KR20150139537A

KR20150139537A - 수지상 세포의 반응 유전자 발현, 물질의 조성물 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20150139537A
Application number: KR1020157029080A
Authority: KR
Inventors: 아비브 레게브; 알렉산더 케이 샬렉; 라훌 사티자; 홍건 박
Original assignee: 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드; 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지; 매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2015-12-11
Also published as: EP2971116A4; IL241294A0; EP2971116A1; US10870885B2; AU2014232794A1; JP2016515383A; WO2014145631A1; CA2904099A1; RU2015144160A; CN105683392A; US20150368719A1

Abstract

본 발명은 일반적으로, 다양한 치료적 및/또는 진단적 적응증(indication)에서, 수지상 세포(DC)의 반응(들), 예를 들어, 수지상 세포의 성숙, 수지상 세포의 항바이러스 반응(들) 및/또는 수지상 세포의 염증 반응(들)을 조정하거나, 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 조절 네트워크를 확인하기 위한 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 수지상 세포의 반응(들)을 조정하거나, 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 조절 네트워크를 활용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

수지상 세포의 반응 유전자 발현, 물질의 조성물 및 이의 사용 방법{DENDRITIC CELL RESPONSE GENE EXPRESSION, COMPOSITIONS OF MATTERS AND METHODS OF USE THEREOF}

관련 출원

본 출원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 61/787,378을 우선권으로 주장하며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

연방 정부 지원 연구에 관한 언급

본 발명은 하기의 보조금 하에 정부의 지원을 받아 이루어졌다: 미국 국립 보건원에 의해 수여되는 선구 보조금 DP1OD003958-01; 미국 국립 보건원에 의해 수여되는 선구 보조금 5DP1OD003893-03; 미국 국립 보건원에 의해 수여되는 게놈 과학 우수 센터(Centers of Excellence in Genomics Science) 보조금 1P50HG006193-01; 미국 국립 인간 게놈 연구소에 의해 수여되는 보조금 1P01HG005062-01; 및 미국 국립 보건원에 의해 수여되는 보조금 1F32HD075541-01. 정부는 본 발명에 소정의 권리를 가진다.

기술분야

항바이러스 반응, 염증 반응, 성숙, T 세포 및 B 세포의 보충(recruitment)을 비롯한 수지상 세포의 반응을 제어하는 분자 회로(molecular circuit)들은 이들의 중요성에도 불구하고, 대체로 알려진 바가 없거나 논의된 바가 없다. 수지상 세포에서의 조절 네트워크를 재구성한 최근의 연구는, 전체 집단에 걸쳐서 신호를 검출하는 데 실패할 수 있으며/있거나 세포의 소정의 서브셋에서만 발현되는 신호(들)를 구별하는 데 실패할 수 있는, 세포 집단에 걸친 측정에 중점을 두었다. 이에, 다양한 치료적 및 진단적 방법에서, 수지상 세포의 반응을 조정하거나, 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 네트워크, 및 이 네트워크를 활용하는 수단을 보다 잘 이해할 필요가 있다.

본 발명은, 하나 이상의 수지상 세포 반응을 조정하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조정하는"은, 하나 이상의 유전자의 발현을 상향조절하거나 그렇지 않다면 증가시키는 것; 하나 이상의 유전자의 발현을 하향조절하거나 그렇지 않다면 감소시키는 것; 하나 이상의 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 저해하거나 그렇지 않다면 감소시키는 것; 하나 이상의 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 중화시키거나 그렇지 않다면 불활성화시키는 것; 및/또는 하나 이상의 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 증강시키거나 그렇지 않다면 증가시키는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "수지상 세포의 반응을 조정하는"은, 임의의 다양한 수지상 세포의 기능 및/또는 활성을 조정하는 것을 포함하며, 비제한적인 예로, 수지상 세포의 성숙을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 수지상 세포의 면역 반응을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 수지상 세포의 항바이러스성 면역 반응, 예를 들어, 코어 항바이러스 반응 및/또는 이차 항바이러스 반응을 비롯한 수지상 세포의 항바이러스성 면역 반응을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 수지상 세포의 염증 면역 반응, 예를 들어, 유도성 염증 반응 및/또는 가파른 정점 염증 반응(sharped peak inflammatory response)을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 수지상 세포의 Toll-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR) 반응을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; T 세포 및 B 세포 보충을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; T_H1-세포 반응(들)의 DC 촉진을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; T_H2-세포 반응(들)의 DC 유도를 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; DC의 다운스트림에 있는 임의의 세포에 대한 DC 유도, 영향 또는 다른 효과를 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 조절 T 세포(Treg), Th17 세포, 기억 T 세포 및 다른 T 세포를 비롯한 T 세포의 DC 유도를 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 예를 들어, 성숙한 표현형과 미성숙한 표현형 사이에서 및/또는 DC의 서브셋들 사이에서, DC 표현형의 시프트(shift)를 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 수지상 세포의 적어도 하나의 기능 또는 생물학적 활성을 조작하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 병원체-구동성 T 세포 극성화의 수지상 세포 제어를 조작하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 및/또는 DC에 의해 분비되는 사이토카인, 케모카인 및 다른 분자들의 생성을 조작하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것을 포함한다.

본 발명은 하나 이상의 수지상 세포 반응(들)을 조정하는 조정제를 제공한다. 적합한 조정제로는 항체, 가용성 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 제제, 펩타이드 제제, 핵산 제제, 핵산 리간드 또는 저분자 제제를 포함한다.

본 발명은 "코어 항바이러스" 유전자 시그너처, "이차 항바이러스" 유전자 시그너처, "성숙" 유전자 시그너처, "유도성 염증" 유전자 시그너처 및 "샤프 정점(sharp peaked) 염증" 유전자 시그너처를 비롯한 일련의 유전자 시그너처들을 제공한다. 이들 시그너처는 단일 세포의 응집성 기(coherent group)와 같은 단일 세포에 걸친 유전자 발현 값을 클러스터링(clustering)함으로써 확인되었다. 일부 구현예에서, 이들 시그너처는 이전에 확인된 시그너처를 상당히 개선하고 향상시킨다. 일부 구현예에서, 이들 시그너처는, 세포 집단 측정 시 존재하지 않거나 신뢰할만하게 검출될 수 없는 신호를 생성한다.

"코어 항바이러스" 유전자 시그너처는 반응성 수지상 세포의 가장 초기에 유도된다. "성숙" 유전자 시그너처는 집단 수준에서 "유도성 염증" 유전자 시그너처와 유사하게 보이지만, 단일 세포 분석을 이용하여, "성숙" 유전자 시그너처는 세포의 서브셋에서만 발현되는 것으로 구축되었다. "성숙" 유전자 시그너처는, 수지상 세포가 T 세포 및 B 세포를 보충할 수 있게 하며, 그로 인해 내재성 면역계 및 적응성 면역계 사이의 간극을 연결하는 데 관여한다.

이들 유전자는 다수의 적응증에 사용하기 위한 표적, 예를 들어, 면역 반응의 치료 및/또는 진단을 위한 표적, 이식 및 다른 치료적 적응증에서 면역 반응, 예를 들어, 염증을 모니터링하기 위한 표적 및/또는 백신 개발을 위한 표적이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 시그너처 유전자는 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A(즉, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A)에 열거된 것들로부터 선택된다.

원하는 표적 유전자 또는 표적 유전자들의 조합이 선택되며, 선택된 표적 유전자(들)가 수지상 세포의 반응 동안에 과발현 또는 저발현되는지 결정된 후, 적합한 길항제 또는 작용제가 원하는 성숙 및/또는 기능 결과에 따라 사용된다. 적합한 길항제 및/또는 작용제로는, 항체, 가용성 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 제제, 펩타이드 제제, 핵산 제제, 핵산 리간드 또는 저분자 제제를 포함한다.

