CN109922819A - 用于治疗癌症的重组免疫毒素 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于治疗癌症的方法和相关组合物。例如,提供了用于在对象(例如患有癌症的对象)中产生瘤形成中性的致耐受性环境并施用重组免疫毒素的方法。
Description
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119要求以下的优先权权益:2016年9月27日提交的美国临时申请No.62/400,609,2016年10月4日提交的美国临时申请No.62/403,889,2016年10月5日提交的美国临时申请No.62/404,754,2016年10月6日提交的美国临时申请No.62/405,221,2016年10月19日提交的美国临时申请No.62/410,226和2016年10月25日提交的美国临时申请No.62/412,786,其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本文提供了用于治疗癌症的方法和相关组合物。例如,提供了用于在对象(例如患有癌症的对象)中产生瘤形成中性的致耐受性环境(neoplasia-neutral tolerogenicenviroment)并施用重组免疫毒素的方法。
发明内容
在一方面,提供了用于治疗患有癌症的对象的方法,其包括在对象中产生瘤形成中性的致耐受性环境,以及向对象施用重组免疫毒素以治疗癌症。
在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,癌症是非血液系统癌症(non-hematologic cancer)。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,癌症包含表达间皮素的癌细胞。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,癌症是间皮瘤、胰腺腺癌、卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌或胃癌。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,当在没有任何免疫抑制疗法的情况下施用于对象或受试对象时,重组免疫毒素在对象或受试对象中产生或预期产生不想要的免疫应答。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,当在没有任何包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下施用于对象或受试对象时,重组免疫毒素在对象或受试对象中产生或预期产生不想要的免疫应答。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,不想要的免疫应答是针对重组免疫毒素的不想要的抗体产生。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,不想要的免疫应答是针对重组免疫毒素的毒素的不想要的抗体产生。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,对象中的瘤形成中性的致耐受性环境通过向对象施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体产生。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,产生的所述瘤形成中性的致耐受性环境是其中针对所述重组免疫毒素的不想要的免疫应答被降低或消除而不增强癌症生长的环境。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,重复施用重组免疫毒素。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,重复施用重组免疫毒素至少2次、3次或更多次。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,在每次施用重组免疫毒素期间存在瘤形成中性的致耐受性环境。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,在每次施用重组免疫毒素期间产生瘤形成中性的致耐受性环境。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,在重复施用重组免疫毒素期间,向对象施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体至少一次。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,在重复施用重组免疫毒素期间,向对象施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体至少两次。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,在重复施用重组免疫毒素期间,向对象施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体至少三次。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,包含免疫抑制剂的合成纳米载体仅与重组免疫毒素的第一次施用一起施用。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,其中当存在重组免疫毒素的至少两次施用时,包含免疫抑制剂的合成纳米载体仅与第一次施用和第二次施用一起施用。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,包含免疫抑制剂的合成纳米载体与重组免疫毒素的每次施用一起施用。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体与施用重组免疫毒素相伴随。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体与施用重组免疫毒素同时进行。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,合成纳米载体在重组免疫毒素之前施用。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,该方法还包括在没有包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下施用重组免疫毒素。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,在没有包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下施用重组免疫毒素至少2次、3次或更多次。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,存在重复施用重组免疫毒素与包含免疫抑制剂的合成纳米载体的组合至少2或3个周期,重复施用的每个周期如本文提供的任何一种方法中所定义的任一组重复施用所定义。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,该方法还包括在所述至少2或3个周期之后,在没有包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下使用重组免疫毒素。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,在至少2或3个周期之后,在没有包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下施用重组免疫毒素至少2次、3次或更多次。
在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,重组免疫毒素包含抗体或其抗原结合片段、以及毒素。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,重组免疫毒素的配体(例如抗体或其抗原结合片段)与癌细胞上表达的抗原特异性结合。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,抗原是间皮素。
在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,重组免疫毒素的毒素是细菌来源的毒素。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,细菌来源的毒素是假单胞菌(Pseudomonas)毒素。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,毒素是假单胞菌外毒素A。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,重组免疫毒素是LMB-100。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,所述方法还包括伴随着重组免疫毒素的至少一次施用,来施用检查点抑制剂。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,检查点抑制剂不与重组免疫毒素的至少一次施用同时施用。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,在重组免疫毒素的至少一次施用之后24小时内施用检查点抑制剂。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,伴随着重组免疫毒素的每次施用,来施用检查点抑制剂。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,检查点抑制剂的施用或每次施用在重组免疫毒素的施用或每次施用之后施用。
在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,检查点抑制剂是抗CLTA4抗体。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,检查点抑制剂是抗OX-40抗体。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,其中在没有免疫抑制疗法的情况下施用重组免疫毒素之后,产生瘤形成中性的致耐受性环境。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,在没有免疫抑制疗法的情况下施用重组免疫毒素后,在对象中存在针对重组免疫毒素的不想要的免疫应答。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,该方法还包括在产生瘤形成中性的致耐受性环境之前,在没有免疫抑制疗法的情况下向对象施用重组免疫毒素。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,不想要的免疫应答是针对重组免疫毒素的不想要的抗体产生。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,不想要的免疫应答是针对重组免疫毒素的毒素的不想要的抗体产生。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,该方法还包括将对象鉴定为患有癌症。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,对象是需要瘤形成中性的致耐受性环境的对象。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,该方法还包括将对象鉴定为需要瘤形成中性的致耐受性环境。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,该方法还包括评估对象中针对重组免疫毒素的不想要的免疫应答。
在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,免疫抑制剂是mTOR抑制剂。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,mTOR抑制剂是雷帕霉素。
在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,免疫抑制剂包封在合成纳米载体中。
在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,合成纳米载体包含聚合物纳米载体。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,聚合物纳米载体包含聚酯或与聚醚连接的聚酯。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己内酯。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,聚合物纳米载体包含聚酯和与聚醚连接的聚酯。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。
在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,使用动态光散射获得的合成纳米载体群体的粒度分布的平均值为直径大于110nm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径大于150nm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径大于200nm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径大于250nm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径小于5μm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径小于4μm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径小于3μm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径小于2μm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径小于1μm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径小于500nm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径小于450nm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径小于400nm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径小于350nm。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,直径小于300nm。
在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,合成纳米载体中包含的免疫抑制剂在合成纳米载体上的平均载荷为0.1%至50%(重量/重量)。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,载荷为0.1%至25%。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,载荷为1%至25%。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,载荷为2%至25%。在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,载荷为2%至10%。
在本文提供的任何一种方法或组合物的一个实施方案中,合成纳米载体群的长宽比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,该方法还包括在向对象施用之前、期间或之后,评估对象中针对重组免疫毒素的免疫应答。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,施用是通过静脉内、腹膜内或皮下施用。
在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,rIT的剂量小于当不与本文提供的包含免疫抑制剂的合成纳米载体同时施用时实现相似水平的功效的rIT剂量。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,rIT的剂量小至少10%。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,rIT的剂量小至少20%。在本文提供的任何一种方法的一个实施方案中,该方法还包括将rIT的剂量选择为小于当不与包含免疫抑制剂的合成纳米载体同时施用时实现相似水平的治疗功效的rIT剂量。
在一个方面,提供了药盒,所述药盒包含一个或更多个包含重组免疫毒素的剂量和一个或更多个包含含有免疫抑制剂的合成纳米载体的剂量。
在本文提供的任何一种药盒的一个实施方案中,药盒还包含一个或更多个包含检查点抑制剂的剂量。
在本文提供的任何一个药盒的一个实施方案中,药盒还包含使用说明书。在本文提供的任何一个药盒的一个实施方案中,使用说明书包括用于实施本文提供的任何一种方法的说明书。
在本文提供的任何一种药盒的一个实施方案中,包含免疫抑制剂的合成纳米载体如对于本文提供的任何一种这样的组合物所述。
在本文提供的任何一种药盒的一个实施方案中,重组免疫毒素如对于本文提供的任何一种这样的组合物所述。
在另一方面,提供了如所提供的任何一种方法或任何一个实施例中所述的组合物。在一个实施方案中,组合物是根据提供的任何一种方法施用的任何一种组合物。
在另一方面,任何一种组合物用于所提供的任何一种方法。
附图说明
图1显示了在用环磷酰胺和喷司他丁(CP/PS)和SS1P治疗之后数月内具有最高总体肿瘤响应的患者中的间皮瘤肿瘤响应。上图显示了八个患者的两个治疗周期,中图显示了一个患者的四个治疗周期,下图显示了一个患者的六个治疗周期。
