CN109950126A - 一种高通量单细胞电喷雾质谱装置及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高通量单细胞电喷雾质谱装置及其检测方法，所述装置包括支撑架，支撑架内水平紧固连有串联的第一、第二三通管，水平方向形成样品通道，所述样品通道上设置有第一、第二、第三长直毛细管喷针，所述第一长直毛细管喷针的左端伸出在样品通道外，右端设置在所述样品通道内，靠近所述第一三通管的右端，与所述第二三通管的左端之间设置连接两个三通管的夹持装置，所述第一三通管通过管路与注射泵相连，在所述第三长直毛细管喷针右侧设置有质谱仪。本发明高通量单细胞电喷雾质谱装置可以实现细胞的排序进入质谱仪进行分析，借助质谱的快速分析能力和单次可检测上万种物质的能力，可以实现快速的单细胞分析。
Description
技术领域
本发明属于质谱分析领域，特别涉及一种高通量单细胞电喷雾质谱装置及其检测方法。
背景技术
质谱作为一种高灵敏、快速的分析仪器，在医药、生物、食品、化学等领域已经得到广泛应用。单细胞分析是现代生物及医学极为关注的方向，细胞具有异质性，同一个生命体中同一个部位的细胞都存在着差异，这也是癌症发生的一个原因。单个细胞内物质及其代谢过程的质谱分析方法已经有很多报道，但其分析速度慢，很难实现大量细胞的分析及统计，这样使得细胞研究和医学分析产生困难，从个性到规律的研究也很难进行。最新的ICP-MS对单细胞分析的方法，可以达到每分钟1000个细胞，但其受仪器的限制，每次只能检测几十种物质，并且是通过检测被金属标记的物质的金属元素含量情况来间接分析物质在细胞中的情况。
而生命活动中，参与其中的物质种类成千上万，其变化也是一瞬间，因此通过有机质谱的多物质同时质量检测的能力，和其极高的灵敏度，配合微流控细胞处理方法，可以实现单个细胞内容物的快速、百余种物质的同时分析，给单细胞生命分析提供一种有效的工具。
CN107833821A公开了一种敞开式双三通毛细管喷针喷雾装置，由两个三通组件串联组成，内部还有一根贯穿的喷雾毛细管，两个三通支路分别可以引入气体和液体，引入的气体用于吹散雾化引入的液体。该发明的缺点是其适合大量液态样品分析，或者对固体表面大面积样品的快速分析，对于直径只有10µm左右，体积为pL的单个细胞无法进行分析。
CN104392886A公开了一种毛细管喷针，包括管体，该管体两端分别是注入口和进行电喷雾的出口，所述管体一部分弯折形成取样端，该取样端上设有与管体内腔体连通取样口。还公开了一种采用上述毛细管喷针的电喷雾质谱分析装置及其进行分析检测的方法。该发明的缺点是只能针对液体快速取样分析，对液体中的极其微小体积的单个细胞很难实现精准的快速取样和分析，更难于实现高通量的单细胞分析。
发明内容
本发明提供了一种高通量单细胞电喷雾质谱装置及其检测方法，弥补了上述现有技术的不足，可以实现细胞的排序进入质谱仪进行分析，借助质谱仪的快速分析能力和单次可检测上万种物质的能力，可以实现快速的单细胞分析，同时不需要金属或者染料的标记。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种高通量单细胞电喷雾质谱装置，包括支撑架，支撑架内水平紧固连接有串联的第一三通管和第二三通管，在水平方向上形成样品通道，在所述样品通道上设置有第一长直毛细管喷针、第二长直毛细管喷针、第三长直毛细管喷针，所述第一长直毛细管喷针的左端伸出在样品通道外，右端设置在所述样品通道内，靠近所述第一三通管的右端，与所述第二三通管的左端之间设置连接两个三通管的夹持装置，所述第一三通管通过管路与注射泵相连，在所述第三长直毛细管喷针右侧设置有质谱仪。