조정제는, 수지상 세포-관련 동요(perturbation)에 반응성인 유전자로서 확인된 하나 이상의 표적 유전자, 또는 하나 이상의 표적 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현을 조정하는 데 사용된다. 이들 표적 유전자는, 예를 들어, 수지상 세포를 조정제와 접촉시킨 후, 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현에 대한 효과가 존재하는 경우 그 효과를 모니터링함으로써 확인된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시그너처 유전자는 표 1 내지 표 5A에 열거된 것들로부터 선택된다. 조정제는 하나 이상의 표적 유전자, 또는 하나 이상의 표적 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현에 직접적으로 작용할 수 있고/있거나 조정제는 표적 유전자(들)와 연관있는 것으로 알려진 유전자 또는 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 조정함으로써 하나 이상의 표적 유전자, 또는 하나 이상의 표적 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현에 간접적으로 작용할 수 있다.

일부 구현예에서, 표적 유전자는 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor; TNFR)이다. 일부 구현예에서, 조정제는 TNFR의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 조정제는 TNFR과 연관있는 유전자, 예컨대 비제한적인 예로, 하기 표 6에 나타낸 것들 유래의 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다.

일부 구현예에서, 표적 유전자는 Toll/인터루킨-1 수용체(TIR) 도메인-함유 어댑터 단백질(TIRAP)이다. 일부 구현예에서, 조정제는 TIRAP의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 조정제는 TIRAP과 연관있는 유전자, 예컨대 비제한적인 예로, 표 7에 나타낸 것들 유래의 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다.

일부 구현예에서, 표적 유전자는 Stat1이다. 일부 구현예에서, 조정제는 Stat1의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 조정제는 Stat1과 연관있는 유전자, 예컨대 비제한적인 예로, 표 8에 나타낸 것들 유래의 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다.

일부 구현예에서, 표적 유전자는 인터페론 생성 조절자(IFNR)이다. 일부 구현예에서, 조정제는 IFNR의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 조정제는 IFNR과 연관있는 유전자, 예컨대 비제한적인 예로, 표 9에 나타낸 것들 유래의 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다.

일부 구현예에서, 표적 유전자는 하기 표 10, 표 11 또는 표 12에 열거된 것들 유래의 하나 이상의 유전자이다. 일부 구현예에서, 조정제는 표적 유전자(들)의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다.

일부 구현예에서, 본 발명은, a) 수지상 세포를, 수지상 세포 반응의 저해제 또는 수지상 세포의 반응을 증강시키는 제제와 접촉시키는 단계; 및 b) 발현이 단계 (a)에 의해 조정되는 유전자 또는 유전적 요소를 확인하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 반응과 연관있는 유전자 또는 유전적 요소를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 또한, c) 수지상 세포 반응의 저해제 또는 수지상 세포의 반응을 증강시키는 제제와 접촉된 수지상 세포에서 단계 b)에서 확인되는 유전자 또는 유전적 요소의 발현을 동요시키는 단계; 및 d) 발현이 단계 c)에 의해 조정되는 유전자를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 길항제 및/또는 작용제는 항체, 가용성 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 길항제, 펩타이드 길항제, 핵산 길항제, 핵산 리간드 또는 저분자 길항제이다.

일부 구현예에서, 본 발명은, 수지상 세포를, 표 1 또는 표 1A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 조정하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 수지상 세포 반응(들)을 조정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은, 수지상 세포를, 표 2 또는 표 2A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 조정하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 수지상 세포 반응(들)을 조정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은, 수지상 세포를, 표 3 또는 표 3A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 조정하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 수지상 세포 반응(들)을 조정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은, 수지상 세포를, 표 4 또는 표 4A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 조정하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 수지상 세포 반응(들)을 조정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은, 수지상 세포를, 표 5 또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 조정하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 수지상 세포 반응(들)을 조정하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 검출하는 단계, 및 검출된 수준을, 시그너처 유전자 또는 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준의 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 진단하는 방법을 제공하며, 여기서, 검출된 수준과 대조군 수준 간의 차이는 개체에 면역 반응이 존재함을 가리킨다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 자가면역 반응이다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 자가면역 반응과 연관있는 염증 반응(들) 및/또는 감염성 질환 또는 다른 병원체-기재의 장애와 연관있는 염증 반응(들)을 비롯한 염증 반응이다.

일부 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물, 예를 들어, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제1 시점에서 검출하는 단계, 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물, 예를 들어, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제2 시점에서 검출하는 단계, 및 제1 시점에서 검출된 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제2 시점에서 검출된 발현, 활성 및/또는 기능의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 모니터링하는 방법을 제공하며, 여기서, 제1 시점에서 검출된 수준과 제2 시점에서 검출된 수준 간의 변화는 개체에서 면역 반응의 변화를 가리킨다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 자가면역 반응이다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 염증 반응이다.

일부 구현예에서, 본 발명은, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 검출하는 단계, 및 검출된 수준을 시그너처 유전자 또는 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준의 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 비정상적인 수지상 세포 반응을 진단하는 방법을 제공하며, 여기서, 검출된 수준과 대조군 수준 간의 차이는 개체에 비정상적인 수지상 세포 반응이 존재함을 가리킨다. 일부 구현예에서, 비정상적인 수지상 세포 반응은 자가면역 반응이다. 일부 구현예에서, 비정상적인 수지상 세포 반응은 자가면역 반응과 연관있는 염증 반응(들) 및/또는 감염성 질환 또는 다른 병원체-기재의 장애와 연관있는 염증 반응(들)을 비롯한 염증 반응이다. 일부 구현예에서, 비정상적인 수지상 세포 반응은 T 세포 및 B 세포를 보충하는 수지상 세포의 능력의 변경이다. 일부 구현예에서, 비정상적인 수지상 세포 반응은 반응의 부재이다. 일부 구현예에서, 비정상적인 수지상 세포 반응은 수지상 세포 반응의 감소이다. 일부 구현예에서, 비정상적인 수지상 세포 반응은 수지상 세포 반응의 증강이다.

일부 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물, 예를 들어, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제1 시점에서 검출하는 단계, 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물, 예를 들어, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제2 시점에서 검출하는 단계, 및 제1 시점에서 검출된 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제2 시점에서 검출된 발현, 활성 및/또는 기능의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 비정상적인 수지상 세포 반응을 모니터링하는 방법을 제공하며, 여기서, 제1 시점에서 검출된 수준과 제2 시점에서 검출된 수준 간의 변화는 개체에서 수지상 세포의 반응의 변화를 가리킨다. 일부 구현예에서, 수지상 세포의 반응은 자가면역 반응이다. 일부 구현예에서, 수지상 세포의 반응은 염증 반응이다. 일부 구현예에서, 수지상 세포의 반응은 T 세포 및 B 세포를 보충하는 수지상 세포의 능력이다.

본원에 제공되는 조성물 및 방법 중 임의의 것에서 사용되기에 적합한 조정제(들)로는, 항체, 가용성 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 제제, 펩타이드 제제, 핵산 제제, 핵산 리간드 또는 저분자 제제를 포함한다.

