CN110004107B - 一种细胞表面预处理及细胞定向解冻的方法 - Google Patents

一种细胞表面预处理及细胞定向解冻的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于定向凝固及生物组织低温保存技术领域，具体涉及一种细胞表面预处理及细胞定向解冻的方法，包括以下步骤：S1，制备含有活细胞的PBS悬浮液；S2，依次向含有活细胞的PBS悬浮液中加入单宁酸水溶液、六水氯化铁水溶液，摇匀；加入MOPS水溶液，放置10‑20分钟，得到表面形成纳米膜的细胞悬浮液；S3，用PBS溶液离心清洗S2得到的表面形成纳米膜的细胞悬浮液；S4，将S2‑S3重复3‑4次，最后一次离心收集的沉淀与PBS溶液混匀后‑30℃至‑20℃冻存，得到经细胞表面预处理的冻存细胞；细胞表面预处理的冻存细胞经水平定向解冻装置进行解冻。本发明通过细胞表面的处理和在解冻过程中温度场的定向改变，避免了解冻过程中冰晶动态再结晶晶界迁移对细胞的剪切应力伤害。

Description

一种细胞表面预处理及细胞定向解冻的方法
技术领域
本发明属于定向凝固及生物组织低温保存技术领域，具体涉及一种细胞表面预处理及细胞定向解冻的方法。
背景技术
近年来，由于器官移植、活体细胞培养等领域的需要，生物组织冷冻保存为人们提供了大量可靠的生物组织来源，生物材料的冷冻保存通常是在生物组织培养液中加入大量的DMSO、抗冻蛋白等添加剂来进行冷冻，企图改变冰晶的生长形态，减小冷冻及解冻过程中冰晶对生物组织的伤害。其基本原理是改变外界冰晶生长的形态，使其与细胞接触时更加温和。
然而，冷冻保存的现有技术存在若干问题和技术限制，首先，现存技术中向培养液中加入大量的添加剂可能会破坏生物组织与周围环境的渗透压平衡，导致细胞凋亡或细胞破裂；其次，解冻期间冰晶在动态再结晶时对生物组织的剪切应力尤其可能使细胞损坏。
发明内容
针对上述背景技术中的不足，本发明是在细胞表面生成可降解的纳米薄膜，减小冷冻过程中冰晶对细胞的压应力，同时维持细胞周围的渗透压平衡；并在解冻过程中通过施加定向的温度场，使细胞主动迁移出冰晶，减小冰晶在动态再结晶时对细胞的剪切应力。
本发明的第一个目的是提供一种细胞表面预处理的方法，包括如下步骤：
S1，制备含有活细胞的PBS悬浮液；
S2，依次向含有活细胞的PBS悬浮液中加入单宁酸水溶液、六水氯化铁水溶液，摇匀；加入pH为7.0-7.5的MOPS水溶液，放置10-20分钟，得到表面形成纳米膜的细胞悬浮液；
S3，用PBS溶液离心清洗S2得到的表面形成纳米膜的细胞悬浮液；
S4，将S2-S3重复3-4次，最后一次离心收集的沉淀与PBS溶液混匀后-30℃至-20℃冻存，得到经细胞表面预处理的冻存细胞。
优选地，所述单宁酸水溶液的浓度为40mg/ml，六水氯化铁水溶液浓度为 10mg/ml，MOPS水溶液的终浓度为MOPS水溶液。
优选地，所述含有活细胞的PBS悬浮液、单宁酸水溶、六水氯化铁水溶液和MOPS水溶液的体积比为：98：1：1：1。
本发明的第二个目的是提供上述方法进行细胞表面预处理后的细胞定向解冻的方法，具有如下步骤：
将经细胞表面预处理的冻存细胞通过水平定向解冻装置进行解冻，所述解冻装置包括相互分离的冷端和热端，所述冷端的温度恒定为-15℃，热端温度恒定为4℃，将盛有所述冻存细胞的容器置于于冷端和热端之间，并与所述解冻装置接触，经细胞表面预处理的冻存细胞自发定向解冻。
优选地，所述水平定向解冻装置包括4块铜板，其中2块铜板并排设置在上端，另外的2块铜板一一对应的并排设置在下端；左右相邻的两块铜板之间的间距均为5mm；下端的2块铜板均由内中部向外侧边水平开设U型槽，U 型槽内均设置有U型输水管，且其中一个U型输水管的进水端和出水端均与低温恒温水浴连通，形成冷端，另一个U型输水管的进水端和出水端均与高温恒温水浴连通，形成热端。
优选地，4块铜板的外部均包覆有保温棉隔热层。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
本发明借助预熔理论，通过在细胞表面进行纳米尺度的界面设计，调控细胞与冰晶界面的相互作用力，在定向温度梯度下实现细胞的定向解冻技术；通过细胞的表面处理，使冷冻过程中不需加入添加剂，维持细胞周围环境的渗透压平衡；通过温度场的改变，使纳米膜包覆的细胞在解冻过程中能从冰晶中定向迁移出冰晶，避免解冻过程中冰晶动态再结晶晶界迁移对细胞的剪切应力伤害。
附图说明
图1为细胞表面处理的模式图。