作为优选的技术方案，所述第一长直毛细管喷针内径为50-100µm，外径不大于150µm，进入口设置在所述第二三通管内，与所述第二三通管的水平管的右端之间的距离为1～3cm；
作为优选的技术方案，所述第二长直毛细管喷针套接在第一长直毛细管喷针外部，内径为250µm，外径为450µm，其左端在第一三通管内的中间位置，其右端穿出第二三通管的右端1-2cm，离第三长直毛细管喷针喷雾口端2mm。
作为优选的技术方案，所述第三长直毛细管喷针套接在第二长直毛细管喷针外部，内径为580µm，尖端口径为10µm。
作为优选的技术方案，靠近所述第三长直毛细管喷针外壁设有高压电源。
作为优选的技术方案，所述第一三通管的水平管的右端采用第二石墨垫封闭，在所述第二石墨垫上设置有通孔，所述第二长直毛细管喷针的右端从所述通孔中穿出。
作为优选的技术方案，所述第一三通管和所述第二三通管均包括水平管和竖直管，所述第一三通管的水平管的左端采用第一石墨垫封闭，右端与所述第二三通管的水平管的左端相连，在所述第一石墨垫上设置有通孔，所述第一长直毛细管喷针的右端从所述通孔中穿出。
作为优选的技术方案，其特征在于：所述第一三通管的竖直管通过管路与所述注射泵相连，所述第二三通管的竖直管通过管路与所述废液瓶相连。
作为优选的技术方案，其特征在于：所述第二三通管的水平管的右端采用第三石墨垫封闭，在所述第三石墨垫上设置有通孔，所述第三长直毛细管喷针的右端从所述通孔中穿出。
本发明的另一个技术方案是利用本发明的高通量单细胞电喷雾质谱装置检测的方法，包括：
步骤一：将使用PBS溶液清洗两次的悬浮细胞，通过微量注射泵注入第一长直毛细管喷针中，启动注射泵，将鞘液萃取剂通过微量注射泵注入第一三通管，并在其上施加4KV左右的脉冲高压。鞘液萃取剂经第一长直毛细管喷针、第二长直毛细管喷针的夹缝流向第一长直毛细管喷针的右端，再与第一长直毛细管喷针中流出的细胞悬液混合。
步骤二：混合液经由第三长直毛细管喷针12的右端喷出，在高压电源电场作用下离子化，进入质谱仪进行分析，未喷出去的液体从第二三通管流出。
所述鞘液萃取剂选自和体积比为2:1的乙腈/水和体积比为2:1的含0.5%乙酸的乙腈/水。
通过以上技术方案，相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的两个三通管里包含三层长直毛细管喷针，最里面一层毛细管喷针用来注入细胞悬液，第二层毛细管喷针用以注入鞘液萃取剂/鞘液，该液体一方面形成夹流使细胞沿着流体中心单列排列，另一方面为电离提供电离试剂，最外层的毛细管喷针提供纳升电喷雾所需的电场和喷雾出口要求的尺寸条件，并将多余的液体通过第二个三通排除，保证喷雾效果。
2、本发明借助质谱的快速分析能力和单次可检测上万种物质的能力，可以实现快速的单细胞分析，同时不需要金属或者染料的标记。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明高通量单细胞电喷雾质谱装置的优选实施例1的结构示意图；
图2是采用本发明实施例1用于对A549、HEPG2、HL60、K562、PC12细胞进行单细胞分析后得到的PCA区分图。
图中：
1-第一长直毛细管喷针，2-第一石墨垫，3-支撑架，4-第一三通管，5-注射泵，6-夹持装置，7-第二石墨垫，8-第二长直毛细管喷针，9-第二三通管，10-第三石墨垫，11-废液瓶，12-第二长直毛细管喷针，13-高压电源，14-质谱仪。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
实施例1
