CN109913420A - Cdc20共表达基因网络作为胶质瘤治疗靶点的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CDC20共表达基因网络作为胶质瘤治疗靶点的应用。本发明提供了抑制剂在如下任一中的应用：(A1)制备用于治疗胶质瘤的产品；(A2)治疗胶质瘤；所述抑制剂为能够降低如下基因或其编码蛋白的表达活性和/或表达水平的物质：AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因。本发明证明了CDC20‑M是胶质瘤中基因组不稳定性以及较差预后的敏感标志物，并在对CDC20‑M中主要成员的实验分析中发现了潜在的胶质瘤治疗靶点，为临床诊断以及治疗提供了新的思路。

Description

CDC20共表达基因网络作为胶质瘤治疗靶点的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种CDC20共表达基因网络作为胶质瘤治疗靶点的应用。

背景技术

胶质母细胞瘤(Glioblastomas，GBM)为成人中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤，占比超过50％。虽然已经有非常多的研究探究胶质母细胞瘤的发生原因以及可行的治疗方案，但是患有胶质母细胞瘤的病人生存期仍旧非常短，中位生存期只有不到两年。胶质母细胞瘤处于一种持续进化的过程，具有复杂的细胞学及遗传学异质性。胶质母细胞瘤的基因组包含许多的单核苷酸变异，也具有染色体不稳定性(Chromosomal instability，CIN)的特征，有研究发现胶质母细胞瘤细胞存在高频率的异常染色体数目事件(非整倍体)以及染色体结构变异事件。这些基因组不稳定性(Genomic instability，GI)的事件会使得每一个胶质母细胞瘤细胞产生新的克隆变异，驱动胶质瘤的进化发展，使得胶质母细胞瘤可以对各种常规治疗方案产生耐受。

胶质母细胞瘤和低等级胶质瘤可能分别起源于神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)和祖细胞(Neural progenitor cells，NPCs)。在神经干细胞及祖细胞中，调控染色体分离的机制对于调节这类细胞自我更新以及分化是极为重要的。包括ASPM、NDE1、CEP120、CENPF以及TACCs在内的调节中心体和微管功能的基因出现异常，会导致新皮层发育阶段神经祖细胞库的细胞命运决定以及分化过程出现严重的错误。另外，已经有很多优秀的研究者对胶质瘤中基因组不稳定性的产生以及影响进行了深入的研究。Singh等人发现在不到5％的胶质母细胞瘤中存在成纤维细胞生长因子受体(FGFR)基因与TACC基因之间的融合现象，而FGFR-TACC融合基因产生的后果是导致这群胶质瘤出现染色体不稳定性。美国癌症基因组图谱计划(The Cancer Genome Atlas，TCGA)也于最近发现在16％的胶质母细胞瘤与低等级胶质瘤中存在很多参与有丝分裂连接复合物功能相关基因(包括NIPBL和STAG2)的突变和拷贝数变异事件。Carter等人找到了一群与非整倍体具有相关性的基因群，命名为CIN70signature，这群基因在胶质瘤以及其他几种肿瘤中均能预测病人较差的预后。基于SNP 6.0数据平台，TCGA于近期发表了一篇研究中提出了一个与癌症中TP53突变和整体突变频率相关的分值计算方法，命名为非整倍体分数(Aneuploidy socre)。CIN70signature在九种常见肿瘤中能很好地将病人的预后水平分开。但是，CIN70signature也有其局限性，首先，CIN70signature不能特异的代表胶质瘤的情况，CIN70signature的建立整合了6种不同肿瘤的数据库，能得到各种肿瘤中具有共性的那些基因，但每种肿瘤均具有特异性，CIN70signature并不能完全代表胶质瘤中的基因组不稳定性；其次，CIN70signature不能完全代表基因组不稳定性，CIN70signature的建立基于文章作者提出的一个非整倍体分数的算法，使基因依据此算法得到的分数高低排序选取排名靠前的70个基因组成CIN70signature，而非整倍体只能代表染色体数目上存在异常的状态，目前认为此现象是由于染色体分裂异常导致的，而基因组不稳定性不仅包括染色体不稳定性，也包括基因位点的突变，所以CIN70signature并不能完全代表基因组不稳定性；最后，CIN70signature无法对某一个病人进行CIN70signature的分型后对其进行预后预测，CIN70signature对于病人预后的预测需要依靠包含大量病人样本的表达数据库，依据CIN70signature在数据库中的表达水平取中间值将病人分为高低两组后来比较两组之间的预后情况，如果只存在一个病人的案例则无法进行有效的预后预测。另外，虽然以上这些研究揭示了基因组不稳定性在胶质瘤病因学上的重要性，但对基因组不稳定性发生的原因机制以及标志物的研究还非常少。

发明内容

本发明的目的是提供一种CDC20共表达基因网络作为胶质瘤治疗靶点的应用。

第一方面，本发明要求保护抑制剂在如下任一中的应用：

(A1)制备用于治疗胶质瘤的产品；

(A2)治疗胶质瘤。

其中，所述抑制剂为能够降低如下基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平的物质：AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因。

进一步地，所述抑制剂为能够降低AURKA基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平的物质，或者为能够降低CDC20基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平的物质，或者为能够降低KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平的物质。

第二方面，本发明要求保护抑制剂在如下任一中的应用：

(B1)制备用于抑制胶质瘤细胞生长和/或增殖的产品，或抑制胶质瘤细胞生长和/或增殖；

(B2)制备用于促进胶质瘤细胞多倍体化的产品，或促进胶质瘤细胞多倍体化；

(B3)制备用于抑制胶质瘤体积增大的产品，或抑制胶质瘤体积增大；

(B4)制备用于延长胶质瘤患者生存期，或延长胶质瘤患者生存期；

(B5)制备用于抑制胶质瘤或胶质瘤细胞中的p-AURKA蛋白的活性和/或表达水平的产品，或抑制胶质瘤或胶质瘤细胞中的p-AURKA蛋白的活性和/或表达水平；

(B6)制备用于减少胶质瘤或胶质瘤细胞中DNA损伤的产品，或减少胶质瘤或胶质瘤细胞中DNA损伤；

(B7)制备用于抑制胶质瘤或胶质瘤细胞中的p-H2A.X蛋白的活性和/或表达水平的产品，或抑制胶质瘤或胶质瘤细胞中的p-H2A.X蛋白的活性和/或表达水平；

其中，所述抑制剂为能够降低如下基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平的物质：AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因。

进一步地，所述抑制剂为能够降低AURKA基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平的物质，或者为能够降低CDC20基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平的物质，或者为能够降低KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平的物质。

在上述两方面中，所述胶质瘤均可为CDC20-M高表达胶质瘤；所述胶质瘤细胞均可为CDC20-M高表达胶质瘤细胞。

进一步地，所述CDC20-M高表达胶质瘤细胞是指CDC20-M核心基因的表达量显著高于对照细胞的胶质瘤细胞；所述CDC20-M核心基因为AURKA基因、CDC20基因和KIF2C基因；所述对照细胞为人星形胶质细胞。具体的，所述CDC20-M高表达胶质瘤细胞是指AURKA基因、CDC20基因和KIF2C基因的表达都比人星形胶质细胞高出1.5倍以上的胶质瘤细胞。在本发明一个实施例中，所述CDC20-M高表达胶质瘤细胞为IDH1/2野生型细胞。

进一步地，所述CDC20-M高表达胶质瘤是指CDC20-M基因群的表达量(基因群内各基因表达量的均值)与CREBRF-M基因群的表达量(基因群内各基因表达量的均值)的比值大于0.96的胶质瘤；或者

所述CDC20-M高表达胶质瘤是按照包括如下步骤的方法确定的属于CDC20-M high组的胶质瘤：

第一步：按照包括如下步骤的方法建立胶质瘤患者分型模型：

b1)获得n个待测胶质瘤患者的CDC20-M基因群和CREBRF-M基因群中各基因的表达量数据，并进行log2处理，得到各基因log2后的表达量数据；

b2)利用一致性聚类算法，根据步骤b1)所得各基因log2后的表达量数据，将所述n个待测胶质瘤患者分为四组，CDC20-M high组、CDC20-M intermediate组、CREBRF-Mintermediate组和CREBRF-M high组；

b3)针对每个分组，分别计算组内所述CDC20-M基因群和所述CREBRF-M基因群中各基因的平均表达量，每个分组组内所述CDC20-M基因群和所述CREBRF-M基因群中各基因的平均表达量即为该组特异的表达模式Centroid；

其中，所述n个待测胶质瘤患者的胶质瘤样本种类来源并非单一化的情况，如既有高等级胶质瘤也有低等级胶质瘤(高等级胶质瘤为WHO对胶质瘤的分级标准为Ⅳ级的胶质瘤；低等级胶质瘤为Ⅱ-Ⅲ级的胶质瘤。所以来源需要有涵盖Ⅱ-Ⅳ级的的胶质瘤)。在本发明的一个实施例中，所述n个待测胶质瘤患者来自于TCGA胶质瘤数据库，具体为该数据库中的381例胶质瘤样本(胶质母细胞瘤160例，星形胶质细胞瘤69例，少突胶质细胞瘤91例，少突星形细胞瘤60例，无形态学诊断1例)。