일부 구현예에서, 조정제는, "코어 항바이러스" 유전자 시그너처 유래의 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 표 1 및 1A에 열거된 것들 유래의 하나 이상의 유전자의 발현을 조정하는 데 사용된다. 본원에서, 이들 조정제는 "코어 항바이러스 조정제(들)"로 지칭된다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 코어 항바이러스 조정제는 키나제, 예컨대 비제한적인 예로, MAPK1, EIF2AK2, TBK1, PLK4, IKBKE, PLK2, MAP3K7, CHUK, JAK1, CRKL, MKNK2, TYK2, RPS6KB2, IKBKB, MKNK1, NEK7, PIK3R2, IKBKG, RIPK2, MAP2K6, MET, RPS6KB1, MARK2, DGKA 및 BUB1B로 이루어진 군으로부터 선택되는 키나제이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 코어 항바이러스 조정제는 막관통 수용체, 포유류 내인성 화학적 약물, 화학적 약물, 예를 들어, 화학적 키나제 저해제 약물 또는 다른 화학적 약물, 예컨대 화학적 시약, 독성제 또는 다른 화학적 약물, 생물학적 약물 또는 이들의 임의의 조합이다. 적합한 코어 항바이러스 조정제로는, 본원에 기술된 것들 중 임의의 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 조정제는, "이차 항바이러스" 유전자 시그너처 유래의 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 표 2 및 2A에 열거된 것들 유래의 하나 이상의 유전자의 발현을 조정하는 데 사용된다. 본원에서, 이들 조정제는 "이차 항바이러스 조정제"로 지칭된다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 이차 항바이러스 조정제는 키나제, 막관통 수용체, 비-포유류 내인성 화학적 약물, 화학적 약물, 예를 들어, 화학적 키나제 저해제 약물 또는 또 다른 화학적 약물, 예컨대 화학적 시약, 독성제 또는 다른 화학적 약물, 또는 이들의 임의의 조합이다. 적합한 이차 항바이러스 조정제로는, 본원에 기술된 것들 중 임의의 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 조정제는, "성숙" 유전자 시그너처 유래의 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 표 3 및 3A에 열거된 것들 유래의 하나 이상의 유전자의 발현을 조정하는 데 사용된다. 본원에서, 이들 조정제는 "성숙 조정제"로 지칭된다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 성숙 조정제는 키나제, 막관통 수용체, 포유류 내인성 화학적 약물, 비-포유류 내인성 화학적 약물, 화학적 약물, 예를 들어, 화학적 키나제 저해제 약물 또는 또 다른 화학적 약물, 예컨대 화학적 시약, 화학적 독성제 또는 다른 화학적 약물, 생물학적 약물, 또는 이들의 임의의 조합이다. 적합한 성숙 조정제로는, 본원에 기술된 것들 중 임의의 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 조정제는, "정점 염증" 유전자 시그너처 유래의 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 표 4 및 4A에 열거된 것들 유래의 하나 이상의 유전자의 발현을 조정하는 데 사용된다. 본원에서, 이들 조정제는 "정점 염증 조정제"로 지칭된다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 정점 염증 조정제는 키나제, 예컨대 비제한적인 예로, 키나제, 막관통 수용체, 포유류 내인성 화학적 약물, 비-포유류 내인성 화학적 약물, 화학적 약물, 예를 들어, 화학적 키나제 저해제 또는 또 다른 화학적 약물, 예컨대 화학적 시약, 독성제 또는 다른 화학적 약물, 생물학적 약물 또는 다른 조정제, 또는 이들의 임의의 조합이다. 적합한 정점 염증 조정제로는, 본원에 기술된 것들 중 임의의 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 조정제는, "유도성 염증" 유전자 시그너처 유래의 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 표 5 및 5A에 열거된 것들 유래의 하나 이상의 유전자의 발현을 조정하는 데 사용된다. 본원에서, 이들 조정제는 "유도성 염증 조정제"로 지칭된다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 유도성 염증 조정제는 키나제, 막관통 수용체, 포유류 내인성 화학적 약물, 비-포유류 내인성 화학적 약물, 화학적 약물, 예컨대 화학적 키나제 저해제 또는 또 다른 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 화학적 시약, 화학적 독성제 또는 다른 화학적 약물, 생물학적 약물 또는 이들의 임의의 조합이다. 적합한 정점 염증 조정제로는, 본원에 기술된 것들 중 임의의 것을 포함한다.

