CN109938173A - 山梨酸在促进动物骨骼生长发育的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了山梨酸在促进动物骨骼生长发育方面的应用。本发明提供了山梨酸的新用途，经动物饲养试验证实，山梨酸不仅能够促进猪肝脏分泌IGF‑1，而且还能够促进动物骨骼的生长发育。所述山梨酸来源丰富，不含对动物和人健康有害的物质，常常作为防腐剂和调味剂在人类食品中广泛运用，安全且易获取。而且，山梨酸作为营养调控物质，可以直接加入动物饲料或食品中，具有安全、有效、不会引起毒副作用等优点，在促进动物骨骼生长发育方面具有良好的推广应用前景。

Description

山梨酸在促进动物骨骼生长发育的应用

技术领域

本发明属于促进动物生长发育技术领域，具体涉及一种饱和脂肪酸—山梨酸促进动物骨骼生长发育的应用。

背景技术

动物生长包含肌肉和骨骼的生长发育过程。早期生长过程中，主要是以骨骼的生长发育为主。骨骼充分的生长发育又为动物后期肌肉的沉积提供了保障。因此，在遗传学中，可以通过对特定部位骨骼长度的测定来估算生长后期肌肉的沉积量，为种用动物的选择提供遗传数据。

骨骼的生长发育是有骨组织中的各种细胞不断的增殖、分化、矿化、凋亡四个过程即骨的代谢。骨代谢是骨骼生长的基础，包括骨形成(bone formation)与骨吸收(boneresorption )，两者处于相对平衡状态。在幼年时期，生长是仔猪特有的生理特点，主要表现为体格（体长、体高）的增长。体格的增长源于骨骼生长。骨骼生长是由于骨形成远远大于骨吸收。成骨细胞介导骨形成。

骨的发生也称成骨的发生，骨的发生有两种方式：①膜内成骨，②软骨内成骨。虽然骨发生的方式不同，但骨组织形成(即成骨)的过程基本上是相同的，都表现为骨的形成和骨的溶解吸收两个方面，通过两者相辅相成密不可分的活动，才能完成骨的成型与改建。

骨的纵向生长及长骨的加长是有骺板及生长板断向两端生长和骨化来完成。动物在正常生长发育时期，骺板的增殖生长速度于软骨内骨化和骨组织溶解吸收速度是相平衡的。所以，在该时期骺板的厚度是相对恒定的，直到体成熟，骺板的增殖生长回逐渐减慢，最后骺板全部骨化消失，骨的长度将停止不在增加。

骨的生长发育有许多的调控因素影响，如营养因素和内源激素等。骨骼的生长发育主要需要的营养物质-蛋白质、能量以及钙磷等。饲料中上述的养分均比较的充足，能够提供幼年动物生长发育所需。此外，在营养物质充分的前提下，动物体内相关的内源激素的调控下，骨骼的生长发育才能正常进行。涉及到调控骨骼生长发育的主要内源激素有：生长激素（GH）、甲状旁腺素（PTH）、降钙素（CT）、类胰岛素生长因子-1（IGF-1）。生长激素在调控动物生长中发挥重要的作用，而生长激素对动物生长的调节作用是由类胰岛素生长因子-1介导的。循环血液中IGF-1的含量受GH的调控。由此可知，IGF-1也是骨骼生长发育最重要的调控激素之一。

山梨酸由于来源丰富，安全且易获取，不含对动物和人健康有害的物质，常常作为防腐剂和调味剂在人类食品中广泛运用,但长期食用超标的山梨酸，可能会抑制骨骼生长我们的早期研究发现，饲料中添加一定剂量的山梨酸能够促进断奶仔猪的生长，但主要是利用山梨酸作为酸制剂，通过在饲料中添加山梨酸来降低动物肠道里消化物pH、改善消化酶的活性、抑制肠道微生物增殖、减少氨气和生物胺的产量等多种途径发挥作用。

在仔猪的快速生长过程中，一方面是蛋白质和脂肪的快速沉积，另一方面是骨骼的快速的生长，在实际生产中畜牧生产者的往往关注蛋白质的快速沉积和脂肪的相对减少，骨骼的生长发育通常被忽略。可骨骼的生长发育对肉猪后期的育肥有着至关重要的作用，骨骼的大小决定了后期肌肉在骨骼中的附着量。同样肌肉的大量附着也会刺激骨骼骨密度、骨骼力量和矿物质含量等的明显升高，两者之间存在着相互促进的关系。

