CN109959626B - 一种定量总脂含量的分光光度法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量总脂含量的分光光度法及应用，依据脂质对酞菁聚集体的解聚机制，以四仲辛氧基镍酞菁为比色材料，石油醚为溶剂，准确定量总脂含量。分三步：(1)制作标准曲线。配制特定浓度酞菁溶液，以压榨花生油为标准脂质，无油样溶液为参照，在675nm分析，拟合吸光度和花生油浓度之间的坐标点，得线性方程。(2)脂质萃取。称量待分析样品，经萃取、蒸除溶剂和称量，回收脂质。(3)总脂定量。取酞菁溶液2.5mL，与0.5mL回收脂样混合，以无脂样溶液为参照，在特征波长下分析，去掉同体积脂样的吸收，代入线性方程，计算脂浓度，及相应的脂质量和总脂含量。与传统的萃取/称重法相比，该法更准确，能避免回收样中残留溶剂的影响。
Description
技术领域
本发明属于仪器分析领域，涉及样品总脂含量的分光光度分析法，该方法中的酞菁比色材料性质稳定，特征吸收在可见光谱，一般不易受到分析体系的干扰。实验操作简单易行，线性标准曲线及线性方程易得，计算方便。分析结果较准确，相对于单纯的称重分析法，可以有效避免脂样中残存溶剂的干扰。
背景技术
脂质是一种能量贮存分子，广泛分布于生物组织细胞中，是生物细胞的结构成分之一。在食品行业，脂质含量是食品的一个重要营养指标。在生物化学研究和环境保护中，脂质含量是一个重要的生物指标，因为脂质代谢在生物体系中与其它代谢是相互关联的，污染物对于生物的污染会影响脂质的代谢，如有机持久性污染物，通常会造成生物细胞中脂质含量的增加。可见，脂质含量是一种重要的物理量，可用作营养、生化和生理学上的研究。那么，掌握生物样品中脂质的含量是非常重要的，但是，脂质是一类组成多样的生物质，包括非极性的三酰甘油酯、二酰甘油脂、单酰甘油酯和胆固醇，及极性较大的自由脂肪酸、磷脂和鞘脂，等等。脂质的这种成分和结构的多样性，给脂质的分析带来了极大的困难，要从多样的脂类分子中确定脂质分子的种类和数量，要求有先进的分析技术。尽管，现在色谱技术已经非常先进，能够分离和定量生物样品中的脂质，而且质谱技术也非常先进，可用于鉴定和定量脂质。但这些分析技术费用较高，并要求有较高操作技能的专门人员来进行，难以普及。
至今，传统的脂质分析方法是有机溶剂萃取称重的方法，也就是称量生物样品后，用低沸点的溶剂进行充分萃取脂质，然后蒸除溶剂，称量回收脂质的质量，计算得出脂质含量。实际上，这种分析方法分析的是总脂的含量。这种对于总脂的分析，一般即可满足对分析对象进行评估的要求。尽管如此，总脂含量的分析技术也在一直受到重视并得以改进，一方面是筛选有利于萃取脂质的溶剂或者使用按比例混合的溶剂，以提高脂质的萃取效率，减少分析的误差。另一方面是使用新的定量方法如色谱、光谱和其他特殊方法代替简单的称重方法，以避免称重方法中残存溶剂的干扰。时至今日，还没有找到可有效代替称重法的可行的方法，因为所谓的新方法在精确度、灵敏度和应用范围上有较大的局限性，不能用于通常的脂质分析，还需要进一步的深入研究。在定量方法中，有一种相对最为简单和方便的方法，即紫外可见分光光度法，这种光谱技术简易、稳定且使用费用低廉，再有，分光光度计在一般的实验室中都有这种仪器。虽然分光光度法定量总脂的研究已经有所开展，但是定量结果的准确性受到比色试剂的限制，比色试剂通常不能彻底地与脂质发生反应，造成比色结果不够准确。以此，至今传统的分光光度技术用于定量总脂含量尚不成熟，最大的局限性就是缺乏可用的比色试剂。假如有理想的比色试剂，能够对脂质的存在灵敏地做出相应，那么，就可能相应地发展为一种更准确地定量总脂含量的新方法。
根据对酞菁材料的研究，酞菁化合物是一类蓝绿色的颜料，它们通常在700nm左右有特征吸收，并且它们的发色特性可用通过改变分子中心的金属种类、周边的取代基，以及溶剂进行调控。比如，烷氧基取代的金属酞菁分子，通常它们在极性小分子中分散良好，但在非小分子溶剂中通常以寡聚体的形式存在，然而这种聚集体是不稳定的，可以用相对较大的分子如脂类分子使之解聚，从而改变其特征吸收的变化。这种光谱的响应性变化是非常灵敏的，可用于脂质含量的分析。正是基于这种脂质与酞菁特征吸收的关系，选用烷氧基金属酞菁，用小分子溶剂如石油醚分散酞菁为聚集体，再加入脂质分子促进酞菁聚集体解聚为游离的分子，达到调控酞菁的效果，进而使之特征吸收做出响应。根据聚集体在溶剂中的解离规律，在解离的初期，脂质浓度与游离酞菁分子的浓度是线性关系，即脂质浓度与酞菁的特征吸收呈现线性关系。依据此线性关系可以较准确地定量脂质，规避溶剂对单纯称重方法的干扰。并可以借鉴试剂盒制备技术，进一步将这种分光光度法发展为定量总脂的试剂盒。
发明内容
(一)本发明目的：创新性地改进称重定量总脂的分析方法，通过以酞菁材料为比色剂的分光光度法分析，避免脂样中溶剂的干扰，为微生物、植物、动物及水产品等生物样品总脂含量的分析提供一种更准确且简便的分析方法。
(二)其技术方案：选用烷氧基金属酞菁，小分子烷烃为溶剂，常用压榨型食用油为标准脂质，得出酞菁特征吸光率增加值与脂质浓度之间的线性关系方程。以此为基础，进行定量脂质的分析。采用常规方法，称量生物样品(ms)，萃取生物样品的脂质，然后蒸除溶剂，称重脂样(mr)。随后，取用0.5mL脂样，加入含有2.5mL特定浓度酞菁溶液的比色皿中，并称重，增加的质量为0.5mL脂样的回收质量(mr0.5)。混合后为检测溶液，在特定波长下，检测吸光度，去掉无油脂酞菁溶液的参照吸收以及无酞菁的脂样溶液吸收，得到有效的吸光度增加值(ΔA)，代入上述线性方程，计算出检测溶液中脂样的浓度(cl)。3cl为0.5mL脂样中脂质的计算质量(mc0.5)。0.5mL脂样中，脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5，回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5，样品中的总脂含量mr·mc0.5/mr0.5·ms，或表示为下式(1)。
传统称重法定量总脂含量可表示为下式(2)
算式(1)相对于算式(2)，去掉了溶剂对总脂含量定量的干扰，更为准确。
(三)优点和效果：
1、分析结果准确。这种分光光度法，使用的比色材料为酞菁材料，其在分析溶剂中对脂质的溶入响应灵敏，并在<1:5(V:V，脂样:酞菁溶液)范围内，呈线性关系，R2>0.99。根据算式(1)计算的结果，一般小于算式(2)计算的结果，可有效避免溶剂的干扰，更接近真实结果。