당업자는, 조정제가 다양한 용도들을 가진다는 것을 알게 될 것이다. 예를 들어, 조정제는 본원에 기술되는 바와 같은 치료제로서 사용된다. 조정제는 스크리닝 분석법, 진단 키트에서 시약으로서, 또는 진단 도구로서 사용될 수 있거나, 이들 조정제는 경쟁 분석법에서 치료 시약을 생성하는 데 사용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1h는, LPS-자극된 BMDC의 단일 세포 RNA-Seq가 광범위한 전사체 이종성을 나타내었음을 도시하는 일련의 그래프 및 도면이다. 이들 도면의 컬러 버전은 문헌[Shalek et al., "Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells." Nature 498(7453):236-40 (2013); doi: 10.1038/nature12172]에서 확인할 수 있다. 도 1a 내지 도 1c는, 2개의 10,000개 세포 집단 복제물(도 1a), 2개의 단일 세포(도 1b), 및 '평균' 단일 세포와 집단 측정(도 1c) 간의 전사 발현 수준(x-축 및 y-축: log-척도의 TPM+1)의 상관도를 도시한 것이다. 피어슨 상관도 계수(Pearson correlation coefficient)(r)는 상부 좌측 코너에 표시되어 있다. 도 1d 및 도 1e는 전사의 예를 도시한 것이다. 각각의 단일 세포(y-축에서 "1") 및 3개의 집단 복제물(y-축에서 "10,000")에서 3개의 비-가변 유전자(도 1d) 및 4개의 가변 유전자(도 1e)에 대한 RNA-Seq 판독 밀도가 도시되어 있다. 도 1f 내지 도 1h는 각각의 전사의 RNA-FISH를 도시한 것이다. 변동률이 더 낮은 유전자 Il6(상부 패널, n=3193 세포) 및 변동률이 더 높은 유전자 Cxcl1(하부 패널, n=3193 세포)에 대한 RNA-FISH 염색의 현미경 사진(log 여과됨(log filtered), (도 1f, 도 1g)) 및 발현 수준의 분포(도 1h)가 도시되어 있다. 세포 경계들은 옅은 회색 윤곽으로 표시된다.
도 2a 내지 도 2c는 단일 세포에 대한 발현 수준의 바이모달(bimodal) 변동을 도시한 일련의 그래프 및 도면이다. 이들 도면의 컬러 버전은 문헌[Shalek et al., "Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells." Nature 498(7453):236-40 (2013)]에서 확인할 수 있다. 도 2a는 광범위한 발현 수준 범위에서 세포간 변동을 도시한 것이다. 단일 세포의 발현 평균(μ, X 축)과 단일 세포의 가변성(표준 편차, σ, Y 축) 간의 관계가 도시되어 있다. 청색 파선(즉, 상부)은 평균 발현 수준에 대한 이론학적 최대 표준 편차를 가리키며(실시예 1); 회색 파선(즉, 하부)은 일정한 파노 인자(Fano factor)(σ/μ = 0.25)를 지정한다. 면역 반응 및 하우스키핑 유전자는 각각 자홍색 및 녹색으로 표시되며; 옅은 청색의 음영 영역은 단일 세포의 평균 TPM이 250 미만임을 나타낸다. 주목할만하게는, 높은 평균 발현 수준에서도, BMDC 반응 요소는 실질적인 가변성(좌측)을 나타내며, 한편 hESC는 실질적인 가변성을 나타내지 않는다(우측)(문헌[Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012)]). 도 2b는 가장 높게 발현된 유전자 522개의 세포간 변동을 도시한 것이다. 각각의 유전자 (열, 낮음(상부)부터 높음(하부)까지 파노 인자에 의해 소팅됨) 및 각각의 발현 수준 구간(bin)(컬럼)에 대해, 유전자가 구간 정의된 수준에서 발현되는 세포의 수(짙은 황색: 18개 세포; 검정색: 0개 세포)가 도시되어 있다. 유전자는 이들의 평균 단일 세포 발현 수준을 토대로 선택된다(TPM이 250 초과, (도 2a)에서 백색 영역). 회색 파선은 (도 2a)에서 강조된 일정한 파노 인자(0.25)를 지정한다. 도 2c는 281개의 저-가변성 유전자(상부) 및 241개의 매우 가변성인 유전자(하부)에 대한 평균 발현 확률 밀도 분포를 도시한 것이다.
도 3a 내지 도 3d는 단일 세포들 간의 이소폼 사용의 변동을 도시한 일련의 그래프 및 도면이다. 이들 도면의 컬러 버전은 문헌[Shalek et al., "Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells." Nature 498(7453):236-40 (2013)]에서 확인할 수 있다. 도 3a는 개별 세포들 간에 상당한 스플라이싱 차이를 가진 유전자의 예를 도시한 것이다. 2개의 예시적인 유전자 좌의 경우 18개 단일 세포(1, 청색) 및 3개 집단 복제물(10K, 회색) 각각에 대한 RNA-Seq 판독 밀도가 도시되어 있으며, 각각은 2개의 상이한 이소폼을 가진다(하부). 도 3b는, 개별 세포(청색 히스토그램, 상부) 및 집단(회색 히스토그램, 하부)에서 높게 발현된 유전자(단일 세포 TPM은 250 초과임)의 다르게 스플라이싱된 엑손에 대한 엑손 포함(스플라이싱된 %(PSI) 스코어, X 축)의 분포를 도시한다. 단일 세포는 하나의 특정한 이소폼의 발현으로 강한 편향을 나타낸다. 도 3c는 Irf7에서 스플라이싱 변동의 RNA-FISH 입증을 도시한다. 좌측: RNA-Seq 판독 밀도(전사가 발현되는 세포만 도시되어 있음). 컬러 상자는 RNA-FISH에 의해 분석되는 엑손을 마크한다. 우측: RNA-FISH 이미지는 전사의 2개의 구성적인('구성적인' 또는 'Con') 영역(구성적인 영역 A: 청록색(C); 구성적인 영역 B: 자홍색(M)) 및 하나의 다르게 스플라이싱된 엑손('특이적인': 주황색(O))에 대한 프로브와의 동시적인 혼성화로 인한 것이다. 백색의 화살표는 Irf7에 대한 유사하게 높은 발현 수준을 가진 2개 세포를 강조하나, 다르게 스플라이싱된 엑손에 대한 반대되는 선호도가 존재한다. 히스토그램: 2개의 구성적인 영역(우측 상부 및 우측 하부 패널)은 유사한 수준으로 검출되는 반면(하부 히스토그램, 0.5의 편차는 프로브 설계로 인해 예상되는 바와 같음), 다른 엑손(중간의 우측 패널)은 개별 세포에서 포함 또는 배제로의 편향을 나타낸다(상부 히스토그램). 도 3d는, 유전자 Acpp에 대한 상호 배타적인 마지막 엑손의 다른 조절에 대해 유사한 결과가 수득되었음을 언급한다.
도 4a 내지 도 4f는, 단일 세포 mRNA 발현 수준에서 공동-변동의 분석이 별개의 성숙 상태 및 항바이러스 세포 회로를 어떻게 나타내었는지 도시하는 일련의 그래프 및 도면이다. 이들 도면의 컬러 버전은 문헌[Shalek et al., "Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells." Nature 498(7453):236-40 (2013)]에서 확인할 수 있다. 도 4a는 632개의 LPS-유도성 유전자의 PCA를 도시한다. 제1의 2개 주성분에 대한 각각의 세포(포인트)의 기여가 도시되어 있다. PC1(X 축)은 3개의 '반성숙' 세포(사각형)를 15개의 '성숙중인' 세포(삼각형)와 식별한다. 옅은 회색의 삼각형은 가장 성숙한 세포를 표시한다. 도 4b는 유도된 유전자의 클러스터링된 상관도 매트릭스를 도시한다. 좌측: 632개의 LPS-유도성 유전자들의 모든 쌍의 단일-세포 발현 프로파일들 간의 피어슨 상관도 계수(r, 보라색: 음성 상관도; 황색: 양성 상관도)가 도시되어 있다(열, 컬럼). 3개의 강조된 클러스터들은 몇몇 대표적인 유전자 좌와 함께 좌측에 기재되어 있다. 우측: PC1(좌측) 및 PC2(우측) 상으로의 각각의 유전자(열)에 대한 투사 스코어(녹색: 높은; 청색: 낮음). PC1은 반성숙 BMDC를 성숙중 BMDC와 구별하며; PC2는 항바이러스 유전자의 클러스터로 맵핑한다. 도 4c는 RNA-FISH에 의한 상관도의 확인을 도시한다. 각각의 쌍의 일원을 동시에 염색하는 경우, RNA-FISH를 토대로 유전자 쌍 2개(Irf7-Stat2, Irf7-Ifit1) 간의 관계가 도시되어 있다. 피어슨 상관도 계수²(r ²) 및 측정된 세포의 수는 상부 좌측 코너에 기재되어 있다. 도 4d 내지 도 4f는 Irf7이 어떻게 인터페론 피드백 회로에서 가변성을 전파하는지 도시하고 있다. LPS로 4시간 동안 자극한 야생형(WT) BMDC(n = 36)(도 4d), Irf7-/- BMDC(n = 47)(도 4e) 및 Ifnr-/- BMDC(n = 18)(도 4f)에서 단일-세포 qRT-PCR을 이용하여 측정 시, 각각의 단일 미성숙 BMDC(컬럼)에서, 항바이러스 클러스터('항바이러스' 열) 유래의 8개 유전자 각각에 대한 발현 수준이, 8개의 비-가변적인 면역 반응 유전자('비-가변적인 반응' 열)와 더불어 도시되어 있다.