图2为细胞在温度梯度下由冷端向热端定向迁移的模式图。
图3为经表面处理的细胞悬浮液(A为处理0次，B为处理4次)。
图4为经表面处理4次的细胞定向解冻的光学显微镜图。
图5为未经纳米膜包覆的细胞定向解冻的光学显微镜图。
图6为未经表面预处理细胞解冻后的荧光标定。
图7为经表面预处理细胞解冻后的荧光标定。
图8为水平定向解冻装置的结构示意图。
图9为水平定向解冻装置U形槽的位置示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件操作，未注明的材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
本发明的技术原理具体如下：
在纳米尺度上设计细胞与冰晶间相互作用的界面(即在细胞表面添加生物相容性好、可降解的纳米膜)，调控细胞与冰晶界面间有效的Hamaker常数A，借助预熔理论(公式1)进一步改变细胞与冰晶间纳米水膜的厚度d，使细胞在宏观尺度上在温度梯度下发生定向热迁移(公式2)，实现定向解冻。
Figure SMS_1
式中，d是细胞与冰晶间纳米水膜的厚度，如图1所示，A是细胞与冰晶界面间范德华力引起的有效Hamaker常数，Tm是冰/水的平衡凝固点，Ti是细胞中心点的温度，ρs是冰的密度，L是冰/水的凝固潜热。
Figure SMS_2
/>
式中，V是细胞在冰晶中定向热迁移的速度，如图2所示；G是温度梯度，μ是水的动力学粘度，a是细胞的有效水力半径。
基于上述原理，本发明提供了一种细胞表面预处理及细胞定向解冻的技术方法，基于该发明创造，以下就以具体的实施例对本发明的技术方案进行具体的举例说明。
实施例1
一种细胞表面预处理的方法，包括如下步骤：
S1、制备含有活细胞的PBS悬浮液：本实施例采用骨癌细胞，预先制备活细胞的PBS悬浮液：细胞的培养，将1ml骨癌细胞(MC3T3-E1，103个/ml) 加入培养皿中，并加入4mlDMEM培养液，37摄氏度，CO2浓度5％，无菌环境中培养48小时；细胞的消化：将1ml胰酶和1ml无菌PBS溶液加入培养皿中消化细胞5分钟，使其脱壁，并在光学显微镜下观察。将上述悬浮液加入到离心管中，1500r/min离心3分钟，并将上清液倒出，加入5ml无菌PBS溶液清洗一次。
S2、将制备好的细胞悬浮液取出980ul放入2ml无菌的离心管中，轻轻摇匀。先将10ul单宁酸水溶液(40mg/ml)加入上述细胞悬浮液中；后将10ul六水氯化铁水溶液(10mg/ml)加入上述细胞悬浮液中；迅速摇晃悬浮液10秒钟，使细胞表面形成FeⅢ-TA络合物的纳米膜；并将10ul MOPS(20mM，pH＝7.4)水溶液加入至上述悬浮液中，放置10分钟，使形成的纳米膜均匀、稳定；
S3、用PBS溶液离心清洗S2得到的悬浮液3次。
S4、将S2-S3重复4次，最后一次离心收集的沉淀与PBS溶液混匀后放入 -20℃冰箱中进行低温保存3天。
实施例2
一种细胞定向解冻的方法
将实施例1的经表面预处理的冻存细胞通过水平定向解冻装置进行解冻，其中细胞冻存在尺寸较大的毛细管中，便于观测其定向解冻行为。所述解冻装置包括相互分离的冷端和热端，冷端的温度恒定为-15℃，热端温度恒定为4℃，将盛有所述冻存细胞的容器水平放置于冷端和热端之间，并与所述解冻装置接触，经细胞表面预处理的冻存细胞自发定向解冻。
具体的，如图8所示，水平定向解冻装置包括4块120mm×100mm×16 mm的铜板，将4块铜板固定在铝板支架上，上面两块铜板，下面两块铜板，上下对齐，左右铜板之间的间距为5mm，底部的两块铜板由内中部向侧边水平开设U型槽，U型槽的位置如图9所示，其孔径φ＝6.5mm，使用保温棉隔热层将铜板与外部环境隔热，将两个恒温水浴锅分别与底部的两个铜板通过U形槽连通，一个恒温水浴锅的温度恒定为-15℃，另外一个恒温水浴锅的温度恒定为4℃。
用光学显微镜(ZEISS Scope A1)耦合CCD相机观测细胞从冰晶中定向迁移出来。实验结果表明：纳米膜包覆的细胞会由冷端向热端自发定向运动，且运动速度随时间增加，能从冰晶中定向解冻，能迁移出冰晶，实验结果如图 4所示；未经纳米膜包覆的细胞几乎没有定向运动，定向迁移速度几乎为零，不能从冰晶中定向解冻，不能自发迁移出冰晶，实验结果如图5所示，由此实验现象可知，细胞经纳米膜处理后与冰晶界面的相互作用模式发生了改变。
对上述解冻后的未经表面预处理的原始动物细胞以及解冻后的经表面预处理的细胞进行存活率检测。所用生物荧光染料为FDA(二乙酸荧光素)和PI(碘化丙啶)。使用荧光共聚焦显微镜(Leica SP8)进行细胞荧光观测，定量统计细胞存活率。