2、克服了比色材料的瓶颈。分光光度法简便易行，在脂质总量分析中的瓶颈为理想的比色材料难以找到，因此至今没有用分光光度进行定量总脂含量。根据酞菁材料的溶解性和在溶剂中的解聚动力学，选用适宜的烷氧基取代金属酞菁和相应的溶剂，可以用脂质的浓度调控其聚集体的解聚平衡，其特征吸收相应做出灵敏的响应。进而根据特征吸收与脂质浓度之间的线性关系定量总脂。其中，理想的酞菁材料是分析方法可行的关键。
具体实施方式
下面以优选的四仲辛氧基酞菁镍为比色材料，压榨花生油为标准脂质，建立A-c间的线性关系，并通过人为将几种食用油与石油醚混合、再蒸除溶剂、称量和分光光度分析，阐明此分光光度分析总脂方法的准确性，进而分析一些干果萃取脂样，并与称重法比较，以此，对本发明做出进一步的详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1
线性关系的建立之一：以60-90℃的石油醚为溶剂，通过称量、溶解和稀释的方法配制四仲辛氧基酞菁镍溶液，浓度为1.2×10-5mol·L-1。通过等体积稀释的方式，配制花生油的系列溶液1:0、1:1、1:3、1:7、1:15、1:31、1:63(V花生油:V石油醚)，相应的质量体积浓度为0.9216、0.4608、0.2304、0.1152、0.0576、0.0288、0.0144g·mL-1。比色皿中检测溶液的体积恒定为3mL，使用移液器，在比色皿中加入2.5mL上述酞菁溶液，再加入0.5mL石油醚，用一小块保鲜膜盖住比色皿口，大拇指压住皿口，食指抵住皿底部，振荡3次，作为测试参照样。使用移液器，在比色皿中加入2.5mL上述酞菁溶液，再加入0.5mL花生油溶液，用一小块保鲜膜盖住比色皿口，大拇指压住皿口，食指抵住皿底部，振荡3次，作为测试样。参照样和测试样中酞菁的浓度经混合稀释浓度都为1.0×10-5mol·L-1，花生油的系列浓度被稀释为0.1536、0.0768、0.0384、0.0192、0.0096、0.0048、0024g·mL-1。在这种酞菁特征吸收波长675nm下进行测定，结果通过excel或者origin软件作图，得直线及线性方程(3)
ΔA＝3.12504cl+0.01939 (3)
实施例2
线性关系的建立之二：如实施例1操作，如果将酞菁溶液的浓度配制成2.4×10- 5mol·L-1，与油样混合后，检测溶液中其浓度稀释为2.0×10-5mol·L-1，其他操作同实施例1，结果可得方程(4)。
ΔA＝4.92511cl+0.01478 (4)
实施例3
线性关系的建立之三：如实施例1操作，如果将酞菁溶液的浓度配制成4.8×10- 5mol·L-1，与油样混合后，检测溶液中其浓度稀释为4.0×10-5mol·L-1，其他操作同实施例1，结果可得方程(5)。
ΔA＝6.38683cl+0.02763 (5)
实施例4
分光光度定量总脂准确性之一：在1个100mL的圆底烧瓶中，加入少量沸石，并称量花生油约10g，再加入20mL30-60℃的石油醚，充分混合后，混合物在80℃水浴回收石油醚，随后，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原花生油mo＝9.9593g，蒸馏回收花生油mr＝11.4395g，回收率为mr/mo＝114.86％。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.58708,代入方程(4)，cl＝0.11620g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.34860g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.3935g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝88.59％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝10.1342g。比较脂样的真实质量9.9593g、称重回收样质量11.4395g和分光光度分析质量10.1342g，可见分光光度分析质量更接近真实质量，二者偏差+0.1749g,而称重质量相对于真实质量偏差+1.4802g。
实施例5
分光光度定量总脂准确性之二：在1个100mL的圆底烧瓶中，加入少量沸石，并称量菜籽油约10g，再加入20mL30-60℃的石油醚，充分混合后，混合物在80℃水浴回收石油醚，随后，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原油样mo＝10.1599g，蒸馏回收油样mr＝11.2606g，回收率为mr/mo＝110.82％。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.60795,代入方程(4)，cl＝0.12044g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.36131g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.3996g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝90.42％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝10.1817g。比较脂样的真实质量10.1596g、称重回收样质量11.2606g和分光光度分析质量10.1817g，可见分光光度分析质量更接近真实质量，二者偏差+0.0218g,而称重质量相对于真实质量偏差+1.1007g。
实施例6
