CN110004074A - 一种利用silac标记耻垢分枝杆菌蛋白质的方法及其专用培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用SILAC标记耻垢分枝杆菌蛋白质的专用培养基。本发明提供的用于SILAC标记的培养基，由无机盐、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、重稳定性同位素标记精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶和葡萄糖组成；所述无机盐为硫酸铵、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、硫酸镁、氯化钙、硫酸锌和硫酸铜。经过实验证明，本发明开发的一种用于耻垢分枝杆菌SILAC标记的培养基，可以在10代内高效标记耻垢分枝杆菌蛋白，为定量内标的制备和高效精确地定量蛋白质组比较研究创造了条件。

Description

一种利用SILAC标记耻垢分枝杆菌蛋白质的方法及其专用培 养基
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用SILAC标记耻垢分枝杆菌蛋 白质组的方法及其专用培养基。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，其流行范围广、危害程度高，是伴随人类历史最长、造成死亡人数最多的一类传染病。2016 年，全球新发结核病例1040万，死亡人数超过180万，其中约三分之一是HIV 阳性患者。在我国，每年新增病人约130万，死亡人数20万，形势也非常严峻。 而耐药性菌株的出现速度有加快的趋势，更是加剧了结核病防诊治的难度。加 强对结核致病菌的研究有着重要的临床价值，但结核分枝杆菌属于慢速生长型 分枝杆菌，菌落形成要4-5周，且实验需要在P3实验室进行，研究成本较高。
耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)是放线菌门(Actinobacteria)、 分枝杆菌属(Mycobacterium)中的抗酸细菌，具有3.0-5.0μm长的杆状形状， 并且可以通过Ziehl-Neelsen方法和金胺-罗丹明荧光法染色，是一种快生长、非 致病性分枝杆菌，于1884年由Lustgarten首次发现和分离，并于1899年由莱曼 和诺伊曼正式命名。
耻垢分枝杆菌主要存在于土壤、水和植物中，已在美国、澳大利亚、俄罗 斯、加拿大和瑞士等多个国家发现了分离株。在大多数情况下，耻垢分枝杆菌 通常是安全不致病的。与致病分枝杆菌相比，耻垢分枝杆菌仅需要生物安全性1 级实验室，易于在大多数实验室常用培养基中培养，且具有生长快速的特点， 在3-5天内即可形成肉眼可见的菌落。1990年分离得到的耻垢分枝杆菌MC2155 突变株具有极高的质粒转化效率，可以方便地进行遗传操作，构建特定的基因 失活和基因报告系统，因而得到了业界的重视。
耻垢分枝杆菌基因组已完成测序，长度为6,988,209个核苷酸，具有67％的 鸟嘌呤和胞嘧啶含量以及33％的腺嘌呤和胸腺嘧啶含量。耻垢分枝杆菌与结核 分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)具有相同的特殊细胞壁结构，且共有2000 多个同源基因，占其编码基因总数的近50％，适于据此调查结核分枝杆菌特定 基因的生物学功能。因此耻垢分枝杆菌是研究结核分枝杆菌和其他病原分枝杆 菌的重要模式生物。此外，耻垢分枝杆菌木糖的转化效率达70％，因此该菌还 可用于发酵法生产食品工业的重要添加剂木糖醇。
蛋白质是基因功能的直接执行者，且相互关联，共同完成细胞复杂的生命 活动过程。蛋白质组学是系统鉴定和定量细胞内蛋白质，并研究其功能的新兴 学科。对耻垢分枝杆菌开展蛋白质组学、特别是定量蛋白质组学研究，发现、 鉴别不同条件相关的关键差异蛋白，不仅可以揭示其分子调控网络及其分子机 制，还可为探索结核分枝杆菌感染及耐药发生的机理提供线索，为新的结核病 预防和治疗技术研发创造条件。
目前基于液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)的定量蛋白质组学研究方法主 要包括无标记定量和标记定量两种。无标记定量方法根据数据类型可以分为基 于鉴定蛋白质肽段数的方法和基于质谱峰强度的方法，操作简单，在高通量大 规模蛋白组定量研究中有很大优势。标记定量技术又分为生物标记技术，包括 使用重稳定同位素标记氨基酸进行细胞培养的技术(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)[OngSE,Blagoev B,Kratchmarova I, Kristensen DB,Steen H,Pandey A,Mann M.Stableisotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC,as a simple andaccurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics.2002May；1(5):376-86.]和同位素亲和标记技术 (Isotope-coded affinity tag,ICAT)[Gygi SP,RistB,Gerber SA,Turecek F,Gelb MH,Aebersold R.Quantitative analysis of complexprotein mixtures using isotope-coded affinity tags.Nat Biotechnol.1999Oct；17(10):994-9.]