图2A至2F显示LMB-100和SVP-R的组合阻止了针对LMB-100的ADA应答。图2A是LMB-100的带状图和SVP-R的图示。图2B显示用LMB-100注射7次,或LMB-100和1、3或7次SVP-R的组合注射的小鼠(用箭头指示)。通过ELISA评估抗LMB-100抗体(n=8)。图2C显示了如箭头所示注射LMB-100和SVP-R的小鼠(n=7)。图2D显示了如箭头所示注射LMB-100和SVP-R的小鼠。显示了第10周的最终平均滴度(n=7)。图2E显示了使用来自所处理小鼠的血浆的中和测定(n=7)。接种KLM-1细胞并用血浆-LMB-100混合物处理。72小时后评估细胞生存力。曲线表示7个生存力曲线的平均值(n=7,每个样品6个重复)。图2F显示了如箭头所示注射LMB-100和SVP-R的小鼠(n=8)。用LMB-100、Fab或抗TAC-PE24包被ELISA板。评估第6周的血浆样品。显示了50%结合的稀释系数。线表示平均误差条SEM。对于图2B和2C中的统计分析,计算每条曲线的AUC并使用单向ANOVA进行比较。
图3A至3C显示了图2B中所示的每两周注射后的小鼠体重和AUC。图3A显示用LMB-100(2.5mg/kg)注射7次,或LMB-100和1、3或7次SVP-R(2.5mg/kg)的组合注射的雌性Balb/c小鼠。收集血浆并通过ELISA分析抗LMB-100抗体。对于统计分析,计算每条曲线的AUC并使用单向ANOVA进行比较。误差条SEM,n=8。图3B显示每次注射前的小鼠体重。图3C显示了在每两周的周期中注射LMB-100(2.5mg/kg)和SVP-R(2.5mg/kg)的小鼠,所述周期包括每隔一天(OOD)的i.v.内注射。在每次注射之前评估小鼠体重。注射时间用箭头表示(n=7)。
图4显示了SVP-R对针对SS1P亲本免疫毒素的ADA形成的影响。向雌性Balb/c小鼠注射9个剂量的SS1P(0.25mg/kg),9个剂量的SS1P和3个剂量的SVP-R(2.5mg/kg)的组合或载剂(n=10)。收集血浆并通过ELISA分析抗SS1P抗体。对于统计分析,计算每条曲线的AUC。误差条显示SEM。注射时间用箭头表示。
图5A至5B显示小鼠血浆中的中和抗体对LMB-100IC50的影响。根据图2E中所示的方案,向小鼠注射15个剂量的LMB-100(2.5mg/kg),15个剂量LMB-100和6个剂量SVP-R的组合(2.5mg/kg)或载剂(n=7)。将来自小鼠的血浆稀释并与LMB-100混合。将KLM-1细胞接种在96孔板中并用血浆-免疫毒素混合物处理。72小时后,使用WST-8评估细胞生存力。将生存力曲线拟合到每个样品,并计算IC50。图5A显示了每个样品的IC50。图5B显示每个样品的滴度与IC50的相关性。方块表示来自LMB-100处理的小鼠的血浆样品,三角形显示来自LMB-100+SVP-R处理的小鼠的血浆样品。误差条显示SEM。P值是使用单向ANOVA的IC50的比较。
图6A至6D显示LMB-100与SVP-R的组合诱导特异性、可转移和调节性T细胞介导的免疫应答。图6A显示每周用LMB-100(i.v.2.5mg/kg)或LMB-100与SVP-R(2.5mg/kg,i.v)的组合注射三次的小鼠。在第4至8周,用LMB-100(i.v.)和卵清蛋白(s.c.)的每周剂量攻击小鼠。收集血浆并通过ELISA分析抗LMB-100和抗OVA抗体。对于统计分析,计算每条曲线的AUC并使用Mann-Whitney检验进行分析。误差条显示SEM,n=13。图6B显示用载剂、LMB-100、SVP-R或两者注射六次的小鼠。在第4周,分离来自供体小鼠的脾细胞并过继转移至初次接受试验的受体小鼠。向受体小鼠注射LMB-100六次。收集血浆并通过ELISA分析抗LMB-100抗体。误差条显示SEM,组合具有相同方案的两个单独实验的结果(n=5至10)。图6C显示在第1、3、5、29、31、33、43、45和47天注射LMB-100的小鼠。在第1、3和5天施用SVP-R。在第15天和第16天i.p.注射抗小鼠CD-25消耗抗体(PC61)或同种型对照。显示了第55天的滴度。图6D显示来自用LMB-100,或LMB-100和SVP-R的组合注射7次的小鼠的血浆。使用对LMB-100特异性的亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM利用夹心ELISA分析抗LMB-100同种型(n=8)。
图7显示了用于过继转移的供体小鼠中的ADA应答。用载剂、LMB-100(2.5mg/kg,i.v.)、SVP-R(2.5mg/kg,i.v.)、或LMB-100和SVP-R的组合注射小鼠6次。在最后一次注射后三天取血浆样品。
图8A至8D显示LMB-100和SVP-R优先共定位于树突细胞和巨噬细胞上。图8A显示了实验方案。i.v.单独或组合注射染料缀合的SVP-Cy5和LMB-100-Alexa488(每组n=3至4只小鼠)。在注射后2小时通过FACS分析脾细胞的染料缀合物摄取。图8B至8C显示代表性FACS图,显示巨噬细胞(F4/80+CD11b+)和树突细胞(CD11c+MHC-II+)的设门,以及设门群体的体内摄取。粗体象限表示针对每种实验条件分析的阳性细胞的百分比。图8D显示了巨噬细胞、DC、单核细胞、CD4+ T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞和CD8+ T细胞对SVP-R和LMB-100的体内摄取的总结。所有细胞的设门策略如表1所示。
图9A至9C显示注射LMB-100-Alexa 488和SVP-R-CY5后小鼠脾细胞的代表性设门策略。小鼠连续注射LMB-100-Alexa488和SVP-R-Cy5。注射后2小时,分离脾细胞,标记并在FACS CANTO II流式细胞仪上分析。图9A显示DC和巨噬细胞,图9B显示B和T细胞淋巴细胞,图9C显示嗜中性粒细胞和单核细胞。
图10A至10D显示LMB-100与SVP-R的组合在具有预先存在的针对免疫毒素特异的抗体的小鼠中诱导免疫耐受。图10A显示在第1周和第3周用LMB-100(i.v.2.5mg/kg)注射雌性BALB/c小鼠6次以诱导针对LMB-100的ADA滴度。在第10周,用LMB-100、载剂(PBS)或LMB-100+SVP-R的3个剂量攻击小鼠。LMB-100和SVP-R处理的小鼠在第12周用LMB-100的另外3个剂量进行攻击。收集血浆并通过ELISA分析LMB-100ADA。误差条显示SEM,n=7或12。图10B显示在14周的过程中用LMB-100注射12次以诱导针对LMB-100的高的ADA滴度的雌性BALB/c小鼠。在第15周,将小鼠用LMB-100或LMB-100+SVP-R进行免疫。显示了攻击前和攻击后的ADA滴度。图10C至10D显示从具有预先存在的ADA并用PBS、LMB-100、SVP-R、或LMB-100和SVP-R的组合攻击的小鼠分离的BM和脾。将BM细胞和脾细胞(100,000个细胞/孔)接种在预涂有LMB-100的ELISpot板中(n=8)。
图11A至11B显示了AB1.L9的发展。图11A显示了用人间皮素稳定转染的小鼠间皮瘤细胞系。用MN抗体和PE标记的第二抗体标记AB.1(非人间皮素转染,浅灰色)和AB1-L9(人间皮素转染,深灰色)。使用FACS检测MFI并使用FLOWJO软件分析。图11B显示用多种浓度的LMB-100孵育的AB1-L9细胞,并使用WST-8细胞计数药盒评估细胞生存力。实验以三个重复进行,误差条显示SEM。
图12A至12F显示SVP-R与LMB-100的组合恢复中和的抗肿瘤活性。图12A显示将AB1-L9细胞接种到小鼠中并如箭头所示用PBS、LMB-100或SVP-R进行处理(n=7)。图12B显示将小鼠用LMB-100免疫四次以诱导基线滴度并用AB1-L9接种。如箭头所示用载剂、LMB-100、或LMB-100和SVP-R处理小鼠。使用卡尺测量肿瘤尺寸(n=7)。图12C显示了通过ELISA分析抗LMB-100抗体的第5天和第19天的血浆。滴定以10%的信号进行插值。图12D显示了如图12C所述处理的小鼠。实验在第31天终止。Kaplan-Meyer图显示到实验终点的时间(一旦肿瘤体积大于400mm3或如果小鼠体重减轻>30%(一只小鼠))(n=7)。图12E显示在第1天接种CT26细胞并在第10天和第16天用SVP-R或载剂处理的小鼠。数值表示平均肿瘤尺寸(n=7),误差条显示SEM。图12F显示在第1天接种66C14细胞并在第10天、第12天和第14天用SVP-R或载剂处理的小鼠。数值表示平均肿瘤尺寸(n=5)。对于统计分析,计算每条曲线的AUC并使用单向ANOVA进行比较。误差条显示SEM。
图13A至13B显示了如图10A所示处理之后,荷瘤小鼠的滴度和重量。将AB1-L9细胞接种到BALB/c小鼠中。在第7天、第9天、第11天、第14天、第16天和第18天,将小鼠用PBS、LMB-100、SVP-R或后两者的组合进行处理(n=7)。误差条显示SEM。图13A显示在第19天和第24天取得的血清样品,并评估LMB-100ADA。由于低的一般滴度,因此在曲线的10%处插入滴度。图13B显示了整个免疫期间的小鼠体重。
图14显示了在如图10B所示处理之后,具有针对免疫毒素的预先存在的抗体的荷瘤小鼠的重量。显示了用LMB-100免疫四次并用AB1-L9接种后的BALB/c重量。在第5天、第7天、第9天、第12天、第14天和第16天,将小鼠用PBS或LMB-100进行处理,并且在第5天和第9天用SVP-R或载剂进行处理(n=7)。误差条显示SEM。
图15A至15D显示SVP-R增强LMB-100在人细胞系中的细胞毒活性。将KLM-1和HAY细胞接种在96孔板中,并用多种浓度的SVP-R、LMB-100或其两者进行处理。72小时后,使用WST-8或结晶紫评估细胞生存力。将生存力曲线拟合到每个样品,并计算IC 50。图15A显示两种细胞系中SVP-R的细胞毒活性。图15B显示了具有或不具有包封在SVP中的5μg/ml雷帕霉素的KLM-1细胞中LMB-100的活性。图15C显示了具有或不具有包封在SVP中的1μg/ml雷帕霉素的HAY细胞中LMB-100的活性。曲线显示六个重复的平均值,误差条显示SEM。图15D显示在HAY细胞固定并用结晶紫染色后拍摄的代表性孔图像。
图16A至16B显示检查点抑制剂抗体不会降低SVP-R活性。将BALB/c小鼠每周用LMB-100,或LMB-100和SVP-R进行免疫,进行5次(2.5mg/kg)(iv),并且每次注射后5天用抗小鼠CTLA-4拮抗剂(图16A)或抗OX-40拮抗剂(图16B)或载剂(i.p.)进行免疫。在每周的第6天收集血浆样品,并使用直接ELISA评估LMB-100ADA滴度。误差条显示SEM,n=8。分别以n=5和n=3重复这些实验,得到相似的结果。
图17显示了使用LMB-100和包含雷帕霉素的合成纳米载体对抗LMB-100抗体应答的抑制。
图18A至18D显示来自攻击前和攻击后血清样品的抗LMB-100抗体滴度。
图19显示了三个组的抗LMB-100抗体滴度(出血3)。
图20A是描绘用于检查同系肿瘤小鼠模型(BALB/c小鼠)的施用方案的示意图。图20B显示了经历图20A的方案的小鼠的肿瘤尺寸。第一行箭头(灰色)显示施用LMB-100,第二行箭头(黑色)显示施用含雷帕霉素的纳米载体。
图21显示了经历图20A的方案的小鼠的重量。第一行箭头(灰色)显示施用LMB-100,第二行箭头(黑色)显示施用含雷帕霉素的纳米载体。
图22显示了经历图20A的方案的小鼠的抗体滴度及其与肿瘤尺寸的相关性。
图23A是描述用于检查同系间皮素转基因小鼠模型的施用方案的示意图。图23B显示了经历图23A的方案的小鼠的肿瘤尺寸。第一行箭头(灰色)显示施用LMB-100,第二行箭头(黑色)显示施用含雷帕霉素的纳米载体。
图24显示了经历图23A的方案的小鼠的重量。第一行箭头(灰色)显示施用LMB-100,第二行箭头(黑色)显示施用含雷帕霉素的纳米载体。
图25显示了经历图23A的方案的小鼠的抗体滴度及其与肿瘤尺寸的相关性。
图26显示在患有间皮瘤的对象中的第1至第4周期间,第1天LMB-100输注后LMB-100的峰值血液水平。
发明详述
在详细描述本发明之前,应理解,本发明不限于特别示例的材料或工艺参数,因为其当然可以变化。还应理解,本文中使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方案的目的,并且不旨在限制使用替代术语来描述本发明。
本文中引用的所有出版物、专利和专利申请,无论是上文还是下文,均通过引用整体并入本文以用于所有目的。
除非另有明确规定,否则本说明书和所附权利要求中使用的没有数量词修饰的名词包括复数指示物。例如,提及“聚合物”包括两种或更多种这样的分子的混合物或不同分子量的单一聚合物种类的混合物,提及“合成纳米载体”包括两种或更多种这样的合成纳米载体的混合物或多种这样的合成纳米载体等。
本文中使用的术语“包括”或其变化形式如“包含”或“含有”应解读为表示包括任何所列举的整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/过程步骤或限制)或整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/过程步骤或限制)的组,但不排除任何其他的整体或整体的组。因此,本文中使用的术语“包括”是包括性的,并且不排除另外的未列举的整体或方法/过程步骤。
在本文中提供的任何一种组合物和方法的实施方案中,“包含”可以用“基本上由...组成”或“由...组成”代替。短语“基本上由...组成”本文中用于要求指定的整体或步骤以及不实质性影响要求保护之发明的特征或功能的那些。本文中使用的术语“由...组成”用于表示只存在列举的整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/加工步骤或限制)或整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/加工步骤或限制)的组。
A.引言
重组免疫毒素(Recombinant immunotoxin,rIT),例如靶向癌症的rIT,是有效的治疗剂;然而,这样的治疗剂可以是具有很强免疫原性的并且诱导免疫原性应答。免疫原性应答的特征可以是形成对rIT(例如rIT的毒素)特异的抗药物抗体(anti-drug antibody,ADA)。即使在一个治疗周期之后,ADA也可以限制这样的疗法的有效性,并且可以在患者中引起严重的超敏反应。即便不是所有患者,在大多数患者中,针对rIT的响应可以非常强烈,例如,当毒素是细菌来源时,使得治疗通常不能进展。作为一个实例,图26示出了在患有间皮瘤的对象中在周期1至4期间第1天LMB-100输注之后LMB-100的峰值血液水平。所有对象在周期1期间具有LMB-100血液水平,但是在周期2期间水平降低至一半,并且接受治疗周期3和4的患者没有具有期望的rIT血液水平。这说明当前不能使用这样的rIT(例如在多个治疗周期中),这实际上没有本文中提供之教导的益处。
为了对抗免疫原性,已经尝试了一些免疫抑制疗法,尽管没有成功。例如,图1示出了在用环磷酰胺和喷司他丁(CP/PS)、免疫抑制疗法和免疫毒素SS1(dsFv)PE38(SS1P)治疗之后数月内患者中最高的整体间皮瘤肿瘤应答。然而,重度免疫抑制治疗仅延迟了对免疫毒素的应答,免疫原性仍然限制了在大多数患者中的使用SS1P的治疗周期数。
然而,本发明人令人惊讶地发现,即使在随后缺少了使用包含本文中提供的免疫抑制剂的合成纳米载体的治疗,使用本文中提供的方法和组合物不仅延迟了、而且还可以长期地显著降低或消除不想要的免疫应答。此外,已令人惊讶地发现,可以以特异性的方式实现对rIT的耐受性,使得不会由于使用包含免疫抑制剂之合成纳米载体进行的免疫调节,而导致促进癌症生长。这些结果尚未通过免疫抑制疗法实现,例如在上文中所述和图1中所示的。
因此,本发明人做出的发现即使在随后没有给予免疫调节疗法(例如本文中提供的包含免疫抑制剂的合成纳米载体)时也可以允许用r1T进行长期和重复的治疗。本文中提供的方法和组合物可以产生瘤形成中性的致耐受性环境,使得可以长期和/或用使用rIT的多个周期治疗(例如,至少2、3、4或更多个治疗周期)降低或消除针对rIT的免疫原性并且显著改善治疗功效。
如实施例中所示,与rIT(例如LMB-100)一起施用包含免疫抑制剂(例如雷帕霉素)的合成纳米载体,即使在随后的LMB-100攻击中,在短期(例如,免疫后2至3周)和长期(例如,免疫后8周)内均有效地抑制ADA。实施例还证明了使用本文中提供的方法和组合物减小肿瘤尺寸以及用本文中提供的免疫抑制剂不促进癌症生长。有趣的是,由包含免疫抑制剂的合成纳米载体诱导的耐受性不受检查点抑制剂(免疫刺激剂)的不利影响,使得检查点抑制剂与rIT和包含免疫抑制剂的合成纳米载体的组合可以被考虑用于治疗。然而,这些结果对于三种试剂一起的组合是特异性的,由此通过检查点抑制剂不增强ADA形成,并且用该组合还证明了肿瘤尺寸减小。
此外,已令人惊讶地发现,本文中提供的方法对于已经经历针对rIT的不想要的免疫应答或之前已经暴露于rIT(例如细菌毒素)的免疫原性部分的对象可以是有效的。例如,发现施用包含免疫抑制剂(例如雷帕霉素)的合成纳米载体在甚至具有高的原始抗-LMB-100抗体滴度的小鼠中将ADA降低至1/7至1/3(稀释度>10,000)。因此,包含免疫抑制剂的合成纳米载体可以如本文中所提供的使用以减轻初次接受试验的小鼠和致敏小鼠中针对rIT的抑制性ADA的形成,导致抗肿瘤活性的恢复。因此,本文中提供的任何一种方法的对象可以是先前暴露于rIT或其免疫原性部分(例如毒素或其部分)的对象。本文中提供的任何一个对象可以是已经接受过使用rIT治疗的对象,或者可以是先前以某种其他方式暴露于rIT免疫原性部分的治疗初次接受试验的对象。通常来说,在没有本文中提供的方法和组合物的情况下,预期在这样的对象中用rIT治疗将基本上无效。
因此,本文中提供了用于治疗患有癌症的对象的方法和相关组合物,例如,如本文中提供的,通过在对象中产生瘤形成中性的致耐受性环境并向所述对象施用rIT以治疗癌症。如在其中所证明的,发现这样的方法和组合物抑制或降低不想要的免疫应答和/或提高rIT的效力。本发明人已令人惊讶和出人意料地发现上述问题和限制可以通过实施本文中公开的本发明来克服。提供了给出前述免疫原性障碍的解决方案和rIT用途(例如用于癌症治疗)的方法和组合物。
现在将在下文更详细地描述本发明。
定义
“施用”意指以药理学有用的方式向对象提供物质。该术语包括导致施用(causingto be administered)。“导致施用”意指直接或间接地导致、督促、鼓励、协助、诱导或指导另一方施用所述物质。
“有效量”是导致一种或更多种期望的应答(例如一种或更多种期望的免疫应答,包括降低针对rIT或rIT的免疫原性部分的免疫原性)的本文中提供的组合物的任何量。该量可用于体外或体内目的。对于体内目的,该量可以是临床医生认为可对有此需要的对象(例如可能由于施用rIT而经历不期望的免疫应答的对象)具有临床益处的量。在本文中提供的任一种方法中,所施用的组合物可以是本文中提供的任一种有效量。
有效量可以涉及降低不期望的免疫应答的水平,尽管在一些实施方案中,其涉及完全阻止不期望的免疫应答。有效量还可以涉及延迟不期望的免疫应答的发生。有效量也可以是导致期望的治疗终点或期望的治疗结果的量。有效量优选地导致对象针对rIT的致耐受性免疫应答。可以通过常规方法来监测前述任一项的实现。