山梨酸在动物骨骼生长发育方面应用的报道目前尚未见报道，而重视断奶仔猪骨骼发育，提高生长阶段猪的体格，有可能成为提高育肥猪瘦肉产量的有效途径之一。

发明内容

本发明的目的是为了克服目前养猪生产中对仔猪骨骼生长发育的研究较少，没有系统的研究方法和有效的测定指标等问题，总结出一套有效评估仔猪骨骼生长发育的检测指标用于后续研究，为相关的研究提供研究方法。首次提出山梨酸在促进动物骨骼生长发育方面的应用，并确定了山梨酸在饲料中促进动物骨骼生长的最佳添加量，为制备促进动物骨骼发育的饲料方面给出了研究数据以及理论支持。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

山梨酸在促进动物骨骼生长发育的应用，其特征在于，所述促进动物骨骼生长发育是指显著提高动物的股骨重量、增加生长板中静止区长度和肥大区的长度，显著增加动物胫骨生长板静止区的长度，显著提高血清中血钙的含量；所述山梨酸作为促进骨骼生长发育的活性成分添加于动物饲料中，所述山梨酸的添加量为质量比0.1%~3.0%。

优选地，山梨酸在饲料中的添加量为15g/kg。

优选地，山梨酸在饲料中的添加量为20g/kg。

优选地，应用对象为小鼠或者断奶仔猪。

优选地，所述小鼠为雌雄昆明小鼠，在室温22-25℃、湿度65-70%条件下饲养，对照组饲喂基础饲粮，试验阶段自由采食，每日记录采食量，试验期为四周。

本发明利用小鼠饲养试验、屠宰试验、放射免疫实验方法、苏木精-伊红染色法研究了日粮中添加不同剂量的山梨酸对小鼠体重的影响，研究了日粮中添加不同剂量的山梨酸对小鼠股骨和胫骨长度和厚度的影响，同时探讨了山梨酸对血液与骨骼生长发育相关激素IGF-1含量的影响，探讨了山梨酸对股骨和胫骨生长板发育的影响。同时探讨了山梨酸促进骨骼生长发育的机理。发明为山梨酸在促进骨骼生长发育方面的应用提供了技术理论基础，为提高动物的产肉性能提供参考。

本发明首次提出了山梨酸能促进动物骨骼生长发育，属于山梨酸的一种新的用途，现有技术中山梨酸作为饲料添加剂仅仅是作为酶制剂和酸化剂，而本发明通过动物饲养试验证明，在动物饲料中添加一定量的山梨酸能显著提高断奶小鼠的体重，显著提高股骨的长度以及静止区和肥大区的宽度，能显著提高断奶小鼠胫骨的长度以及静止区的宽度，促进小鼠的生长以及骨骼的生长发育，为了更好地研究饲料添加剂，促进动物生长，提供了很好了理论依据。

本发明所述的山梨酸作为营养调控物质，添加量少，可以直接加入动物饲料、食品或药品中，发挥的生理活性高，安全、有效、不会引起毒副作用。

附图说明

图1是生长板示意图；

图2是生长板切片图。

具体实施方式

实施例1 饲粮中添加山梨酸对昆明小鼠生产性能的影响

试验选取48只3~4周龄的雌性昆明小鼠按体重差异不显著的原则平均分为四个组，每组4个重复，每个重复3只，同一鼠笼中饲养。其中一个组为对照组，饲喂基础饲粮，其余三组为试验组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组）分别饲喂含 10、15和20 g/kg山梨酸的饲粮，在室温22~25 ℃，湿度65~70 %条件下饲养。试验阶段自由采食，每日记录采食量，试验期为四周。试验结束后称重。眼眶静脉采血，制备血清备用，同时屠宰留取小鼠胫骨和股骨样备用。

表1 饲粮中添加山梨酸对小鼠生长性能的影响

Table 1 Effects of dietary Sorbic acid on growth performance of mice

注：同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P＞0.01)。下表同。

由表1可知，与对照组相比，饲粮中添加15 g/kg的山梨酸能显著提高昆明小鼠的平均体增重和平均采食量 (P<0.05）；而饲粮中添加20 g/kg的山梨酸可显著提高昆明小鼠的平均日采食量（P<0.05），对小鼠的平均体增重无显著性影响。