、同位素标记 蛋白质标签(isotope-coded protein labels,ICPL)[SchmidtA,Kellermann J,Lottspeich F.A novel strategy for quantitative proteomicsusing isotope-coded protein labels.Proteomics.2005Jan；5(1):4-15.]、同位素标记相对和绝对定量技术 (Isobaric tag for relative absolute quantitation,iTRAQ)[Ross PL,Huang YN,Marchese JN,Williamson B,Parker K,Hattan S,Khainovski N,Pillai S,Dey S,Daniels S,Purkayastha S,Juhasz P,Martin S,Bartlet-Jones M,HeF,Jacobson A,Pappin DJ.Multiplexed protein quantitation in Saccharomycescerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.Mol CellProteomics.2004Dec；3(12):1154-69.Epub 2004Sep 22.]以及串联质量标签技术(Tandemmass tags,TMT)[Thompson A, J,Kuhn K,Kienle S,Schwarz J,Schmidt G,Neumann T,Johnstone R,Mohammed AK,Hamon C.Tandem mass tags:a novelquantification strategy for comparative analysis of complex protein mixturesby MS/MS.Anal Chem.2003Apr 15；75(8):1895-904.]等化学标记技术。其中SILAC技术采用轻、重同位素型必需氨基酸培养基对细胞进行传代培养。由于待比较蛋白质 组样品在培养过程中已经带上标记标签，可在蛋白质组样品制备前进行混合， 并经过完全一致的样品处理过程，因此可以最大限度地抵消样品处理过程中引 入的实验误差。在液相色谱-质谱联用分析时由于轻重不同标记样品化学性质相 同，因此在质谱分离时可以被共洗脱，因此进入质谱前，两者的离子化效率一 致，从而实现最高精准度的蛋白质和肽段定量比较，是目前定量蛋白质组学研 究的金标准。
由于技术和培养条件的限制，早期耻垢分枝杆菌组学水平的蛋白质鉴定主 要依靠双向凝胶电泳，难于分清所有蛋白质及其量的变化。作为致病性分枝杆 菌——结核分枝杆菌研究的重要非致病性模式生物，耻垢分枝杆菌SILAC标记 技术的开发对耻垢分枝杆菌定量蛋白质组学研究及其在基础医学研究乃至发酵 产业中的应用具有重要的意义。
SILAC技术尽管具有诸多优势，但由于需要在生物体培养过程中实现蛋白 质组的高标记甚至全标记，必须研制适合目标生物体培养的特定培养基。而目 前耻垢分枝杆菌的SILAC标记方法和培养条件还未见报道。专利 CN201610390913和CN201610391015分别公开了用于细菌SILAC标记的培养 基，其中分别包含20及19种氨基酸，以适用于多种细菌的标记。但该类培养 基不是专门针对耻垢分枝杆菌进行设计，将该种培养基应用于耻垢分枝杆菌的 SILAC标记的效果未知，且其中添加的多种氨基酸并不是培养耻垢分枝杆菌的 必须营养元素，甚至可能对标记效果产生负面影响。专利CN201210276080公布 了一种针对大肠杆菌的SILAC标记培养基，根据本申请发明人的研究，耻垢分 枝杆菌在类似组分的培养基中标记效果并不理想。结合耻垢分枝杆菌蛋白标记 在医学和生物研究中的重要作用，专门应用于耻垢分枝杆菌蛋白标记的培养基 有极大的应用价值。在研究实验的基础上，本发明对培养基的组分进行探索， 以提供一种可高效标记耻垢分枝杆菌的培养基。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于耻垢分枝杆菌SILAC标记的培养基。
本发明提供的培养基，在不含谷氨酸和天冬氨酸的培养耻垢分枝杆菌的基 础培养基中添加重稳定性同位素标记赖氨酸和重稳定性同位素标记精氨酸，通 过调整各组分的配比达到高效标记效果。其组分包括无机盐、组氨酸、异亮氨 酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨 酸、重稳定性同位素标记精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤、尿嘧啶 和葡萄糖；
所述无机盐为硫酸铵、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、 硫酸镁、氯化钙、硫酸锌和硫酸铜。
上述培养基中，所述组氨酸为L-组氨酸；所述异亮氨酸为L-异亮氨酸；所 述缬氨酸为L-缬氨酸；所述亮氨酸为L-亮氨酸；所述苯丙氨酸为L-苯丙氨酸； 所述色氨酸为L-色氨酸；所述丝氨酸为L-丝氨酸；所述重稳定性同位素标记赖 氨酸为重稳定性同位素标记L-赖氨酸；所述精氨酸为重稳定性同位素标记L-精 氨酸；所述苏氨酸为L-苏氨酸；所述酪氨酸为L-酪氨酸；所述蛋氨酸为L-蛋氨 酸。