基于围绕中心点划分(Partitioning around medoid,PAM)的一致性聚类算法(Consensus Clustering)是一种非监督类学习算法，适用于任何随机聚类分析，能够有效地鉴定差异分子表达模式和分类。此算法集成于R包ConsensusClusterPlus。本发明中，基于CDC20-M以及CREBRF-M在胶质瘤TCGA训练集中的样本一致性聚类步骤如下：

1.生成CDC20-M及CREBRF-M所有基因在TCGA训练集中的log2表达量文件；

2.打开Rstudio，导入此文件：edata<-read.table("1中生成文件.txt",sep＝"\t",header＝T)；

3.edata.m<-apply(edata[,X:Y],2,scale)；

4.library("ConsensusClusterPlus")；

5.

results＝ConsensusClusterPlus(edata.m,maxK＝6,reps＝1000,pItem＝0.9,pFeature＝1,title＝"TCGA_training",clusterAlg＝"pam",distance＝"euclidean",seed＝1262118388.71279,plot＝"png",writeTable＝T,verbose＝1)；

6.得到K＝2-10共9种聚类结果，选取最终聚类结果的依据是一致性矩阵图(Consensus matrix plot)要足够干净，尽量少出现中间过渡色，并且对应的CDF曲线要接近平行(起点接近0，终点接近1)。基于以上原则最终选取K＝4的分组结果，依据此分组将TCGA训练集样本分为四组：CDC20-M high,CDC20-M intermediate,CREBRF-Mintermediate以及CREBRF-M high。

第二步：获得所述待测胶质瘤患者的CDC20-M基因群和CREBRF-M基因群中各基因的表达量数据，并进行log2处理，得到各基因log2后的表达量数据；

第三步：将第二步所得的各基因log2后的表达量数据与第一步所建立的胶质瘤患者分型模型中的Centroid进行斯皮尔曼相关性分析，相关程度最高的Centroid所在组即为所述待测胶质瘤患者所在的组别。

所述CDC20-M基因群由如下139个基因组成：ASF1B(55723)、ASPM(259266)、AURKA(6790)、AURKB(9212)、BIRC5(332)、BRCA1(672)、BUB1(699)、BUB1B(701)、BUD31(8896)、C11orf82(220042)、CASC5(57082)、CASP2(835)、CCNA2(890)、CCNB1(891)、CCNB2(9133)、CDC20(991)、CDC25A(993)、CDC45(8318)、CDC6(990)、CDCA2(157313)、CDCA3(83461)、CDCA7(83879)、CDCA7L(55536)、CDCA8(55143)、CDK1(983)、CDK2(1017)、CDKN2C(1031)、CDKN3(1033)、CENPA(1058)、CENPE(1062)、CENPF(1063)、CENPK(64105)、CENPN(55839)、CENPW(387103)、CEP55(55165)、CHEK1(1111)、CKAP2L(150468)、CKS2(1164)、DBF4(10926)、DDX39A(10212)、DEPDC1(55635)、DEPDC1B(55789)、DLGAP5(9787)、DNMT1(1786)、DSN1(79980)、DTL(51514)、DTYMK(1841)、E2F7(144455)、ECT2(1894)、EME1(146956)、ESPL1(9700)、FAM64A(54478)、FANCD2(2177)、FANCI(55215)、FBXO5(26271)、FOXM1(2305)、GAS2L3(283431)、GINS1(9837)、GINS2(51659)、GJC1(10052)、GPX7(2882)、GTF2IRD2(84163)、GTSE1(51512)、HJURP(55355)、HMGB2(3148)、HMMR(3161)、IGF2BP3(10643)、KIAA0101(9768)、KIF11(3832)、KIF14(9928)、KIF15(56992)、KIF20A(10112)、KIF23(9493)、KIF2C(11004)、KIF4A(24137)、KIFC1(3833)、KNTC1(9735)、KPNA2(3838)、LMNB1(4001)、LMNB2(84823)、LRR1(122769)、MAD2L1(4085)、MCM2(4171)、MCM3(4172)、MCM6(4175)、MCM8(84515)、MELK(9833)、MKI67(4288)、MLF1IP(79682)、MND1(84057)、MYBL2(4605)、NCAPG(64151)、NCAPG2(54892)、NCAPH(23397)、NDC80(10403)、NEK2(4751)、NRM(11270)、NUF2(83540)、NUSAP1(51203)、PARPBP(55010)、PBK(55872)、PCNA(5111)、PDIA4(9601)、POC1A(25886)、POLE2(5427)、PRC1(9055)、PTBP1(5725)、PTTG1(9232)、RACGAP1(29127)、RAE1(8480)、RBBP8(5932)、RFC2(5982)、RFC3(5983)、RFC4(5984)、RNASEH2A(10535)、RRM2(6241)、SGOL2(151246)、SHCBP1(79801)、SMC4(10051)、SNRPB(6628)、SPAG5(10615)、SPC24(147841)、STIL(6491)、TACC3(10460)、TCF3(6929)、TIMELESS(8914)、TK1(7083)、TMEM48(55706)、TOP2A(7153)、TPX2(22974)、TRIP13(9319)、TTK(7272)、TYMS(7298)、UBE2C(11065)、UBE2S(27338)、USP1(7398)、ZNF765(91661)、ZNF850(342892)、ZWINT(11130)。

所述CREBRF-M基因群由如下120个基因组成：ABLIM1(3983)、ACADSB(36)、ADARB2(105)、ADD3(120)、AKAP6(9472)、AKR1C1(1645)、ANKRD46(157567)、ARHGAP32(9743)、ATP6V1G2(534)、AVPI1(60370)、CAB39L(81617)、CBX7(23492)、CCDC85A(114800)、CDS2(8760)、CHIC1(53344)、CPEB3(22849)、CREBRF(153222)、CRY2(1408)、CRYZL1(9946)、DCUN1D5(84259)、DNAJC12(56521)、EIF1(10209)、EZH1(2145)、FAIM2(23017)、FBRSL1(57666)、FBXL20(84961)、FBXO9(26268)、FRY(10129)、FSTL5(56884)、GABARAPL1(23710)、GABBR1(2550)、GABRG1(2565)、GARNL3(84253)、GRAMD1B(57476)、GTDC1(79712)、GTF2H5(404672)、HDAC4(9759)、HERC1(8925)、HLF(3131)、HMGCLL1(54511)、IGIP(492311)、IKZF5(64376)、JMY(133746)、KSR2(283455)、MAGEE1(57692)、MAPK10(5602)、MINOS1(440574)、MKX(283078)、MLLT6(4302)、MXI1(4601)、MYCBP2(23077)、NALCN(259232)、NAP1L2(4674)、NAP1L3(4675)、NCAM1(4684)、NCOA2(10499)、NEBL(10529)、NEGR1(257194)、NR1D2(9975)、NTRK2(4915)、OIP5-AS1(729082)、PAPOLG(64895)、PCGF5(84333)、PELI3(246330)、PIAS1(8554)、PLA2G6(8398)、PLEKHM3(389072)、POU6F1(5463)、PPM1A(5494)、PPM1L(151742)、PPP1R12B(4660)、PPP1R3E(90673)、PPP1R3F(89801)、PURA(5813)、RAB11FIP2(22841)、RABGGTB(5876)、RELN(5649)、REPS2(9185)、RPL37(6167)、RPS6KA5(9252)、RUNDC3A(10900)、SCAMP1(9522)、SCAPER(49855)、SEC62(7095)、SERP2(387923)、SGSM1(129049)、SH3BGRL2(83699)、SKP1(6500)、SLC12A6(9990)、SLK(9748)、SPTAN1(6709)、TBRG1(84897)、TEF(7008)、TOM1L2(146691)、TTBK2(146057)、TUB(7275)、UQCRB(7381)、USP46(64854)、VPS13D(55187)、YPEL3(83719)、YPEL4(219539)、ZBTB4(57659)、ZBTB44(29068)、ZMYND11(10771)、ZNF540(163255)、ZRANB1(54764)、ADRBK2(157)、KIAA0240(23506)、LOC283588(283588)、AGXT2L1(64850)、LOC283713(283713)、SEPT8(23176)、KIAA0368(23392)、C7orf41(222166)、GABARAPL3(23766)、FAM190B(54462)、BZRAP1(9256)、KIAA1107(23285)、LOC157562(157562)、KIAA1377(57562)。