分光光度定量总脂准确性之三：在1个100mL的圆底烧瓶中，加入少量沸石，并称量大豆油约10g，再加入20mL30-60℃的石油醚，充分混合后，混合物在80℃水浴回收石油醚，随后，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原油样mo＝10.2499g，蒸馏回收油样mr＝11.0624g，回收率为mr/mo＝107.94％。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.65078,代入方程(4)，cl＝0.12913g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.38740g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4090g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝94.72％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝10.4782g。比较脂样的真实质量10.2499g、称重回收样质量11.0624g和分光光度分析质量10.4782g，可见分光光度分析质量更接近真实质量，二者偏差+0.2283g,而称重质量相对于真实质量偏差+0.8125g。
实施例7
分光光度定量总脂准确性之四：在1个100mL的圆底烧瓶中，加入少量沸石，并称量芝麻油约10g，再加入20mL30-60℃的石油醚，充分混合后，混合物在80℃水浴回收石油醚，随后，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原油样mo＝10.0810g，蒸馏回收油样mr＝10.9206g，回收率为mr/mo＝108.33％。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.63941,代入方程(4)，cl＝0.12683g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.38048g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4170g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝91.24％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝9.9641g。比较脂样的真实质量10.0810g、称重回收样质量10.9206g和分光光度分析质量9.9641g，可见分光光度分析质量更接近真实质量，二者偏差-0.1169g,而称重质量相对于真实质量偏差+0.8396g。
实施例8
分光光度定量总脂准确性之五：在1个100mL的圆底烧瓶中，加入少量沸石，并称量调和油约10g，再加入20mL30-60℃的石油醚，充分混合后，混合物在80℃水浴回收石油醚，随后，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原油样mo＝10.3460g，蒸馏回收油样mr＝11.2095g，回收率为mr/mo＝108.32％。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.64384,代入方程(4)，cl＝0.12773g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.38318g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4156g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝92.20％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝10.3349g。比较脂样的真实质量10.3460g、称重回收样质量11.2095g和分光光度分析质量10.3349g，可见分光光度分析质量更接近真实质量，二者偏差-0.0111g,而称重质量相对于真实质量偏差+0.8635g。
实施例9
分光光度定量总脂准确性之六：在1个100mL的圆底烧瓶中，加入少量沸石，并称量葵花油约10g，再加入20mL30-60℃的石油醚，充分混合后，混合物在80℃水浴回收石油醚，随后，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原油样mo＝10.2036g，蒸馏回收油样mr＝11.0414g，回收率为mr/mo＝108.21％。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.61839,代入方程(4)，cl＝0.12256g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.36767g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.3965g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝92.73％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝10.2387g。比较脂样的真实质量10.2036g、称重回收样质量11.0414g和分光光度分析质量10.2387g，可见分光光度分析质量更接近真实质量，二者偏差+0.0351g,而称重质量相对于真实质量偏差+0.8378g。
实施例10
分光光度定量总脂准确性之七：在1个100mL的圆底烧瓶中，加入少量沸石，并称量芥花油约10g，再加入20mL30-60℃的石油醚，充分混合后，混合物在80℃水浴回收石油醚，随后，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原油样mo＝10.1148g，蒸馏回收油样mr＝10.8476g，回收率为mr/mo＝107.25％。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.59370,代入方程(4)，cl＝0.11754g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.35263g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4000g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝88.16％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝9.5631g。比较脂样的真实质量10.1148g、称重回收样质量10.8476g和分光光度分析质量9.5631g，可见分光光度分析质量更接近真实质量，二者偏差-0.5517g,而称重质量相对于真实质量偏差+0.7328g。