在一个实施方案中,降低的免疫原性在对象中持续存在。在另一个实施方案中,由于根据本文中提供的方案或治疗方案施用本文中提供的组合物,降低的免疫原性产生或持续存在。当然,有效量将取决于所治疗的特定对象;病症、疾病或障碍的严重程度;个体患者参数包括年龄、身体状况、身高和体重;治疗的持续时间;并行治疗(如果有的话)的性质;具体施用途径以及在健康从业者的知识和专业之内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员公知的并且仅用常规实验就可解决。通常优选的是使用最大剂量,即根据合理医学判断的最高安全剂量。然而,本领域普通技术人员将理解,出于医学原因、心理原因或出于几乎任何其他原因,患者可坚持较低剂量或可耐受剂量。
一般来说,本发明的组合物中免疫抑制剂和/或rIT的剂量是指免疫抑制剂和/或rIT的量。或者,可以基于提供期望量的免疫抑制剂的合成纳米载体的数量来施用剂量。本文中提供的任一种方法或组合物的免疫抑制剂和/或rIT和/或合成纳米载体的任一种量可以是有效量。
“评估免疫应答”是指体外或体内免疫应答的水平(存在或不存在,降低、提高等)的任何测量或确定。这样的测量或确定可以对从对象获得的一个或更多个样品进行。这样的评估可以用本文中提供的任何方法或本领域已知的其他方法进行。评估可以是评估抗体或T细胞的数量或百分比、细胞因子产生的水平等,例如在来自对象的样品中。
除非另有说明,否则“平均(average)”是指平均值(mean)。
“伴随”意指以在时间上相关(优选地在时间上充分相关)以提供生理或免疫应答的调节的方式向对象施用两种或更多种物质/试剂,并且甚至更优选地,这两种或更多种物质/试剂组合施用。在一些实施方案中,伴随施用可涵盖在指定的时间段内(优选地在1个月内,更优选地在1周内,还更优选地在1天内,并且甚至更优选地在1小时内)施用两种或更多种组合物。在一些实施方案中,组合物可重复地伴随施用;即多于一次的伴随施用,例如可以是本文中所提供的。
在所提供的任一种方法的一些实施方案中,伴随施用是“同时的”,这意指施用是在同一时间或基本上是在同一时间,其中临床医生将考虑施用之间几乎为零或可忽略不计的任何时间对期望的治疗结果的影响。在所提供的任一种方法的一些实施方案中,同时施用在彼此5分钟或更短的时间内。
“偶联”或“偶联的”(等)意指一个实体(例如部分)与另一个实体化学地缔合。在一些实施方案中,偶联是共价的,意指偶联发生在在两个实体之间存在共价键的情况下。在非共价实施方案中,非共价偶联由非共价相互作用介导,所述非共价相互作用包括但不限于电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主客体相互作用(host-guestinteraction)、疏水相互作用、TT堆积相互作用、氢键键合相互作用、范德华相互作用、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、和/或其组合。在一些实施方案中,包封是偶联形式。
“周期”是指一种或更多种试剂的一次施用或一组施用,其中预期在一次施用或一组施用期间对对象具有一定水平的临床益处。治疗周期的结束发生在存在一段没有施用的时间的情况下,优选地,在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中,治疗周期的结束发生在存在一段在一次施用或一组施用的时间之后,在对象中没有观察到预期的另外显著临床益处的时间的情况下。在这样的实施方案中,在周期之间存在这样的时间段。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中,每个周期可以是本文中提供的施用(包括如在实施例中所述的)的任一种周期(例如,rIT和/或包含免疫抑制剂的合成纳米载体的剂量和频率)。
“产生”意指直接自身或间接地(例如但不限于通过依赖某者的言行采取行动的无关第三方)引起行动的发生。
“剂型”意指在适于施用于对象的介质、载体、载剂或装置中的药理学和/或免疫学活性物质。本文中提供的任一种组合物或剂量可以是剂型。
“剂量”是指用于以给定时间施用于对象的药理学和/或免疫学活性物质的特定量。
“包封”意指将物质的至少一部分封装在合成纳米载体中。在一些实施方案中,物质完全封装在合成纳米载体中。在另一些实施方案中,包封的物质中的大部分或全部不暴露于合成纳米载体外部的局部环境。在另一些实施方案中,不超过50%、40%、30%、20%、10%或5%(重量/重量)暴露于局部环境。包封不同于吸收,所述吸收将物质的大部分或全部置于合成纳米载体的表面上,并使物质暴露于合成纳米载体外部的局部环境。
“鉴定对象”是允许临床医生识别可受益于本文中提供的方法或组合物或所提供的一些其他指示物的对象的任何行动或一组行动。优选地,鉴定的对象是需要针对rIT的致耐受性免疫应答的对象。这样的对象包括患有或有风险患有癌症的任何对象。该行动或一组行动可以是自身直接地、或间接地进行,例如但不限于通过依赖某者的言行采取行动的无关第三方。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中,所述方法还包括鉴定需要本文中提供的组合物或方法的对象。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中,所述方法还包括鉴定需要本文中提供的瘤形成中性的致耐受性环境的对象。
“免疫检查点抑制剂”是直接或间接,部分或完全地抑制免疫检查点途径的任何分子。本公开内容的一些方面涉及以下观察:与包含免疫抑制剂的合成纳米载体和rIT的组合抑制这样的免疫检查点途径仍然可以导致与存在ADA应答的单独rIT相比针对rIT的免疫原性的降低和/或改善的治疗效力。免疫检查点途径的一些实例包括但不限于PD-1/PD-L1、CTLA4/B7-1、TIM-3、LAG3、By-He、H4、HAVCR2、1DO1、CD276和VTCN1以及单克隆抗体,例如BMS-936558/MDX-1106、BMS-936559/MDX-1105、伊匹单抗/Yervoy和替西木单抗;人源化抗体,例如CT-011和MK-3475;和融合蛋白,例如AMP-224,和实施例的抗体。
“免疫抑制剂”意指可以引起致耐受性作用的化合物,优选通过其对APC的作用。致耐受性作用通常是指APC或其他免疫细胞的调节,其以持久的方式降低、抑制或防止针对抗原的不期望免疫应答。在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中,免疫抑制剂是引起APC在一种或更多种免疫效应细胞中促进调节性表型的免疫抑制剂。例如,调节性表型的特征可以是:抑制抗原特异性CD4+ T细胞或B细胞的产生、诱导、刺激或募集;抑制抗原特异性抗体的产生,Treg细胞(例如,CD4+CD25highFoxP3+ Treg细胞)的产生、诱导、刺激或募集等。这可以是CD4+ T细胞或B细胞转化为调节性表型的结果。这也可以是在其他免疫细胞(例如CD8+ T细胞、巨噬细胞和iNKT细胞)中诱导FoxP3的结果。在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中,免疫抑制剂是在APC处理抗原之后影响APC的应答的免疫抑制剂。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中,免疫抑制剂不是干扰抗原处理的免疫抑制剂。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中,免疫抑制剂不是凋亡信号分子。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中,免疫抑制剂不是磷脂。
免疫抑制剂包括但不限于:mTOR抑制剂,例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物(即,rapalog);TGF-β信号传导剂;TGF-β受体激动剂;组蛋白脱乙酰酶抑制剂,例如曲古抑菌素A;皮质类固醇;线粒体功能抑制剂,例如鱼藤酮;P38抑制剂;NF-κβ抑制剂,例如6Bio、地塞米松、TCPA-1、IKK VII;腺苷受体激动剂;前列腺素E2激动剂(PGE2),例如米索前列醇;磷酸二酯酶抑制剂,例如磷酸二酯酶4抑制剂(PDE4),例如咯利普兰;蛋白酶体抑制剂;激酶抑制剂等。本文中使用的“Rapalog”是指在结构上与雷帕霉素(西罗莫司)(的类似物)相关的分子。Rapalog的一些实例包括但不限于坦罗莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD001)、地磷莫司(AP-23573)和佐他莫司(ABT-578)。Rapalog的一些另外的实例可见于例如WO公开WO 1998/002441和美国专利No.8,455,510,其Rapalog通过引用整体并入本文。另外的免疫抑制剂是本领域技术人员已知的,并且本发明不限于此方面。
在一些实施方案中,当与合成纳米载体偶联时,免疫抑制剂是除构成合成纳米载体结构的物质之外的要素。例如,在其中合成纳米载体由一种或更多种聚合物构成的一个实施方案中,免疫抑制剂是除一种或更多种聚合物之外并且与其偶联的化合物。作为另一个实例,在其中合成纳米载体由一种或更多种脂质构成的一个实施方案中,免疫抑制剂还是除一种或更多种脂质之外并且与其偶联的化合物。在另一个这样的实施方案中,例如在合成纳米载体的物质也导致致耐受性作用的情况下,免疫抑制剂是除导致致耐受性作用的合成纳米载体物质之外还存在的要素。
当与合成纳米载体偶联时,“负载”是基于整个合成纳米载体中物质的总干配方重量与合成纳米载体偶联的免疫抑制剂的量(重量/重量)。通常来说,这样的负载计算为合成纳米载体群的平均值。在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中,合成纳米载体的平均负载为0.1%至50%。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中,负载为0.1%至20%。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中,负载为0.1%至10%。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中,负载为1%至10%。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中,负载为7%至20%。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中,合成纳米载体群的平均负载为至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中,合成纳米载体群的平均负载为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在任一种上述实施方案的一些实施方案中,合成纳米载体群的平均负载不超过25%。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,如本领域已知的那样计算负载。
“合成纳米载体的最大尺寸”意指沿合成纳米载体的任何轴测量的纳米载体的最大尺寸。“合成纳米载体的最小尺寸”意指沿合成纳米载体的任何轴测量的合成纳米载体的最小尺寸。例如,对于球形合成纳米载体,合成纳米载体的最大尺寸和最小尺寸将基本上相同,并且将是其直径的尺寸。类似地,对于立方形合成纳米载体,合成纳米载体的最小尺寸将是其高度、宽度或长度中的最小者,而合成纳米载体的最大尺寸将是其高度、宽度或长度中的最大者。在一个实施方案中,基于样品中合成纳米载体的总数,该样品中合成纳米载体中的至少75%、优选至少80%、更优选至少90%的最小尺寸等于或大于100nm。在一个实施方案中,基于样品中合成纳米载体的总数,该样品中合成纳米载体中的至少75%、优选至少80%、更优选至少90%的最大尺寸等于或小于5μm。优选地,基于样品中合成纳米载体的总数,该样品中合成纳米载体中的至少75%、优选至少80%、更优选至少90%的最小尺寸大于110nm、更优选大于120nm、更优选大于130nm并且更优选还大于150nm。发明的合成纳米载体的最大尺寸与最小尺寸的纵横比可根据实施方案而变化。例如,合成纳米载体的最大尺寸与最小尺寸的纵横比可以是1∶1至1,000,000∶1、优选1∶1至100,000:1、更优选1∶1至10,000∶1、更优选1∶1至1000∶1、还更优选1∶1至100∶1并且还更优选1∶1至10∶1而不等。优选地,基于样品中合成纳米载体的总数,该样品中合成纳米载体中的至少75%、优选至少80%、更优选至少90%的最大尺寸等于或小于3μm、更优选等于或小于2μm、更优选等于或小于1μm、更优选等于或小于800nm、更优选等于或小于600nm并且更优选还等于或小于500nm。在一些优选的实施方案中,基于样品中合成纳米载体的总数,该样品中合成纳米载体中的至少75%、优选至少80%、更优选至少90%的最小尺寸等于或大于100nm、更优选等于或大于120nm、更优选等于或大于130nm、更优选等于或大于140nm,并且更优选还等于或大于150nm。可通过将合成纳米载体混悬在液体(通常为水性)介质中并使用动态光散射(dVnamic lightscattering,DLS)(例如,使用Brookhaven ZetaPALS仪器)来获得合成纳米载体尺寸(例如,直径)的测量。例如,可将合成纳米载体的混悬液从水性缓冲液稀释到纯水中,以实现约0.01至0.5mg/mL的最终合成纳米载体混悬液浓度。经稀释的混悬液可直接在合适的吸收池内制备或转移到合适的吸收池中用于DLS分析。然后,可以将吸收池放置在DLS中,使其平衡至受控温度,并随后基于介质黏度和样品的折射率的合适输入扫描足够的时间以获得稳定且可再现的分布。然后,可以报告有效直径或分布的平均值。合成纳米载体的“尺寸”或“大小”或“直径”意指在一些实施方案中使用动态光散射获得的粒度分布的平均值。
“表达间皮素的癌症”是指具有表达间皮素的细胞的任何癌症。间皮素通常被认为是一种40kDa的GPI连接的糖蛋白抗原,于间皮细胞表面发现并在包括以下的实体瘤上表达:与肺、胸膜、卵巢、乳腺、胃、胆管、子宫和胸腺相关的那些(Pastan等,Cancer Res.2014;74:2907-2912)。因此,表达间皮素的癌症的一些实例包括但不限于间皮瘤、胰腺腺癌、卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌和胃癌、以及上述任何一种。
“瘤形成中性的致耐受性环境”是指产生一种环境以由此降低或消除针对用于治疗癌症的rIT的不想要的免疫应答,同时免疫降低不会导致促进癌症生长。通常来说,一旦这种环境已经产生,即使单独施用rIT,也会降低或消除不想要的免疫应答。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中,产生这样的环境允许长期使用rIT的和/或包含多次施用(例如,至少2、3、4或更多次)或多个治疗周期(例如,至少2、3、4或更多个)的治疗。
“非血液系统癌症”是不在血液或骨髓中开始并且在本领域中已知的那些。这样的癌症包括但不限于脑癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、生殖系统癌、胃肠系统癌、胰腺腺癌和泌尿系统癌症、上消化道癌或结直肠癌、膀胱癌或肾细胞癌和前列腺癌。
“可药用赋形剂”或“可药用载体”意指与活性物质一起使用以配制组合物的药理学惰性物质。可药用赋形剂或载体包括本领域中已知的多种物质,包括但不限于糖类(例如葡萄糖、乳糖等)、防腐剂(例如抗微生物剂)、重构助剂、着色剂、盐水(例如磷酸缓冲盐水)和缓冲剂。
“方案”是指以一种或更多种物质向对象的任何给药方案。给药方案可包括施用的给药量、频率、速率、持续时间和/或模式。在一些实施方案中,这样的方案可用于将一种或更多种本发明的组合物施用于一个或更多个受试对象。然后可以评估这些受试对象中的免疫应答以确定该方案是否有效产生期望的免疫应答,例如针对rIT的致耐受性免疫应答。作为替代或除了上述免疫应答之外,还可以评估任何其他治疗和/或预防效果。可以使用本文中提供的或本领域已知的任何方法确定方案是否具有期望的效果。例如,可以从根据特定方案已经施用了本文中提供的组合物的对象获得细胞群,以确定特定免疫细胞、细胞因子、抗体等是否产生、活化等。用于检测免疫细胞的存在和/或数量的可用方法包括但不限于流式细胞术方法(例如,FACS)和免疫组织化学方法。用于免疫细胞标志物的特异性染色的抗体和其他结合剂是可商购的。这样的试剂盒通常包括用于多种抗原的染色试剂,其允许对来自异质细胞群的期望细胞群的基于FACS的检测、分离和/或定量。本文中提供的任一种方法可以包括确定方案和/或基于所确定的方案进行施用以具有本文中提供的任一种有益结果的步骤。
“重组免疫毒素”意指用于对象治疗(例如癌症治疗)的包含配体和毒素的化合物。在一些实施方案中,当在没有包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下向对象施用rIT时,rIT产生或预期产生不想要的免疫应答,例如针对rIT的不想要的抗体。在一些实施方案中,rIT包含抗体或其抗原结合片段和毒素。在一些实施方案中,rIT是LMB-100。在一个实施方案中,本文中提供的任一种方法或组合物的rIT是其中需要瘤形成中性环境以使对象中的治疗有效的rIT。这样的rIT通常是其中毒素具有很强免疫原性的rIT。这样的rIT包括包含细菌来源的毒素、植物毒素或毒液毒素(例如昆虫之一)的那些。另一些示例将是本领域已知的或本文中提供的。本文中提供的任一种rIT可以是本文中提供的任一种方法或组合物的rIT。
“重组免疫毒素免疫应答”是指针对rIT的任何免疫应答。通常来说,这样的免疫应答是不期望的或不想要的,并且可能干扰rIT的治疗效力。因此,免疫应答可以特异于rIT,其是指由rIT或其部分(例如毒素或其部分)的存在引起的免疫应答。通常来说,虽然这样的应答针对rIT或其部分是可测量的,但是对于其他抗原,所述应答降低或可忽略不计。在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,针对rIT或其部分的免疫应答是本文中提供的抗体免疫应答。
“类似水平”是指本领域技术人员期望为可比较的结果的应答水平。在一些实施方案中,类似应答不被认为是统计上不同的。是否产生类似应答可以用体外或体内技术确定。例如,可以通过确定体外IC50水平来确定是否产生类似水平的细胞杀伤。作为另一个实例,可以通过使rIT与96孔板中的靶细胞接触并在24至96小时之后分析来评估rIT的体外细胞毒性。可以通过确定存活细胞对3H-胸苷的摄取来完成细胞死亡的定量。可以通过使用对照细胞、用过量的未标记抗体阻断、或控制rIT来确定特异性。
作为另一个实例,是否产生类似水平的效力(例如治疗效力)可以通过多种测量这样的效力的任何指标的技术来确定。这样的指标可以在动物或临床试验对象中测量,并且根据本文中提供的方法向其施用组合物的对象可以相同或不同。例如,小鼠可以用于确定rIT对肿瘤尺寸的影响。还可以确定动物存活率。效力的另一些指标包括癌细胞数量减少、指示血清中存在癌细胞的生物标志物的水平降低、症状(例如骨痛)的发作或降低、转移的发生或提高等。用于评估效力(例如治疗效力)的指标的方法和技术是本领域已知的。