上述各基因后面的括号内数字为相应基因在NCBI网站上的gene ID。

在上述两方面的应用中，所述抑制剂可为靶向AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因的药物。

进一步地，所述药物为靶向AURKA基因的药物，或者为靶向CDC20基因的药物，或者为靶向KIF2C基因的药物。

在本发明的一个实施例中，所述药物为靶向AURKA基因的药物；所述靶向AURKA基因的药物具体为Aurora A激酶选择性抑制剂。所述Aurora A激酶选择性抑制剂更加具体的为MLN8237。

在本发明的一个实施例中，所述药物为靶向CDC20基因的药物；所述靶向CDC20基因的药物具体为能够竞争性抑制CDC20与后期促进复合物APC相互结合的药物。所述能够竞争性抑制CDC20与后期促进复合物APC相互结合的药物更加具体的为proTAME。

第三方面，本发明要求保护如下任一制备细胞模型的方法：

方法A：一种制备生长和/或增殖受到抑制的胶质瘤细胞模型的方法，可包括如下步骤：降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平；

方法B：一种制备多倍体化胶质瘤细胞模型的方法，可包括如下步骤：降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平；

方法C：一种制备p-AURKA蛋白的表达活性和/或表达水平受到抑制的胶质瘤细胞模型的方法，可包括如下步骤：降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平；

方法D：一种制备DNA损伤减少的胶质瘤细胞模型的方法，可包括如下步骤：降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平；

方法E：一种制备p-H2A.X蛋白的表达活性和/或表达水平受到抑制的胶质瘤细胞模型的方法，可包括如下步骤：降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平。

在所述方法中，具体可通过采用抑制剂处理所述胶质瘤细胞来实现降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平。所述抑制剂可见前文。

在所述方法中，所述胶质瘤细胞可为CDC20-M高表达胶质瘤细胞。所述CDC20-M高表达胶质瘤细胞可见前文。

上述提供的各种制备细胞模型的方法均为体外制备细胞模型的方法。

第四方面，本发明要求保护第三方面所述方法制备得到的细胞模型。

在上述各方面中，所述AURKA基因见NCBI Reference Sequence:NC_000020.11，相应的编码蛋白见ACCESSION：O14965.2；所述CDC20基因见NCBI Reference Sequence:NC_000001.11，相应的编码蛋白见ACCESSION：Q12834；所述p-AURKA蛋白为磷酸化的AURKA蛋白；所述p-H2A.X蛋白为磷酸化的H2A.X蛋白。

本申请的发明人所在团队提出在神经祖细胞中参与维持基因组稳定性的基因群网络出现了异常之后，可能会成为导致胶质瘤基因组不稳定性的驱动因素的假说。因此，本申请的目标是发现一个在胶质瘤中的基因组不稳定性标志物，此标志物需要具有以下几个方面的特征：(1)具有维持基因组稳定性的功能，这种功能的激活或异常调节可能会导致基因组不稳定或与基因组不稳定性存在极强相关性；(2)能够预测胶质瘤病人预后水平；(3)包含有可能作为临床靶向用药的靶点；(4)能够应用于大部分的胶质瘤(甚至其他肿瘤)。

为了验证这个假说，本申请在来自不同国家的胶质瘤病人的表达数据库中进行了筛选，通过筛选与调节神经祖细胞发育、在染色体不稳定性中具有已知重要作用的基因作为种子基因，利用基因共表达分析在胶质瘤数据库中寻找到一群与CDC20(有丝分裂后期促进复合物APC的激活因子)共表达基因模块(CDC20-M)。CDC20-M的成员包括细胞增殖的主要调控因子以及参与DNA损伤修复和染色体分离的重要组成成员。通过对CDC20-M的生物信息学分析，体外细胞实验以及体内实验的深入研究，本发明证明了CDC20-M是胶质瘤中基因组不稳定性以及较差预后的敏感标志物，并在对CDC20-M中主要成员的实验分析中发现了潜在的胶质瘤治疗靶点，为临床诊断以及治疗提供了新的思路。

附图说明

图1为TCGA训练集基于CDC20-M/CREBRF-M的分组及预后分析。A：TCGA训练集基于CDC20-M及CREBRF-M表达水平的一致性聚类结果，不同的分组形式(K＝2-10)均进行了评估。图中显示最佳分组(K＝4)时的一致性矩阵图。B：CDC20-M及CREBRF-M在TCGA训练集样本依据一致性聚类K＝4的分组排序后的表达热图，热图下方标注每组中CDC20-M/CREBRF-M比值的平均值及标准差。C：生存曲线表示一致性聚类分组后TCGA训练集各组间的预后差异，CDC20-M high与CREBRF-Mhigh病人间的风险比率在生存曲线下方标注。

图2为CGGA数据库及TCGA验证集基于独立样本预测分组及预后分析。A和C分别表示CDC20-M及CREBRF-M在CGGA数据库和TCGA验证集样本依据独立样本预测分析分组排序后的表达热图，热图下方标注每组中CDC20-M/CREBRF-M比值的平均值及标准差。B和D分别表示独立样本预测分析分组后CGGA数据库和TCGA验证集各组间的预后差异，CDC20-M high与CREBRF-M high病人间的风险比率在生存曲线下方标注。

图3为细胞中CDC20、AURKA及KIF2C的RNA表达水平的鉴定。对本发明中使用到的细胞进行CDC20、AURKA及KIF2C的实时定量qPCR分析，参照细胞采用HA细胞，比较所有其它细胞中这三个基因的表达水平与HA之间的关系，以UBC基因的表达作为校正标准化的参照(Fold change>1.5视为显著变化)，三次独立重复实验的平均值及方差标于图中(每次独立实验每个基因在每种细胞中的PCR检测均设置三个重复)。

图4为胶质瘤细胞对proTAME的敏感性实验。(左)对数生长期的胶质瘤细胞在不同浓度的proTAME处理下孵育24小时，相比于对照组HA细胞及CDC20-M低表达的胶质瘤细胞来说，CDC20-M高表达的胶质瘤细胞对proTAME更加敏感。(右)表中展示各个细胞在proTAME孵育下的IC50的统计数据。数据显示三次独立重复实验的平均值及标准差结果，每次独立实验的每种细胞的每种药物浓度均设置6个重复孔。

图5为胶质瘤细胞对MLN8237的敏感性实验。对数生长期的胶质瘤细胞在不同浓度的MLN8237处理下孵育12天，相比于对照组HA细胞及CDC20-M低表达的胶质瘤细胞N8来说，CDC20-M高表达的胶质瘤细胞N33对MLN8237更加敏感。数据显示三次独立重复实验的平均值及方差结果，每次独立实验的每种细胞的每种药物浓度均设置6个重复孔。

图6为其余胶质瘤细胞对MLN8237的敏感性实验。A：对数生长期的胶质瘤细胞在不同浓度的MLN8237处理下孵育12天，相比于对照组HA细胞及CDC20-M低表达的胶质瘤细胞来说，CDC20-M高表达的胶质瘤细胞对MLN8237更加敏感。数据显示三次独立重复实验的平均值及方差结果，每次独立实验的每种细胞的每种药物浓度均设置6个重复孔。B：表中展示各个细胞在MLN8237孵育12天后的IC50的统计数据。数据显示三次独立重复实验的平均值及标准差结果，每次独立实验的每种细胞的每种药物浓度均设置6个重复孔。

图7为胶质瘤细胞在MLN8237作用下处于S期细胞比例及多倍体化流式结果。图中展示N33及N8细胞在不同MLN8237浓度下作用3天后进行Hoechst 33342及EdU共染的流式结果示例图，横坐标代表Hoechst 33342标记DNA含量，纵坐标为EdU标记的处于S期细胞信号。

图8为胶质瘤细胞在MLN8237作用下处于S期细胞比例及多倍体化流式结果。图中展示N5，N9，PDX，N3及HA细胞在不同MLN8237浓度下作用3天后进行Hoechst 33342及EdU共染的流式结果示例图，横坐标代表Hoechst 33342标记DNA含量，纵坐标为EdU标记的处于S期细胞信号。

图9为胶质瘤细胞在MLN8237孵育后多倍体化统计结果。对数生长期的胶质瘤细胞在不同浓度的MLN8237处理下孵育3天后对活细胞进行Hoechst 33342单染流式检测，相比于对照组HA细胞及CDC20-M低表达的胶质瘤细胞N8来说，CDC20-M高表达的胶质瘤细胞N33在越高浓度的MLN8237下多倍体化的细胞(多于4N的DNA含量)所占比例明显增高。*表示与HA细胞相比具有统计学差异，ns表示与HA细胞相比无统计学差异。数据显示三次独立重复实验的平均值及方差结果，每次独立实验的每种细胞的每种药物浓度均设置6个重复孔。

图10为其余胶质瘤细胞在MLN8237孵育后多倍体化统计结果。对数生长期的胶质瘤细胞在不同浓度的MLN8237处理下孵育3天后对活细胞进行Hoechst 33342单染流式检测，相比于对照组HA细胞及CDC20-M低表达的胶质瘤细胞来说，CDC20-M高表达的胶质瘤细胞在越高浓度的MLN8237下多倍体化的细胞(多于4N的DNA含量)所占比例明显增高。*表示与HA细胞相比具有统计学差异，ns表示与HA细胞相比无统计学差异。数据显示三次独立重复实验的平均值及方差结果，每次独立实验的每种细胞的每种药物浓度均设置6个重复孔。