实施例11
分光光度定量总脂准确性之八：在1个100mL的圆底烧瓶中，加入少量沸石，并称量玉米油约10g，再加入20mL30-60℃的石油醚，充分混合后，混合物在80℃水浴回收石油醚，随后，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原油样mo＝10.2577g，蒸馏回收油样mr＝10.9291g，回收率为mr/mo＝106.54％。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.67380,代入方程(4)，cl＝0.13381g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.40142g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4254g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝94.36％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝10.3131g。比较脂样的真实质量10.2577g、称重回收样质量10.9291g和分光光度分析质量10.3131g，可见分光光度分析质量更接近真实质量，二者偏差+0.0554g,而称重质量相对于真实质量偏差+0.6714g。
实施例12
分光光度定量总脂准确性之九：在1个100mL的圆底烧瓶中，加入少量沸石，并称量亚麻油约10g，再加入20mL30-60℃的石油醚，充分混合后，混合物在80℃水浴回收石油醚，随后，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原油样mo＝10.1825g，蒸馏回收油样mr＝10.8996g，回收率为mr/mo＝107.04％。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.63800,代入方程(4)，cl＝0.12654g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.37962g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4091g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝92.79％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝10.1141g。比较脂样的真实质量10.1825g、称重回收样质量10.8996g和分光光度分析质量10.1141g，可见分光光度分析质量更接近真实质量，二者偏差-0.0684g,而称重质量相对于真实质量偏差+0.7171g。
实施例13
分光光度定量坚果总脂含量之一：称量一定质量杏仁粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝9.9579g，蒸馏回收油样mr＝5.5807g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量56.04％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.62551,代入方程(4)，cl＝0.12400g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.37201g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4166g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝89.30％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝4.9834g,总脂含量按方程(1)计算为50.04％。
实施例14
分光光度定量坚果总脂含量之二：称量一定质量腰果粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝10.3040g，蒸馏回收油样mr＝4.1756g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量40.53％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.66682,代入方程(4)，cl＝0.13239g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.39717g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4264g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝93.15％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝3.8894g,总脂含量按方程(1)计算为37.75％。
实施例15
分光光度定量坚果总脂含量之三：称量一定质量夏威夷果仁粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝10.3120g，蒸馏回收油样mr＝5.5814g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量54.13％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10- 5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.64657,代入方程(4)，cl＝0.12828g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.38484g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4206g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝91.51％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝5.1068g,总脂含量按方程(1)计算为49.52％。
