Klymchenko,et al.2012),委托合成,0.5wt％)或IR-780脂质(近红外染料，委托合成，CEA,格勒诺布尔,法国,0.5wt％)，制备用于光学成像的荧光颗粒。通过向油相中添加卡巴他赛(10wt％,Biochempartner,中国湖北武汉)制备含有治疗用细胞抑制药物的粒子。
向油相中添加由含有Brij L23(10mM,23PEG单位,MW 1225,Sigma-Aldrich)和Kolliphor HS15(10mM,15PEG单位,MW 960,Sigma-Aldrich)的0.1M HCl组成的水相，立即在冰上超声处理3分钟(6x30秒间隔,60％振幅,Branson Ultrasonics数字超声波仪450,Danbury,CT,USA)。将溶液在室温下磁力搅拌1小时，然后使用0.1M NaOH将pH调节至5。在室温下继续聚合2小时，然后将温度升至50℃保持8小时，同时旋转溶液(15rpm)。将分散液相对于1mM HCl进行透析(Spectra/Por透析膜MWCO 100,000Da,Spectrum Labs,RanchoDominguez,CA,USA)以除去未反应的PEG。将透析液更换3次。关于NP平台的PEG化的细节已有公开(Baghirov,et al.2017,et al.2015,et al.2017)。使用ZetasizerNano ZS(Malvern仪器,Malvern,UK)通过动态光散射测量NP的尺寸、多分散指数(PDI)和电动电位。为了计算包封药物的量，通过将它们溶解在丙酮(1:10)中以从颗粒中提取药物，并且通过与质谱联用的液相色谱法定量(LC-MS/MS,Agilent 6490三重四极杆联用Agilent1290HPLC,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)。
如所述的(et al.2015)，通过添加0.5％处于磷酸盐缓冲盐水中的酪蛋白并且使用ultra-turrax(T-25,IKAWerke,Staufen,德国)剧烈搅拌，通过在气体-水界面的NP(1wt％,10mg/ml)的自组装来制备NP稳定的MB(也称为NPMB)。使用全氟丙烷(F2Chemicals,Preston,Lancashire,UK)代替空气以增加循环时间。使用光学显微镜和图像分析(ImageJ 1.48v,National Institute of Health,Bethesda,MA,USA)确定平均MB直径、尺寸分布和浓度。NPMB溶液是游离NP和NPMB的组合，其中只有一小部分NP位于MB上。相对于如下所述的声学破坏表征MB(实施例8)。
结果：
纳米粒子和微泡的表征
NP的直径范围为140-195nm(z-平均)，PDI低于0.2且电动电位范围为-1至-2.5mV。确定卡巴他赛的负载效率接近100％，药物有效负载为10wt％。
自组装MB的平均直径为2.6±1.3μm。MB的浓度为约5*108MB/ml。从体外流动模型中的表征来看，MB显示在MI 0.1没有破坏，在MI 0.2部分破坏，且在MI 0.5完全破坏。
实施例7：皮下异种移植肿瘤的治疗
动物和肿瘤
所有实验程序均经挪威动物研究机构批准。购买的雌性Balb/c裸鼠(Envigo,Cambridgeshire,英国)为7-8周龄，16-21g。将它们饲养在无特定病原体的条件下，在单个通风笼(模型1284L,Tecniplast,里昂,法国)中每组4-5只，温度为22-23℃，相对湿度为50–60％，每小时换气70次，可随意获取食物和无菌水。
从乳腺癌MDA-MB-231细胞生长皮下异种移植肿瘤。通过吸入在O2和NO2中的2-3％异氟烷(Baxter,Deerfield,IL,USA)麻醉动物，然后在左后腿的侧面、膝盖和臀部之间缓慢地皮下注射含有3×106个细胞的50μl培养基。在接下来的几周内，将动物称重并使用卡尺每周测量肿瘤2-3次。通过πlw2/6计算肿瘤体积，其中l和w分别是肿瘤的长度和宽度。肿瘤生长不影响动物的体重。
在实验期间，以0.1ml/10g的剂量皮下注射芬太尼(0.05mg/kg,Actavis GroupHF,Hafnarfirdi,冰岛)、美托咪定(0.5mg/kg,Orion Pharma,Oslo,挪威)、咪达唑仑(5mg/kg,Accord Healthcare Limited,North Harrow,英国)、水(2:1:2:5)将动物麻醉。必要时，以0.1ml/10g的剂量皮下注射阿替美唑(2.5mg/kg,Orion Pharma,Oslo,挪威)、氟马西尼(0.5mg/kg,Fresenius Kabi,Bad Homburg vor der德国)、水(1:1:8)用作终止麻醉的解毒剂。在所有实验期间，通过外部加热维持动物的体温，并用Viscotears液体凝胶(Alcon,Fort Worth,TX,USA)保持眼睛湿润。在实验结束时，通过颈椎脱位使麻醉的动物安乐死。