图11为MLN8237抑制CDC20-M高表达的PDX原位模型胶质瘤的生长。A：荧光成像显示对照组和实验组小鼠肿瘤体积大小在第10天、第17天以及第24天的变化。B：柱状图显示对照组和实验组小鼠在第10天、第17天、第24天以及第31天荧光强度的平均值及方差。*表示对照组与实验组小鼠相比，荧光强度的差异具有统计学意义。

图12为MLN8237用药实验组小鼠与对照组小鼠的预后差异。生存曲线比较了对照组小鼠与实验组小鼠的生存时长，P值采用log-rank检验。结果展示为两次独立重复实验其中一次的结果。

图13为对照组及MLN8237用药实验组小鼠胶质瘤组织HE染色，p-AURKA及p-H2A.X的蛋白表达水平。HE染色、p-AURKA及p-H2A.X抗体免疫组化实验在未用药的对照组小鼠胶质瘤组织(上图)及实验组小鼠胶质瘤组织(下图)的石蜡切片中进行。标尺标于图右下方。结果展示两次独立重复实验的代表结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、CDC20-M是胶质瘤中较差预后的敏感标志物

一、CDC20-M以及CREBRF-M基因共表达模块的建立

肿瘤的基因组不稳定性表现于肿瘤样本携带大量的动态变化的染色体异常和基因突变。不同的肿瘤样本可能携带不同的染色体异常和基因突变，而且，肿瘤可能在某个发展节点上积累了重要的基因组异常，然后其基因组保持相对稳定。因此，如何鉴定基因组不稳定的肿瘤样本成为本领域研究的关键问题。可行的策略之一是在典型样本中，筛选与染色体变异数量相关的基因表达谱。

为了筛选特异的在胶质瘤中与基因组不稳定性存在紧密相关性的基因群，本发明利用皮尔森相关性分析，取皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient，PCC)>70％为临界点，通过文献筛选，以已知的与神经祖细胞(neural progenitor cell,NPC)自我更新、细胞增殖、染色体分离及DNA损伤修复相关的基因为种子基因，在胶质瘤表达数据库中得到其各自的基因共表达网络。通过尝试不同的种子基因，最后得到调控细胞周期M期的调控因子CDC20为种子的基因共表达模块(CDC20-Module,CDC20-M)作为研究对象。CDC20-M成员来自于GSE4290胶质瘤表达数据库中与CDC20(探针：202870_s_at)表达相关性最高的185个探针(包含139个基因)。组成CDC20-M的共139个基因如下：ASF1B(55723)、ASPM(259266)、AURKA(6790)、AURKB(9212)、BIRC5(332)、BRCA1(672)、BUB1(699)、BUB1B(701)、BUD31(8896)、C11orf82(220042)、CASC5(57082)、CASP2(835)、CCNA2(890)、CCNB1(891)、CCNB2(9133)、CDC20(991)、CDC25A(993)、CDC45(8318)、CDC6(990)、CDCA2(157313)、CDCA3(83461)、CDCA7(83879)、CDCA7L(55536)、CDCA8(55143)、CDK1(983)、CDK2(1017)、CDKN2C(1031)、CDKN3(1033)、CENPA(1058)、CENPE(1062)、CENPF(1063)、CENPK(64105)、CENPN(55839)、CENPW(387103)、CEP55(55165)、CHEK1(1111)、CKAP2L(150468)、CKS2(1164)、DBF4(10926)、DDX39A(10212)、DEPDC1(55635)、DEPDC1B(55789)、DLGAP5(9787)、DNMT1(1786)、DSN1(79980)、DTL(51514)、DTYMK(1841)、E2F7(144455)、ECT2(1894)、EME1(146956)、ESPL1(9700)、FAM64A(54478)、FANCD2(2177)、FANCI(55215)、FBXO5(26271)、FOXM1(2305)、GAS2L3(283431)、GINS1(9837)、GINS2(51659)、GJC1(10052)、GPX7(2882)、GTF2IRD2(84163)、GTSE1(51512)、HJURP(55355)、HMGB2(3148)、HMMR(3161)、IGF2BP3(10643)、KIAA0101(9768)、KIF11(3832)、KIF14(9928)、KIF15(56992)、KIF20A(10112)、KIF23(9493)、KIF2C(11004)、KIF4A(24137)、KIFC1(3833)、KNTC1(9735)、KPNA2(3838)、LMNB1(4001)、LMNB2(84823)、LRR1(122769)、MAD2L1(4085)、MCM2(4171)、MCM3(4172)、MCM6(4175)、MCM8(84515)、MELK(9833)、MKI67(4288)、MLF1IP(79682)、MND1(84057)、MYBL2(4605)、NCAPG(64151)、NCAPG2(54892)、NCAPH(23397)、NDC80(10403)、NEK2(4751)、NRM(11270)、NUF2(83540)、NUSAP1(51203)、PARPBP(55010)、PBK(55872)、PCNA(5111)、PDIA4(9601)、POC1A(25886)、POLE2(5427)、PRC1(9055)、PTBP1(5725)、PTTG1(9232)、RACGAP1(29127)、RAE1(8480)、RBBP8(5932)、RFC2(5982)、RFC3(5983)、RFC4(5984)、RNASEH2A(10535)、RRM2(6241)、SGOL2(151246)、SHCBP1(79801)、SMC4(10051)、SNRPB(6628)、SPAG5(10615)、SPC24(147841)、STIL(6491)、TACC3(10460)、TCF3(6929)、TIMELESS(8914)、TK1(7083)、TMEM48(55706)、TOP2A(7153)、TPX2(22974)、TRIP13(9319)、TTK(7272)、TYMS(7298)、UBE2C(11065)、UBE2S(27338)、USP1(7398)、ZNF765(91661)、ZNF850(342892)、ZWINT(11130)。上述各基因后面的括号内数字为相应基因在NCBI网站上的gene ID。

CDC20-M的139个成员中有37个与CIN70signature是一样的，说明两个基因群间具有一定的共性，但是，将CIN70signature中的基因放入胶质瘤表达数据库中进行监督聚类分析发现，将q值(False discovery rate)设为0.01，p值为0.008时，已经筛选掉了大部分在各样本间表达差异无统计学意义的基因后，CIN70signature中仍旧有接近五分之一的基因与其他成员间没有共表达关系。这使得将胶质瘤样本按照CIN70signature的表达来分组是不准确的。综上所述，本发明将采用CDC20-M作为探究胶质瘤基因组不稳定性的研究对象。

在确定了CDC20-M之后，为了使分类能更加稳定，本发明在胶质瘤表达数据库中以CREBRF为种子基因筛选到120个与其共表达的基因(PCC>70％)组成的模块CREBRF基因共表达模块(CREBRF-Module,CREBRF-M)作为在胶质瘤中与CDC20-M表达趋势完全相反的对照来进行样本分类。CREBRF作为非折叠蛋白应答(unfolded protein response；UPR)的负调节因子在各种成熟组织中广泛表达，在来自不同国家的胶质瘤表达数据库中CREBRF-M均高表达于正常组织及低等级胶质瘤，而在高等级胶质瘤表达程度低，与CDC20-M的表达趋势完全相反。之后的胶质瘤表达数据库的分类结果均依据CDC20-M及CREBRF-M两组基因群的表达水平来确定。CREBRF-M成员来自于GSE4290胶质瘤表达数据库中与CREBRF(探针：225556_at)表达相关性最高的157个探针(包含120个基因)。组成CREBRF-M的共120个基因如下：ABLIM1(3983)、ACADSB(36)、ADARB2(105)、ADD3(120)、AKAP6(9472)、AKR1C1(1645)、ANKRD46(157567)、ARHGAP32(9743)、ATP6V1G2(534)、AVPI1(60370)、CAB39L(81617)、CBX7(23492)、CCDC85A(114800)、CDS2(8760)、CHIC1(53344)、CPEB3(22849)、CREBRF(153222)、CRY2(1408)、CRYZL1(9946)、DCUN1D5(84259)、DNAJC12(56521)、EIF1(10209)、EZH1(2145)、FAIM2(23017)、FBRSL1(57666)、FBXL20(84961)、FBXO9(26268)、FRY(10129)、FSTL5(56884)、GABARAPL1(23710)、GABBR1(2550)、GABRG1(2565)、GARNL3(84253)、GRAMD1B(57476)、GTDC1(79712)、GTF2H5(404672)、HDAC4(9759)、HERC1(8925)、HLF(3131)、HMGCLL1(54511)、IGIP(492311)、IKZF5(64376)、JMY(133746)、KSR2(283455)、MAGEE1(57692)、MAPK10(5602)、MINOS1(440574)、MKX(283078)、MLLT6(4302)、MXI1(4601)、MYCBP2(23077)、NALCN(259232)、NAP1L2(4674)、NAP1L3(4675)、NCAM1(4684)、NCOA2(10499)、NEBL(10529)、NEGR1(257194)、NR1D2(9975)、NTRK2(4915)、OIP5-AS1(729082)、PAPOLG(64895)、PCGF5(84333)、PELI3(246330)、PIAS1(8554)、PLA2G6(8398)、PLEKHM3(389072)、POU6F1(5463)、PPM1A(5494)、PPM1L(151742)、PPP1R12B(4660)、PPP1R3E(90673)、PPP1R3F(89801)、PURA(5813)、RAB11FIP2(22841)、RABGGTB(5876)、RELN(5649)、REPS2(9185)、RPL37(6167)、RPS6KA5(9252)、RUNDC3A(10900)、SCAMP1(9522)、SCAPER(49855)、SEC62(7095)、SERP2(387923)、SGSM1(129049)、SH3BGRL2(83699)、SKP1(6500)、SLC12A6(9990)、SLK(9748)、SPTAN1(6709)、TBRG1(84897)、TEF(7008)、TOM1L2(146691)、TTBK2(146057)、TUB(7275)、UQCRB(7381)、USP46(64854)、VPS13D(55187)、YPEL3(83719)、YPEL4(219539)、ZBTB4(57659)、ZBTB44(29068)、ZMYND11(10771)、ZNF540(163255)、ZRANB1(54764)、ADRBK2(157)、KIAA0240(23506)、LOC283588(283588)、AGXT2L1(64850)、LOC283713(283713)、SEPT8(23176)、KIAA0368(23392)、C7orf41(222166)、GABARAPL3(23766)、FAM190B(54462)、BZRAP1(9256)、KIAA1107(23285)、LOC157562(157562)、KIAA1377(57562)。上述各基因后面的括号内数字为相应基因在NCBI网站上的gene ID。