“对象”意指动物,包括温血哺乳动物,例如人和灵长类;禽类;驯养的家养或农场动物,例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪;实验动物,例如小鼠、大鼠和豚鼠;鱼;爬行动物;动物园动物和野生动物;等。
“合成纳米载体”意指在自然界中未发现并且具有至少一个小于或等于5微米大小的尺寸的离散物体。一般来说包含白蛋白纳米颗粒作为合成纳米载体,然而在某些实施方案中,合成纳米载体不包含白蛋白纳米颗粒。在一些实施方案中,合成纳米载体不包含壳聚糖。在某些另一些实施方案中,合成纳米载体不包含壳聚糖。在另一些实施方案中,发明的合成纳米载体不是基于脂质的纳米颗粒。在另外的实施方案中,发明的合成纳米载体不包含磷脂。
合成纳米载体可以是但不限于以下一种或多种:基于脂质的纳米粒(在本文中也称为脂质纳米粒,即构成其结构的大部分物质是脂质的纳米粒)、聚合物纳米粒、金属纳米粒、基于表面活性剂的乳液、树枝状聚合物、巴基球、纳米线、病毒样颗粒(即,主要由病毒结构蛋白构成但不具有感染性或感染性低的颗粒)、基于肽或蛋白质的颗粒(在本文中也称为蛋白质颗粒,即构成其结构的大部分物质是肽或蛋白质的颗粒)(例如白蛋白纳米粒)和/或使用纳米材料的组合产生的纳米粒(例如脂质-聚合物纳米粒)。合成纳米载体可以是多种不同的形状,包括但不限于球形、立方形、棱锥形、长方形、圆柱形、环形等。根据本发明的合成纳米载体包含一个或更多个表面。可适用于本发明实践的示例性合成纳米载体包括:(1)Gref等的美国专利5,543,158中公开的生物可降解纳米粒,(2)Saltzman等的公开美国专利申请20060002852的聚合物纳米粒,(3)DeSimone等的公开美国专利申请20090028910的光刻法构建的纳米粒,(4)von Andrian等的WO 2009/051837的公开内容,(5)Penades等的公开美国专利申请2008/0145441中公开的纳米粒,(6)de los Rios等的公开美国专利申请20090226525中公开的蛋白质纳米粒,(7)Sebbel等的公开美国专利申请20060222652中公开的病毒样颗粒,(8)Bachmann等的公开美国专利申请20060251677中公开的核酸偶联的病毒样颗粒,(9)WO2010047839A1或WO2009106999A2中公开的病毒样颗粒,(10)P Paolicelli等,“Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associateand Deliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6):843-853(2010)中公开的纳米沉淀纳米粒,(11)美国公开2002/0086049中公开的凋亡细胞、凋亡小体或者合成或半合成模拟物,或(12)Look等,“Nanogel-based delivery of mycophenolic acid amelioratessystemic lupus erythematosus in mice”J.Clinical Investigation 123(4):1741-1749(2013)的那些。
根据本发明的合成纳米载体具有等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的最小尺寸,不包含具有激活补体的羟基基团的表面,或者作为替代包含基本上由不是激活补体的羟基基团的部分组成的表面。在一个优选的实施方案中,最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的根据本发明的合成纳米载体不包含显著激活补体的表面,或者作为替代包含基本上由不显著激活补体的部分组成的表面。在一个更优选的实施方案中,最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的根据本发明的合成纳米载体不包含激活补体的表面或者作为替代包含基本上由不激活补体的部分组成的表面。在一些实施方案中,合成纳米载体的纵横比可大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或大于1∶10。
“治疗效力”是指治疗(例如用rIT)的任何期望效果。这样的效果包括抑制疾病(例如癌症或其症状)的发作或进展。治疗效力指标的另一些实例在本文中其他地方提供,或者对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。
C.组合物和相关方法
抗药物抗体(ADA)的开发限制了治疗(例如rIT)的有效性,并且可以在患者中引起严重的超敏反应。ADA的形成一直是例如用于癌症治疗的rIT的临床效力的限制因素。绝大多数具有免疫能力的患者在一个治疗周期之后产生中和性的抗rIT抗体,其降低了抗癌效力并且阻止进一步治疗。在暴露于毒素(例如铜绿假单胞菌的毒素)之前,是一种由此治疗初次接受试验的患者可以呈现预先存在的针对外毒素A的抗体使得甚至第一周期的rIT治疗无效的机制。本文中提供了用于降低针对这样的rIT的不想要的免疫应答的组合物和方法,由此提高rIT例如在癌症治疗中的效力。已经发现,通过产生瘤形成中性的致耐受性环境,例如通过施用包含免疫抑制剂(例如雷帕霉素)的合成纳米载体,可以降低rIT的免疫原性并且通过施用的轮次或周期提高rIT的效力(和/或甚至允许多个施用轮次或周期)。
在一些实施方案中,rIT可以靶向癌细胞,例如通过由此表达或在其上表达的抗原。癌症抗原可以与仅一种类型的癌症或其特征相关。然而,癌症抗原可以与多于一种类型的癌症或其特征相关。癌症抗原的一些实例包括但不限于间皮素、CD5、CD7、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD52、CD56、CD66、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、MAGE(黑素瘤相关的抗原)、PRAME(黑素瘤的优先表达抗原)、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、酪氨酸酶肿瘤抗原、NY-ESO-1、端粒酶、p53、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(GD2、GD3、GM等)、Lewis-Y抗原(碳水化合物抗原)、IL2R、IL4R、IL13R、TfR(转铁蛋白受体)、GM-CSFR、ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3、c-Met、IGF1R、EGFR、突变表皮生长因子受体变体III、VEGF、VEGFR、αVβ3、α5β1、GPNMB(糖蛋白非转移性黑素瘤蛋白B)、HMW-MAA(高分子量黑素瘤相关的抗原)、EphA2、EphA3、uPAR(尿激酶型纤溶酶原激活物受体)、蛋白多糖、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP和生腱蛋白。
rIT的配体可以是任何靶向分子。例如,配体可以是抗体、抗体片段,例如单链抗体,或天然配体,例如细胞因子、生长因子或肽激素(Weng等,Mol Oncol.2012,6(3):323-332)。如果靶向配体是抗体或其抗原结合片段,其可以是单克隆的或重组的,包括嵌合体或可变区片段。
本文中使用的“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(complementarity determining region,CDR)的高变区,其散布有被称为框架区(framework region,FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞))和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
本文中使用的抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或更多个部分,其保留与抗原特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。包含在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的一些实例包括:(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab’)2片段,包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546),其由VH结构域组成;以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外,尽管Fv片段的两个结构域V和VH由独立的基因编码,但是其可以使用重组方法通过合成接头连接,使得其能够作为单个蛋白质链制成,其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(single chain Fv,scFv);参见例如Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体还旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段使用常规方法获得,例如J.Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第98-118页(N.Y.Academic Press1983)中描述的蛋白水解片段化方法(其在此通过引用并入),以及通过本领域技术人员已知的其他技术。以与完整抗体相同的方式筛选片段的功用。
任何毒素可与本文中提供的配体缀合以形成rIT。在一些实施方案中,配体和毒素共价连接。毒素可来自或基于多种来源,包括植物、昆虫、脊椎动物、细菌和真菌。毒素的一些实例包括但不限于铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PE)、来自白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)的白喉毒素(diphtheria toxin,DT)、来自肥皂草(Saponaria officinalis)的皂苷、志贺氏毒素、来自相思子(Abrusprecatorius)种子的相思豆毒蛋白、香石竹毒蛋白-30、蓖麻毒蛋白-A-链(ricin-A-chain,RTA)、美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein,PAP)、多花白树毒蛋白、异株泻根毒蛋白1、加利车霉素毒素等。
在一些实施方案中,毒素是细菌来源的或基于这样的毒素,并且可以是例如细菌毒素,例如铜绿假单胞菌外毒素A(PE)、铜绿假单胞菌内毒素、白喉毒素(DT;白喉棒状杆菌)、产气荚膜梭菌肠毒素(Clostridium perfringens enterotoxin,CPE)、α毒素(例如,来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、产气荚膜梭菌或铜绿假单胞菌)、葡萄球菌肠毒素-A、α-帚曲霉素(巨曲霉(Aspergillus giganteus))、志贺氏毒素(例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)或痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae))、加利车霉素毒素(棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora))和周期调节蛋白(cyclomodulin)(例如细胞毒素坏死因子(cytotoxin necrotizing factor,CNF)。
在一些实施方案中,毒素可以是植物来源的或基于这样的毒素,并且可以是例如植物毒素,例如全毒素(例如,I类核糖体失活蛋白)或半毒素(例如,II类核糖体失活蛋白)。全毒素的一些实例包括但不限于蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、蒴莲根毒蛋白和槲寄生凝集素。半毒素的一些实例包括但不限于美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、多花白树毒蛋白、肥皂草毒蛋白、三角梅核糖体失活蛋白(bouganin)和异株泻根毒蛋白。
毒素也可以来自或基于真菌。真菌毒素的一些实例包括但不限于曲霉菌素和局限曲菌素。
在一些实施方案中,毒素是毒液毒素,并且可以是例如来自或基于昆虫毒素。可以使用的昆虫毒素的一些实例包括但不限于肥大脱粒肽(mastoparan,MP)(来自Polybiapaulista的Polybia-MP1、Polybia-MPII和Polybia-MPIII)、7,8-开环-对-铁锈酮(SPF;来自Vespa simillima)、蜂毒肽(来自Apis mellifera)和磷脂酶A2(PLA2;来自Apismellifera)。
rIT的一些实例包括本文中提供的任一种毒素(或其部分)。rIT的另外的实例包括用于治疗实体瘤的rIT以及用于治疗血液系统癌症的rIT。rIT的另外的实例包括但不限于奥英妥珠单抗奥佐米星(人源化抗CD22抗体和奥佐米星、加利车霉素)、moxetumomabpasudotox(抗CD22单克隆抗体和PE38,假单胞菌外毒素A的38kDa片段)、LMB-2(抗CD25或IL-24抗体和PE38)和VB4-845(抗-EpCAM单链抗体片段和PE38)。rIT的另一些实例包括:LMB-1、LMB-7、LMB-9、BL22/CAT-3888、SS1P(SS1(dsFv)-PE38)、DT388-IL3、HA22/CAT-8015、去糖基化的蓖麻毒蛋白A链-缀合的抗CD19/抗CD22、DT2219、D2C7-IT、A-dmDT390-bisFv(UCHT1)、AB389IL2、DT388GMCSF、RFB4-dgA、HD37-dgA、Combotox(RFB4-dgA+HD37-dgA)、RFT5-dgA(IMTOX-25)、Ki-4.dgA、HuM195/rGel、Erb38、scFv(FRP5)-ETA、SGN-10、OvB3-PE、TP40、D2C7-(scdsFv)-PE38KDEL(D2C7-IT)、MR1(Fv)-PE38(MR1)、MR1-1(FV)-PE38(MR1-1)、TGFα-PE38(TP38)、TGFa-PE40(TP40)、DAB389EGF、DT390-BiscFv806、ScFv(14E1)-ETA、抗-EGFR/LP1、IL-13PE38QQR(IL-13PE)、IL13E13K-PE38、抗-IL-13Ra2(scFv)-PE38、DT390IL13、IL4(38-37)-PE38KDEL(cpIL4-PE)、DT390-mIL4、DT390-ATF(DTAT)、DT390-IL-13-ATF(DTAT13)、EGFATFKDEL、EGFATFKDEL7mut、DTEGF13、8H9scFv-PE38、肝配蛋白A1-PE38QQR、NZ-1-(scdsFv)-PE38KDEL、DmAb14m-(scFv)-PE38KDEL(DmAb14m-IT)、和IT-87。
在一些实施方案中,rIT是具有例如与毒素(例如细菌来源的毒素(例如,铜绿假单胞菌外毒素A的结构域))共价连接的肿瘤抗原靶向抗体可变结构域(Fv)的rIT。因此,在本文中提供的任一种方法或组合物中,rIT可以是LMB-100,包含与经修饰的毒素融合的人源化Fab靶向间皮素的第二代rIT(图2A)。根据本发明的一些方面有用的另外的rIT对于本领域技术人员而言将是显而易见的,并且本发明不限于此方面。
本文中提供的方法包括施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体。通常来说,免疫抑制剂是除构成合成纳米载体结构的物质之外的要素。例如,在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中,其中合成纳米载体由一种或更多种聚合物构成,免疫抑制剂是另外的化合物,并且在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中与一种或更多种聚合物连接。在其中合成纳米载体的物质也导致致耐受性作用的实施方案中,免疫抑制剂是除导致致耐受性作用的合成纳米载体物质之外还存在的要素。
根据本发明可以使用广泛的多种其他合成纳米载体,并且在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,其与免疫抑制剂偶联。在一些实施方案中,合成纳米载体是球体或球状体。在一些实施方案中,合成纳米载体是平的或片状的。在一些实施方案中,合成纳米载体是立方体或立方体的。在一些实施方案中,合成纳米载体是卵形体或椭圆形体。在一些实施方案中,合成纳米载体是圆柱体、锥体或棱锥形体。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,期望使用在尺寸或形状方面相对均匀的合成纳米载体群,使得每个合成纳米载体具有类似的特性。例如,基于合成纳米载体的总数,所提供的任一种组合物或方法的合成纳米载体的至少80%、至少90%或至少95%可具有落在合成纳米载体的平均直径或平均尺寸的5%、10%或20%内的最小尺寸或最大尺寸。
合成纳米载体可以是实心的或中空的,并且可包含一个或更多个层。在一些实施方案中,每个层相对于另外的层具有独特的组成和独特的特性。仅给出一个实例,合成纳米载体可具有核/壳结构,其中核是一个层(例如聚合物核),并且壳是第二层(例如脂质双层或单层)。合成纳米载体可包含多个不同的层。
在一些实施方案中,合成纳米载体可任选地包含一种或更多种脂质。在一些实施方案中,合成纳米载体可包含脂质体。在一些实施方案中,合成纳米载体可包含脂质双层。在一些实施方案中,合成纳米载体可包含脂质单层。在一些实施方案中,合成纳米载体可包含胶束。在一些实施方案中,合成纳米载体可包含由脂质层(例如脂质双层、脂质单层等)包围的包含聚合物基质的核。在一些实施方案中,合成纳米载体可包含由脂质层(例如,脂质双层、脂质单层等)包围的非聚合物的核(例如,金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒、骨颗粒、病毒颗粒、蛋白质、核酸、碳水化合物等)。