存活率检测原理：
FDA本身无荧光，透过细胞膜后，在细胞内累积，使活细胞产生绿色荧光，测定原生质体活性，激发波长为494nm，发射波长为520nm。当细胞膜受损后，FDA无法在细胞内累积，因而死细胞无法发出荧光。
当细胞膜完好时，PI不能进入细胞内。当细胞死亡后，PI因细胞膜缺损而得以进入细胞中。PI与细胞内DNA和RNA相互作用，生成红色荧光物，使死亡细胞发出红色荧光，激发波长为537nm，发射波长为617nm。
存活率检测步骤：
1、配制0.65mol/L的甘露醇水溶液。称量1.1841g甘露醇加入10ml去离子水中。
2、配制5mg/ml FDA溶液。称量25mg FDA加入1ml丙酮酸中溶解，再加入4ml步骤1中的甘露醇溶液，摇匀，避光存放。
3、配制2mg/ml PI溶液。称量2mg PI加入1ml甘露醇溶液中，摇匀，避光存放。
4、取出1ml上述解冻细胞，先后加入16μl PI溶液和20μl FDA溶液，轻轻摇匀，室温避光静置15min。
5、使用无菌PBS清洗荧光染色细胞1-2次，将液体中多余的荧光染料清除。
6、将荧光染色的细胞放入培养皿中，密封。使用荧光共聚焦显微镜(Leica SP8)进行细胞荧光观测并拍照。在照片上定量统计红细胞(死)与绿细胞(活)的个数。
7、大量统计细胞存活及死亡个数，计算细胞存活率。
解冻后未经表面预处理细胞的荧光标定如图6所示，大部分细胞为红色，即死亡状态；极少部分细胞为绿色，即存活状态。解冻后经表面预处理细胞荧光标定如图7所示，部分细胞为绿色，部分细胞为红色。对比图6和图7可知，解冻后经表面预处理细胞的存活率高于解冻后未经表面预处理的存活率。随机选取实验图片10次以上，大量统计得到解冻后经表面预处理细胞的存活率为 45.18％±10.71％，解冻后未经表面预处理的存活率为22.17％±7.52％,由此可知，细胞表面包覆的纳米膜在一定程度上保护了细胞在冰晶冷冻生长及解冻时动态再结晶的应力伤害，并使细胞与冰晶界面的相互作用模式发生了改变，经表面预处理的细胞得以定向解冻。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种细胞定向解冻的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将经细胞表面预处理的冻存细胞通过水平定向解冻装置进行解冻，所述水平定向解冻装置包括相互分离的冷端和热端，所述冷端的温度恒定为-15℃，热端温度恒定为4℃，将盛有所述冻存细胞的毛细管置于冷端和热端之间，并与所述解冻装置接触，经细胞表面预处理的冻存细胞自发定向解冻；
所述经细胞表面预处理的冻存细胞是通过如下步骤获得：
S1，制备含有活细胞的PBS悬浮液；
S2，依次向含有活细胞的PBS悬浮液中加入单宁酸水溶液、六水氯化铁水溶液，摇匀；加入pH为7.0-7.5的MOPS水溶液，放置10-20分钟，得到表面形成纳米膜的细胞悬浮液；
S3，用PBS溶液离心清洗S2得到的表面形成纳米膜的细胞悬浮液；
S4，将S2-S3重复3-4次，最后一次离心收集的沉淀与PBS溶液混匀后-30℃至-20℃冻存，得到经细胞表面预处理的冻存细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞定向解冻的方法，其特征在于，所述单宁酸水溶液的浓度为40mg/ml，六水氯化铁水溶液浓度为10mg/ml，MOPS水溶液的终浓度为20mM。
3.根据权利要求2所述的一种细胞定向解冻的方法，其特征在于，所述含有活细胞的PBS悬浮液、单宁酸水溶、六水氯化铁水溶液和MOPS水溶液的体积比为：98：1：1：1。
4.根据权利要求3所述的细胞定向解冻的方法，其特征在于，所述水平定向解冻装置包括4块铜板，其中2块铜板并排设置在上端，另外的2块铜板一一对应的并排设置在下端；左右相邻的两块铜板之间的间距均为5mm；下端的2块铜板均由内中部向外侧边水平开设U型槽，U型槽内均设置有U型输水管，且其中一个U型输水管的进水端和出水端均与低温恒温水浴连通，形成冷端，另一个U型输水管的进水端和出水端均与高温恒温水浴连通，形成热端。
5.根据权利要求4所述的细胞定向解冻的方法，其特征在于，4块铜板的外部均包覆有保温棉隔热层。
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