上述培养基中，所述硫酸铵、所述柠檬酸钠、所述磷酸氢二钠、所述磷酸 二氢钾、所述柠檬酸铁铵、所述硫酸镁、所述氯化钙、所述硫酸锌、所述硫酸 铜、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所 述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述同位素标 记的L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨 酸、所述腺嘌呤硫酸盐和所述尿嘧啶的质量比为500：100：2500：1000：40： 50：0.5：1：1：2000：20：30：150：30：50：20：400：120：80：200：30： 20：20：20。
在上述培养基中，所述硫酸铵在所述培养基中的终浓度为500mg/L；
所述柠檬酸钠在所述培养基中的终浓度为100mg/L；
所述磷酸氢二钠在所述培养基中的终浓度为2500mg/L；
所述磷酸二氢钾在所述培养基中的终浓度为1000mg/L；
所述柠檬酸铁铵在所述培养基中的终浓度为40mg/L；
所述硫酸镁在所述培养基中的终浓度为50mg/L；
所述氯化钙在所述培养基中的终浓度为0.5mg/L；
所述硫酸锌在所述培养基中的终浓度为1mg/L；
所述硫酸铜在所述培养基中的终浓度为1mg/L；
所述葡萄糖在所述培养基中的终浓度为2000mg/L；
所述L-组氨酸为其盐酸盐，在所述培养基中的终浓度为20mg/L；
所述L-异亮氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；
所述L-缬氨酸在所述培养基中的终浓度为150mg/L；
所述L-亮氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；
所述L-苯丙氨酸在所述培养基中的终浓度为50mg/L；
所述L-色氨酸在所述培养基中的终浓度为20mg/L；
所述L-丝氨酸在所述培养基中的终浓度为400mg/L；
所述同位素标记的L-赖氨酸在所述培养基中的终浓度为120mg/L；
所述同位素标记的L-精氨酸在所述培养基中的终浓度为80mg/L；
所述L-苏氨酸在所述培养基中的终浓度为200mg/L；
所述L-酪氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；
所述L-蛋氨酸在所述培养基中的终浓度为20mg/L；
所述腺嘌呤硫酸盐在所述培养基中的终浓度为20mg/L；
所述尿嘧啶在所述培养基中的终浓度为20mg/L。
上述培养基中，所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸为L-lysine-13C6或 L-lysine-13C6 15N2，所述重稳定性同位素标记L-精氨酸为L-Arginine-13C6 15N4。
本发明还提供了一种制备上述培养基的具体配方。在其中一个优选的实施 方式中，所述培养基具有如下组成：
本发明的实验证明，本发明开发的一种用于耻垢分枝杆菌SILAC标记的培 养基，可以专门用于SILAC标记耻垢分枝杆菌蛋白质。这不仅省却了营养缺陷 型构筑的繁琐步骤和遗传条件限制，而且可以实现快速、高效地标记，为定量 内标的制备和高效精确定量蛋白质组研究创造了条件。
附图说明
图1基于大肠杆菌SILAC标记培养基SILACE的耻垢分枝杆菌标记效率测 试。
图2基于SILAC标记培养基ZJL-x的耻垢分枝杆菌赖氨酸K6标记规律测 试。
图3基于SILAC标记培养基ZJL-x的耻垢分枝杆菌精氨酸R10标记规律测 试。
图4基于SILAC标记培养基ZJL-y的耻垢分枝杆菌标记效率测试。
图5耻垢分枝杆菌M.smegmatis MC2155在所设计的SILAC标记培养基 ZJL-z中的生长曲线。
图6耻垢分枝杆菌M.smegmatis MC2155在所设计的SILAC标记培养基 ZJL-z中蛋白质组标记效率随标记代数变化曲线。
图7以ATP合成酶代表性肽段(ASHSDIFDGIR)为例表征耻垢分枝杆菌 M.smegmatisMC2155在第5、第8和第10代的轻重标母离子丰度分布。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明可以通过以下实施例帮助理解发明的内容，以下实施例不应视为是 对本发明的范围进行限制。任何未背离本发明的实质与原理的对技术方案的改 变与修饰均应落入本发明的保护范围。
仪器：旋涡混合仪Vortex-Genie 2,Scientific Industries
液相色谱nanoAcquity Ultra Performance LC,Waters公司
质谱LTQ Orbitrap Velos，Thermo Fisher Scientific公司
试剂：轻标氨基酸均购自美国Amresco公司，重稳定性同位素标记氨基酸 L-lysine-13C6和L-Arginine-13C6 15N4购自美国CIL公司，货号分别为 CLM-2247-H-0.25和CNLM-539-H-0.25。
实施例1、耻垢分枝杆菌在高效原核生物SILAC标记培养基中蛋白质组标 记效率测试
发明人首先利用其研制的适合非营养缺陷大肠杆菌SILAC蛋白质组全标记 培养基(Ping L,Zhang H,Zhai L,Dammer EB.,Duong DM.,Li N,Yan Z,Wu J,XuP.Quantitative proteomics reveals significant changes in cell shape and anenergy shift after IPTG induction via an optimized SILAC approach forEscherichia coli.J Proteome Res.2013,12:5978-5988.)对耻垢分枝杆菌M.smegmatisMC2155进行 了SILAC标记研究。发明人所用的大肠杆菌SILAC标记培养基SILACE如表 1.1所示。