如图1所示，本发明的高通量单细胞电喷雾质谱装置包括支撑架3，支撑架内水平紧固连接有串联的第一三通管4和第二三通管9，在水平方向上形成样品通道，在样品通道上设置有第一长直毛细管喷针1、第二长直毛细管喷针8、第三长直毛细管喷针12，第一长直毛细管喷针1的左端伸出在样品通道外，右端设置在所述样品通道内，靠近第一三通管4的右端，与第二三通管9的左端之间设置连接两个三通管的夹持装置6，第一三通管4通过管路与注射泵5相连，在所述第三长直毛细管喷针12右侧设置有质谱仪14。
以下为优选方案：
第一长直毛细管喷针1、第二长直毛细管喷针8、第三长直毛细管喷针12的材料均为熔融石英玻璃，横截面为圆形，均包括管体、进入口和出口。第一长直毛细管喷针1内径为50-100µm，外径不大于150µm，进入口设置在所述第二三通管9内，与所述第二三通管9的水平管的右端之间的距离为1～3cm；第二长直毛细管喷针8套接在第一长直毛细管喷针1外部，内径为250µm，外径为450µm，其左端在第一三通管4内的中间位置，其右端穿出第二三通管9的右端1-2cm，离第三长直毛细管喷针12喷雾口端2mm。第三长直毛细管喷针12套接在第二长直毛细管喷针8外部，内径为580µm，尖端口径为10µm。靠近所述第三长直毛细管喷针12外壁设有高压电源13。第一三通管4的水平管的右端采用第二石墨垫7封闭，在所述第二石墨垫7上设置有通孔，所述第二长直毛细管喷针8的出口从所述通孔中穿出。
第一三通管4和所述第二三通管9均包括水平管和竖直管，所述第一三通管4的水平管的左端采用第一石墨垫2封闭，右端与所述第二三通管2的水平管的左端相连，在所述第一石墨垫2上设置有通孔，所述第一长直毛细管喷针1的右端从所述通孔中穿出。第一三通管4的竖直管通过管路与所述注射泵5相连，所述第二三通管9的竖直管通过管路与所述废液瓶11相连。第二三通管9的水平管的右端采用第三石墨垫10封闭，在所述第三石墨垫10上设置有通孔，所述第三长直毛细管喷针12的右端从所述通孔中穿出。
本发明的实施例1高通量单细胞电喷雾质谱装置进行检测的工作原理是：将使用PBS溶液清洗两次的悬浮细胞，通过微量注射泵注入第一长直毛细管喷针1中，流速约为2µL/min，由注射泵5通过微量注射泵注入鞘液萃取剂，流速82µL/min，并在其上施加4KV左右的静电场高压。鞘液萃取剂经第一长直毛细管喷针1、第二长直毛细管喷针8的夹缝流向第一长直毛细管喷针1的右端，再与第一长直毛细管喷针中流出的细胞悬液混合。由于鞘液萃取剂流速较快，可以将第一长直毛细管喷针1中流出的细胞悬液压缩、拉伸，使液体中的细胞排列成一排，然后通过第三长直毛细管喷针12的右端实现电喷雾，悬浮细胞在高电压13作用下碎裂并电离，通过质谱获得有效分子信息。
鞘液萃取剂根据测试需要可以使用甲醇/水/乙腈等溶剂进行不同比例混合，正离子模式下使用含有0.5%乙酸的乙腈/水（V:V=2:1），负离子模式下使用乙腈/水（V:V=2:1）。
高压电源13的电压是3500V，PBS溶液清洗过的细胞悬液流速2微升每分钟，鞘液流速8微升每分钟，附加电压频率370Hz，这样可以让细胞悬液的流速从2-8微升每分钟都可以保证质谱获得良好的信号。过快的流速造成的过多的溶液第二三通管反向导出收集至废液瓶中，而进入口第三长直毛细管喷针12的直径10微米的出口可以实现良好的电喷雾，细胞在整个液流的中心轴被电喷雾产生的拉力拉向喷雾口，在喷雾口被电压破碎，细胞内分子被电离。
采用本发明的高通量单细胞电喷雾质谱装置对A549、HEPG2、HL60、K562、PC12细胞进行单细胞分析，MATLAB软件处理实验数据，通过PCA方法进行分类区分获得到PCA区分图，如图2所示。说明了本发明的高通量单细胞电喷雾质谱装置可以实现不同种类单细胞的区分，适用于活细胞中代谢物及脂类的分析，以实现快速的单细胞分析，同时不需要金属或者染料的标记。