超声设置
使用定制的中心频率为1MHz的单元件聚焦换能器(Imasonic,Besancon,法国)。由波形发生器(33500B,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)产生信号，并且通过50dB功率放大器(2100L,E&I,Rochester,NY,USA)放大。换能器安装在水室底部，带有吸收器的盖子放在水面上。将动物放在盖子上，并将带有肿瘤的腿通过10mm的开口放入水中。将肿瘤置于FUS束的远场中，距离为190mm，以覆盖整个肿瘤。将槽中的水加热至34℃(Trixieaqua pro heater,Zoopermarked,丹麦)，以避免体温过低和鼠腿血流改变(Hyvelin,et al.2013)。换能器的直径为50mm，焦距为125mm。其特征在于水槽使用水听器(HGL-0200,Onda,Sunnyvale,CA,USA)。横向3dB和6dB波束宽度在190mm处分别具有6mm和10mm的直径。在轴向上，在210mm处测量3dB压力降低。
微泡破坏的表征
通过在体外流动模型(型号524,ATS实验室,Bridgeport,CT,USA)中成像NPMB来评估NPMB的破坏，流动是由蠕动泵驱动的。在流过模型的管的同时，使用1MHz换能器(Imasonic)在0.1、0.2和0.5的MI下超声处理NPMB(1000个循环,PRF＝100Hz)。同时，在对比模式下通过临床US扫描仪使用0.07MI的脉冲反向对超声区域下游的管的一部分进行成像(Vivid E9扫描仪和9L换能器,GE Healthcare,芝加哥,IL,USA)。通过视觉检查确定MB的破坏。
超声暴露优化
为了研究各种声学设置与所述MB的组合如何影响肿瘤组织中的NP积累，使18只小鼠的皮下肿瘤生长4-8周，直至它们在最长方向上的直径达到约7-8mm并且体积约为120-250mm3。将动物麻醉并将侧尾静脉插管，使用10mg/ml NP以200μl的剂量静脉注射含有NR668的NPMB(100mg/kg)。当注射开始时，初始化US治疗。将小鼠随机分配在不同组中，并用不同的FUS治疗对肿瘤进行治疗。声压范围为0.1至1MPa(MI范围为0.1至1)。所有肿瘤(第4组除外)每100ms(局部PRF 10Hz)接受10 000个循环(10ms)的爆发(burst)，持续0.5s治疗，然后1.5s中断(总PRF 0.5Hz，总占空比2.5％)。在预期MB破坏的组中，超声处理区域中MB的再灌注对于允许新MB到达肿瘤是重要的，因此使用0.5Hz的PRF。对于最高压力，还研究了3次循环的短暂瞬间。总治疗时间为2分钟。
使用包封了卡巴他赛的纳米粒子-微泡治疗三阴性乳腺癌MDA-MB-231异种移植物
使肿瘤生长3周，直至它们在最长方向上达到约4mm。动物和对照组的数量符合“3Rs”(替代、减少、优化)(Fenwick,et al.2009)，在这项试点研究中保持低水平。将12只动物随机分配到3组中：
1.动物注射盐水，对照组
2.动物注射含有卡巴他赛的NPMB
3.动物注射含有卡巴他赛的NPMB并且将肿瘤暴露于先前描述的US治疗中(MI＝0.5)。
小鼠连续治疗两周(植入细胞后第21天和第29天)。在治疗当天，将动物麻醉并将尾静脉插管。静脉推注给予200μl盐水或如实施例6中所述产生的NPMB。气泡溶液中NP的浓度为10mg/ml，导致每只动物的总剂量为2mg NP，并因此卡巴他赛为10mg/kg。该剂量是基于文献选择的(Semiond,et al.2013,Vrignaud,et al.2014,Vrignaud,et al.2013)。对于第一次治疗，使用来自各种MI优化的最佳US治疗(如实施例8中所述的MI为0.5的组)。使用另一换能器(RK-100系统,孔径为52mm且焦距为60mm,FUS仪器,Toronto,ON,加拿大)进行第二次治疗，频率为1.1MHz。由于焦点直径较小，扫描换能器以覆盖肿瘤区域。在3.5秒内扫描16个斑点(4×4)。在每个斑点，传输了10 000个循环的爆发。第二次治疗的总治疗时间从2分钟增加到3.5分钟，实现60次超声处理，使治疗尽可能与使用Imasonic换能器的第一次治疗相似。横向3dB和6dB束宽度分别为1.3和1.6mm，而在轴向方向上，4cm的压力在3dB限度内。