实施例16
分光光度定量坚果总脂含量之四：称量一定质量榛子仁粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝10.1370g，蒸馏回收油样mr＝5.6747g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量55.98％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.63842,代入方程(4)，cl＝0.12662g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.37987g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4232g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝89.76％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝5.0937g,总脂含量按方程(1)计算为50.25％。
实施例17
分光光度定量坚果总脂含量之五：称量一定质量花生仁粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝10.1770g，蒸馏回收油样mr＝4.6328g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量45.52％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.63480,代入方程(4)，cl＝0.12589g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.37767g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4286g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝88.12％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝4.0823g,总脂含量按方程(1)计算为40.11％。
实施例18
分光光度定量坚果总脂含量之六：称量一定质量碧根果仁粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝10.1515g，蒸馏回收油样mr＝5.7499g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量56.64％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.64207,代入方程(4)，cl＝0.12737g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.38210g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4275g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝89.38％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝5.1392g,总脂含量按方程(1)计算为50.63％。
实施例19
分光光度定量坚果总脂含量之七：称量一定质量松子仁粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝10.1680g，蒸馏回收油样mr＝6.9242g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量56.64％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.61057,代入方程(4)，cl＝0.12097g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.36291g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4211g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝86.18％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝5.9674g,总脂含量按方程(1)计算为58.69％。
实施例20
分光光度定量坚果总脂含量之八：称量一定质量开心果仁粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝10.1420g，蒸馏回收油样mr＝5.1011g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量50.29％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.62245,代入方程(4)，cl＝0.12338g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.37015g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4350g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝85.09％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝4.3406g,总脂含量按方程(1)计算为42.80％。