在另一些实施方案中,合成纳米载体可包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中,非聚合物的合成纳米载体是非聚合物组分的聚集体,例如金属原子(例如金原子)的聚集体。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,合成纳米载体可以包含一种或更多种聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,合成纳米载体包含是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物的一种或更多种聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,构成合成纳米载体的聚合物的至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%(重量/重量)是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,构成合成纳米载体的所有聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,合成纳米载体包含一种或更多种是非甲氧基封端聚合物的聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,构成合成纳米载体的聚合物的至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%(重量/重量)是非甲氧基封端的聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,构成合成纳米载体的所有聚合物是非甲氧基封端的聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,合成纳米载体包含不含普朗尼克聚合物的一种或更多种聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,构成合成纳米载体的聚合物的至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%(重量/重量)不包含普朗尼克聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,构成合成纳米载体的所有聚合物不包含普朗尼克聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,这样的聚合物可以被包衣层(例如脂质体、脂质单层、胶束等)包围。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,合成纳米载体的要素可以与聚合物连接。
可以通过多种方法中的任一种将免疫抑制剂与合成纳米载体偶联。通常来说,连接可以是免疫抑制剂与合成纳米载体之间结合的结果。这种结合可导致免疫抑制剂与合成纳米载体的表面连接和/或被包含(包封)在合成纳米载体内。然而,在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,由于合成纳米载体的结构,免疫抑制剂被合成纳米载体包封,而不是与合成纳米载体结合。在所提供的任一种方法或组合物的一些优选的实施方案中,合成纳米载体包含本文中提供的聚合物,并且免疫抑制剂与聚合物偶联。
当由于免疫抑制剂和合成纳米载体之间的结合而发生偶联时,偶联可通过偶联部分来发生。偶联部分可以是免疫抑制剂通过其与合成纳米载体结合的任何部分。这样的部分包括共价键(例如酰胺键或酯键)以及将免疫抑制剂与合成纳米载体(共价或非共价地)结合的单独分子。这样的分子包括接头或聚合物或其单元。例如,偶联部分可以包含免疫抑制剂与其静电结合的带电聚合物。作为另一个实例,偶联部分可以包含与其共价结合的聚合物或其单元。
在所提供的任一种方法或组合物的一些优选的实施方案中,合成纳米载体包含本文中提供的聚合物。这些合成纳米载体可以是完全聚合的,或者其可以是聚合物与其他材料的混合物。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,合成纳米载体的聚合物缔合以形成聚合物基质。在所提供的任一种方法或组合物的这些实施方案的一些中,组分(例如免疫抑制剂)可以与聚合物基质的一种或更多种聚合物共价缔合。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,共价缔合由接头介导。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,组分可以与聚合物基质的一种或更多种聚合物非共价缔合。例如,在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,组分可以包封在聚合物基质内、被聚合物基质包围和/或分散在聚合物基质中。作为替代或补充,组分可通过疏水相互作用、电荷相互作用、范德华力等与聚合物基质中的一种或更多种聚合物缔合。广泛多种的聚合物和用于从其形成聚合物基质的方法是常规已知的。
聚合物可以是天然或非天然(合成)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含两种或更多种单体的共聚物。就序列而言,共聚物可以是随机的、嵌段的、或包含随机和嵌段序列的组合。通常来说,根据本发明的聚合物是有机聚合物。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚合物包括聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、或聚醚、或其单元。在所提供的任一种方法或组合物的另一些实施方案中,聚合物包含聚(乙二醇)(poly(ethylene glycol),PEG)、聚丙二醇、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、或聚己内酯、或其单元。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,优选地,聚合物是生物可降解的。因此,在所提供的任一种方法或组合物的这些实施方案中,优选地,如果聚合物包含聚醚,例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其单元,则聚合物包含聚醚和生物可降解聚合物的嵌段共聚物,使得聚合物是生物可降解的。在所提供的任一种方法或组合物的另一些实施方案中,聚合物不仅仅包含聚醚或其单元,例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其单元。
适用于本发明的聚合物的另一些实例包括但不限于聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1,3-二氧六环-2酮))、聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))、聚丙基延胡索酸酯(polypropylfumerate)、聚酰胺(例如聚己内酰胺)、聚缩醛、聚醚、聚酯(例如,聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚己内酯、聚羟基酸(例如聚(β-羟基链烷酸酯)))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、和聚胺、聚赖氨酸、聚赖氨酸-PEG共聚物和聚(乙烯亚胺)、聚(乙烯亚胺)-PEG共聚物。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,根据本发明的聚合物包括已由美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)根据21C.F.R.§177.2600批准用于人的聚合物,包括但不限于聚酯(例如,聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯、聚戊内酯、聚(1,3-二氧六环-2酮));聚酸酐(例如,聚(癸二酸酐));聚醚(例如,聚乙二醇);聚氨酯;聚甲基丙烯酸酯;聚丙烯酸酯;和聚氰基丙烯酸酯。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚合物可以是亲水的。例如,聚合物可包含阴离子基团(例如磷酸根基团、硫酸根基团、羧酸根基团);阳离子基团(例如季铵基团);或极性基团(例如,羟基基团、巯基基团、胺基基团)。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,包含亲水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生亲水性环境。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚合物可以是疏水性的。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,包含疏水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生疏水环境。聚合物的亲水性或疏水性的选择可对并入合成纳米载体内的物质的性质具有影响。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚合物可用一个或更多个部分和/或官能团进行修饰。根据本发明可使用多种部分或官能团。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚合物可用聚乙二醇(PEG)、用碳水化合物和/或用来自于多糖的非环状聚缩醛进行修饰(Papisov,2001,ACS Symposium Series,786:301)。一些实施方案可使用Gref等的美国专利No.5543158或von Andrian等的WO公开WO 2009/051837的一般教导来进行。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚合物可以是聚酯,包括包含乳酸和乙醇酸单元的共聚物,例如聚(乳酸-乙醇酸)共聚物和聚(丙交酯-乙交酯)共聚物,在本文中统称为“PLGA”;和包含乙醇酸单元的均聚物,在本文中称为“PGA”,以及包含乳酸单元的均聚物,例如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D,L-丙交酯,在本文中统称为“PLA”。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,示例性聚酯包括例如:聚羟基酸;PEG共聚物以及丙交酯和乙交酯的共聚物(例如PLA-PEG共聚物、PGA-PEG共聚物、PLGA-PEG共聚物及其衍生物)。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚酯包括例如:聚(己内酯)、聚(己内酯)-PEG共聚物、聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)共聚物、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]及其衍生物。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚酯可以是PLGA。PLGA是乳酸和乙醇酸的生物相容性和生物可降解的共聚物,并且多种形式的PLGA特征在于乳酸∶乙醇酸的比。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸或D,L-乳酸。PLGA的降解速率可以通过改变乳酸∶乙醇酸之比来调节。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,根据本发明待使用的PLGA特征在于约85∶15、约75∶25、约60∶40、约50∶50、约40∶60、约25∶75或约15∶85的乳酸∶乙醇酸之比。
在一些实施方案中,聚合物可以是带有阳离子侧链的可降解聚酯(Putnam等,1999,Macromolecules,32:3658;Barrera等,1993,J.Am.Chem.Soc.,115:11010;Kwon等,1989,Macromolecules,22:3250;Lim等,1999,J.Am.Chem.Soc.,121:5633;和Zhou等,1990,Macromolecules,23:3399)。这些聚酯的一些实例包括聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)共聚物(Barrera等,1993,J.Am.Chem.Soc.,115:11010)、聚(丝氨酸酯)(Zhou等,1990,Macromolecules,23:3399)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam等,1999,Macromolecules,32:3658;和Lim等,1999,J.Am.Chem.Soc.,121:5633)和聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam等,1999,Macromolecules,32:3658;和Lim等,1999,J.Am.Chem.Soc.,121:5633)。
这些和其他聚合物的特性及其制备方法是本领域中公知的(参见例如美国专利6,123,727;5,804,178;5,770,417;5,736,372;5,716,404;6,095,148;5,837,752;5,902,599;5,696,175;5,514,378;5,512,600;5,399,665;5,019,379;5,010,167;4,806,621;4,638,045;以及4,946,929;Wang等,2001,J.Am.Chem.Soc.,123:9480;Lim等,2001,J.Am.Chem.Soc.,123:2460;Langer,2000,Acc.Chem.Res.,33:94;Langer,1999,J.Control.Release,62:7;以及Uhrich等,1999,Chem.Rev.,99:3181)。更一般地,用于合成某些合适聚合物的多种方法描述于Concise Encyclopedia of Polymer Science andPolymeric Amines and Ammonium Salts,由Goethals编辑,Pergamon Press,1980;Principles of Polymerization,Odian,John Wiley&Sons,第四版,2004;ContemporaryPolymer Chemistry,Allcock等,Prentice-Hall,1981;Deming等,1997,Nature,390:386;以及美国专利6,506,577、6,632,922、6,686,446、和6,818,732中。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚合物可以是直链或支链聚合物。在一些实施方案中,聚合物可以是树枝状聚合物。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚合物可以基本上彼此交联。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,聚合物可以基本上没有交联。在一些实施方案中,聚合物可以无需进行交联步骤来根据本发明使用。还应理解,合成纳米载体可包含前述任一种和其他聚合物的嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物和/或加合物。本领域技术人员将理解,本文中列出的聚合物代表可根据本发明使用的聚合物的示例性而非全面性的列表。
在一些实施方案中,合成纳米载体不包含聚合物组分。在一些实施方案中,合成纳米载体可包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中,非聚合物合成纳米载体是非聚合物组分的聚集体,例如金属原子(例如金原子)的聚集体。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,本文中提供的任何免疫抑制剂可以与合成纳米载体偶联。免疫抑制剂包括但不限于:他汀类;mTOR抑制剂,例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物(rapalog);TGF-β信号传导剂;TGF-β受体激动剂;组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂;皮质类固醇;线粒体功能抑制剂,例如鱼藤酮;P38抑制剂;NF-κB抑制剂;腺苷受体激动剂;前列腺素E2激动剂;磷酸二酯酶抑制剂,例如磷酸二酯酶4抑制剂;蛋白酶体抑制剂;激酶抑制剂;G蛋白偶联受体激动剂;G蛋白偶联受体拮抗剂;糖皮质激素;类视黄醇;细胞因子抑制剂;细胞因子受体抑制剂;细胞因子受体激活剂;过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂;过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂;组蛋白脱乙酰酶抑制剂;钙调磷酸酶抑制剂;磷酸酶抑制剂和氧化的ATP。免疫抑制剂还包括IDO、维生素D3、环孢素A、芳烃受体抑制剂、白藜芦醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、阿司匹林、尼氟酸、雌三醇、雷公藤甲素(tripolide)、白介素(例如IL-1、IL-10)、环孢素A、靶向细胞因子或细胞因子受体的siRNA等。
mTOR抑制剂的一些实例包括雷帕霉素及其类似物(例如,CCL-779、RAD001、AP23573、C20-甲代烯丙基雷帕霉素(C20-Marap)、C16-(S)-丁基磺酰氨基雷帕霉素(C16-BSrap)、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素(C16-iRap)(Bayle等Chemistry&Biology 2006,13:99-107))、AZD8055、BEZ235(NVP-BEZ235)、大黄根酸(大黄酚)、地磷莫司(MK-8669)、依维莫司(RAD0001)、KU-0063794、PI-103、PP242、替西罗莫司、和WYE-354(可从Selleck,Houston,TX,USA获得)。
关于与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体,用于将组分偶联至合成纳米载体的方法可以是有用的。合成纳米载体的要素可以例如通过一个或更多个共价键与整个合成纳米载体偶联,或者可以通过一个或更多个接头连接。合成纳米载体官能化的其他方法可以修改自Saltzman等的公开美国专利申请2006/0002852、DeSimone等的公开美国专利申请2009/0028910或Murthy等的公开国际专利申请WO/2008/127532A1。
在一些实施方案中,偶联可以是共价接头。在一些实施方案中,根据本发明的免疫抑制剂可以通过由叠氮基团与包含炔基基团的免疫抑制剂的1,3-偶极环加成反应,或通过炔烃与包含叠氮基团的免疫抑制剂的1,3-偶极环加成反应所形成的1,2,3-三唑接头共价偶联至外表面。这样的环加成反应优选在Cu(I)催化剂以及合适的Cu(I)-配体和还原剂的存在下进行以将Cu(II)化合物还原为催化活性Cu(I)化合物。这种Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition,CuAAC)也可以称为点击反应。