治疗之后，施用解毒剂以终止麻醉，并将动物置于恢复架中直至第二天早晨，以避免在恢复期间出现体温过低。将架子的温度保持在28℃。治疗后的几天，给予动物营养补充果冻(Diet gel boost)(ClearH2O,Westbrook,ME,USA)作为干粮的补充剂。使用卡尺测量肿瘤生长，并且在治疗结束后将动物每周称重2次，持续14周。动物实施安乐死的人道终点标准是肿瘤直径15毫米或体重减轻15％。
统计分析
使用双尾非配对t检验来评估第1组和第6组之间NP摄取的差异是否具有统计学显著性(Excel 2010,Microsoft,Redmond,WA,USA)。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。
结果：
使用含有卡巴他赛的纳米粒子-微泡治疗肿瘤
本研究作为原理验证执行，以评估增加的NP向肿瘤组织的递送是否足以改善用包封的细胞抑制药物的治疗。
3个治疗组的平均肿瘤生长如图21所示。
未治疗的动物(盐水)显示出连续的肿瘤生长，并且在植入后当肿瘤达到15mm时的第62、69和72天处死动物。与未经治疗的动物相比，使用包封卡巴他赛的NPMB治疗的组显示肿瘤生长减少，并且所有动物都对治疗有响应，但动物之间的肿瘤体积差异很大。肿瘤在植入后约80天开始再生(治疗结束后50天)。当肿瘤达到15mm时的第120天处死一只动物，并且在研究结束时另外两只动物仍处于存活状态，肿瘤长度为13和4.5mm。除了具有卡巴他赛的NPMB之外还使用FUS治疗的组显示肿瘤生长减少更多，并且从第48天开始，所有动物均完全缓解。在研究结束时，治疗结束后约100天，所有动物仍然存活并完全缓解(见图21)。
无论是对照动物还是使用包封的卡巴他赛和FUS治疗的动物，动物均没有因治疗而减轻任何重量。
实施例8：原位乳腺癌(67NR-细胞)的治疗
设计了一个概念验证实验，以探索与共注射NP和SonoVue以及超声介导的递送相比，用包含NP稳定的MB的递送系统和超声介导的NP递送实现的效果差异。在这一实验中，使用如实施例6所述生产的负载卡巴他赛的PEBCA-稳定的MB。
对于接受重复治疗的小鼠，比较肿瘤生长随时间的变化，并且对仅接受一次治疗并且在治疗后6小时处死的小鼠，比较肿瘤中卡巴他赛的摄取。
具有NP稳定的MB的组合物以5.65E+08(平均大小2.91)的浓度给药。
在第1天，共有30只雌性balb/c小鼠在乳腺脂肪垫中注射20μl 67NR肿瘤细胞(500.000个细胞)。通过Shalini Rao培养和制备细胞，并通过Tonje Steigedal进行注射。十六(16)只小鼠被纳入治疗研究，在不同日期给予三次注射含有卡巴他赛的NP/NPMB，八(8)只小鼠只注射NP和NPMB一次并且注射后6小时处死，五(5)只小鼠用于测试在不同MI下的超声处理并且一(1)只小鼠因健康状况不佳(压力和体重低)而不得不在第7天处死。
治疗研究
组 动物数
1:对照 N＝4
2:NP+SonoVue+US N＝6
3:NPMB+US N＝6
纳入治疗研究中的小鼠在接种肿瘤细胞后第8天、第12天和第16天给予三次相同的治疗。在第7天和第8天，检查所有小鼠，选择具有最大肿瘤的小鼠进行治疗研究。
超声
我们将Imasonics 1MHz换能器与新的E&I 50dB放大器和Agilent信号发生器结合使用。将小鼠放置在离换能器表面20cm的位置(远场)，并且3dB束宽度为9-10mm。为了实现0.5的机构指数(MI)，我们使用270mVpp作为50dB放大器的输入。
MI＝0.5
爆发:10.000个循环
PRF＝0.5Hz
持续时间:4分钟
卡巴他赛的剂量
将使用具有卡巴他赛的纳米粒子的一批BC-1用于这一实验。NPMB溶液中NP的量对应于每毫升NPMB中1mg卡巴他赛的浓度。这将导致注射200μl NPMB的剂量为0.2mg，因此20g的小鼠中为10mg/kg。由于NPMB的气泡浓度非常高(类似或高于SonoVue)，我们决定将NPMB的量减少到150μl，以便第2组和第3组的注入气泡总数相同。因此，在每次治疗中给予卡巴他赛的总剂量为0.15mg，对应于20g小鼠为7.5mg/kg剂量。
以1:3稀释BC-1溶液，向含有0.5ml BC-1的小瓶中加入1ml盐水。这导致浓度为3mg/ml，因此注射50μl含有0.15mg卡巴他赛。
治疗
对照：通过200μl注射麻醉(sc)来麻醉小鼠并用200μl解毒剂唤醒并且放入恢复架直到第二天早晨。未给予注射。