实施例2 饲粮中添加山梨酸对昆明小鼠骨骼生长发育的影响

一、骨骼相关指标的测定

（1）骨长与骨重的测定：

胫骨（股骨）近端关节面和远端关节面之间的距离即为胫骨（股骨）长。同一人员，游标卡尺测量三次，取其平均值并称其重量。

（2）骨骼指数的测定：

取骨样去除附着的肌肉组织等，无水乙醚浸泡12 h脱脂，放置105 ℃烘干箱72 h、室温平衡24 h后称骨重。骨骼指数=脱脂骨重/骨长。

二、血清中骨骼相关激素和生化指标的测定：

（1）血清游离IGF-1Ⅰ含量测定

血清游离IGF-1含量的测定参考天津九鼎生物技术有限公司放射免疫法fIGF-1试剂盒说明书进行：对标准品、质控血清、标记物按说明书进行配制；同血清T₃、T₄含量测定各管加入样品、标准液、标记物、抗体、分离剂，吸干各管上清后测定沉淀物的cpm，根据标准曲线计算样本浓度。

（2）总IGF-1 含量测定：

血清总IGF-1含量的测定参考天津九鼎生物技术有限公司放射免疫法总IGF-1试剂盒说明书进行：

①IGF-1前处理：取40μL样本血清于500 μL离心管中，再加入360 μL酸醇混合液，混匀后室温放置30分钟，4 ℃以10000 rpm离心2分钟，取300 μL上清液于另一500 μL离心管内，加入150 μL Tris碱溶液，混匀后室温放置30分钟，4 ℃以10000 rpm离心2分钟，取300 μL上清液用于后续测定；骨骼的固定、包埋和生长板切片染色及结果统计：

②按照游离IGF-1操作步骤，进行后续检测。

（3）血清中骨特异性碱性磷酸酶( bone-specific alkaline phosphatase,BAP)的测定

采用南京建成生物工程研究所生产的Elisa试剂盒检测。参考说明书将标准品浓度等比稀释为5个梯度，以制备标准曲线。在酶标板上，标准品孔每孔加入稀释好标准品50μL，零孔加入标准品/样品稀释液50μL，然后加入生物素抗原50μL；样品孔加入样品50μL，然后加入亲和素-HRP原50μL；轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30 min。洗板，加入抗体50μL，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30 min；第二次洗板；每孔加入显色剂A 50μL，在加入显色剂B 50μL。轻轻震荡摇匀，37℃避光显色10 min；每孔加入终止液50μL；波长450 nm，酶标仪比色，测各孔浓度。

（4）骨钙素(Osteocalcin,OCN)的测定：

同BAP试剂盒。

（5）血钙含量的测定：

采用南京建成生物工程研究所生产的钙 (Ca) 测试盒 (带标准) 微板法试剂盒检测。参考说明书将标准品浓度等比稀释为5个梯度，以制备标准曲线。在酶标板上，标准品孔每孔加入稀释好标准品10μL，零孔加入蒸馏水10μL；样品孔加入样品10μL；加入工作液Ⅰ250μL；混匀，静置5 min后，波长610 nm，酶标仪比色，测各孔浓度。

另外，进行骨骼的固定、包埋、生长板切片染色和结果统计：

一、样本的固定：

饲养试验结束，处死小鼠取股骨和胫骨，剔除附着的肌肉和筋膜等放入10％中性甲醛溶液中固定 48 h左右。

二、样品的脱钙处理：

（1）样品脱钙处理前：

对标本进行适当的清水浸泡和流水洗涤12 h。

（2）样品脱钙过程：

将标本浸入装有15% EDTA脱钙液(150 g EDTA，1 L蒸馏水，50 g NaOH，搅拌均匀后使用盐酸调节pH值至7.0～7.5)的玻璃容器中。及时更换新的脱钙液，可加快脱钙的进程。约10 d左右，当骨组织可被针轻易刺入时，脱钙完成。此时的标本柔软而有弹性。样品脱钙结束后，以流水冲洗12 h。

三、样品的包埋和染色：

（1）脱水与透明：

室温条件下，脱水与透明。脱水过程从低浓度乙醇逐步向高浓度乙醇进行。可将标本置70%乙醇短暂保存，既可脱水，同时对标本也有继续固定的作用。

开始制片时，标本在 80%乙醇中过夜后，依次浸入体积分数为95%乙醇 Ⅰ、Ⅱ各2h，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各 1.5 h。二甲苯(无水乙醇：二甲苯1:1)Ⅰ、Ⅱ 透明2次，各40 min。透明过程中用肉眼观察透明程度，避免透明不足或过度。