表1.1 SILAC标记大肠杆菌专用培养基SILACE组分
1.1、SILAC标记大肠杆菌培养基SILACE的制备
按照上述组分及其终浓度，用超纯水配置，得到大肠杆菌SILAC标记培养 基SILACE。无机盐及葡萄糖采用高压灭菌的方式，氨基酸采用过滤除菌的方式。
1.2、总蛋白的提取
取SILAC标记的M.smegmatis MC2155菌体重悬于1×SDS loading buffer(组 分为25mM pH 6.8的Tris、1％SDS、5％甘油、10mM DTT和0.05％溴酚蓝)， 加入玻璃珠(Biospec Products Inc.,Bartlesville)在旋涡混合仪上以最高速震荡1 分钟，冰上冷却1分钟，重复5次；80℃加热5分钟；在冰上冷却2分钟；再 在旋涡混合仪上最高速震荡1分钟，在冰上冷却1分钟，共5次得到裂解产物。
所得裂解产物在17,000g的条件下离心10分钟，收集上清，得到细胞总蛋 白。用SDS-PAGE对所制备的细胞总蛋白进行电泳分析、质检和定量。
1.3、蛋白酶消化
取10μg提取的总蛋白经终浓度5mM的DTT 80℃处理10分钟后，再用终 浓度30mM的碘乙酰胺避光25℃下处理30分钟。SDS-PAGE电泳，对目的蛋 白条带进行割胶，切成1mm3胶粒。对这些包含蛋白的胶粒加入脱色液(30％乙 腈，35mM NH4HCO3)，在涡旋混合仪上缓慢涡旋至胶粒无色。弃去脱色液， 加入乙腈脱水后真空干燥。加入消化液(50mM NH4HCO3,5％乙腈，10ng/μL 胰蛋白酶)37℃消化14小时。用抽提液(5％甲酸，50％乙腈)抽提出肽段， 真空抽干机中蒸干，置于-80℃冰箱保存。
胰蛋白酶Trypsin为本实验室自制，市场上商品化质谱级胰蛋白酶都可达到 相同效果。
1.4、色谱-质谱联用分析
将上述所抽提得到的肽段以15μL的色谱-质谱联用上样缓冲液(5％乙腈， 1％甲酸)溶解，取2μL进行色谱-质谱联用分析。具体方法参照实验室发表文 献(Xu,P.；Duong,D.；Peng,J.,Systematical optimization of reverse-phase chromatography forshotgun proteomics.J Proteome Res 2009,8(8),3944-50)进行， 简述如下：肽段样品首先通过在线液相色谱(nanoAcquity Ultra Performance LC, Waters公司)分离，分离时间60分钟，分离梯度从98％A相(2％乙腈+0.1％甲 酸)到35％B相(100％乙腈+0.1％甲酸)，流速为300nL/min。质谱(LTQ Orbitrap Velos，Thermo Fisher Scientific公司)使用DDA模式采集数据，设置扫描离子 的质核比范围为300-1600(m/z)。在Orbitrap内完成一级母离子扫描，设置分 辨率为30,000，设置离子自动增益控制(Automatic Gain Control，AGC)为1×106个离子。采用CID模式进行二级碎裂，设置归一化能量为35％。选取丰度排名 前20的离子进行二级碎裂。设置最小信号检测阈值(Minimal signal threshold) 为2000，动态排除(Dynamic exclusion)为35秒。
1.5、SILAC标记耻垢分枝杆菌的标记效率测定
质谱数据经MaxQuant软件(Cox J,Mann M.MaxQuant enables high peptideidentification rates,individualized p.p.b.-range mass accuracies andproteome-wide protein quantification.Nat Biotechnol.2008Dec；26(12):1367-72.)分析，根据鉴定 到蛋白质的重、轻标肽段的信号强度(intensity)的比例来计算标记效率。利用 表1.1的培养基配方对耻垢分枝杆菌进行标记，并检测标记效率，结果如图1所 示。由图1可知，利用大肠杆菌SILAC标记的专用培养基SILACE对耻垢分枝 杆菌进行标记，定量蛋白的高斯分布Mean值为-1.0，计算标记效率为33.4％， 不能满足实验需求。
实施例2、耻垢分枝菌SILAC标记培养基ZJL-x的设计和标记效率测试
由于耻垢分枝杆菌在培养基SILACE中并未实现高标记效率，因此，我们 选择以分枝杆菌常用的培养基Middlebrook 7H9[Atlas,Ronald M.；James W. Snyder(2006).Handbook of media for clinical microbiology.CRC Press.ISBN 978-0-8493-3795-6.]为基础培养基(基础培养基组成如表2.0所示), 并将其中影响赖氨酸和精氨酸生物合成的谷氨酸和天冬氨酸去除，设计了耻垢 分枝杆菌特异性SILAC标记培养基ZJL-x，成分如表2.1所示。
表2.0耻垢分枝杆菌基础培养基Middlebrook 7H9组成
组分 终浓度(mg/L)
硫酸铵 500
L-Glutamic Acid(L-谷氨酸) 500
吡哆醇 1
生物素 0.5
柠檬酸钠 100
磷酸氢二钠 2500
磷酸二氢钾 1000
柠檬酸铁铵 40
硫酸镁 50
氯化钙 0.5
硫酸锌 1.0
硫酸铜 1.0
表2.1 SILAC标记耻垢分枝杆菌培养基ZJL-x组成