二、CDC20-M与现有胶质瘤预后诊断标志物的比较

为了验证CDC20-M在胶质瘤发生发展过程中的作用，本发明首先分析了CDC20-M在胶质瘤病人预后诊断预测上的能力，探究CDC20-M是否具有将所有类型及等级的胶质瘤按照其预后差异区分开的能力。对于胶质瘤的预后诊断目前在临床上已有一些常用的标志物，如年龄、IDH1突变、染色体臂1p及19q共缺失以及Ki-67的蛋白表达水平，所以本发明将CDC20-M与这几个成熟的预后诊断标志物进行多因素cox回归分析比较，所使用到的数据库涵盖了来自欧洲、美国及中国的共1305例病人样本(Rembrandt、GSE16011、TCGA及CGGA数据库)，结果如表1所示。可以发现，无论在哪个国家的数据库中，CDC20-M的风险比率(Hazardratio)相对于其他几个成熟的预后诊断标志物而言均更高，且是唯一一个同时在四个数据库中的结果均具有统计学意义的因素，这样的结果说明CDC20-M的表达预测预后的能力要比其他几个预后诊断因素更明显，且相对预后差异更大。年龄、IDH1突变、染色体臂1p及19q共缺失以及MKI67的表达均不能在四个数据库中稳定得到具有统计学意义的风险比率。而CIN70signature与常用预后诊断标志物的多因素cox回归分析得到的结果在GSE16011以及TCGA数据库中均不能作为一个独立的预后预测指标。CDC20-M另一个优势在于其风险比率在所有四个数据库的指标中均是最大的，意味着按照CDC20-M分组的病人，不同组间的生存期差异相较于其他指标而言最显著。以上结果说明，相对于现有的预后诊断标志物，CDC20-M在预后诊断预测上更加敏感，值得深入研究。

表1 CDC20-M与胶质瘤常规预后诊断标志物的多因素cox回归分析比较

注：表中的CDC20-M score表示CDC20-M成员的平均表达量，MKI67score表示表达蛋白Ki-67的基因MKI67的RNA表达水平。IDH1mutation及1p19q co-deletion这两个因素的风险比率(Hazard ratio)是以IDH1未突变及1p19q未同缺失的病人为参照得出。

为了建立一个稳定的CDC20-M/CREBRF-M分类标准，本发明以TCGA胶质瘤数据库中包含381个样本(胶质母细胞瘤160例，星形胶质细胞瘤69例，少突胶质细胞瘤91例，少突星形细胞瘤60例，无形态学诊断1例)的数据库作为训练集进行分类。选取TCGA数据库的依据是这个数据库是目前为止最权威的胶质瘤数据库平台，包含最全面的病人临床信息及表达、遗传学水平数据，以这个平台的样本作为训练集是最合适的。利用一致性聚类算法，TCGA训练集依照CDC20-M及CREBRF-M的表达水平(各基因表达量数据进行log2处理)分为了四组：CDC20-M high、CDC20-M intermediate、CREBRF-M intermediate以及CREBRF-M high组(图1中的A和B)。根据图1中B，确定采用CDC20-M基因群的表达量(基因群内各基因表达量的均值)与CREBRF-M基因群的表达量(基因群内各基因表达量的均值)比值大于0.96即可初步判定为CDC20-M high组。

具体如下：

基于围绕中心点划分(Partitioning around medoid,PAM)的一致性聚类算法(Consensus Clustering)是一种非监督类学习算法，适用于任何随机聚类分析，能够有效地鉴定差异分子表达模式和分类。此算法集成于R包ConsensusClusterPlus。本发明基于CDC20-M以及CREBRF-M在胶质瘤TCGA训练集中的样本一致性聚类步骤如下：

1.生成CDC20-M及CREBRF-M所有基因在TCGA训练集中的log2表达量文件；

2.打开Rstudio，导入此文件：edata<-read.table("1中生成文件.txt",sep＝"\t",header＝T)；

3.edata.m<-apply(edata[,X:Y],2,scale)；

4.library("ConsensusClusterPlus")；

5.

results＝ConsensusClusterPlus(edata.m,maxK＝6,reps＝1000,pItem＝0.9,pFeature＝1,title＝"TCGA_training",clusterAlg＝"pam",distance＝"euclidean",seed＝1262118388.71279,plot＝"png",writeTable＝T,verbose＝1)；

6.得到K＝2-10共9种聚类结果，选取最终聚类结果的依据是一致性矩阵图(Consensus matrix plot)要足够干净，尽量少出现中间过渡色，并且对应的CDF曲线要接近平行(起点接近0，终点接近1)。基于以上原则最终选取K＝4的分组结果，依据此分组将TCGA训练集样本分为四组：CDC20-M high,CDC20-M intermediate,CREBRF-Mintermediate以及CREBRF-M high。

与CDC20-M high和CDC20-M intermediate组相比，CREBRF-M high和CREBRF-Mintermediate组的病人具有更差的预后，CDC20-M high组与CREBRF-M high组病人间的风险比率为11.35，说明CDC20-M high组的病人相对CREBRF-M high组的病人死亡风险高出11.35倍(图1中的C)。CDC20-M分组与经典的形态学分类并不完全一致，每一个CDC20-M分组中均包含不同组织学分类的胶质瘤，CDC20-M high组病人年龄相对更大，而CREBRF-M high组病人ATRX和IDH1突变及1p19q共缺失现象发生得相对更多。以上结果说明，TCGA训练集采用一致性聚类算法得到的CDC20-M分类是独立于其他分组方式，可以很好地预测病人预后，也具有其特定的遗传学特征。