（2）样品浸蜡包埋：

①标本依次浸入50 ℃～52 ℃ 软蜡Ⅰ2 h，56 ℃～58 ℃ 硬蜡Ⅱ1 h。

②包埋蜡(熔点 58 ℃～60 ℃，可加入10%～20%蜂蜡包埋。

③切片前修正石蜡块，标本置于冰上冷却蜡块切面，切取5～10 μm厚度蜡片，常规烤片。

（3）染色（苏木精-伊红（HE）染色）：

经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10 min，无水乙醇、95%乙醇逐级复水至 70%乙醇，每级2 min，进蒸馏水3 min 后，行苏木精染色（胫骨3 min ，股骨2.5 min），1%盐酸酒精（70%乙醇配制）分色 10 s，流水冲洗20 min，伊红染色5 min，最后经 70%乙醇、85%乙醇和95%乙醇Ⅰ、Ⅱ，无水乙醇各级脱水2 min后，二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明各5 min，中性树胶封固。

五、生长板厚度、增殖带和肥大带厚度测量：

取骨样进行以上组织固定和脱钙，常规制备骨组织石蜡切片5 μm，苏木精-伊红染色，光学显微镜观察组织切片，置于20倍物镜下选取五个视野拍照，用Image- Pro Plus对生长板各区域（见图1、图2）进行形态统计。

表2 饲粮中添加山梨酸对昆明小鼠股骨发育的影响

Table 2 Effects of sorbic acid in diets on femur development of Kunmingmice

由表2可知，与对照组相比，饲粮中添加15 g/kg的山梨酸可显著提高昆明小鼠的股骨重量、增加生长板中静止区长度和肥大区的长度(P<0.05)；但是对其他指标无显著影响 (P>0.05)。饲粮中添加15 g/kg和20 g/kg的山梨酸对股骨的生长无显著影响(P>0.05)。是上述结果提示，日粮中添加15 g/kg的山梨酸能显著促进股骨的生长发育。

表3 饲粮中添加山梨酸对昆明小鼠胫骨发育的影响

Table 3 Effects of sorbic acid in diets on the development of tibia inKunming

由表3可知，饲粮中添加20 g/kg的山梨酸可显著增加昆明小鼠胫骨生长板静止区的长度(P<0.05)，但对小鼠胫骨重量、胫骨长度、骨指数、增殖区、肥大区和生长板长度无显著影响(P>0.05)。饲粮中添加10 g/kg和15 g/kg的山梨酸对小鼠胫骨的各项指标无显著影响。上述结果显示：日粮中添加山梨酸对小鼠胫骨的生长发育无显著影响。

表4 饲粮中山梨酸对昆明小鼠血清生化指标的影响

Table 4 Effect of Sorbic acid on serum biochemical indicators in Kunmingmice

由表4可知，与对照组相比，饲粮中添加20 g/kg 山梨酸可显著提高血清中血钙的含量(P<0.05)，提高血清中总IGF-Ⅰ的含量，但差异不显著(P>0.05)，饲粮中添加山梨酸对昆明小鼠血清中BAP和OCN 的浓度无显著影响(P>0.05)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.山梨酸在促进动物骨骼生长发育的应用，其特征在于，所述促进动物骨骼生长发育是指显著提高动物的股骨重量、增加生长板中静止区长度和肥大区的长度，显著增加动物胫骨生长板静止区的长度，显著提高血清中血钙的含量；所述山梨酸作为促进骨骼生长发育的活性成分添加于动物饲料中，所述山梨酸的添加量为质量比0.1%~3.0%。

2.根据权利要求1所述的山梨酸在促进动物骨骼生长发育的应用，其特征在于，山梨酸在饲料中的添加量为15g/kg。

3.根据权利要求1所述的山梨酸在促进动物骨骼生长发育的应用，其特征在于，山梨酸在饲料中的添加量为20g/kg。

4.根据权利要求1所述的山梨酸在促进动物骨骼生长发育的应用，其特征在于，应用对象为小鼠或者断奶仔猪。

5.根据权利要求1所述的山梨酸在促进动物骨骼生长发育的应用，其特征在于，所述小鼠为雌雄昆明小鼠，在室温22-25℃、湿度65-70%条件下饲养，对照组饲喂基础饲粮，试验阶段自由采食，每日记录采食量，试验期为四周。