2.1、耻垢分枝杆菌SILAC标记培养基ZJL-x的配置
按照上述培养基ZJL-x的组分及其终浓度，用超纯水配置，得到培养基用 于耻垢分枝杆菌SILAC标记实验。无机盐及葡萄糖采用高压灭菌的方式，氨基 酸采用过滤除菌的方式。
2.2、总蛋白的提取
分别取6代、7代、8代、9代、10代SILAC标记的M.smegmatis MC2155 菌体重悬于1×SDS loading buffer(25mM pH 6.8的Tris、1％SDS、5％甘油、 10mM DTT和0.05％溴酚蓝)，加入玻璃珠(Biospec Products Inc.,Bartlesville) 在旋涡混合仪(Vortex-Genie 2,Scientific Industries)上以最高速震荡1分钟，冰 上冷却1分钟，重复5次；80℃加热5分钟；在冰上冷却2分钟；再在旋涡混 合仪上最高速震荡1分钟，在冰上冷却1分钟，共5次得到裂解产物。
所得裂解产物在17,000g的条件下离心10分钟，收集上清，得到细胞总蛋 白。用SDS-PAGE对所制备的细胞总蛋白进行电泳分析、质检和定量。
2.3、蛋白酶消化
分别取10μg提取的总蛋白经终浓度5mM的DTT 80℃处理10分钟后，再 用终浓度10mM的碘乙酰胺避光25℃下处理30分钟。SDS-PAGE电泳，对目 的蛋白条带进行割胶，切成1mm3胶粒。对这些包含蛋白的胶粒加入脱色液(30％ 乙腈，35mM NH4HCO3)，在涡旋混合仪上缓慢涡旋至胶粒无色。弃去脱色液， 加入乙腈脱水后真空干燥。加入消化液(50mM NH4HCO3,5％乙腈，10ng/μL 胰蛋白酶)37℃消化14小时。用抽提液(5％甲酸，50％乙腈)抽提出肽段，真空抽干机中蒸干，置于-80℃冰箱保存。
胰蛋白酶Trypsin为本实验室自制，市场上商品化质谱级胰蛋白酶都可达到 相同效果。
2.4、色谱-质谱联用分析
将上述所抽提得到的肽段以15μL的色谱-质谱联用上样缓冲液(5％乙腈， 1％甲酸)溶解，取2μL进行色谱-质谱联用分析。具体方法参照实验室已有文 献(Xu,P.；Duong,D.；Peng,J.,Systematical optimization of reverse-phase chromatography forshotgun proteomics.J Proteome Res 2009,8(8),3944-50)进行， 简述如下：肽段样品首先通过在线液相色谱(nanoAcquity Ultra Performance LC, Waters公司)分离，分离时间60分钟，分离梯度从98％A相(2％乙腈+0.1％甲 酸)到35％B相(100％乙腈+0.1％甲酸)，流速为300nL/min。质谱(LTQ Orbitrap Velos，Thermo Fisher Scientific公司)使用DDA模式采集数据，设置扫描离子 的质核比范围为300-1600(m/z)。在Orbitrap内完成一级母离子扫描，设置分 辨率为30,000，设置离子自动增益控制(Automatic Gain Control，AGC)为1×106个离子。采用CID模式进行二级碎裂，设置归一化能量为35％。选取丰度排名 前20的离子进行二级碎裂。设置最小信号检测阈值(Minimal signal threshold) 为2000，动态排除(Dynamic exclusion)为35秒。
2.5、耻垢分枝杆菌在SILAC标记培养基ZJL-x的标记效率测试
质谱数据经MaxQuant软件(Cox J,Mann M.MaxQuant enables high peptideidentification rates,individualized p.p.b.-range mass accuracies andproteome-wide protein quantification.Nat Biotechnol.2008Dec；26(12):1367-72.)分析，根据鉴定 到蛋白的重、轻标肽段的信号强度(intensity)的比例来计算标记效率。利用表 2.1的ZJL-x培养基配方对耻垢分枝杆菌分别进行赖氨酸(K6)和精氨酸(R10) 标记，并检测标记效率，结果如图2和图3所示。
利用表2.1的培养基进行耻垢分枝杆菌标记，发现K6的标记效率随着标记 代数的增加而增加。当标记效率增长到81％左右后反而迅速下降，呈先升高后 降低的趋势，未能达到理想的标记效率。提示我们可能是培养基ZJL-x中重标 氨基酸K6的含量不足，难以支撑耻垢分枝杆菌蛋白质组的高标记。
利用表2.1的ZJL-x培养基进行耻垢分枝杆菌标记，与赖氨酸K6的结果类 似，R10标记效率随着标记代数的增加而增加，但当标记效率增加到91％左右 后迅速下降，呈先升高后降低的趋势，未能达到理想的标记效率。提示我们培 养基ZJL-x中重标氨基酸R10的含量不足以支撑耻垢分枝杆菌达到高标记效率。
综上所述，培养基ZJL-x由于重标氨基酸K6和R10的含量不足，导致标记 效率过低不能满足实验要求，因此不适用于耻垢分枝杆菌的SILAC标记。
实施例3、耻垢分枝菌SILAC专用标记培养基ZJL-y的设计和标记效率测 试
基于实施例2的结果，我们在培养基ZJL-x的基础上将重标氨基酸K6和 R10的含量加倍，设计了耻垢分枝杆菌SILAC标记培养基ZJL-y如表3.1所示。
表3.1 SILAC标记耻垢分枝杆菌专用培养基ZJL-y组分
3.1、耻垢分枝杆菌SILAC标记培养基ZJL-y的配置
按照上述ZJL-y的组分及其终浓度，用超纯水配置，得到培养基用于耻垢 分枝杆菌SILAC标记实验。无机盐及葡萄糖采用高压灭菌的方式，氨基酸采用 过滤除菌的方式。