NP+SonoVue+US：通过200μl注射麻醉(sc)来麻醉小鼠。将Venflon置于侧尾静脉中，将小鼠置于水槽顶部。注射50μl NP，然后注入150μl SonoVue(注射5-7秒)。在SonoVue注射开始之前打开超声，并在注射完成时启动计时器。
治疗后不久，通过200μl解毒剂(sc)唤醒小鼠并放入恢复架直到第二天早晨。
NPMB+UL：通过200μl注射麻醉(sc)来麻醉小鼠。将Venflon置于侧尾静脉中，将小鼠置于水槽顶部。在5-7秒内注入150μl NPMB。在NPMB注射开始之前打开超声，并在注射完成时启动计时器。
治疗后不久，通过200μl解毒剂(sc)唤醒小鼠并放入恢复架直到第二天早晨。
肿瘤生长和重量
在第8、10、12、16、19、22和24天用卡尺测量肿瘤。结果如图22所示。
四个最大的肿瘤都在对照组中，并且三个最小的肿瘤在NPMB组中。与最小的对照肿瘤相比，NP+SonoVue和NPMB组中的肿瘤大小相似。
在第24天，处死所有小鼠，解剖肿瘤并称重。结果显示NPMB组的平均值小于SonoVue组，然而，在各组之间看到了一些重叠。
实施例9：NP稳定的MB用于治疗神经胶质瘤
在NOD/SCID小鼠中颅内注射神经胶质瘤细胞系。神经胶质瘤被证明是侵入性的并且小鼠具有完整的BBB，使其成为评价药物递送系统穿过BBB的能力以及NPMB和US对中枢神经系统中肿瘤生长的影响的良好模型。
每周用MRI监测肿瘤生长。从植入4周后对肿瘤进行成像，并在植入约6周后开始治疗。使用MR-FUS系统在三周的时间内对小鼠进行3次治疗。在治疗之前，优化了MR-FUS系统设置。
将小鼠分成4组：第1组是对照组且未接受任何治疗，第2组仅注射卡巴他赛，第3组注射卡巴他赛和NPMB，并且第4组注射卡巴他赛负载的NPMB。使用如实施例6中所述生产的卡巴他赛负载的PEBCA稳定的MB。对于第3组和第4组，将US应用于覆盖肿瘤的区域(4个位置相距1.2mm，在机动台上移动)。使用的超声设置是：1.2MHz，0.38MPa，10ms爆发，4分钟，每个位置每秒进行一次超声处理。NPMB分两次推注注射，治疗开始时第一次和进入治疗2分钟后第二次。将纳米粒子荧光标记以能够通过荧光显微镜进行跟踪。
四个读数用于评估治疗：1)肿瘤生长；2)肿瘤中卡巴他赛的定量化(通过质谱法)；3)肿瘤中NP的摄取(通过共焦激光扫描仪显微镜观察肿瘤切片)；4)肿瘤组织的组织学。
结果：
在完成治疗研究后，观察不同组中的肿瘤大小。观察结果显示，与对照组相比，使用卡巴他赛负载的NPMB与US治疗的组中的肿瘤生长明显减少。结果证明了当用于根据本发明的递送系统时卡巴他赛负载的NP穿透BBB的能力，以及递送系统对颅内神经胶质瘤的治疗作用。

Claims (34)

1.一种用于在疗法中应用的药物递送系统，包含充气微泡、与所述充气微泡缔合的多个纳米粒子以及与所述纳米粒子中的至少一个缔合的至少一种治疗剂，其中，全身给予所述药物递送系统并且在释放位点产生声场以介导所述纳米粒子和/或所述至少一种治疗剂向靶位点的递送。
2.根据权利要求1所述的药物递送系统，其中，所述纳米粒子表面缔合到所述充气微泡。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的药物递送系统，其中，所述至少一种治疗剂负载在所述纳米粒子内。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物递送系统，进一步包含至少一个游离纳米粒子以及与所述至少一个游离纳米粒子缔合的至少一种治疗剂。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的药物递送系统，其中，所述纳米粒子是聚合物纳米粒子。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的药物递送系统，其中，所述纳米粒子中的至少一个是聚(氰基丙烯酸烷基酯)(PACA)纳米粒子。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的药物递送系统，其中，与所述充气微泡缔合的所述纳米粒子稳定所述微泡。