以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (10)
1.一种高通量单细胞电喷雾质谱装置，其特征在于：包括支撑架(3)，支撑架内水平紧固连接有串联的第一三通管(4)和第二三通管(9)，在水平方向上形成样品通道，在所述样品通道上设置有第一长直毛细管喷针(1)、第二长直毛细管喷针(8)、第三长直毛细管喷针(12)，所述第一长直毛细管喷针(1)的左端伸出在样品通道外，右端设置在所述样品通道内，靠近所述第一三通管(4)的右端，与所述第二三通管(9)的左端之间设置连接两个三通管的夹持装置(6)，所述第一三通管(4)通过管路与注射泵(5)相连，在所述第三长直毛细管喷针(12)右侧设置有质谱仪(14)。
2.根据权利要求1所述的高通量单细胞电喷雾质谱装置，其特征在于：所述第一长直毛细管喷针(1)内径为50-100µm，外径不大于150µm，进入口设置在所述第二三通管(9)内，与所述第二三通管(9)的水平管的右端之间的距离为1～3cm。
3.根据权利要求1所述的高通量单细胞电喷雾质谱装置，其特征在于：所述第二长直毛细管喷针(8)套接在第一长直毛细管喷针(1)外部，内径为250µm，外径为450µm，其左端在第一三通管(4)内的中间位置，其右端穿出第二三通管(9)的右端1-2cm，离第三长直毛细管喷针(12)喷雾口端2mm。
4.根据权利要求1所述的高通量单细胞电喷雾质谱装置，其特征在于：所述第三长直毛细管喷针(12)套接在第二长直毛细管喷针(8)外部，内径为580µm，尖端口径为10µm。
5.根据权利要求1所述的高通量单细胞电喷雾质谱装置，其特征在于：靠近所述第三长直毛细管喷针(12)外壁设有高压电源(13)。
6.根据权利要求1所述的高通量单细胞电喷雾质谱装置，其特征在于：所述第一三通管(4)的水平管的右端采用第二石墨垫(7)封闭，在所述第二石墨垫(7)上设置有通孔，所述第二长直毛细管喷针(8)的右端从所述通孔中穿出。
7.根据权利要求1所述的高通量单细胞电喷雾质谱装置，其特征在于：所述第一三通管(4)和所述第二三通管(9)均包括水平管和竖直管，所述第一三通管(4)的水平管的左端采用第一石墨垫(2)封闭，右端与所述第二三通管(2)的水平管的左端相连，在所述第一石墨垫(2)上设置有通孔，所述第一长直毛细管喷针(1)的右端从所述通孔中穿出。
8.根据权利要求7所述的高通量单细胞电喷雾质谱装置，其特征在于：所述第一三通管(4)的竖直管通过管路与所述注射泵(5)相连，所述第二三通管(9)的竖直管通过管路与所述废液瓶(11)相连。
9.根据权利要求7所述的高通量单细胞电喷雾质谱装置，其特征在于：所述第二三通管(9)的水平管的右端采用第三石墨垫(10)封闭，在所述第三石墨垫(10)上设置有通孔，所述第三长直毛细管喷针(12)的右端从所述通孔中穿出。
10.基于权利要求1-9任一权利要求所述的高通量单细胞电喷雾质谱装置的检测方法，其特征在于，包括：
步骤一：将使用PBS溶液清洗两次的悬浮细胞，通过微量注射泵注入第一长直毛细管喷针（1）中，启动注射泵（5），将体积比为2:1的乙腈/水或体积比为2:1的含0.5%乙酸的乙腈/水鞘液萃取剂通过微量注射泵注入第一三通管(4)，并在其上施加4KV左右的静电场高压；鞘液萃取剂经第一长直毛细管喷针（1）、第二长直毛细管喷针（8）的夹缝流向第一长直毛细管喷针（1）的右端，再与第一长直毛细管喷针中流出的细胞悬液混合；
步骤二：混合液经由第三长直毛细管喷针（12）的右端喷出，在高压电源(13)电场作用下离子化，进入质谱仪(14)进行分析，未喷出去的液体从第二三通管（9）流出到废液瓶（11）。
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