도 5는 단일 LPS 자극된 BMDC들 간의 mRNA 발현에서 전반적인 상관도를 도시하는 그래프이다. 18개 개별 세포 각각의 전반적인 발현 프로파일, 단일 세포 평균, 및 각각 10,000개 세포의 3개 집단(열, 컬럼) 간의 피어슨 상관도 계수가 도시되어 있다. 모든 상관도들은 log-척도의 발현 프로파일로 산출되었다. 단일 세포(S) 12, 13 및 16은 반성숙이며, 한편, 9 및 16은 가장 성숙한 것으로서, 도 4a에서 옅은 회색 삼각형에 상응한다.
도 6은, 25개의 상이한 전사체들에 대한 단일-세포 RNA-Seq 및 RNA-FISH 간의 일치성을 도시하는 일련의 그래프이다. 18개 세포의 단일-세포 RNA-Seq(좌측, 청색) 및 평균적으로 1600개 세포의 단일-세포 RNA-FISH(우측, 적색)에서 25개 전사체 각각에 대한 유전자 발현 수준의 분포가 도시되어 있다.
도 7은 모든 세포들에 대한 강력한 LPS 반응을 도시하는 그래프이다. 각각의 단일 세포(청색) 및 집단 평균(회색)에서 주요 반응 유전자 (컬럼, 하부에 유전자 명칭이 있음)의 수준에 대한 Integrative Genomics Viewer로부터의 RNA-Seq 판독의 트랙이 도시되어 있다. 유전자는 주요 케모카인 및 케모카인 수용체(Ccl3, Ccl4, Ccrl2), 사이토카인(Cxcl2), 및 LPS 반응의 다른 중요한 성분(Tank, Cflar)을 포함한다.
도 8은 다른 세포 유형에서 단일-세포 RNA-Seq로부터의 유전자 발현의 변동을 도시하는 일련의 그래프이다. 마우스 배아 줄기세포(좌측) 및 마우스 배아 섬유아세포(우측)에서 단일 세포 발현 평균(μ, X 축) 및 단일 세포 가변성(표준 편차, σ, Y 축) 간의 관계가 도시되어 있다. 이들 도면은 이전에 공개된 단일 세포 RNA-seq 데이터의 재분석을 도시한 것이다(문헌[Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N. & Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports, doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003]). 하우스키핑 유전자는 녹색이다. 두 경우 모두에서, LPS-자극된 BMDC와 비교하여 단일-세포 유전자 발현에서 실질적으로 더 작은 가변성이 확인되었다(도 2a).
도 9a 내지 도 9d는 3개의 단일 세포에서 독특한 mRNA 분자의 정량화를 도시하는 일련의 그래프 및 도면이다. 도 9a는 변형된 프로토콜을 도시한다. SMARTer II A 올리고는, 역방향 전사 동안에 4개의 랜덤 뉴클레오타이드 바코드를 각각의 mRNA 분자 상에 도입함으로써 변형되었다. 변형된 올리고(바코드는 NNNN으로 표시됨)의 구조가 도시되어 있다. 이 바코드는 PCR 증폭 및 라이브러리 제조를 통해 보유된다. 도 9b는, 3개의 바코드화된 단일-세포 cDNA 라이브러리(청색)뿐만 아니라 세 번의 10,000개 세포 복제물 실험(회색)에 대해 하나의 유전자 좌에서 판독 밀도를 도시하는 IGV 그린샷(screenshot)을 도시한다. 2개의 단일 세포는 2개의 이소폼 중 하나를 독점적으로 발현한다. 도 9c는 전사의 5' 말단으로 맵핑되는 판독의 상세한 검사를 도시한다. 81개의 판독은 23개의 독특한 바코드를 나타내며, 이는 관찰된 스플라이싱이 단순히 하나의 분자 또는 몇몇 분자의 확률적 증폭으로 인한 것이 아님을 지지한다. 도 9d는 단일-세포 TPM (X 축, log 척도) 및 3개의 바코드화된 단일-세포 라이브러리에 대해 독특하게 확인된 바코드(Y 축, log 척도) 간의 관계를 도시한다. 적어도 하나의 독특한 바코드로 표시되는 유전자만이 플로팅된다. 옅은 청색 음영 영역은 단일 세포 TPM이, 연구 전반에 걸쳐 사용되는 역치인 250 미만인 것을 나타낸다. 단일-세포 유전자 발현의 2개의 다른 정량화는 전반적으로 상관도가 양호하며(R은 0.82 초과이며 0.86 미만임), 높게 발현된 유전자(TPM은 250 초과임)에 대해 밀접하게 선형인 관계를 나타낸다.
도 10a 내지 도 10c는 3개의 바코드화된 단일-세포 라이브러리를 토대로 하는 단일 세포들 간의 이소폼 발현의 변동을 도시하는 일련의 그래프 및 표이다. 도 10a는 6개의 다르게 스플라이싱된 유전자에 대한 판독 밀도를 보여주는 IGV 그린샷을 도시한다. 각각의 유전자에 대해, 다르게 스플라이싱된 엑손은 주황색으로 박스로 표시하였다. 도 10b는 도 10a에 도시된 각각의 전사에 대해 계수된 독특한 분자 바코드의 수를 도시하는 표이다. 도 10c는 단일 세포(청색 히스토그램, 상부) 및 집단(회색 히스토그램, 하부)에서 적어도 15개의 바코드로 표시되는 유전자에서 다르게 스플라이싱된 엑손에 대한 엑손 포함(PSI 스코어, X 축)의 분포를 도시한다. 결과는, 18개 세포에 대해 높게 발현된 유전자(단일-세포 TPM은 250 초과임; 도 3)의 스플라이싱 분석과 매우 유사하다. 단일 세포는 하나의 이소폼 또는 다른 이소폼으로의 강한 편향을 나타낸다.
도 11은 단일 세포에서 Irf7의 스플라이싱 변동의 RNA-FISH 입증을 도시하는 그래프이다. 보다 짧은 구성적인 프로브(자홍색, 도 3c)에 대해 이소폼 특이적인 Irf7 프로브(주황색, 도 3c)를 표시하는 Irf7 전사체의 비율의 분포가 세포에 걸쳐 도시되어 있다. 분포는, 특이적인 프로브 : 더 긴 구성적인 프로브(도 3c)의 비율을 계산하는 경우 수득되는 것과 마찬가지로 바이모달이다.
도 12는 반성숙 세포와 성숙중인 세포 간의 분리를 나타내는 IGV 그린샷을 도시하는 그래프이다. 이들 유전자는 PC1에 대해 매우 높은(양성) 투사 스코어 또는 낮은(음성) 투사 스코어를 가진다. 우측의 검정색 수직 막대는, 성숙 마커 및 성숙중 마커 둘 모두를 발현하는 2개의 세포를 강조하고 있으며, 이는, 이들이 사실상 성숙중인 세포의 가장 성숙된 형태임을 제시한다.
도 13a 내지 도 13e는, RNA-FISH에 의한 공동-변동 패턴의 확인을 도시하는 일련의 그래프이다. RNA-FISH에 의해 동시에 측정되는 전사체 쌍에 대한 발현 수준(log(계수+1))의 관계가 도시되어 있다. 도 13a는, Ccr7(성숙중인 세포에서 더 많이 발현됨)에 대한 발현 수준 및 Il1b(반성숙 세포에서 더 많이 발현됨)에 대한 발현 수준이 강하게 상관적이지 않았음(피어슨 r²은 0.12이며, n은 812임)을 도시한다. 도 13b는, Stat4(반성숙 세포에서 더 많이 발현됨)에 대한 발현 수준 및 Serpinb9(반성숙 세포에서 더 많이 발현됨)에 대한 발현 수준은 보다 강하게 상관적이었음(피어슨 r²은 0.28이며, n은 573임)을 도시한다. 도 13c는 약하게 상관적인(피어슨 r²은 0.18이며, n은 511임) Cxcl10 및 Tnf(둘 다 성숙중인 세포에서 더 많이 발현됨)에 대한 발현 수준을 도시한다. 도 13d는 중간 정도로 상관적인(피어슨 r²은 0.26이며, n은 1110임) Ccl22 및 Irf8(둘 다 반성숙 세포에서 발현됨)에 대한 발현 수준을 도시한다. 도 13e는 매우 약하게 상관적인(피어슨 r²은 0.07이며, n은 631임) Stat1(항바이러스, 어느 것에도 특이적이지 않음) 및 Cxcl1(염증, 어느 것에도 특이적이지 않음)을 도시한다.
도 14는, 단일-세포 qRT-PCR에 의한 2개의 별개의 집단으로의 개별 LPS-자극된 BMDC 클러스터를 도시하는 그래프이다. 46개 개별 세포 각각(컬럼)에서 50개 유전자(열)에 대한 단일-세포 qRT-PCR(Fluidigm)로부터 정상화된 발현 수준(적색: 높음; 청색: 낮음, 상부에 척도)이 도시되어 있다. 세포를 이들의 발현 프로파일(덴드로그램, 상부)을 토대로 하는 계층적 병합식 클러스터링에 의해 클러스터링하고, 2개의 주요 클러스터(반성숙 및 성숙중, 하부)를 형성한다.