8.根据权利要求1-7所述的药物递送系统，其中，所述纳米粒子进一步包含至少一种靶向剂。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的用于应用的药物递送系统，进一步包含药学上可接受的载体。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的药物递送系统，其中，所述纳米粒子进一步涂覆有聚乙二醇(PEG)。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的药物递送系统，其中，与纳米粒子缔合的所述充气微泡的平均直径在0.5至30μm的范围内。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的药物递送系统，其中，所述治疗剂是化疗剂或化疗增强剂。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的药物递送系统，其中，所述充气微泡填充有选自由以下组成的组的气体：空气、全氟化碳、N2、O2、CO2。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的药物递送系统，其中，所述声场由超声、如聚焦超声产生。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的药物递送系统，其中，在向所述微泡施加聚焦超声时，所述微泡是可破坏的。
16.一种用于制备根据权利要求1-15所述的用于在疗法中应用的药物递送系统的方法，包括以下步骤：
a.合成待负载所述治疗剂的所述纳米粒子，
b.将纳米粒子添加到包含表面活性物质的溶液中，
c.将所述溶液与气体混合以获得充气气泡。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，通过纳米粒子在气体-水界面中的自组装来稳定所述微泡。
18.根据权利要求16-17中任一项所述的方法，其中，将所述溶液与气体以所需的时间和/或所需的速度混合，以获得所需尺寸的微泡。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中，将c)中的所述溶液混合2秒至60分钟，优选1至10分钟。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中，以500至50 000rpm、优选1 000至30 000rpm混合c)中的所述溶液。
21.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中，所述表面活性物质是血清、蛋白质或脂质或表面活性剂。
22.一种组合物，包含充气微泡、与所述微泡缔合的多个纳米粒子以及与所述多个纳米粒子中的一个或多个缔合的一种或多种治疗剂，其中，所述组合物进一步包含至少一个游离纳米粒子以及与所述纳米粒子缔合的一种或多种治疗剂。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中，与所述微泡缔合的所述多个纳米粒子表面缔合到所述充气微泡。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的组合物，其中，所述治疗剂负载在所述纳米粒子内。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的组合物，其中，所述纳米粒子是聚合物纳米粒子。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的组合物，其中，所述纳米粒子中的至少一个是聚(氰基丙烯酸烷基酯)(PACA)纳米粒子，如聚(氰基丙烯酸乙基丁酯)(PEBCA)纳米粒子。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的组合物，其中，与所述充气微泡缔合的所述多个纳米粒子稳定所述微泡。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的组合物，其中，所述纳米粒子进一步包含至少一种靶向剂。
29.根据权利要求22-28中任一项所述的组合物，进一步包含药学上可接受的载体。
30.根据权利要求22-29中任一项所述的组合物，其中，所述纳米粒子进一步涂覆有聚乙二醇(PEG)。
31.根据权利要求22-30中任一项所述的组合物，其中，与多个纳米粒子缔合的所述充气微泡的平均直径在0.5至30μm的范围内。
32.根据权利要求22-31中任一项所述的组合物，其中，所述治疗剂是化疗剂或化疗增强剂。
33.根据权利要求22-32中任一项所述的组合物，其中，所述充气微泡填充有选自由以下组成的组的气体：空气、全氟化碳、N2、O2、CO2。
34.一种治疗癌症或中枢神经系统中的疾病的方法，包括向有需求的患者给予根据权利要求1-14所述的药物递送系统。
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