3.2、总蛋白的提取
分别取4代、5代、7代、8代SILAC标记的M.smegmatis MC2155菌体重 悬于1×SDSloading buffer(25mM pH 6.8的Tris、1％SDS、5％甘油、10mM DTT 和0.05％溴酚蓝)，加入玻璃珠(Biospec Products Inc.,Bartlesville)在旋涡混合 仪(Vortex-Genie 2,Scientific Industries)上以最高速震荡1分钟，冰上冷却1分 钟，重复5次；80℃加热5分钟；在冰上冷却2分钟；再在旋涡混合仪上最高 速震荡1分钟，在冰上冷却1分钟，共5次得到裂解产物。
所得裂解产物在17,000g的条件下离心10分钟，收集上清，得到细胞总蛋 白。用SDS-PAGE对所制备的细胞总蛋白进行电泳分析、质检和定量。
3.3、蛋白酶消化
分别取10μg提取的总蛋白经终浓度5mM的DTT 80℃处理10分钟后，再 用终浓度10mM的碘乙酰胺避光25℃下处理30分钟。SDS-PAGE电泳，对目 的蛋白条带进行割胶，切成1mm3胶粒。对这些包含蛋白的胶粒加入脱色液(30％ 乙腈，35mM NH4HCO3)，在涡旋混合仪上缓慢涡旋至胶粒无色。弃去脱色液， 加入乙腈脱水后真空干燥。加入消化液(50mM NH4HCO3,5％乙腈，10ng/μL 胰蛋白酶)37℃消化14小时。用抽提液(5％甲酸，50％乙腈)抽提出肽段，真空抽干机中蒸干，置于-80℃冰箱保存。
胰蛋白酶Trypsin为本实验室自制，市场上商品化质谱级胰蛋白酶都可达到 相同效果。
3.4、色谱-质谱联用分析
将上述所抽提得到的肽段以15μL的色谱-质谱联用上样缓冲液(5％乙腈， 1％甲酸)溶解，取2μL进行色谱-质谱联用分析。具体方法参照实验室已有文 献(Xu,P.；Duong,D.；Peng,J.,Systematical optimization of reverse-phase chromatography forshotgun proteomics.J Proteome Res 2009,8(8),3944-50)进行， 简述如下：肽段样品首先通过在线液相色谱(nanoAcquity Ultra Performance LC, Waters公司)分离，分离时间60分钟，分离梯度从98％A相(2％乙腈+0.1％甲 酸)到35％B相(100％乙腈+0.1％甲酸)，流速为300nL/min。质谱(LTQ Orbitrap Velos，Thermo Fisher Scientific公司)使用DDA模式采集数据，设置扫描离子 的质核比范围为300-1600(m/z)。在Orbitrap内完成一级母离子扫描，设置分 辨率为30,000，设置离子自动增益控制(Automatic Gain Control，AGC)为1×106个离子。采用CID模式进行二级碎裂，设置归一化能量为35％。选取丰度排名 前20的离子进行二级碎裂。设置最小信号检测阈值(Minimal signal threshold) 为2000，动态排除(Dynamic exclusion)为35秒。
3.5、耻垢分枝杆菌在SILAC标记培养基ZJL-y的标记效率测试
质谱数据经MaxQuant软件(Cox J,Mann M.MaxQuant enables high peptideidentification rates,individualized p.p.b.-range mass accuracies andproteome-wide protein quantification.Nat Biotechnol.2008Dec；26(12):1367-72.)分析，根据鉴定 到蛋白的重、轻标肽段的信号强度(intensity)的比例来计算标记效率。利用表 3.1的培养基配方对耻垢分枝杆菌进行赖氨酸/精氨酸(K6/R10)标记、检测标 记效率，其结果如图4所示。
利用表3.1的培养基ZJL-y进行耻垢分枝杆菌标记，虽然将重标氨基酸的含 量加倍，但是依然随着标记代数的增加呈先升高后降低的趋势，也未达到理想 的标记效率。提示我们培养基ZJL-y中重标氨基酸K6/R10的含量仍不足以支撑 耻垢分枝杆菌达到高标记效率。因此该培养基同样不适用于耻垢分枝杆菌的 SILAC标记。
实施例4、耻垢分枝杆菌SILAC蛋白质组完全标记培养基ZJL-z的设计和 应用
基于实施例3的结果，我们在培养基ZJL-y的基础上将重标氨基酸K6和 R10的含量再次加倍，设计了SILAC标记耻垢分枝杆菌培养基ZJL-z如表4.1 所示。
表4.1为SILAC标记耻垢分枝杆菌专用培养基ZJL-z组分
4.1、耻垢分枝杆菌SILAC标记培养基ZJL-z的配置
按照ZJL-z的组分及其终浓度，用超纯水配置，得到用于耻垢分枝杆菌 SILAC标记的培养基。无机盐及葡萄糖采用高压灭菌的方式，氨基酸采用过滤 除菌的方式。
4.2、耻垢分枝杆菌在SILAC标记培养基ZJL-z的标记
实验室常用耻垢分枝杆菌，如MC2155等均可用本发明的培养条件进行培 养。
将保存的M.smegmatis MC2155菌种在Middlebrook 7H11(含ADC，BD公 司，货号：212203)固体培养基上划线，37℃培养36小时。挑取一个单菌落， 转接至Middlebrook 7H9液体培养基中(BD公司，货号：271310)，220转/ 分钟转速下37℃培养36小时，10,000g离心3分钟收集菌体，用无菌水清洗3 遍，再按照起始OD600值为0.005接种于耻垢分枝杆菌SILAC标记培养基ZJL-z 中，37℃培养。分别在5代、8代、10代收集菌液，17,000g离心5分钟，得到SILAC标记M.smegmatis MC2155菌体，同时在培养过程中检测M.smegmatis MC2155的生长情况，绘制生长曲线(图5)。结果表明M.smegmatis MC2155 在我们研制的培养基中可以正常生长。