实施例21
分光光度定量坚果总脂含量之九：称量一定质量芝麻籽粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝6.0684g，蒸馏回收油样mr＝3.4081g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量56.16％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.65166,代入方程(4)，cl＝0.12931g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.38794g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4290g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝90.43％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝3.0819g,总脂含量按方程(1)计算为50.79％。
实施例22
分光光度定量坚果总脂含量之十：称量一定质量葵花籽粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝5.0324g，蒸馏回收油样mr＝2.7535g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量54.72％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.65126,代入方程(4)，cl＝0.12923g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.38769g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4280g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝90.58％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝2.4942g,总脂含量按方程(1)计算为49.56％。
实施例23
分光光度定量坚果总脂含量之十一：称量一定质量核桃仁粉，以30-60℃的石油醚为溶剂，在80℃水浴下，索氏提取7h，然后在80℃水浴下回收石油醚，油样在100℃干燥1h，再在干燥器中冷却0.5h，在电子天平上称重。如上操作，重复5个批次，取平均值：称量原坚果粉质量ms＝10.1325g，蒸馏回收油样mr＝5.6004g，根据方程式(2)计算称重法所得总脂含量55.28％，即称重法所得回收率。另一方面，回收的油样取0.5mL，加入2.5mL的浓度为2.4×10-5mol·L-1四仲辛氧基酞菁镍的溶液，在比色皿中充分混合，以无油样的酞菁溶液为参照，在675nm下分析，并去掉0.5mL油样的吸收。检测液中酞菁的浓度都为2.0×10-5mol·L-1。油样如此分析3次，取平均值，ΔA＝0.69223,代入方程(4)，cl＝0.13755g·mL-1,计算0.5mL回收油样的质量mc0.5＝0.41265g，称量0.5mL回收油样的质量mr0.5＝0.4344g,脂质的比率可表示为mc0.5/mr0.5＝94.99％,回收脂样中的总脂质量为mr·mc0.5/mr0.5＝5.3200g,总脂含量按方程(1)计算为52.50％。
*使用的四仲辛氧基酞菁镍，不限于四仲辛氧基酞菁镍，其他在小分子非极性或低极性溶剂中具有H-聚集特性的酞菁衍生物，如能够被脂质调控其解聚平衡，都可以在其单分子特征吸收的特征波长下用于生物样品总脂含量的定量分析。
**以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
Claims (6)
1.一种定量总脂含量的分光光度法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)标准曲线的绘制，将选用的酞菁材料四-β-仲辛氧基酞菁镍配制成浓度为2.4×10- 5mol·L-1的溶液，将选用的标准脂质配制成一系列浓度的溶液，将此酞菁溶液与不同浓度的标准脂质溶液按一定的体积比混合，所得混合溶液为检测液，以同样体积比将此酞菁溶液和溶剂混合作为参照溶液，在特定波长下，检测吸光度，去掉参照溶液的吸收，得有效的吸光度增加值，绘制有效吸光度增加值与标准脂质浓度之间的标准曲线，并得线性方程；
(2)样品脂质的提取，称取一定质量的待测样品，经石油醚充分萃取后，蒸发除去石油醚，回收脂质样品，并称量其质量；
(3)样品总脂的定量，将步骤(2)中回收的脂质样品与步骤(1)中所述浓度的酞菁溶液按一定的体积比混合，所得混合溶液为检测液，并以同样体积比将溶剂和酞菁溶液混合作为参照溶液，测定其特征吸光度，代入步骤(1)中所得的线性方程，计算脂质浓度，并计算脂质的质量和总脂含量。
2.根据权利要求1所述的定量总脂含量的分光光度法，其特征在于，在所述步骤(1)和(3)中，检测液的总体积为3mL，其中包含特定浓度的酞菁溶液的体积为2.5mL，标准脂质溶液的体积为0.5mL或待测脂样的体积为0.5mL或溶剂的体积为0.5mL。
3.根据权利要求1所述的定量总脂含量的分光光度法，其特征在于，在所述步骤(1)和(3)中，用于分光光度分析的检测液的特征吸光度分析波长为675nm。
4.根据权利要求1所述的定量总脂含量的分光光度法，其特征在于，在所述步骤(1)中所使用的标准脂质为压榨花生油。
5.根据权利要求1所述的定量总脂含量的分光光度法，其特征在于，在所述步骤(1)中标准脂质的质量体积浓度范围为0.0144-0.9216g·mL-1。
6.根据权利要求1所述的定量总脂含量的分光光度法，其特征在于，在所述步骤(1)和(3)中，配制酞菁溶液所使用的溶剂，配制标准脂质溶液所使用的溶剂，及参照溶液中与酞菁溶液混合所使用的溶剂，都是石油醚。
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