도 15는, 상이한 반성숙 세포 표면 마커 및 성숙중 세포 표면 마커에 양성인 아집단과 음성인 아집단 간의 주요 마커의 발현 수준의 차이를 도시하는 그래프이다. 각각의 마커(X 축)에 대해 양성적으로 소팅된 세포와 음성적으로 소팅된 세포 사이에서 qRT-PCR에 의해 측정되는 10개의 마커 유전자 각각(막대, 색상 범례(color legend), 우측)의 차별적인 발현 수준(Y 축)이 도시되어 있다. 마커들은, RNA-Seq 데이터에서 '성숙'(적색) 아집단 및 '반성숙'(청색) 아집단을 식별하는 이들의 능력을 토대로 선택되었다.
도 16a 및 도 16b는 LPS 반응 시간 경과에 따라 13개 유전자의 시그너처에 대한 단일-세포 qPCR 발현 프로파일링을 도시하는 일련의 그래프이다. 도 16a는, 비자극된 BMDC에서와, LPS-자극 후 2시간, 4시간 및 6시간째에, 각각의 세포(컬럼)에서 각각의 유전자(열)의 발현 수준을 도시한다. 유전자 시그너처는 9개의 항바이러스 클러스터 유전자, 2개의 균일하게 유도된 유전자, 및 2개의 하우스키핑 대조군으로 구성된다. 도 16b는, 각각의 시점(컬럼)에서 각각의 유전자(열)를 발현하는 세포의 %를 도시한다. 유전자의 발현이 Fluidigm BioMark에서 23의 Ct보다 높은 경우, 세포는 유전자에 대해 양성으로서 스코어링되었다. 일부 면역 반응 유전자인 Cxcl10 및 Clec4e가 모든 세포들에서 균일하게 유도되었으며 시점에 걸쳐 지속된 반면, 항바이러스 클러스터 유전자를 발현하는 세포의 %는 시간-의존적인 방식으로 증가하였다.
도 17a 및 도 17b는 RNA-FISH 및 면역형광 공동염색을 도시하는 일련의 사진 및 그래프이다. 도 17a는 Stat1 단백질(녹색), Stat1 mRNA(자홍색) 및 Ifit1 mRNA(백색)에 대한 공동염색 이미지의 예를 도시한다. 도 17b는 LPS에 0시간(상부), 2시간(중간) 또는 4시간(하부) 동안 노출된 후, Ifit1 mRNA(검정색) 및 Stat1(적색), pStat1(회색) 및 Stat2(녹색) 단백질의 수준의 분포를 도시한다(총 형광 수준, 좌측 히스토그램; 평균 형광 수준, 중간; 및 핵 위치화%, 우측). 전반적인 단백질 수준은 모든 경우들에서 시간 경과 내내 증가한 한편, Stat1, pStat1 및 Stat2의 유도에서 실질적인 변동이 확인되었다. Stat1 수준은 점차 상승한 한편, pStat1의 시프트는 초기에 가장 우세하였다. 한편, Stat2는 2시간까지 강한 핵 위치화를 나타내었으며, 이어서, 2시간 내지 4시간째에 강한 유도가 나타났다. 4시간째까지, 단백질 수준은 보다 균일해졌으며, 핵 전좌는 덜 우세하였다.
도 18a 및 도 18b는 Stat 단백질 및 Ifit1 mRNA 발현 간의 상관도를 도시하는 일련의 그래프이다. 도 18a는, LPS로 4시간 동안 자극한 후, Stat 단백질(Y 축) 및 Ifit mRNA 수준(X 축) 간의 상관도를 보여주는 대표적인 산란 플롯을 도시한다. 상부 열: Stat1, 중간 열: pStat1; 하부 열: Stat 2. 좌측 컬럼: 총 단백질 형광; 중간 컬럼: 평균 단백질 형광; 우측 컬럼: 핵 단백질%. 도 18b는 LPS에 0시간(상부), 2시간(중간) 또는 4시간(하부) 동안 노출된 후, 상이한 측정되는 매개변수들 간의 상관도(r ²; 청색은 0임; 적색은 1임)를 보여주는 히트맵(heatmap)을 도시한다.
도 19는 확인된 항바이러스 회로에 대한 간단한 모델을 도시하는 도면이다. X는 동요점을 나타낸다. Ifn 피드백은 Irf7 및 Stat2의 발현을 유발한다. Irf7의 발현에서의 가변성은 Ifit1과 같은 항바이러스 유전자의 발현에서의 가변성으로 전파된다. Stat2 역시 연루되어 있지만, Irf7과의 관련성은 본 실험에 의해서는 구축될 수 없다.
도 20은 스플라이싱 인자 Srsf3 및 Srsf7의 '포이즌' 카세트 엑손에 대한 스플라이싱 패턴을 도시하는 그래프이다.　스플라이싱 인자 Srsf3 및 Srsf7를 인코딩하는 2개의 유전자에 대한 각각의 개별 세포('1', 청색) 및 집단 평균('10,000', 회색)에서 RNA-Seq 판독 밀도가 도시되어 있으며, 이들 각각은 다르게 스플라이싱된 포이즌 카세트 엑손(파선 상자)을 가지는 것으로 알려져 있다. 각각의 유전자에 대한 공지된 주석화된 이소폼은 하부에 도시되어 있다. 하나의 세포인 S13은 상부에 주황색으로 강조되어 있으며, '포이즌' 엑손을 포함하는 Srsf3 및 Srsf7 이소폼만을 발현하였다. 각각의 유전자에 대해, 11개의 세포는 다른 이소폼을 독점적으로 발현하였다.
도 21은 긴 비-코딩 (lnc) RNA에서 발현 변동을 도시하는 그래프이다. 3개의 이전에 주석화된 lncRNA 유전자에 대한 각각의 개별 세포('1', 청색) 및 집단 평균('10,000', 회색)에서 RNA-Seq 판독 밀도가 도시되어 있다. lncRNA는 집단 수준에서 상대적으로 높게 발현되며(Gas5, 좌측), 단일-세포 수준에서는 바이모달형으로 발현된다. 집단(Gm8773, 2810025M15Rik)에서 낮게 발현되거나 검출불가능한 2개의 lncRNA는 사실상 일부 개별 세포에서 상당히 발현된다.
도 22는 3' 편향에 대한 품질 대조군을 도시하는 일련의 그래프이다. 6개의 단일 세포(상부의 2개 열) 및 모든 3개의 10,000개 집단(하부 열)에 대해 5'(좌측)에서 3'(우측)으로 각각의 정상화된 전사 위치에서 정상화된 RNA-Seq 범위의 플롯이 도시되어 있다. 단일 세포 및 집단 둘 모두는 3' 편향을 거의 나타내지 않는다.
도 23은 LPS 자극의 부재 시(좌측)와, LPS로 자극한 지 4시간 후(우측), 면역-반응 유전자 Cxcl1(상부) 및 Cxcl10(하부)의 RNA-FISH를 도시하는 일련의 사진이다. Cxcl10 및 Cxcl1은, 자극 전에는 무시할만한 수준으로 발현되기는 하지만, LPS에 의해 강하게 유도된다.
도 24a 내지 도 24e는, 병원체 성분으로 자극한 골수 유래의 수지상 세포 (BMDC)의 단일-세포 RNA-Seq를 미세유체가 가능하게 하였음을 도시하는 일련의 그래프 및 도면이다. 도 24a는 BMDC(척도 막대: 25 ㎛)의 주사 전자 현미경 사진을 도시한다. 도 24b는, TLR2에 의한 PAM3CSK(PAM, 그람-양성 박테리아 유래)의 감지, TLR4에 의한 리포다당류(LPS, 그람-음성 박테리아 유래)의 감지, 및 TLR3에 의한 폴리이노신산:폴리시티딜산(PIC, 폴리(I:C), 바이러스 RNA의 합성 모방체)의 감지에 대한 Toll-유사 수용체(TLR) 네트워크의 간략화된 도식을 도시한다. 도 24c는 C1 칩(CAD 드로잉, 하부) 상에의 단일 BMDC(상부, 보라색 원형 안의 세포)의 미세유체 포착을 도시한다. 도 24d는 LPS-자극된 세포(좌측)에 대한 주성분(PC) 분석 및 처음 3개 PC(우측)에 대한 LPS-자극된 세포의 스코어의 분포를 도시하며, 모든 3개의 자극원 및 시점으로부터 검체에 대해 함께 산출하였다. 도 24e는 BMDC 집단(좌측 컬럼) 및 개별 BMDC(우측 컬럼) 내에서 PAM(녹색), LPS(검정색) 및 PIC(자홍색)로 자극 후 0시간, 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간째에 BMDC에서 유도된 유전자(열)에 대한 시간 경과 발현 프로파일을 도시한다. 훨씬 우측에는 처음 3개 주성분(PC)(PC1, PC2 및 PC3, 컬럼) 상으로의 유전자 투사 스코어가 있으며; 하부에는 처음 3개의 PC(PC1, PC2 및 PC3, 열)에 대한 각각의 세포(컬럼)의 기여도가 있다.
도 25a 내지 도 25d는 단일 세포의 시간 의존적인 거동을 도시하는 일련의 그래프이다. 도 25a는, PAM(상부, 녹색), LPS(중간, 검정색) 및 PIC(하부, 자홍색)로 자극한 후 각각의 시점(상부에 마크되어 있음)에서, 3개의 유전자(도 24e에서 3개의 클러스터 각각으로부터 1개)에 대해 나타난 예시적인 단일-세포 발현 분포를 도시한다. 분포는 동일한 최대 높이를 가지도록 척도화된다. 개별 세포는 각각의 분포 아래에서 막대로서 플로팅된다. 도 25b 내지 도 25d는, 3개의 모듈(표지됨, 상부) 각각에 대해, LPS(상부), PIC("코어" 항바이러스 클러스터 Id)(도 25b) 또는 PAM("정점" 염증 클러스터)(도 25c)로 자극된 BMDC 및 "지속적인" 염증(도 25d) 클러스터에서 2시간(좌측) 및 6시간(우측)째에 구성 유전자 모두의 웨이브 플롯을 도시한다. X 축: 발현 수준, ln(TPM+1); Y 축: 유전자; Z 축: 단일-세포 발현 밀도. 유전자는 2시간("정점" 염증) 또는 6시간("코어" 항바이러스, "지속적인" 염증) LPS 시점에서 가장 낮은 평균 발현값부터 높은 평균 발현값의 순으로 정렬된다.