三、基于CDC20-M及CREBRF-M的独立样本预测

在得到稳定的CDC20-M分组后，本发明以TCGA训练集为基础，利用独立样本预测分析方法对其他来源的胶质瘤病人样本进行分组。在TCGA训练集中，对每个CDC20-M分类的组，分别计算CDC20-M及CREBRF-M中每个成员的平均表达量，所以对于每个分组而言都有139+120个成员的一套平均表达量，四个分组就有四套平均表达量，每一套平均表达量就叫做每组特异的表达模式(Centroid)。四个分组就有四个Centroid。本发明后续得到了CGGA的319例胶质瘤样本(胶质母细胞瘤140例，星形胶质细胞瘤67例，少突胶质细胞瘤40例，少突星形细胞瘤72例)及新的TCGA 301例低等级胶质瘤样本(星形胶质细胞瘤100例，少突胶质细胞瘤82例，少突星形细胞瘤54例，，无形态学诊断低等级胶质瘤65例)(TCGA验证集)，将新的每一个样本的CDC20-M及CREBRF-M的表达与centroid进行斯皮尔曼相关性分析，与其相关程度最高的centroid所在组即为此样本的组别。这样的独立样本预测分析方法的优势之一在于能保持不同来源样本的分组稳定性，且不受胶质瘤样本种类来源单一化的影响(如TCGA验证集中没有高等级胶质瘤，如果在此数据库内部做一致性聚类分析，则可能造成错误分组)，并且也能将大数据分析转化为独立样本预测，使得CDC20-M分型具有了临床实际运用价值。将两个数据库的每个样本进行逐一分组后，分别对其进行了表达热图分析、病人预后分析(图2)。通过分析结果发现，在两个数据库中，依据独立样本预测分析得到的CDC20-M分组的不同组之间在年龄、形态学分类及遗传学特征上均与TCGA训练集得到的结果一致，值得关注的是，在TCGA验证集中CDC20-M high组的病人相对CREBRF-M high组的病人死亡风险高出700.8倍，而此验证集中的胶质瘤样本均为低等级胶质瘤，一般而言低等级胶质瘤预后均较好，但通过CDC20-M的表达能分离出一群具有极差预后的低等级胶质瘤病人，说明了CDC20-M在预后预测上的灵敏性显著优于目前临床使用的形态学分类。在TCGA训练集中用CIN70signature表达进行同样的一致性聚类分析得到CIN70high组以及CIN70low组，在TCGA验证集以及CGGA数据库中依照独立样本预测的方法同样得到CIN70high以及CIN70low两组样本，两组病人的预后虽然存在显著性差异，但是CIN70high组的病人相对CIN70low组的病人死亡风险差异没有CDC20-M分类显著。以上在新的两个数据库中进行的独立样本预测分析的结果进一步证明了CDC20-M分组稳定的分类情况、遗传学特征及预后预测能力。

综上结果所示，在胶质瘤中依据CDC20-M/CREBRF-M表达量进行的分组在来自不同国家的数据库中均是稳定的，CDC20-M的分组能很好地将属于同一组织学分类或其他分类方式的病人从预后水平上区分开，并且在所有数据库中的病人预后诊断预测上均优于常规经典的预后诊断预测参数，高表达的CDC20-M是病人预后差及病情快速进展的标志。

实施例2、CDC20共表达基因网络作为胶质瘤治疗靶点

一、胶质瘤细胞的CDC20-M分型鉴定

本发明在细胞学水平上对CDC20-M进行了验证。使用到的细胞包括：5个通过手术切除的胶质瘤块经原代培养后传代培养的胶质瘤细胞(N5、N9、N33、N3及N8)；一个PDX来源胶质瘤细胞(PDX细胞)，以上六个胶质瘤细胞进行基因组鉴定均为IDH1/2野生型细胞；一个神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH(SK)作为别种肿瘤的对照，，以及作为正常参照的人类星形胶质细胞Human astrocytes(HA)。

使用到的所有胶质瘤细胞，除PDX细胞外，其余五个细胞(N5、N9、N33、N3及N8)均由北京天坛医院取得患者神经胶质瘤组织块(合作单位已完成伦理论证)，经本实验室原代培养、传代建立得到。PDX细胞由河北大学附属医院取得患者神经胶质瘤组织块，整个操作过程经过当地伦理委员会批准和患者和家属的知情同意。组织块经5周大雌性BALB/C裸鼠皮下种植后待生长达1.5cm³取出，分散成单细胞，以5×10⁵的细胞量颅内注射建立原位PDX模型后取出肿瘤块，经传代培养建立，建立PDX模型由合作单位完成。神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH(SK)购于国家实验细胞资源共享服务平台“http://www.cellresource.cn/”(货号：3111C0001CCC000086)人类星形胶质细胞Human astrocytes(HA)购于ScienCell公司(货号：1800)。

采用实时定量qPCR，检测了所有细胞中CDC20、AURKA及KIF2C三个CDC20-M核心基因的表达水平，引物公司及货号：CDC20Gene Expression Assays,(AppliedBiosystems,#Hs00426680_mH)；AURKAGene Expression Assays,(AppliedBiosystems,#Hs01582072_m1)；KIF2CGene Expression Assays,(AppliedBiosystems,#Hs00901710_m1)；UBCGene Expression Assays,(AppliedBiosystems,#Hs01871556_s1)。

结果如图3所示。以HA细胞中这三个核心基因的表达作为参照，可以发现PDX细胞、N5、N9及N33细胞这三个核心基因具有较高的表达，而N3、N8及SK细胞则较低。由定量qPCR的结果，本发明将PDX细胞、N5、N9及N33细胞归为CDC20-M high细胞，而N3和N8细胞为CDC20-Mlow细胞(三个核心基因的表达比HA高出1.5倍以上为CDC20-M high细胞；反之则为CDC20-Mlow细胞)。接下来将比较这两组具有不同CDC20-M核心基因表达量的胶质瘤细胞的基因组不稳定性差异。

二、CDC20-M核心基因在胶质瘤细胞中的靶向用药效果

尝试在胶质瘤细胞中对CDC20-M的种子基因CDC20进行靶向用药，使用到的药物为proTAME(R&D Systems,#I-440-01M)，为TAME的前体药物，由于TAME无法透过细胞膜，所以proTAME作为优化的TAME可以通过细胞膜后发挥TAME的活性作用，它的作用机理为与后期促进复合物APC相互作用，竞争性抑制CDC20与APC结合，使得CDC20无法激活APC的活性泛素化降解一系列相关蛋白，使得细胞分裂无法正常进入后期阶段。本发明对所有胶质瘤细胞均使用了不同浓度梯度的proTAME(图4)，发现除了PDX外，N5、N9及N33这三个高表达CDC20-M的细胞在24小时用药后均出现了细胞分裂抑制导致的细胞死亡，这三个胶质瘤细胞对proTAME的浓度相对敏感，IC50均小于20μM，已知proTAME导致的细胞分裂停滞也依赖纺锤体组装检测点SAC的活性，而CDC20-M成员中有纺锤体组装检测点SAC相关成员，它们与其他成员一起在细胞中高表达，与已知发现结果一致。而在N3及N8这两个CDC20-M低表达的胶质瘤细胞中，proTAME的作用效果则不明显，平均的IC50均大于25μM。而proTAME对HA细胞几乎不产生抑制作用，IC50大于50μM。以上结果说明靶向CDC20的用药在CDC20-M高表达的胶质瘤细胞中效果显著，而低表达CDC20-M的细胞对靶向CDC20的proTAME具有较高抗性。

虽然proTAME在CDC20-M高表达的胶质瘤细胞中具有相对较好的效果，但由于其的药物有效浓度过大，且由于其化学结构的特殊性在被人体吸收后进入血液循环被降解而无法产生活性，所以本发明接下来对CDC20-M的另一核心基因AURKA进行靶向用药实验，AURKA激酶在细胞周期调控中具有重要作用，它定位于中心体以及纺锤体微管靠近两级的位置，AURKA激酶调控中心体的成熟、纺锤体的组装，以及通过磷酸化相应底物控制有丝分裂进程。使用到的药物是MLN8237(Alisertib)(Selleck,#S1133)，MLN8237是第一个口服有效的小分子Aurora A激酶选择性抑制剂，经美国食品及药品管理局(Food and DrugAdministration，FDA)批准为口服临床肿瘤药物，其已在急性髓性白血病、乳腺癌中进入临床二期实验，在滤泡性淋巴癌、消化器官恶性肿瘤、口咽部肿瘤及生殖器官恶性肿瘤中进入临床一期实验(数据来源：https://clinicaltrials.gov/)。有研究发现在原发性骨髓纤维化中MLN8237能引起巨核细胞多倍体化和分化作用，也有研究发现其在胶质母细胞瘤中具有一定的抑癌效果。首先在胶质瘤细胞中对不同浓度梯度的MLB8237抑制效果进行了实验，发现在CDC20-M高表达的N5、N9及N33胶质瘤细胞中，MLN8237对细胞生长产生抑制效果的浓度比proTAME产生效果时的浓度低了100倍左右(IC50平均为0.05μM左右)，说明细胞对MLN8237非常敏感，而同样的浓度对HA细胞及CDC20-M低表达的胶质瘤细胞产生的作用非常有限(图5展示N33、N8及HA的药物作用曲线图，IC50结果以及其余细胞药物作用曲线展示于图6)。