4.3、总蛋白的提取
分别取5代、8代、10代SILAC标记的M.smegmatis MC2155菌体重悬于 1×SDSloading buffer(25mM pH 6.8的Tris、1％SDS、5％甘油、10mM DTT 和0.05％溴酚蓝)，加入玻璃珠(Biospec Products Inc.,Bartlesville)在旋涡混合 仪(Vortex-Genie 2,Scientific Industries)上以最高速震荡1分钟，冰上冷却1分 钟，重复5次；80℃加热5分钟；在冰上冷却2分钟；再在旋涡混合仪上最高 速震荡1分钟，在冰上冷却1分钟，共5次得到裂解产物。
所得裂解产物在17,000g的条件下离心10分钟，收集上清，得到细胞总蛋 白。用SDS-PAGE对所制备的细胞总蛋白进行电泳分析、质检和定量。
4.4、蛋白酶消化
分别取10μg提取的总蛋白经终浓度5mM的DTT 80℃处理10分钟后，再 用终浓度10mM的碘乙酰胺避光25℃下处理30分钟。SDS-PAGE电泳，对目 的蛋白条带进行割胶，切成1mm3胶粒。对这些包含蛋白的胶粒加入脱色液(30％ 乙腈，35mM NH4HCO3)，在涡旋混合仪上缓慢涡旋至胶粒无色。弃去脱色液， 加入乙腈脱水后真空干燥。加入消化液(50mM NH4HCO3,5％乙腈，10ng/μL 胰蛋白酶)37℃消化14小时。用抽提液(5％甲酸，50％乙腈)抽提出肽段，真空抽干机中蒸干，置于-80℃冰箱保存。
胰蛋白酶Trypsin为本实验室自制，市场上商品化质谱级胰蛋白酶都可达到 相同效果。
4.5、色谱-质谱联用分析
将上述所抽提得到的肽段以15μL的色谱-质谱联用上样缓冲液(5％乙腈， 1％甲酸)溶解，取2μL进行色谱-质谱联用分析。具体方法参照实验室已有文 献(Xu,P.；Duong,D.；Peng,J.,Systematical optimization of reverse-phase chromatography forshotgun proteomics.J Proteome Res 2009,8(8),3944-50)进行， 简述如下：肽段样品首先通过在线液相色谱(nanoAcquity Ultra Performance LC, Waters公司)分离，分离时间60分钟，分离梯度从98％A相(2％乙腈+0.1％甲 酸)到35％B相(100％乙腈+0.1％甲酸)，流速为300nL/min。质谱(LTQ Orbitrap Velos，Thermo Fisher Scientific公司)使用DDA模式采集数据，设置扫描离子 的质核比范围为300-1600(m/z)。在Orbitrap内完成一级母离子扫描，设置分 辨率为30,000，设置离子自动增益控制(Automatic Gain Control，AGC)为1×106 个离子。采用CID模式进行二级碎裂，设置归一化能量为35％。选取丰度排名 前20的离子进行二级碎裂。设置最小信号检测阈值(Minimal signal threshold) 为2000，动态排除(Dynamic exclusion)为35秒。
4.6、SILAC标记耻垢分枝杆菌的标记效率测定
质谱数据经MaxQuant软件(Cox J,Mann M.MaxQuant enables high peptideidentification rates,individualized p.p.b.-range mass accuracies andproteome-wide protein quantification.Nat Biotechnol.2008Dec；26(12):1367-72.)分析，根据鉴定 到蛋白的重、轻标肽段的信号强度(intensity)的比例来计算标记效率。结果如 图6和表4.2所示。采用耻垢分枝杆菌SILAC标记专用培养基ZJL-z，耻垢分枝 杆菌的蛋白标记效率随着标记代数的增加而升高。5代时标记效率为91.2％，8 代时为93.4％，10代时为96.5％。表明本申请开发的SILAC培养基培养5代后 已经可以达到90％以上的标记效率，10代后可以使耻垢分枝杆菌蛋白质组的标 记效率达到96％以上。
进一步，随机选取鉴定到的耻垢分枝杆菌ATP合成酶α亚基肽段 ASHSDIFDGIR的一级谱图，对轻重标的比例进行了分析比较，结果如图7所示。 该肽段5、8、10代轻标肽段的信号强度(NL)分别为5.83×104，4.06×104、 3.97×104，而重标肽段的信号强度分别为7.25×105，7.58×105、7.23×105，由 此可知该肽段5、8、10代的标记效率分别为92.6％、94.9％和94.8％，与总蛋白 分析的结果相似。
利用本发明开发的SILAC培养基ZJL-z对耻垢分枝杆菌进行10代培养，最 终鉴定到的肽段96％为重稳定性同位素标记氨基酸形式(表4.2)，表明本发明 开发的SILAC培养基ZJL-z培养10代后可以实现耻垢分枝杆菌蛋白质组的高效 率标记。