도 26a 내지 도 26l은, 자극 동안 변동의 동적인 변화를 도시하는 일련의 그래프이다. 도 25a는 좌측에서 우측으로 단일-세포 발현 분포를 기술하는 데 사용된 3개의 매개변수의 도식을 제시한다: μ, 발현의 수준이 검출가능한 세포에 대한 평균 RNA 부화도 수준; σ, 발현이 검출가능한 세포에 대한 발현의 분산; 및 α, 발현이 검출가능한 모든 세포의 비율(ln(TPM+1)은 1 초과임). 도 25b는 LPS 자극 후 상이한 시점에서 측정된 TNF 발현 분포(검정색)에 대한 적합(회색)의 예를 도시한다. 도 25c는 각각의 시점(X 축)에서 TNF에 대해 추정된 μ, σ², 및 α(Y 축, 좌측에서 우측)의 값의 변화를 도시한다. μ 및 σ²에 대한 단위는 ln(TPM+1)이다. 도 25d는 최대 공산 추정값 α이다. LPS 자극 후 상이한 시점에서, 발현이 log-정규 방식으로 분포되며 임의의 편차는 기술적 검출 한계로 인한 것인 널 모델을 고려하는 경우, TNF의 발현 분포(검정색, 좌측) 및 α_MLE(녹색, 우측)를 결정하는 데 사용된 매칭 공산 함수(청색 점선)가 도시되어 있다. 도 25e 및 도 25f는, 발현 및　H3K27ac 결합 간의 관계가 μ가 아니라 α에 의존한다는 것을 도시한다. 플롯은, 집단 발현(Y 축)의 10개 변위치 구간 각각 및 α(도 25e, X 축) 또는 μ(도 25f, X 축)의 10개 변위치 구간 각각에 상응하는, H3K27ac(LPS 2시간, 상부), H3K27ac(무자극, 중간) 및 H3K4me3(2시간 LPS, 하부) 유전자에 대한 평균 프로모터 판독 밀도(강도; 검정색 높음; 백색 낮음; 척도 막대, 하부)를 도시한다. 발현 및 H3K27ac(도 25e, 상부, 중간) 간의 전반적인 집단 상관도는 발현 수준이 검출가능한(α; 도 25e, 중간) 단일 세포의 %를 제어한 후 대체로 사라지지만, 이러한 의존성은 H3K4Me3 수준(도 25e, 하부)의 경우 잔존한다. 대조적으로, μ(도 25f)에 대한 제어는 발현 수준과 K27ac 간의 의존성을 없애지 않는데, 단일 범위의 μ(수직 줄선) 내에서 집단 발현 수준과 K27ac 간의 상관도가 유지되기 때문이며, 이는, μ 자체가 이 관계의 근본적인 결정인자가 아님을 제시한다. 도 25k는 그 자체로(적색) 또는 μ(청색) 또는 α(녹색)에 대해 제어한 경우, 면역 반응 유전자에 대한 평균 발현 수준과 K27ac 단독 간의 상관도의 p값을 보여주는 막대 플롯을 도시한다. 도 25h는 각각의 모듈에서 α 및 μ의 동적인 변화를 도시한다. 각각의 모듈(상부: 코어 항바이러스; 중간: 정점 염증; 하부: 지속적인 염증)을 보여주는 막대 플롯은, 각각의 전이(X 축)에서 상이한 조건(상부에 마크됨)들에서, α(공산비 검정에 의함, P < 0.01, 청색) 단독에서, μ(윌콕슨 검정, P < 0.01, 녹색) 단독에서 또는 둘 모두에서(각각 독립적으로 시험됨, 옅은 청색) 상당한 변화를 가진 유전자(Y 축)의 분획을 나타낸다. 각각의 모듈 및 조건에서, 비율은, 반응 시간경과 동안에 적어도 하나의 시점에서 상당히 바이모달(공산비 검정에 의함)이며 두 조건 모두에서 적어도 10개 세포에서 발현되는 모듈에서 유전자의 총 수에서 계산된다. 이 수는 각각의 막대의 상부에 마크된다.
도 27a 내지 도 27f는, IFN-β 피드백이 "코어" 항바이러스 표적의 발현에서 이종성을 유발함을 도시하는 일련의 그래프 및 도면이다. 도 27a는 LPS(좌측, 검정색) 또는 IFN-β(우측, 적색)로 2시간 동안 자극한 후, Rsad(상부) 및 Stat2(하부)에 대한 단일 세포 발현 분포를 도시한다. 도 27b는 LPS(좌측) 또는 IFN-β(우측)로 자극한 지 2시간째에, "코어" 항바이러스 클러스터(Y 축; 도 25b에서와 같이 정렬됨)에서 유전자 각각의 발현 분포를 보여주는 웨이브 플롯을 도시한다. 대부분의 유전자의 발현은 LPS로 자극한 지 2시간째에 바이모달이었던 반면, 대부분은 IFN-β로 자극한 지 2시간째에 유니모달형으로 발현되었다(도 25b에서 4시간째 LPS 시점과 유사함). 도 27c는 LPS-자극된 세포 각각(0시간, 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간) 및 IFN-β로 2시간 동안 자극한 세포(최우측)에 대한 "코어" 항바이러스 스코어(Y 축)를 도시한다. 2개의 "조숙" 세포(황색 별모양)는 평소와 달리, 1시간 LPS에서 높은 항바이러스 스코어를 가진다. (d)는 1시간 LPS에서 "코어" 항바이러스 클러스터(클러스터 Id, 좌측) 및 이차 항바이러스 클러스터(클러스터 Ic, 우측) 유래의 유전자의 발현에 대한 정규 변위치 플롯이다. 2개의 "조숙" 세포(황색 별모양)는 평소와 달리, 이차 유전자(우측)가 아니라 "코어" 항바이러스 유전자(좌측)를 높은 수준으로 발현한다. 도 27e는, RNA-형광 인 시추 혼성화(RNA-FISH)가 드물게는, Ifnb1(자홍색) 및 Ifit1(청록색) 둘 모두에 대해 양성인 초기의 반응자의 존재(화살표; 황색 별모양)를 확인시켜 주었음을 도시한다. 회색: 세포 윤곽. 척도 막대: 25 ㎛. 도 27f는 LPS로 자극한 지 1시간 후, RNA-FISH에 의해, Ifnb1(자홍색) 및 Ifit1(청록색) 둘 모두의 검출(5개 초과의 복사체)에 대한 일치성을 보여주는 벤다이어그램을 제시한다(P는 10 내지 25 미만임, 동일한 비율의 시험).
도 28a 내지 도 28e는, 세포-대-세포 신호전달의 미세유체 차단이 항바이러스 및 염증 모듈에서 반응 이종성에 영향을 미침을 도시하는 일련의 도면 및 그래프이다. 도 28a는 세포-대-세포의 소통의 실험적인 차단을 도시한다. 좌측: C1 칩; 우측: 온-칩 자극, 이후, 미세유체 밸브(적색 막대)의 작동은 개별 챔버에서 세포를 밀봉하여, 세포간 신호전달을 방지한다. 도 27b는, 온-칩 자극(좌측; 세포-대-세포 신호전달 없음) 및 인-튜브(우측) 자극 유래의 단일 세포(컬럼)에서 "코어" 항바이러스(Id, 상부 열) 및 "정점" 염증 (IIIc, 하부 열) 모듈에서 유전자(열)의 발현을 도시한다. 색상은 척도화된 발현 값(z-스코어)을 나타낸다. 도 27c는, 온-칩(좌측, 청색; 측분비 신호전달 없음) 또는 인-튜브(우측; 검정색) 4시간의 LPS 자극에서, "코어" 항바이러스(상부) 및 "정점" 염증(하부) 클러스터 유래의 개별 대표적인 유전자에 대한 유전자 발현 분포를 도시한다. 도 27d는, (좌측부터 우측): LPS 0시간, LPS 1시간, LPS 2시간, LPS 4시간, LPS 6시간, "온-칩" 비자극, "온-칩" LPS 4시간, 0시간째에 GolgiPlug(브레펠딘 A)가 첨가된 LPS 4시간, 1시간째에 GolgiPlug가 첨가된 LPS 4시간, 2시간째에 GolgiPlug가 첨가된 LPS 4시간, Ifnar-/- BMDC를 동반한 LPS 4시간, 및 Stat1-/- BMDC를 동반한 LPS 4시간 유래의 개별 세포에 대한 "코어" 항바이러스(상부 패널, Y 축), "정점" 염증(중간 패널, Y 축) 및 "지속적인" 염증(하부 패널, Y 축) 스코어의 바이올린 플롯을 도시한다. 1시간 LPS에서 평소와 달리 높은 항바이러스 스코어를 가진 2개의 "조숙" 세포(도 27)는 황색 별모양으로 표시한다.
도 29a 및 도 29b는, 집단-수준 측분비 신호전달이 "코어" 항바이러스 반응을 증강시키고 조화롭게 하는 한편, "정점" 염증을 약화시키고 비동기화함을 도시하는 일련의 도면 및 그래프이다. 도 29a는, 가능하게는 "정점" 염증 클러스터를 약화시키고 이의 이종성을 증가시키는 IL-10을 포함하여, 양성 IFN-β 신호전달이 동시에 음성 측분비 피드백 고리를 활성화시키면서도, 어떻게 항바이러스 반응을 유도하였으며, 이의 이종성을 감소시켰는지를 보여주는 유전자 네트워크 모델이다. 도 29b는 어떻게 양성 측분비 피드백 및 음성 측분비 피드백이 세포에 대한 항바이러스(자홍색) 및 염증(녹색) 유전자 발현 가변성을 변경시켰는지 보여주는 세포 집단 모델이다. 회색은 발현 없음을 표시한다.