由于在镜下观察MLN8237作用后的胶质瘤细胞不仅生长受到了抑制，很多细胞体积也变大了，结合阅读文献得知MLN8237在其他肿瘤中有发现促进细胞形成多倍体化的效果。为了探究MLN8237在胶质瘤中是否具有同样的效果，在MLN8237作用胶质瘤细胞3天后，利用Hochest 33342标记DNA，同时EdU标记处于S期DNA复制阶段的细胞，采用流式细胞术对胶质瘤细胞用药后的DNA含量及S期细胞比例进行了分析(图7及图8)，发现CDC20-M高表达的胶质瘤细胞对MLN8237的剂量更敏感，处于S期细胞比例在MLN8237用药后明显下降，多倍体细胞比例增加。对MLN8237未处理及处理后的活细胞单染Hoechest 33342后进行流式分析发现，在未用药的空白对照组中，80％以上的细胞DNA含量均为二倍体细胞DNA的含量(2N)，当使用了低于IC50值的MLN8237浓度0.03μM时，CDC20-M高表达的胶质瘤细胞DNA含量大于4N的细胞比例显著增加(10％-40％)，而CDC20-M低表达的胶质瘤细胞DNA含量大于4N的细胞比例均低于3％，HA细胞则低于1％。当MLN8237的浓度达到了0.12μM时，CDC20-M高表达的胶质瘤细胞大多数细胞均含有多于4N的DNA含量，N33含有大于4N的DNA含量的细胞比例更是高达90％，CDC20-M低表达的胶质瘤细胞含有大于4N的DNA含量的细胞比例依旧低于10％，HA细胞则低于5％(图9展示N33、N8及HA的统计结果，其余细胞的统计结果展示于图10)。说明MLN8237对CDC20-M高表达的胶质瘤细胞不仅具有极强的生长抑制作用，而且也能使得其细胞产生多倍体化，抑制细胞分裂。

综上所述，在CDC20-M高表达的胶质瘤细胞中，针对CDC20-M成员的核心基因CDC20及AURKA进行靶向用药均能得到很好的抑制效果，靶向针对AURKA的MLN8237更是能使CDC20-M高表达的胶质瘤细胞产生多倍体化现象。以上药物作用在CDC20-M低表达的胶质瘤细胞中效果不明显，对正常对照细胞HA也没有强烈的副作用，说明在CDC20-M高表达的胶质瘤细胞中针对CDC20-M成员的核心基因的用药是具有特异性的。

三、CDC20-M核心基因在PDX小鼠模型中的体内靶向用药效果

由于发现MLN8237在CDC20-M高表达的胶质瘤细胞中具有良好的效果，于是继续深入探究其在体内实验中是否也能对CDC20-M高表达的胶质瘤产生抑制作用，延长生存期。

使用到的体内实验对象为合作单位天津医科大学康春生教授课题组建立的胶质母细胞瘤的PDX小鼠原位模型。PDX小鼠原位模型构建方法具体如下：胶质母细胞瘤组织取自河北大学附属医院，病理科医生已做常规病理学诊断为GBM。患者为46岁男性，整个操作过程经过当地伦理委员会批准和患者和家属的知情同意。新鲜肿瘤组织取下后直接泡在无血清的DMEM中，立即在实验室超净台中用PBS清洗组织三遍，在无血清培养基中将肿瘤用组织剪剪成1mm³大小，离心收集肿瘤组织。预先将5周大雌性BALB/C裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司品系代码：401)用10％水合氯醛麻醉，在腋窝或腹股沟切约1-1.5cm切口，用血管钳分离皮下形成囊腔，种入0.4ml肿瘤组织，缝合伤口。待皮下肿瘤生长达1.5cm³，在无菌条件下取出肿瘤组织，将肿瘤切成0.5mm³大小碎块。加入含EDTA的胰蛋白酶在37℃中酶解1-2小时。收集细胞，并将细胞分散在含25mM葡萄糖的PBS中后并转染表达荧光素酶的慢病毒(吉凯基因)，以5×10⁵的细胞量颅内注射建立原位PDX模型(选择肿瘤大小及小鼠体重尽量一致的小鼠随机分为对照组9只，实验组10只)。

分析此PDX小鼠模型的胶质瘤的mRNA-seq数据得到CDC20-M/CREBRF-M表达量的比值为2.08±0.12(n＝4)，由此可知此PDX小鼠模型的胶质瘤属于CDC20-M高表达的胶质瘤。对此小鼠模型进行MLN8237用药实验。

MLN8237给药实验步骤如下：1、准备溶剂Arginine(Sigma,#A8094)25mg/ml溶于无菌水中，以2mg/ml的浓度向Arginine中加入MLN8237，加热至50℃直至溶解，注意操作避光；2、进行灌胃给药，给药剂量为20mg/kg，每只小鼠每次灌胃200μl(早晚各一次，隔一天一次给药)，对照组小鼠使用1中配制的Arginine溶剂，实验组小鼠使用1中配制的MLN8237溶液；3、每周进行一次体外荧光成像观察，记录小鼠体重变化以及肿瘤成像结果。4、待对照组小鼠全部死亡后，处死所有未死亡的实验组小鼠，取脑组织浸泡于福尔马林中后使用石蜡包埋，以备后续免疫组化实验。

结果显示：在给药的第10天、第17天、第24天以及第31天时，检测肿瘤荧光成像，发现在未口服MLN8237的对照组小鼠中，肿瘤的生长非常迅速，在第10天时与实验组小鼠肿瘤的荧光值还几乎一致(图11)，随着时间地推移，实验组小鼠的肿瘤荧光强度一直控制在2×10⁵以下，而对照组小鼠的肿瘤在第17天时已经生长到了平均荧光值接近20×10⁵，而到了31天时已经达到了60×10⁵(最高为140×10⁵)，超过实验组接近30倍。除了肿瘤生长的情况存在巨大差异外，实验组和对照组小鼠的生存期也差异很大(图12)，对照组小鼠在第34天时已经全部死亡(n＝9)，而在对照组小鼠全部死亡的时候，实验组小鼠还有80％的小鼠存活(n＝10)。由于需要对对照组及实验组小鼠脑内肿瘤进行免疫组化实验分析，小鼠死亡后脑组织会极速坏死，使得免疫组化实验结果不符合实际情况，所以在小鼠濒死时将脑组织福尔马林固定后进行石蜡包埋。实验组小鼠在对照组小鼠全部死亡的同时处死，取其脑组织固定后进行石蜡包埋。使用p-AURKA抗体(Thermo Fisher Scientific,#44-1210G,1:100稀释于PBS)以及p-H2A.X抗体(Thermo Fisher Scientific,#14-9865-82,clone ID:CR55T33,5μg/ml于PBS)对对照组及实验组小鼠的石蜡切片进行免疫组化实验(图13)，对照组小鼠肿瘤的p-AURKA抗体信号为强阳性，同时大量肿瘤细胞的p-H2A.X信号也为阳性，说明在对照组小鼠的胶质瘤中AURKA的表达活性仍旧很强，同时细胞也有活跃的DNA损伤修复应答机制。而在使用了MLN8237后的小鼠免疫组化结果中发现，p-AURKA及p-H2A.X的蛋白表达信号均有降低。

综上所述，MLN8237在PDX小鼠原位模型中也能对CDC20-M高表达的胶质瘤产生非常好的药效，不仅抑制了肿瘤的生长，延长了小鼠的生存期。同时免疫组化实验发现MLN8237确实抑制了肿瘤细胞中的p-AURKA的表达活性，而p-H2A.X的信号减弱也说明用药后的小鼠肿瘤DNA损伤现象减少了。在体外及体内的实验验证能够说明MLN8237确实可能成为CDC20-M高表达的胶质瘤特异性的靶向药物。

本实施例小结：

1、靶向CDC20-M核心基因表达的药物在CDC20-M高表达的胶质瘤细胞中更加有效

在这个部分中，本发明对细胞使用了常规化疗药物替莫唑胺发现作用不佳，但是当对细胞进行CDC20-M种子基因CDC20以及核心基因AURKA分别地靶向用药后发现结果出现了差异，CDC20-M高表达的胶质瘤细胞对proTAME(抑制CDC20与APC结合的特异性药物)以及MLN8237(特异性抑制AURKA磷酸化活性的药物)十分敏感，而相对而言CDC20-M低表达的胶质瘤细胞以及正常人类星形细胞均不敏感。流式实验发现MLN8237用药后，CDC20-M高表达胶质瘤细胞出现了与药物浓度相关的多倍体化倾向，抑制其细胞分裂速率。以上实验得到的结果非常令人振奋，靶向CDC20-M核心基因的药物能特异性的在CDC20-M高表达的胶质瘤细胞中产生很好的抑制作用，而对其他胶质瘤细胞的作用很微弱，说明这样的药物有可能在某一群胶质瘤病人产生非常好的疗效。

2、靶向CDC20-M核心基因AURKA的药物能够有效抑制PDX小鼠肿瘤生长，延长生存期

为了更进一步地验证在体外细胞实验中得到的结果，本发明对注射入CDC20-M高表达胶质瘤细胞的PDX小鼠模型进行了MLN8237用药实验。结果与猜想一致，与对照组PDX小鼠相比，口服了MLN8237的小鼠颅内的胶质瘤生长受到了明显抑制，31天的时间内均没有明显增大的情况，而对照组小鼠的肿瘤生长十分迅速，导致对照组小鼠在34天时已经全部死亡，而实验组小鼠还有80％的存活率。对未服药小鼠以及服药后小鼠颅内胶质瘤进行的免疫组化实验发现，服药后的小鼠胶质瘤的p-AURKA以及p-H2A.X蛋白表达均有明显地下降，说明MLN8237的药物确实作用于了AURKA，而且显著降低了胶质瘤中的DNA损伤事件发生几率。以上实验进一步证明了靶向CDC20-M核心基因AURKA的药物MLN8237十分有效，能够显著地抑制肿瘤的生长，延长小鼠的生存时间以及DNA损伤的情况，MLN8237可能成为CDC20-M高表达的胶质瘤病人特异性的靶向药物。