采用本发明的策略，以其他分枝杆菌研究的培养基，如KIRCHNER'S培养 基[Kitahara T,Hotta K,Yoshida M,Okami Y.Biological studies of amiclenomycin.JAntibiot(Tokyo).1975Mar；28(3):215-21.] 或改良的Youmans and Karlson培养基[YOUMANS,G.P.&KARLSON,A.G., Streptomycin sensitivity of tuberclebacilli.Studies on recently isolated tubercle bacilli and the development ofresistance to streptomycin in vivo.Amer.Rev.Turbec., 1947,55,529-535.]等为基础，加入重稳定性同位素标记赖氨酸和/或重稳定性同 位素标记精氨酸，经过组分的优化及培养条件的控制，应该会得到类似的标记 效率。
表4.2耻垢分枝杆菌SILAC标记效率

Claims (8)

1.一种用于SILAC标记耻垢分枝杆菌的培养基，其特征在于所述培养基组成为：在不含谷氨酸和天冬氨酸的培养耻垢分枝杆菌的基础培养基中添加重稳定性同位素标记赖氨酸和重稳定性同位素标记精氨酸。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养基包括无机盐、组氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、重稳定性同位素标记精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶和葡萄糖；
所述无机盐为硫酸铵、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、硫酸镁、氯化钙、硫酸锌和硫酸铜；所述组氨酸盐酸盐为L-组氨酸盐酸盐；所述异亮氨酸为L-异亮氨酸；所述缬氨酸为L-缬氨酸；所述亮氨酸为L-亮氨酸；所述苯丙氨酸为L-苯丙氨酸；所述色氨酸为L-色氨酸；所述丝氨酸为L-丝氨酸；所述重稳定性同位素标记赖氨酸为重稳定性同位素标记L-赖氨酸；所述重稳定性同位素标记精氨酸为重稳定性同位素标记L-精氨酸；所述苏氨酸为L-苏氨酸；所述酪氨酸为L-酪氨酸；所述蛋氨酸为L-蛋氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述培养基中重稳定性同位素标记的赖氨酸在所述培养基中的终浓度为120mg/L；重稳定性同位素标记的精氨酸在所述培养基中的终浓度为80mg/L。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于所述培养基中：
所述硫酸铵、所述柠檬酸钠、所述磷酸氢二钠、所述磷酸二氢钾、所述柠檬酸铁铵、所述硫酸镁、所述氯化钙、所述硫酸锌、所述硫酸铜、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记的L-赖氨酸、所述重稳定性标记的L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐和所述尿嘧啶的质量比为500：100：2500：1000：40：50：0.5：1：1：2000：20：30：150：30：50：20：400：120：80：200：30：20：20：20。
5.根据权利要求1-3中任一所述的培养基，其特征在于：
所述硫酸铵在所述培养基中的终浓度为500mg/L；
所述柠檬酸钠在所述培养基中的终浓度为100mg/L；
所述磷酸氢二钠在所述培养基中的终浓度为2500mg/L；
所述磷酸二氢钾在所述培养基中的终浓度为1000mg/L；
所述柠檬酸铁铵在所述培养基中的终浓度为40mg/L；
所述硫酸镁在所述培养基中的终浓度为50mg/L；
所述氯化钙在所述培养基中的终浓度为0.5mg/L；
所述硫酸锌在所述培养基中的终浓度为1mg/L；
所述硫酸铜在所述培养基中的终浓度为1mg/L；
所述葡萄糖在所述培养基中的终浓度为2000mg/L；
所述L-组氨酸为盐酸盐，在所述培养基中的终浓度为20mg/L；
所述L-异亮氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；
所述L-缬氨酸在所述培养基中的终浓度为150mg/L；
所述L-亮氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；
所述L-苯丙氨酸在所述培养基中的终浓度为50mg/L；
所述L-色氨酸在所述培养基中的终浓度为20mg/L；
所述L-丝氨酸在所述培养基中的终浓度为400mg/L；
所述重稳定性同位素标记的L-赖氨酸在所述培养基中的终浓度为120mg/L；
所述重稳定性同位素标记的L-精氨酸在所述培养基中的终浓度为80mg/L；
所述L-苏氨酸在所述培养基中的终浓度为200mg/L；
所述L-酪氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；
所述L-蛋氨酸在所述培养基中的终浓度为20mg/L；
所述腺嘌呤为其硫酸盐，在所述培养基中的终浓度为20mg/L；
所述尿嘧啶在所述培养基中的终浓度为20mg/L。
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：
所述重稳定性同位素标记的赖氨酸为L-lysine-13C6或L-lysine-13C6 15N2，所述重稳定性同位素标记的精氨酸为L-Arginine-13C6 15N4。
7.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养耻垢分枝杆菌的基础培养基为Middlebrook 7H9或KIRCHNER’S培养基。
8.根据权利要求1-7任一项所述的培养基，其特征在于所述培养基组成为：
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