另外地,共价偶联可包含共价接头,包括酰胺接头、二硫接头、硫醚接头、腙连接头、酰肼接头、亚胺或肟接头、脲或硫脲接头、脒接头、胺接头、和磺酰胺接头。
作为替代或补充,合成纳米载体可以通过非共价相互作用直接或间接地偶联至组分。在非共价实施方案中,非共价连接由非共价相互作用介导,所述非共价相互作用包括但不限于电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主客体相互作用、疏水相互作用、TT堆积相互作用、氢键键合相互作用、范德华相互作用、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、和/或其组合。这样的偶联可布置在合成纳米载体的外表面或内表面上。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,包封和/或吸收是偶联形式。
对于可用的缀合方法的详细描述,参见Hermanson G T“BioconjugateTechniques”,第二版,Academic Press,Inc.出版,2008。除了共价连接之外,组分可以通过吸附偶联至预先形成的合成纳米载体,或者可以在形成合成纳米载体期间通过包封偶联。
可使用本领域中已知的广泛多种方法制备合成纳米载体。例如,合成纳米载体可通过例如以下的方法形成:纳米沉淀、使用流体通道的流聚焦、喷雾干燥、单和双乳液溶剂蒸发、溶剂萃取、相分离、研磨、微乳液操作、微米制造、纳米制造、牺牲层、简单和复杂的凝聚、以及本领域普通技术人员公知的其他方法。作为替代或补充,已经描述了用于单分散半导体、传导性、磁性、有机和其他纳米材料的水性和有机溶剂合成(Pellegrino等,2005,Small,1:48;Murray等,2000,Ann.Rev.Mat.Sci.,30:545;和Trindade等,2001,Chem.Mat.,13:3843)。在文献中已经描述了另外的方法(参见例如Doubrow,编辑,“Microcapsules andNanoparticles in Medicine and Pharmacy,”CRC Press,Boca Raton,1992;Mathiowitz等,1987,J.Control.Release,5:13;Mathiowitz等,1987,Reactive Polymers,6:275;和Mathiowitz等,1988,J.Appl.Polymer Sci.,35:755;美国专利5578325和6007845;P.Paolicelli等,“Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that canEfficiently Associate and Deliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6):843-853(2010))。
可使用多种方法如所期望地将物质包封到合成纳米载体中,所述方法包括但不限于C.Astete等,“Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles”J.Biomater.Sci.Polymer Edn,第17卷,第3期,第247-289页(2006);K.Avgoustakis“Pegylated Poly(Lactide)and Poly(Lactide-Co-Glycolide)Nanoparticles:Preparation,Properties and Possible Applications in Drug Delivery”CurrentDrug Delivery1:321-333(2004);C.Reis等,“Nanoencapsulation I.Methods forpreparation of drug-loaded polymeric nanoparticles”Nanomedicine 2:8-21(2006);P.Paolicelli等,“Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that canEfficiently Associate and Deliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6):843-853(2010)。可使用适合于将物质包封到合成纳米载体中的其他方法,包括但不限于2003年10月14日授权的Unger的美国专利6,632,671中公开的方法。
在一些实施方案中,合成纳米载体通过纳米沉淀法或喷雾干燥制备。可改变用于制备合成纳米载体的条件以产生期望尺寸或特性(例如,疏水性、亲水性、外部形态、“黏性”、形状等)的颗粒。制备合成纳米载体的方法和使用的条件(例如,溶剂、温度、浓度、空气流量等)可取决于待与合成纳米载体偶联的物质和/或聚合物基质的组成。
如果通过任何上述方法制备的合成纳米载体具有在所期望范围之外的尺寸范围,则可以例如使用筛子对合成纳米载体的尺寸进行调整。
本文中提供的组合物可包含无机或有机缓冲剂(例如,磷酸、碳酸、乙酸或柠檬酸的钠盐或钾盐)和pH调节剂(例如,盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾、柠檬酸盐或乙酸盐、氨基酸及其盐)、抗氧化剂(例如,抗坏血酸、α-生育酚)、表面活性剂(例如,聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、脱氧胆酸钠)、溶液和/或冷冻/冻干稳定剂(例如,蔗糖、乳糖、甘露糖醇、海藻糖)、渗透调节剂(例如,盐或糖)、抗菌剂(例如,苯甲酸、酚、庆大霉素)、消泡剂(例如,聚二甲基硅氧烷(polydimethylsilozone))、防腐剂(例如,硫柳汞、2-苯氧基乙醇、EDTA)、聚合物稳定剂和黏度调节剂(例如,聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆488、羧甲基纤维素)和共溶剂(例如,甘油、聚乙二醇、乙醇)。
根据本发明的组合物可以包含可药用赋形剂,例如防腐剂、缓冲剂、盐水或磷酸缓冲盐水。可使用常规药物制造和复配技术制备组合物以获得可用的剂型。在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中,将组合物与防腐剂一起混悬在无菌注射用盐水溶液中。适用于实施本发明的技术可见于Handbook of Industrial Mixing:Science andPractice,Edward L.Paul,Victor A.Atiemo-Obeng,和Suzanne M.Kresta编辑,2004 JohnWiley&Sons,Inc.;和Pharmaceutics:The Science of Dosage Form Design,第2版.M.E.Auten编辑,2001,Churchill Livingstone。在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中,将组合物与防腐剂一起混悬在无菌注射用盐水溶液中。
应理解,本发明的组合物可以以任何合适的方式制备,并且本发明决不限于可以使用本文中所述的方法产生的组合物。选择合适的制造方法可需要注意相关的特定部分的特性。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,组合物在无菌条件下制备或者在最终进行灭菌。这可以确保所得组合物是无菌且非感染性的,因此当与非无菌组合物相比时提高安全性。这提供了有价值的安全措施,尤其是当接受组合物的对象具有免疫缺陷、遭受感染和/或易受感染时。
根据本发明的施用可通过多种途径进行,包括但不限于皮下、静脉内和腹膜内途径。可使用常规方法制造和制备本文中提及的组合物用于施用。
本发明的组合物可以以有效量(例如本文中所述的有效量)施用。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,在施用或不施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下进行重复多次的rIT施用周期。根据本发明,剂型的剂量可包含不同量的免疫抑制剂和/或rIT。剂型中存在的免疫抑制剂和/或rIT的量可以根据rIT、合成纳米载体和/或免疫抑制剂的性质、待实现的治疗益处和其他这样的参数而变化。在一些实施方案中,可以进行剂量范围研究以确定剂型中待存在的组分的最佳治疗量。在一些实施方案中,组分以有效产生针对rIT的致耐受性免疫应答的量存在于剂型中。在一些优选的实施方案中,例如在向对象伴随施用时,组分以有效降低针对rIT的免疫应答的量存在于剂型中。可以在对象中使用常规剂量范围研究和技术来确定有效产生期望的或降低不期望的免疫应答的组分的量。剂型可以以多种频率施用。
本发明的一些方面涉及确定本文中提供的施用方法的方案。方案可以通过改变至少rIT和/或包含免疫抑制剂的合成纳米载体的频率、剂量,并随后评估期望或不期望的免疫应答来确定。与没有施用本文中提供的包含免疫抑制剂之合成纳米载体的相同施用方法相比,用于实施本发明的优选方案降低了针对rIT的免疫应答和/或允许重复施用。方案可以包含至少rIT和/或包含免疫抑制剂的合成纳米载体的施用频率和剂量。本文中提供的任一种方法可包括确定方案的步骤或根据所确定的方案进行给药步骤以实现本文中提供的任一种或更多种期望结果。
本文中所述的组合物和方法可用于患有或有风险患有病症(例如癌症)的对象。癌症的一些实例包括但不限于乳腺癌;胆道癌;膀胱癌;脑癌,包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤;宫颈癌;绒毛膜癌;结肠癌;子宫内膜癌;食管癌;胃癌;血液系统肿瘤,包括急性淋巴细胞和髓性白血病,例如B细胞CLL;T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤;毛细胞白血病;慢性髓性白血病,多发性骨髓瘤;AIDS相关白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤;上皮内肿瘤包括鲍恩病(Bowen’s disease)和佩吉特病(Paget’s disease);肝癌;肺癌;淋巴瘤,包括霍奇金(Hodgkin’s)病和淋巴细胞性淋巴瘤;神经母细胞瘤;口腔癌,包括鳞状细胞癌;卵巢癌,包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞产生的那些;胰腺腺癌;前列腺癌;直肠癌;肉瘤,包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤;皮肤癌,包括黑素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、基底细胞癌,和鳞状细胞癌;睾丸癌,包括生殖肿瘤(germinal tumor),例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞肿瘤;甲状腺癌,包括甲状腺腺癌和髓样癌;以及肾癌,包括腺癌和肾母细胞瘤(Wilms tumor)。
本公开内容的另一方面涉及药盒。在一些实施方案中,药盒包含本文中提供的任一种或更多种组合物。在一些实施方案中,药盒包含免疫抑制剂、合成纳米载体和rIT。在一些实施方案中,药盒可还包含检查点抑制剂。在一个实施方案中,免疫抑制剂与合成纳米载体偶联。药盒的不同组分可以各自包含在药盒中的独立容器中。在一些实施方案中,容器是小瓶或安瓿。在一些实施方案中,药盒的组分包含在与容器分开的溶液中,使得组分可以在随后的时间添加至容器。在一些实施方案中,药盒的组分在独立的容器中是冻干形式,使得其可以在随后的时间重构。在一些实施方案中,药盒还包含用于偶联、重构、混合、施用等的说明书。在一些实施方案中,说明书包含本文中所述方法的描述。说明书可以是任何合适的形式,例如印刷插页或标签。在一些实施方案中,药盒还包含用于施用合成纳米载体和rIT和/或检查点抑制剂的一个或更多个注射器或其他装置。优选地,组合物是提供本文中提供的任一种或更多种剂量的量。
实施例
实施例1:包含免疫抑制剂的合成纳米载体的合成(预示性)
包含免疫抑制剂(例如雷帕霉素)的合成纳米载体可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法制备。优选地,在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中,包含免疫抑制剂的合成纳米载体通过美国公开No.US 2016/0128986 A1和美国公开No.US2016/0128987 A1中的任一种方法制备,所述的这种制备方法和所得的合成纳米载体通过引用整体并入本文。在本文中提供的任一种方法或组合物中,包含免疫抑制剂的合成纳米载体是这样并入的合成纳米载体。
实施例2:重组免疫毒素与和免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的伴随施用(预示性)
例如在与施用任一个实例中的合成纳米载体组合物相同的日期向招募用于临床试验的对象伴随施用rIT。评价了一种或更多种针对rIT的免疫应答。可通过与对象或另一组对象中的一种或更多种免疫应答的水平相比较来评价针对rIT的一种或更多种免疫应答,所述另一组对象在没有合成纳米组合物的情况下(例如当单独施用rIT时)施用rIT。在实施方案中,以类似方式评价任何施用方案。
在这些试验期间建立的信息的应用中,当预期需要rIT治疗的对象在不伴随施用合成纳米载体组合物时针对rIT具有不期望的免疫应答时,rIT和合成纳米载体组合物可以向这些对象伴随施用。在另外的实施方案中,可准备使用在试验期间建立的信息的方案,以指导需要用rIT治疗或者预期针对rIT具有不期望的免疫应答的对象的rIT和合成纳米载体的伴随剂量而没有合成纳米载体组合物的益处。如此准备的方案然后可用于治疗对象,特别是人对象。
实施例3:致耐受性合成纳米载体通过减轻免疫原性来恢复重组免疫毒素的抗肿瘤活性
免疫应答rIT是限制其针对例如具有完整免疫系统的癌症患者中的实体瘤的效力的主要因素。在此,研究了使用包封在合成纳米载体中的雷帕霉素(SVP-R)的针对rIT的抗原特异性免疫耐受性。这些纳米载体由生物可降解的聚(乳酸)片芯和表面PEG化的冠状物构成。已经证明SVP-R产生持久、特异性的且可转移的免疫耐受性,其阻止初次接受试验的小鼠中针对LMB-100的ADA形成,并且降低具有预先存在的rIT抗体的小鼠中的ADA。诱导对LMB-100的免疫耐受性使得在免疫活性小鼠的同系间皮瘤肿瘤模型中恢复其抗肿瘤活性,否则其将被ADA中和。
LMB-100与SVP-R的组合阻止ADA应答
为了评价包含雷帕霉素的合成纳米载体对响应于LMB-100的ADA的影响(图2A),每隔一周向BALB/c小鼠注射LMB-100或LMB-100+SVP-R的组合。LMB-100具有降低人而非小鼠应答的突变。注射LMB-100的小鼠对LMB-100具有强烈且快速的应答(图2B),其中在第14周时平均滴度为10,975±2372,表明LMB-100在BALB/c小鼠中具有免疫原性。
所有注射LMB-100+SVP-R的小鼠在整个实验过程中具有不可检测的滴度,表明有效阻止ADA形成。此外,用LMB-100注射7次并且仅伴随前三次注射给予SVP-R的小鼠在第14周时的平均滴度仅为371±301,表明免疫耐受性的诱导。该滴度显著低于在第8周(p=0.03),仅4个剂量之后,和第14周(p=0.0006),7个剂量之后单独用LMB-100处理的对照小鼠的滴度。计算整个实验中每只小鼠的曲线下面积(AUC)以比较ADA应答(图3A)并显示出给予三个剂量(p=0.001)或七个剂量(p=0002)的SVP-R的小鼠中的显著降低。小鼠良好地耐受治疗,没有显著的体重减轻(图3B)。
SVP-R免疫的时机对于免疫耐受性是重要的
为了确定SVP-R与和患者中所使用的相类似的LMB-100方案一起的效力,用连续的周期的LMB-100处理小鼠。每个周期由每隔一周每周三个剂量(QODx3)组成,并且在第一和第二周期期间向小鼠注射SVP-R一次、两次或三次(图2C)。发现每个周期单剂量的SVP-R与三个剂量在阻止ADA形成中一样有效(p=0.003)。在两个治疗周期后,单独接受LMB-100的小鼠的中位数滴度为47,926,而用LMB-100+SVP-R分别进行免疫2、4或6次的小鼠的中位数滴度仅为881、1958和993。当在没有进一步SVP-R处理的情况下用另外三个周期的LMB-100攻击小鼠时,也维持了ADA抑制。小鼠良好地耐受六个剂量的LMB-100+SVP-R,没有显著的体重减轻(图3C)。
通过错开SVP-R注射的日期来评价SVP-R治疗的时机的影响。在5个周期的每一个中的第1、3和5天注射LMB-100,并在每个周期的第1天、第3天、第1+3天、第3+5天或第1+3+5天共同施用SVP-R(图2D)。在五个治疗周期结束时,用LMB-100处理的对照小鼠显示出平均滴度为44,132。相比之下,在第1天接受SVP-R的小鼠,无论它们在每个周期中是否接受一个、两个或三个SVP-R剂量,都显示出ADA形成的显著降低,其中平均滴度分别为1,413±495(p=0.0007)、2,952±1,320(p=0.001)和1,979±807(p=0.0007)。在第3天或第3+5天接受SVP-R的小鼠的最终滴度分别为29,34l±11,705和41,934±9,725,表明在每个周期的第一天与SVP-R的共同治疗对于阻止ADA形成是重要的。
还用更高免疫原性的LMB-100前体SS1P评价SVP-R。在第1、3和7天向小鼠注射三个剂量的SS1P(图4),并在第1天给予SVP-R。三个周期的SS1P诱导平均ADA滴度为37,734±21,748,并且SVP-R的单个周期完全阻止这些ADA(p=0.0001)。
ADA应答是中和性的并靶向Fab和毒素二者
为了检测ADA是否可以中和免疫毒素,使用来自注射LMB-100(15个剂量)、LMB-100(15个剂量)与SVP-R(6个剂量)或载剂的小鼠的血浆样品进行功能性体外中和测定。将血浆样品与多种浓度的LMB-100混合并添加至KLM-1人胰腺细胞。所述细胞对LMB-100非常敏感,IC50为1.1ng/ml(图2E)。来自单独用LMB-100免疫的小鼠的血浆抑制LMB-100的活性并使IC50改变至93.2ng/ml(p<0.0001),表明ADA是中和性的。相比之下,LMB-100与血浆LMB-100+SVP-R的孵育显示出低50倍的IC50(p<0.0001),并且与用来自载剂处理小鼠的血浆孵育的LMB-100的IC50没有显著差异(图5A)。观察到抗LMB-100滴度与IC50之间的强相关性(R2=0.96)(图5B)。