Claims (10)

1.抑制剂在如下任一中的应用：

(A1)制备用于治疗胶质瘤的产品；

(A2)治疗胶质瘤；

所述抑制剂为能够降低如下基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平的物质：AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因。

2.抑制剂在如下任一中的应用：

(B1)制备用于抑制胶质瘤细胞生长和/或增殖的产品，或抑制胶质瘤细胞生长和/或增殖；

(B2)制备用于促进胶质瘤细胞多倍体化的产品，或促进胶质瘤细胞多倍体化；

(B3)制备用于抑制胶质瘤体积增大的产品，或抑制胶质瘤体积增大；

(B4)制备用于延长胶质瘤患者生存期，或延长胶质瘤患者生存期；

(B5)制备用于抑制胶质瘤或胶质瘤细胞中的p-AURKA蛋白的活性和/或表达水平的产品，或抑制胶质瘤或胶质瘤细胞中的p-AURKA蛋白的活性和/或表达水平；

(B6)制备用于减少胶质瘤或胶质瘤细胞中DNA损伤的产品，或减少胶质瘤或胶质瘤细胞中DNA损伤；

(B7)制备用于抑制胶质瘤或胶质瘤细胞中的p-H2A.X蛋白的活性和/或表达水平的产品，或抑制胶质瘤或胶质瘤细胞中的p-H2A.X蛋白的活性和/或表达水平；

所述抑制剂为能够降低如下基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平的物质：AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述胶质瘤为CDC20-M高表达胶质瘤；所述胶质瘤细胞为CDC20-M高表达胶质瘤细胞；

所述CDC20-M高表达胶质瘤细胞是指CDC20-M核心基因的表达量高于对照细胞的胶质瘤细胞；所述CDC20-M核心基因为AURKA基因、CDC20基因和KIF2C基因；所述对照细胞为人星形胶质细胞；

所述CDC20-M高表达胶质瘤是指CDC20-M基因群的表达量与CREBRF-M基因群的表达量的比值大于0.96的胶质瘤；或者

所述CDC20-M高表达胶质瘤是按照包括如下步骤的方法确定的属于CDC20-Mhigh组的胶质瘤：

第一步：按照包括如下步骤的方法建立胶质瘤患者分型模型：

b1)获得n个待测胶质瘤患者的所述CDC20-M基因群和所述CREBRF-M基因群中各基因的表达量数据，并进行log2处理，得到各基因log2后的表达量数据；

b2)利用一致性聚类算法，根据步骤b1)所得各基因log2后的表达量数据，将所述n个待测胶质瘤患者分为四组，CDC20-M high组、CDC20-M intermediate组、CREBRF-Mintermediate组和CREBRF-M high组；

b3)针对每个分组，分别计算组内所述CDC20-M基因群和所述CREBRF-M基因群中各基因的平均表达量，每个分组组内所述CDC20-M基因群和所述CREBRF-M基因群中各基因的平均表达量即为该组特异的表达模式Centroid；

第二步：获得所述待测胶质瘤患者的CDC20-M基因群和CREBRF-M基因群中各基因的表达量数据，并进行log2处理，得到各基因log2后的表达量数据；

第三步：将第二步所得的各基因log2后的表达量数据与第一步所建立的胶质瘤患者分型模型中的Centroid进行斯皮尔曼相关性分析，相关程度最高的Centroid所在组即为所述待测胶质瘤患者所在的组别；

所述CDC20-M基因群由如下139个基因组成：ASF1B、ASPM、AURKA、AURKB、BIRC5、BRCA1、BUB1、BUB1B、BUD31、C11orf82、CASC5、CASP2、CCNA2、CCNB1、CCNB2、CDC20、CDC25A、CDC45、CDC6、CDCA2、CDCA3、CDCA7、CDCA7L、CDCA8、CDK1、CDK2、CDKN2C、CDKN3、CENPA、CENPE、CENPF、CENPK、CENPN、CENPW、CEP55、CHEK1、CKAP2L、CKS2、DBF4、DDX39A、DEPDC1、DEPDC1B、DLGAP5、DNMT1、DSN1、DTL、DTYMK、E2F7、ECT2、EME1、ESPL1、FAM64A、FANCD2、FANCI、FBXO5、FOXM1、GAS2L3、GINS1、GINS2、GJC1、GPX7、GTF2IRD2、GTSE1、HJURP、HMGB2、HMMR、IGF2BP3、KIAA0101、KIF11、KIF14、KIF15、KIF20A、KIF23、KIF2C、KIF4A、KIFC1、KNTC1、KPNA2、LMNB1、LMNB2、LRR1、MAD2L1、MCM2、MCM3、MCM6、MCM8、MELK、MKI67、MLF1IP、MND1、MYBL2、NCAPG、NCAPG2、NCAPH、NDC80、NEK2、NRM、NUF2、NUSAP1、PARPBP、PBK、PCNA、PDIA4、POC1A、POLE2、PRC1、PTBP1、PTTG1、RACGAP1、RAE1、RBBP8、RFC2、RFC3、RFC4、RNASEH2A、RRM2、SGOL2、SHCBP1、SMC4、SNRPB、SPAG5、SPC24、STIL、TACC3、TCF3、TIMELESS、TK1、TMEM48、TOP2A、TPX2、TRIP13、TTK、TYMS、UBE2C、UBE2S、USP1、ZNF765、ZNF850、ZWINT；

所述CREBRF-M基因群由如下120个基因组成：ABLIM1、ACADSB、ADARB2、ADD3、AKAP6、AKR1C1、ANKRD46、ARHGAP32、ATP6V1G2、AVPI1、CAB39L、CBX7、CCDC85A、CDS2、CHIC1、CPEB3、CREBRF、CRY2、CRYZL1、DCUN1D5、DNAJC12、EIF1、EZH1、FAIM2、FBRSL1、FBXL20、FBXO9、FRY、FSTL5、GABARAPL1、GABBR1、GABRG1、GARNL3、GRAMD1B、GTDC1、GTF2H5、HDAC4、HERC1、HLF、HMGCLL1、IGIP、IKZF5、JMY、KSR2、MAGEE1、MAPK10、MINOS1、MKX、MLLT6、MXI1、MYCBP2、NALCN、NAP1L2、NAP1L3、NCAM1、NCOA2、NEBL、NEGR1、NR1D2、NTRK2、OIP5-AS1、PAPOLG、PCGF5、PELI3、PIAS1、PLA2G6、PLEKHM3、POU6F1、PPM1A、PPM1L、PPP1R12B、PPP1R3E、PPP1R3F、PURA、RAB11FIP2、RABGGTB、RELN、REPS2、RPL37、RPS6KA5、RUNDC3A、SCAMP1、SCAPER、SEC62、SERP2、SGSM1、SH3BGRL2、SKP1、SLC12A6、SLK、SPTAN1、TBRG1、TEF、TOM1L2、TTBK2、TUB、UQCRB、USP46、VPS13D、YPEL3、YPEL4、ZBTB4、ZBTB44、ZMYND11、ZNF540、ZRANB1、ADRBK2、KIAA0240、LOC283588、AGXT2L1、LOC283713、SEPT8、KIAA0368、C7orf41、GABARAPL3、FAM190B、BZRAP1、KIAA1107、LOC157562、KIAA1377。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述抑制剂为靶向AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因的药物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述药物为靶向AURKA基因的药物；所述靶向AURKA基因的药物为Aurora A激酶选择性抑制剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述Aurora A激酶选择性抑制剂为MLN8237。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述药物为靶向CDC20基因的药物；所述靶向CDC20基因的药物为能够竞争性抑制CDC20与后期促进复合物APC相互结合的药物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述能够竞争性抑制CDC20与后期促进复合物APC相互结合的药物为proTAME。

9.如下任一方法：

方法A：一种制备生长和/或增殖受到抑制的胶质瘤细胞模型的方法，包括如下步骤：降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平；

方法B：一种制备多倍体化胶质瘤细胞模型的方法，包括如下步骤：降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平；

方法C：一种制备p-AURKA蛋白的表达活性和/或表达水平受到抑制的胶质瘤细胞模型的方法，包括如下步骤：降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平；

方法D：一种制备DNA损伤减少的胶质瘤细胞模型的方法，包括如下步骤：降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平；

方法E：一种制备p-H2A.X蛋白的表达活性和/或表达水平受到抑制的胶质瘤细胞模型的方法，包括如下步骤：降低所述胶质瘤细胞中AURKA基因、CDC20基因和/或KIF2C基因或其编码蛋白的活性和/或表达水平。

10.利用权利要求9所述方法制备得到的细胞模型。