为了确定针对LMB-100的ADA是否靶向Fab、毒素片段或二者,在板上对来自用单独或与SVP-R组合的每周5个剂量的LMB-100注射的小鼠的血浆(n=8)进行测定,所述板包被有LMB-100、人Fab或免疫毒素(抗TacFv-PE24),所述免疫毒素包含与小鼠Fv融合的与LMB-100中所发现的相同的外毒素A(PE24)的结构域III。抗LMB-100血浆与免疫毒素的两种组分反应(图2F)。如所预期的那样,SVP-R降低了对两种组分的应答。
LMB-100与SVP-R的组合诱导特异性和可转移的免疫耐受性
为了确定ADA形成的抑制是否是抗原特异性免疫耐受性而不是慢性免疫抑制的结果,在第1、2、3周用每周注射8次LMB-100和3个剂量的SVP-R(i.v.)来免疫小鼠。在第4周,用每周四次注射卵清蛋白和LMB-100(s.c.)来攻击小鼠(图6A)。LMB.100+SVP-R的组合选择性地抑制针对LMB-100的ADA形成,但不影响对卵清蛋白的抗体应答,结果是相似的抗卵清蛋白滴度:4,362和4,024。这些结果表明LMB-100与SVP-R的组合诱导了特异性免疫耐受性,其不抑制小鼠对之后施用的另外的抗原产生免疫应答的能力。
为了测试免疫耐受性是否可以从耐受小鼠转移至初次接受试验的小鼠,用LMB-100、SVP-R或LMB-100+SVP-R处理供体小鼠两个周期。单独用LMB-100免疫的小鼠显示出平均滴度为4521±1994,而用LMB-100+SVP-R处理的小鼠的平均滴度为51±25(图7)。将脾细胞分离,合并并转移至初次接受试验的受体小鼠(图6B)。细胞注射之后一周,用两个周期的LMB-100攻击所有受体小鼠。过继转移来自用LMB-100免疫的小鼠的细胞随后LMB-100攻击受体小鼠诱导平均滴度为4884±1548,这与从载剂处理小鼠中接受细胞或者不接受细胞的小鼠的滴度没有显著差异(平均滴度分别为4571±1494和6541±3079)。过继转移不会诱导大量的免疫记忆。因为这三组小鼠具有相似的平均滴度,所以将这些小鼠称为对照。
相比之下,与对照组相比,过继转移来自用LMB-100+SVP-R的组合免疫的小鼠的10×106个脾细胞使滴度降低了78%至85%(分别p=0.007、0.003和0.02)。过继转移2.5x106个脾细胞使滴度降低44%至61%,但无统计学意义(p=0.5)。接受来自SVP-R处理小鼠的脾细胞的小鼠的平均滴度与对照小鼠没有差异,表明耐受性诱导需要供体小鼠中的LMB-100和SVP-R二者,并且不是由于一般的免疫抑制。
Treg细胞的清除
为了研究Treg细胞在SVP-R诱导的免疫耐受性中的作用,在SVP-R耐受性诱导之后在体内将Treg细胞清除。向小鼠注射LMB-100或LMB-100+SVP-R三次。在第15天和第16天,使用抗CD25(PC61)清除抗体23将Treg细胞清除,并用另外两个周期的LMB-100进行攻击(图6C)。Treg的清除消除了SVP-R的致耐受性作用,使平均滴度从416±157提高至1094±304(p=0.04)。该滴度1094与未接受SVP-R的小鼠中的滴度(1348±399)相似。
Ig亚类
为了研究SVP-R对类别转换的影响,针对LMB-100特异性IgG和IgM抗体来表征血浆样品(图6D)。用LMB-100诱导的ADA的免疫分布在所有IgG亚类中,其中IgG1是最主要的。该亚类分布类似于先前描述的用亲本免疫毒素SS1P免疫之后的IgG亚类分布24。用LMB-100+SVP-R的免疫诱导了LMB-100特异性IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3抗体的不可检测信号。有趣的是,抗LMB-100IgM抗体的水平与单独用LMB-100免疫的小鼠中的水平相似。这些结果表明SVP-R阻止同种型转换但不阻止IgM产生。
LMB-100与SVP-R优先共定位于树突细胞和巨噬细胞上
为了确定脾中SVP-R和LMB-100的命运,在体内注射之后,连续注射Alexa-488标记的LMB-100和Cy5标记的SVP-R,并在注射之后2小时分离脾细胞(图8A)。根据所示的设门策略,使用细胞标志物分析细胞表型。在巨噬细胞、DC、CD4+和CD8+ T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞中比较了LMB-100和SVP-R的摄取(图8B-8D)。发现巨噬细胞和DC对LMB-100和SVP-R二者的摄取最高;38%的巨噬细胞和13%的DC对LMB-100呈阳性,29%的巨噬细胞和11%的DC对SVP-R呈阳性。有趣的是,22%的巨噬细胞和9%的DC对于二者染色呈阳性。即使两种药剂分别注射,也会发生这种共定位。相对细胞数没有改变(表1)。表达CD1lb高、Ly6C+和Ly6G-的单核细胞参与免疫抑制活性25,26。发现3%的这些细胞显示出摄取LMB-100和SVP-R二者。最后,淋巴细胞和中性粒细胞显示出最低的共定位百分比(图8D)。这些结果一起表明通过专职抗原呈递细胞的SVP-R和LMB-100优先摄取可以介导免疫耐受性。
表1.注射LMB-100和包含雷帕霉素的合成纳米载体之后2小时脾中的细胞性质
LMB-100与SVP-R的组合阻止具有预先存在的抗体的小鼠中的ADA应答
为了确定SVP-R是否可以降低具有针对rIT的预先存在的ADA的小鼠中的免疫原性并诱导免疫耐受性,在第1至3周期间用LMB-100免疫小鼠六次以诱导预先存在的ADA。在第9周,小鼠的平均滴度为741±66,并将其分成具有相似平均滴度的三组。在第10周,用载剂(PBS)、LMB-100或LMB-100+SVP-R来免疫这些组。在第12周评价滴度。单独用LMB-100攻击诱导强记忆免疫应答,结果是平均ADA滴度为9808±3608。相比之下,用LMB-100+SVP-R攻击不仅可以阻止抗体增加,而且在第12周时与加强前滴度(738±320,p=0.003)相比和与注射PBS的小鼠(滴度=502±143,p=0.002)相比滴度降低(滴度=257±121)。在用8、8和4只小鼠的组进行的另外三个实验中观察到该应答。
为了评价SVP-R是否可以在这些小鼠中诱导可以阻止对之后攻击的应答的持久的免疫耐受性,在第13周用另外3个剂量的LMB-100(无SVP-R)攻击小鼠(图10A)。在第14周的滴度评价显示,在第10周施用LMB-100+SVP-R维持了634±269的低滴度,其显著低于单独用LMB-100治疗的小鼠的滴度(11505±4172,p=0.0001)。这表明在第10周SVP-R+LMB-100组合诱导了免疫耐受性,这阻止了对之后LMB-100攻击的应答。
接下来,评价了SVP-R是否也可用于降低预先存在的rIT抗体的高滴度。用LMB-100或LMB-100+SVP-R注射来自图I0A的对照小鼠,所述小鼠具有由在14周的过程中的12个剂量的LMB-100诱导的>10,000的抗LMB-100抗体滴度(图10B)。用组合处理的小鼠的滴度从31,114±13,730显著降低至7,797±4,558(p=0.02)。
为了确定用组合处理具有预先存在的抗体的小鼠是否影响骨髓(BM)中抗体分泌浆细胞的数量,用预先存在的rIT抗体和PBS、LMB-100、SVP-R或二者的组合处理小鼠。注射之后24小时从BM和脾中收集细胞,并通过ELISpot测定产生抗LMB-100抗体的细胞数(图10C-10D)。所有小鼠在BM中具有相似数量的抗体分泌细胞(平均值=9.6±6.7SFC/1E6细胞)并且在它们的脾中没有可检测的点。这些结果表明SVP-R不影响存在于BM中的抗体分泌浆细胞。
LMB-100与SVP-R的组合恢复具有预先存在的抗LMB-100抗体的小鼠中的LMB-100的抗肿瘤活性
为了研究LMB-100和SVP-R在免疫活性荷瘤小鼠中的活性,用人间皮素稳定转染AB-1小鼠间皮瘤细胞系27(AB1-L9,图11A-11B)。接种至BALB/c小鼠中的AB1-L9细胞迅速生长,在15天内尺寸达到600mm3(图12A)。为了评价抗肿瘤活性,当肿瘤的平均尺寸达到199mm3时,用LMB-100、SVP-R或二者的组合对荷瘤小鼠进行六次治疗性治疗。用LMB-100处理的小鼠(黑线)显示出显著的肿瘤生长抑制(相较于PBS处理小鼠,对于肿瘤生长曲线的AUC,p=0.003),其中1/7小鼠达到完全缓解。用SVP-R处理的小鼠仅显示出轻微的肿瘤生长延迟(p=0.05)。然而,LMB-100+SVP-R诱导了最显著的肿瘤生长抑制(p=0.0003),结果是在第20天肿瘤尺寸降低13倍。由于免疫接种时间表相对较短,当在实验的第18天进行评价时,所有小鼠的滴度都非常低或检测不到(图13A),因此未观察到LMB-100的显著体内中和。
为了研究LMB-100和SVP-R在具有预先存在的rIT抗体的小鼠中的活性,首先用LMB-100免疫小鼠四次以诱导平均基线滴度2597±2080,随后用AB1-L9接种。在肿瘤接种之后5天,当肿瘤达到135mm3的平均值时,在每个周期(每隔一周)的第一天施用或不施用SVP-R的情况下,用三次注射LMB-100或载剂(图12B)的两个周期治疗小鼠。发现单独用LMB-100处理的肿瘤对治疗没有应答,并且具有与PBS处理的肿瘤相似的生长速率。缺乏对LMB-100的应答归因于高ADA滴度(图12C),其中和了LMB-100的活性。相比之下,用SVP-R+LMB-100处理的小鼠对LMB-100具有优异的应答,并且没有产生高ADA滴度。LMB-100+SVP-R处理的小鼠具有更高的存活率(达到600mm3的时间更长)(p=0.0001)(图12D)。使用每组7只小鼠重复这些实验两次,得到相似的结果。然而,用LMB-100+SVP-R处理的小鼠显示体重减轻,这可能是由于阻止中和ADA导致LMB-100暴露提高(图14)。
SVP-R不会使肿瘤生长速率加快
为了测试用SVP-R治疗小鼠是否干扰肿瘤免疫和/或增强肿瘤生长,将CT26(鼠结肠癌)和66C14(鼠乳腺癌)细胞系接种在免疫活性BALB/c小鼠的侧腹并将SVP-R处理小鼠的生长速率与PBS处理小鼠的生长速率进行比较(图12E-12F)。SVP-R延迟肿瘤CT-26肿瘤生长,并且显示出66C14肿瘤中的肿瘤生长没有变化。
SVP-R增强LMB-100在人细胞系中的细胞毒活性
因为据报道雷帕霉素具有抗肿瘤活性,所以测量了组合对人间皮瘤细胞(HAY)和人胰腺细胞(KLM-1)的体外细胞毒活性。发现SVP-R本身在两种细胞系中都具有适度的细胞毒活性(图15A)。然而,当与LMB-100组合时,5μg/ml的SVP-R改善了LMB-100的细胞毒活性,使对于KLM-1细胞的IC50从1.1ng/ml改变至0.1ng/ml(图15B),并且对于HAY细胞,1μg/ml的SVP-R使IC50从2.9ng/ml改善至0.9ng/ml(图15C)。通过用SVP-R(2μg/ml)和LMB-100(0.4ng/ml)孵育72小时,随后在没有药物的情况下孵育72小时之后用结晶紫染色来评价HAY细胞生存力(图15D)。组合在杀伤细胞方面比单独使用任一种药物更有效。
检查点抑制剂或共刺激激动剂不会降低SVP-R活性
研究了抗CTLA-4拮抗剂抗体和抗OX-40激动剂抗体是否能增强针对LMB-100的ADA的形成,以及这些ADA是否可以被SVP-R阻断。在每周的第五天向小鼠注射每周5个剂量的LMB-100和抗小鼠CTLA-4抗体或抗OX-40抗体(图16A-16B),n=8。发现与单独用LMB-100处理相比,两种抗体显著提高了抗LMB-100ADA滴度的形成(对于抗CTLA-4和抗OX-40,分别为p=0.001和p=0.02)。在与LMB-100相同的日期注射SVP-R的结果是分别用抗CTLA-4或抗OX-40处理的小鼠中的滴度的消除(平均滴度低于检测限)或滴度显著降低12倍。SVP-R活性不受免疫检查点抑制剂或共刺激激动剂的活性的影响。这些实验再重复两次,其中n=5,n=3,具有相似的结果。
免疫抑制与耐受
先前的研究已经评价了数种降低患者中rIT的免疫原性的免疫抑制方法。这些方法包括使用对于阻止患者中的抗免疫毒素免疫应答无效的利妥昔单抗清除B细胞28,以及使用环磷酰胺和喷司他丁的组合抑制B和T细胞14。这种方法的成功受到免疫抑制剂毒性的限制,并且尽管一些患者具有延迟的ADA形成,但大多数患者发生了强烈的ADA应答,停止了治疗。
免疫耐受机理
在该研究中,证明了SVP-R特异性靶向专职吞噬细胞,例如巨噬细胞和DC以及较小程度上的单核细胞。这与一般免疫抑制治疗不同。发现LMB-100特异性靶向专职吞噬细胞并与SVP-R共定位(图8)。在清除Treg后消除了耐受性(图6C),支持了由Treg细胞介导的骨髓细胞耐受机理。此外,虽然SVP-R有效地抑制了IgG抗体应答,但观察到特异性IgM抗体未被SVP-R抑制(图6D)。这也支持了Treg介导的机理。
免疫抑制和耐受之间的主要区别是能够针对其他抗原产生免疫应答。发现通过注射LMB-100和SVP-R而耐受的小鼠对皮下注射的第二抗原产生免疫应答(图6A)。即使LMB-100和第二免疫原在攻击阶段期间同时、同剂量和同频率施用,小鼠对第二免疫原而不是LMB-100具有免疫应答的事实也表明诱导对LMB-100的特异性耐受性而非对免疫系统的全面抑制。免疫抑制通常由药物介导,其在治疗停止后对免疫系统没有持久影响。另一方面,免疫耐受性涉及诱导调节细胞,其在没有药物的情况下积极维持耐受性。发现对分离自用LMB-100和SVP-R的组合处理的小鼠的脾细胞(图6B)进行转移阻止了初次接受试验的受体小鼠中的ADA形成。总之,数据表明LMB-100与SVP-R的组合诱导了免疫耐受性。
预先存在的抗体模型中的活性
本发现表明,SVP-R不仅有效控制抗LMB-100滴度的加强,而且实际上证明了用rIT与SVP-R组合的显著延长的耐受性(图10A-10D)。因此,本文中提供的方法和组合物可用于具有预先存在的rIT抗体的患者(甚至可能用于参与先前用SS1P、LMB-100或MoxetumomabPasudotox进行的临床试验的患者)。这些试验中的许多患者最初对免疫毒素治疗有应答,但由于ADA形成,应答停止7,30。
雷帕霉素和癌症
mTOR信号传导网络包含许多肿瘤抑制基因和原癌基因,包括PTEN、PIK3和AKT(综述于32)。在此,发现SVP-R改善了免疫毒素的细胞毒性和抗肿瘤活性(图12A和15A-15D)。在肿瘤部位处雷帕霉素从合成纳米载体中的释放可以与靶免疫毒素协同作用。
SVP-R不影响肿瘤免疫原性
重要的是,单独的SVP-R不会引起免疫活性小鼠中的肿瘤生长得更快(图12A,12E-12F)。这些观察结果减轻了SVP-R诱导针对肿瘤的耐受性或使肿瘤生长更快的潜在安全性问题。
与检查点抑制剂的三重组合
评价了抗CTLA-4和抗OX-40抗体对针对LMB-100的ADA形成的起始和强度的作用,以及SVP-R阻止这些应答的能力。发现抗CTLA-4检查点抑制和抗OX40共刺激激动剂加速并加强了LMB-100 ADA的形成(图16A-16B)。重要的是,在注射LMB-100当天给予的SVP-R完全消除了这些恶化的免疫原性应答。这些免疫刺激性mAb不损害SVP-R的致耐受性活性的事实表明,在如本文中所提供的组合治疗的背景下,致耐受性信号不会被这些免疫治疗性抗体所覆盖。
材料和方法
LMB-100和SVP-R
LMB-100如前所述制造41。通过如前所述制备SVP-R,其中雷帕霉素含量为500μg/ml19。
动物实验
使用雌性BALB/cAnNCr小鼠(8至14周龄)。除非另有说明,否则向小鼠静脉内注射抗原和SVP-R。按照每个实验中指出的时间表注射小鼠(在SVP-R之后5分钟注射rIT)并通过下颌取血收集血浆样品。每周测量小鼠体重。用年龄匹配的对照组进行所有小鼠研究。
对于肿瘤实验,向雌性BALB/c的侧腹接种RPMI中的1x106个AB1-L9细胞或1x106个CT26细胞(ATCC),或向其乳腺垫中接种IMDM培养基中的0.5×106个66C14细胞。每2或3天使用卡尺测量肿瘤尺寸。如果小鼠的肿瘤负荷超过10%体重,则对小鼠实施安乐死。没有动物被排除在统计分析之外37。
如前所述23,通过腹膜内(i.p.)注射200μg抗小鼠CD25清除抗体(克隆PC61)或同种型对照(克隆TNP6A7)(均购自BioXcell)进行Treg细胞的清除。
提供抗CTLA-4(Roche IgG2A,克隆9D9),并购买了抗OX40(克隆OX-86,InVivoPlus,BioXcell)。将抗体在PBS中稀释,并如在指定的时间表中那样i.p.注射5mg/kg抗体。
同系小鼠模型的开发
将细胞皮下(s.c.)接种至免疫活性BALB/c小鼠的侧腹中。然而,只有50%的肿瘤生长,可能是由于人转基因的免疫排斥。一旦在一些小鼠中肿瘤体积达到200mm3,切除肿瘤,将其消化并克隆至96孔板中,用嘌呤霉素进行选择。获得15个单克隆并评价具有最高GeoMean值的克隆(图13A)在小鼠中的生长,其中>95%植入成功。
通过用LMB-100处理细胞并在72小时之后使用WST-8细胞计数试剂盒评价它们的生存力来评价AB1-L9细胞的细胞毒活性(图13B)。发现LMB-100杀伤AB1-L9,IC50为10.6ng/ml。
细胞毒性和中和测定
提供了KLM1胰腺细胞系(NCI,Bethesda,MD)。HAY间皮瘤细胞由Stehlin癌症研究基金会(Stehlin Foundation for Cancer Research,Houston,TX)提供。细胞在补充有10%FCS,1%L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI培养基中培养。将细胞接种在96孔平底板中(5,000个细胞/孔)24小时。用多种浓度的LMB-100、SVP-R或二者一式四份处理细胞。72小时后,根据制造商的说明书使用WST细胞生存力测定法(Dojindo MolecularTechnologies Inc.)评价细胞生存力。在光密度(O.D.)450nm下评价颜色变化。O.D读数归一化为0至100%生存力。百分之百的生存力代表没有治疗,0%代表星形孢菌素(Sigma-Aldrich)阳性对照。
如前所述42使用KLM1细胞进行中和测定。将来自21只小鼠的血清样品以1∶50稀释。
ELISA
总Ig抗LMB-100和抗Ova抗体:将血浆样品收集至肝素化管中,旋转并冷冻直至滴度评价。如前所述42,通过直接ELISA测量总Ig抗LMB-100和抗Ova抗体。
抗LMB-100和总Ig的同种型测定:用2ug/ml的LMB-100或多克隆驴抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research Laboratories,Inc.)包被ELISA板(Thermo Fisher)。将板封闭并将血浆的连续稀释液孵育1小时。血浆中捕获的抗体分别被山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM同种型试剂盒(Sigma)以1∶3,000、1∶4,000、1∶4,000、1∶3000和1∶16,000的稀释度结合,使用抗山羊IgG(H+L)HRP(1∶15,000)(Jackson Immuno ResearchLaboratories,Inc.)进行检测。
针对Fab或毒素片段的ADA:ELISA板用2μg/ml的LMB-100的Fab部分或2μg/ml的含有鼠scFv的RIT包被,所述鼠scFv靶向与LMB-100的去免疫毒素片段连接的无关表位(抗Tac)。如上所述进行ADA测定。添加H2SO4终止溶液之后,立即在波长450nm下读取孔的O.D.,同时减去650nm下的读数。基于四参数逻辑曲线拟合图计算滴度,并在抗LMB-100(IP12)15或抗Ova(克隆TOSG1C6 Biolegend)标准曲线的半最大值上插值。
用人间皮素转染细胞系和肿瘤接种
根据制造商的方案,通过Lipofectamine LTX/PLUS试剂(Invitrogen)用人间皮素cDNA37稳定转染AB-1小鼠间皮瘤细胞系(Sigma)。通过FACS将转染的细胞分选三次以获得前5%高表达细胞。然后从分选细胞群中分离LMB-100/SS1P敏感性单克隆。将100μl PBS中的克隆AB1-L9(5×106)接种于BALB/c小鼠中。当肿瘤体积达到200mm3时,切除肿瘤。如前所述43制备消化的肿瘤。为了制备AB1-L9细胞的单克隆,将消化的肿瘤稀释(0.5个细胞/100μl)并在含有选择试剂的96孔培养皿中等分100μl。获得15个单克隆,并选择具有最高GeoMean值的克隆。将最终克隆皮下注射至BALB/c小鼠中,证实超过95%的肿瘤在BALB/c小鼠中生长。
B细胞ELISpot
从8只免疫小鼠的股骨中提取基膜(Basement membrane,BM)。洗涤BM,通过70mm筛网过滤并用激光照射以除去RBC。将细胞重悬在温热的补充有热灭活的FCS,1%L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI中。将PVDF板(0.45um)(Mabtech)用2μg/ml的LMB-100包被18小时,洗涤并用测定培养基在37℃下封闭2小时。将每个BM样品以100,000个细胞/孔的浓度一式六份接种并孵育4小时。使用捕获抗小鼠Ig生物素化抗体(Mabtech)随后使用ALP和BCIP/NTP底物(KPL)来检测指示抗LMB-100抗体分泌B细胞的点。
通过计算机辅助图像分析(Immunospot5.0;Cellular Technology Limited)对点进行计数。结果显示在SFC/1E6细胞中。
流式细胞术
对来自用Alexa 488标记的LMB-100、Cy5标记的SVP-R或二者免疫的小鼠或者未处理的小鼠的脾进行解剖。通过向脾中注射3ml补充有释放酶(Roche)、DNAas(Roche)和胶原酶(Roche)的培养基,随后在37℃下孵育10分钟来提取脾细胞。将脾切碎,通过70mm筛网,洗涤并裂解RBC。通过台盼蓝,所有细胞>90%有生存力。如前所述44,将细胞固定,洗涤,并使用从Biolegend获得的以下抗体对细胞进行染色:CD3(克隆17A2)、CD4(克隆GK1.5)、CD8(克隆53-5.8)、CD19(克隆6D5)、B220(克隆RA3,6B2)、CD11c(克隆N418)、IAIE(克隆M5/114.15.2)、CD11b(克隆M1/70,),Ly6G(克隆1A85)和Ly6C(克隆HK1.4)。在FACS CANTO II流式细胞仪(BD Bioscience)上收集数据,并用FLOWJO X版本(Treestar)进行分析。
统计分析
使用Graph Pad Prism计算统计分析并绘图。对于参数变量的多重比较,使用单因素方差分析(ANOVA)。对于两个非参数变量的比较,使用Mann-Whitney,并且对于多个非参数变量,使用具有Dunn’s多重比较的Friedman检验。
实施例4:含雷帕霉素的纳米载体阻止长期LMB-100免疫原性
如图17所示,施用LMB-100和包含雷帕霉素的合成纳米载体二者抑制了抗LMB-100抗体应答。另外且重要的是,与PBS相比,包含雷帕霉素的合成纳米载体不增强肿瘤生长(图12F)。
为了评价LMB-100和含雷帕霉素的纳米载体组合在阻止长期记忆回忆应答中的有效性,提高了初始免疫应答与LMB-100和包含雷帕霉素的纳米载体攻击之间的时间。根据以下时间表处理雌性免疫活性BALB/c小鼠(表2):
表2
每组中有8只小鼠。剂量为50μg/mL LMB-100和100μL含雷帕霉素的纳米载体(静脉内,首先注射纳米载体)。从血液样品中分离血清并通过ELISA分析抗LMB-100抗体。分析来自第二次取血的血清的抗LMB-100抗体,然后将小鼠分组,使得每组在第11周处理之前具有相似的平均抗LMB-100抗体滴度。
对攻击前后的血清样本进行分析;结果如图18A-18D和19所示。在初次免疫之后的8周内,抗LMB-100抗体滴度没有下降。在第1组中,与攻击前滴度(第2次取血)相比,用LMB-100和含雷帕霉素的纳米载体的攻击显著降低了抗LMB-100抗体滴度(第3次取血)(Mann-Whitney检验,p<0.005)。发现PBS攻击对抗体滴度没有影响(Mann-Whitney检验,p>0.05)。此外,与PBS攻击和LMB-100攻击的对照相比,用LMB-100和含雷帕霉素的纳米载体的攻击显著降低了抗LMB-100抗体滴度(Mann-Whitney检验,p<0.005)。
实施例5:同系肿瘤小鼠模型
根据图20A和23A中所示的时间表,对两种小鼠模型即BALB/c和在其基因组和一些细胞中表达人间皮素的转基因小鼠进行免疫。首先研究了预先存在的抗体同系BALB/c小鼠模型(图20A)。结果(图20B)显示LMB-100对AB-1细胞具有良好的抗肿瘤活性,而预先存在的抗体诱导了对LMB-100的显著的中和作用,导致效力丧失。LMB-100与含雷帕霉素的纳米载体(1mg/mL,在50μL注射体积中)一起施用可阻止ADA的形成,从而显著恢复抗肿瘤活性。然而,该方案导致对象体重减轻(图21)。
关于抗体滴度(图22),所有三组在第5天以相似的平均滴度开始。在六个剂量的LMB-100后,滴度提高了500倍。重要的是,LMB-100(六次)和含雷帕霉素的纳米载体(两次)的组合没有引起滴度的显著变化,这类似于载剂对照组中观察到的结果。观察到滴度和LMB-100效力之间的相关性(如通过肿瘤尺寸所反映的)。
使用转基因小鼠模型,按照类似的方案(图23A)。注意到与BALB/c模型中所看到的类似的结果(图23B)。关于小鼠体重,观察到组合组中的小鼠体重减轻(图24)。在该模型中LMB-100剂量较低(40μg/小鼠),并且在第15天时用LMB-100和含雷帕霉素的合成纳米载体处理的七只小鼠中的一只死亡。关于抗体滴度,在转基因模型中观察到不同处理组的滴度之间的差异(图25)。然而,该模型中的总体滴度低于BALB/c模型。
实施例6:免疫毒素和检查点抑制剂的施用
在每周的第一天用或不用包含雷帕霉素的合成纳米载体处理的情况下,用LMB-100每周处理小鼠。第2组和第3组也在每周的第5天接受抗CLTA4抗体。结果显示单独接受LMB-100的小鼠(第1组)在5周时产生约2000的滴度。向LMB-100方案添加抗CTLA4显著提高了抗LMB-100应答(第2组)。令人惊讶的是,即使在免疫刺激检查点抑制剂的存在下(第3组),LMB-100与包含雷帕霉素的合成纳米载体一起施用也抑制了抗毒素抗体应答(图16A)。因此,在这些对象中,包含雷帕霉素的合成纳米载体不受免疫刺激检查点抑制剂的不利影响。
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Claims (85)
1.用于治疗患有癌症的对象的方法,其包括:
a)在所述对象中产生瘤形成中性的致耐受性环境,以及
b)向所述对象施用重组免疫毒素以治疗所述癌症。
2.权利要求1所述的方法,其中所述癌症是非血液系统癌症。
3.权利要求1或2所述的方法,其中所述癌症包含表达间皮素的癌细胞。
4.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述癌症是间皮瘤、胰腺腺癌、卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌或胃癌。
5.前述权利要求中任一项所述的方法,其中当在没有任何免疫抑制疗法的情况下施用于对象或受试对象时,所述重组免疫毒素在所述对象或受试对象中产生或预期产生不想要的免疫应答。
6.前述权利要求中任一项所述的方法,其中当在没有任何包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下施用于对象或受试对象时,所述重组免疫毒素在所述对象或受试对象中产生或预期产生不想要的免疫应答。
7.权利要求5或6所述的方法,其中所述不想要的免疫应答是针对所述重组免疫毒素的不想要的抗体产生。
8.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述对象中的瘤形成中性的致耐受性环境通过向所述对象施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体产生。
9.前述权利要求中任一项所述的方法,其中产生的所述瘤形成中性的致耐受性环境是这样的环境,其中针对所述重组免疫毒素的不想要的免疫应答被降低或消除而不增强癌症生长。
10.前述权利要求中任一项所述的方法,其中重复施用所述重组免疫毒素。
11.前述权利要求中任一项所述的方法,其中重复施用所述重组免疫毒素至少2次、3次或更多次。
12.权利要求10或11所述的方法,其中在每次施用所述重组免疫毒素期间存在所述瘤形成中性的致耐受性环境。
13.权利要求10至12中任一项所述的方法,其中在每次施用所述重组免疫毒素期间产生所述瘤形成中性的致耐受性环境。
14.权利要求10至13中任一项所述的方法,其中在重复施用所述重组免疫毒素期间,向所述对象施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体至少一次。
15.权利要求14所述的方法,其中在重复施用所述重组免疫毒素期间,向所述对象施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体至少两次。
16.权利要求15所述的方法,其中在重复施用所述重组免疫毒素期间,向所述对象施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体至少三次。
17.权利要求10至13中任一项所述的方法,其中所述包含免疫抑制剂的合成纳米载体仅与所述重组免疫毒素的第一次施用一起施用。
18.权利要求10至13中任一项所述的方法,其中当存在所述重组免疫毒素的至少两次施用时,所述包含免疫抑制剂的合成纳米载体仅与第一次施用和第二次施用一起施用。
19.权利要求10至16中任一项所述的方法,其中包含免疫抑制剂的合成纳米载体与所述重组免疫毒素的每次施用一起施用。
20.权利要求8至19中任一项所述的方法,其中施用所述包含免疫抑制剂的合成纳米载体与施用所述重组免疫毒素相伴随。
21.权利要求8至20中任一项所述的方法,其中施用所述包含免疫抑制剂的合成纳米载体与施用所述重组免疫毒素同时进行。
22.权利要求20或21所述的方法,其中所述合成纳米载体在所述重组免疫毒素之前施用。
23.权利要求8至22中任一项所述的方法,其中所述方法还包括在没有所述包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下施用所述重组免疫毒素。
24.权利要求23所述的方法,其中在没有所述包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下施用所述重组免疫毒素至少2次、3次或更多次。
25.权利要求8至22中任一项所述的方法,其中存在重复施用所述重组免疫毒素与所述包含免疫抑制剂的合成纳米载体之组合的至少2或3个周期,重复施用的每个周期如权利要求8至22中任一项所限定。
26.权利要求25所述的方法,其中所述方法还包括在所述至少2或3个周期之后,在没有所述包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下施用所述重组免疫毒素。
27.权利要求26所述的方法,其中在所述至少2或3个周期之后,在没有所述包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下施用所述重组免疫毒素至少2次、3次或更多次。
28.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述重组免疫毒素包含抗体或其抗原结合片段,以及毒素。
29.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述重组免疫毒素的配体与癌细胞上表达的抗原特异性结合。
30.权利要求29所述的方法,其中所述抗原是间皮素。
31.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述重组免疫毒素的毒素是细菌来源的毒素。
32.权利要求31所述的方法,其中所述细菌来源的毒素是假单胞菌(Pseudomonas)毒素。
33.权利要求32所述的方法,其中所述毒素是假单胞菌外毒素A。
34.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述重组免疫毒素是LMB-100。
35.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法还包括伴随着所述重组免疫毒素的至少一次施用,来施用检查点抑制剂。
36.权利要求35所述的方法,其中所述检查点抑制剂不与所述重组免疫毒素的至少一次施用同时施用。
37.权利要求35或36所述的方法,其中在所述重组免疫毒素的至少一次施用之后24小时内施用所述检查点抑制剂。
38.权利要求35至37中任一项所述的方法,其中伴随着所述重组免疫毒素的每次施用,来施用所述检查点抑制剂。
39.权利要求35至38中任一项所述的方法,其中所述检查点抑制剂的施用或每次施用在所述重组免疫毒素的施用或每次施用之后施用。
40.权利要求35至39中任一项所述的方法,其中所述检查点抑制剂是抗CLTA4抗体。
41.权利要求35至39中任一项所述的方法,其中所述检查点抑制剂是抗OX-40抗体。
42.前述权利要求中任一项所述的方法,其中在没有免疫抑制疗法的情况下施用所述重组免疫毒素之后,产生所述瘤形成中性的致耐受性环境。
43.权利要求42所述的方法,其中在没有免疫抑制疗法的情况下施用所述重组免疫毒素之后,在所述对象中存在针对所述重组免疫毒素的不想要的免疫应答。
44.权利要求42或43所述的方法,其中所述方法还包括在产生所述瘤形成中性的致耐受性环境之前,在没有免疫抑制疗法的情况下向所述对象施用所述重组免疫毒素。
45.权利要求42或43所述的方法,其中所述不想要的免疫应答是针对所述重组免疫毒素的不想要的抗体产生。
46.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法还包括将所述对象鉴定为患有所述癌症。
47.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述对象是需要瘤形成中性的致耐受性环境的对象。
48.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法还包括将所述对象鉴定为需要瘤形成中性的致耐受性环境。
49.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法还包括评估所述对象中针对所述重组免疫毒素的不想要的免疫应答。
50.权利要求6至49中任一项所述的方法,其中所述免疫抑制剂是mTOR抑制剂。
51.权利要求50所述的方法,其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。
52.权利要求6至51中任一项所述的方法,其中所述免疫抑制剂包封在所述合成纳米载体中。
53.权利要求至52中任一项所述的方法,其中所述合成纳米载体包含聚合物纳米载体。
54.权利要求53所述的方法,其中所述聚合物纳米载体包含聚酯或与聚醚连接的聚酯。
55.权利要求54所述的方法,其中所述聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己内酯。
56.权利要求54或55所述的方法,其中所述聚合物纳米载体包含聚酯和与聚醚连接的聚酯。
57.权利要求54至56中任一项所述的方法,其中所述聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。
58.权利要求6至57中任一项所述的方法,其中使用动态光散射获得的所述合成纳米载体群体的粒度分布的平均值为直径大于110nm。
59.权利要求58所述的方法,其中所述直径大于150nm。
60.权利要求59所述的方法,其中所述直径大于200nm。
61.权利要求60所述的方法,其中所述直径大于250nm。
62.权利要求58至61中任一项所述的方法,其中所述直径小于5μm。
63.权利要求62所述的方法,其中所述直径小于4μm。
64.权利要求63所述的方法,其中所述直径小于3μm。
65.权利要求64所述的方法,其中所述直径小于2μm。
66.权利要求65所述的方法,其中所述直径小于1μm。
67.权利要求66所述的方法,其中所述直径小于500nm。
68.权利要求67所述的方法,其中所述直径小于450nm。
69.权利要求68所述的方法,其中所述直径小于400nm。
70.权利要求69所述的方法,其中所述直径小于350nm。
71.权利要求70所述的方法,其中所述直径小于300nm。
72.权利要求6至71中任一项所述的方法,其中所述合成纳米载体中包含的免疫抑制剂在所述合成纳米载体间平均的载荷为0.1%至50%(重量/重量)。
73.权利要求72所述的方法,其中所述载荷为0.1%至25%。
74.权利要求73所述的方法,其中所述载荷为1%至25%。
75.权利要求74所述的方法,其中所述载荷为2%至25%。
76.权利要求75所述的方法,其中所述载荷为2%至10%。
77.权利要求6至76中任一项所述的方法,其中所述合成纳米载体群体的长宽比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。
78.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法还包括在向所述对象施用之前、期间或之后,评估所述对象中针对所述重组免疫毒素的免疫应答。
79.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述施用是通过静脉内、腹膜内或皮下施用。
80.药盒,其包含:
一个或更多个包含重组免疫毒素的剂量和一个或更多个包含含有免疫抑制剂的合成纳米载体的剂量。
81.权利要求80所述的药盒,其中所述药盒还包含一个或更多个包含检查点抑制剂的剂量。
82.权利要求80或81所述的药盒,其中所述药盒还包含使用说明书。
83.权利要求82所述的药盒,其中所述使用说明书包含用于实施权利要求1至79中任一项所述方法的说明书。
84.权利要求80至83中任一项所述的药盒,其中所述包含免疫抑制剂的合成纳米载体如权利要求6至79中任一项所述。
85.权利要求80至84中任一项所述的药盒,其中所述重组免疫毒素如权利要求1至79中任一项所述。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20190621 |