본 발명은 일반적으로, 다양한 치료적 및/또는 진단적 적응증에서, 코어 항바이러스 반응, 이차 항바이러스 반응, 성숙, 유도성 염증 반응 및 샤프 정점 염증 반응을 비롯한 수지상 세포의 반응을 제어하는 조절 네트워크를 확인하기 위한 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 수지상 세포의 반응(들)을 제어하는 조절 네트워크를 활용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

본원에 제공되는 연구는 다양한 병원성 성분들에 반응하는 개별 수지상 세포(DC)에서 mRNA를 프로파일링하기 위한 단일 세포 핵산 분석, 구체적으로는 단일-세포 RNA Seq를 이용하였다. 단일-세포 RNA Seq를 이용하여, 프로파일링 방법은 다수의 이점들, 예컨대 비제한적인 예로, 클리너(cleaner) 시그너처, 성숙한 것들로부터의 항바이러스 회로의 분리, 및 세포 집단에서 확인되는 시그너처의 정제(refining)를 제공한다.

단일-세포 RNA-Seq는 외관상 일치하는 세포들 간의 유전자 발현 변동의 규모, 근거 및 기능을 이해하기 위한 비편향된 접근법을 제공한다. 그러나, 이러한 가능성을 충족시키기 위해서는, 상이한 실험 조건에 대해 다수의 세포들을 프로파일링 및 분석하기 위한 고-처리량의 워크플로우가 필요하다. 개시내용은, 3개의 병원성 성분들로 자극한 1,700개의 일차 마우스 수지상 세포(DC)로부터 단일-세포 RNA-Seq 라이브러리를 제조하기 위한 미세유체-기재의 접근법을 제공한다. 동일한 자극에 노출된 개별 세포들 간의 실질적인 변동은, 주어진 mRNA 전사를 이들 발현 세포 내에서 검출가능한 수준 및 전사 수준으로 발현하는 세포 분획에서 확인되었다. 별개의 유전자 모듈은 상이한 일시적인 이종성 프로파일을 특징으로 한다. 특히, 항바이러스 유전자의 "코어" 모듈은 몇몇 "조숙(precocious)" 세포에 의해 매우 초기에 발현된 다음, 이후의 시점에서는 모든 세포들에서 활성으로 된다. 밀봉된 미세유체 챔버에서 세포를 개별적으로 자극하고, 녹아웃 마우스 유래의 DC를 분석하고, 분비 및 세포외 신호전달을 조정함으로써, 이러한 반응은 인터페론-매개의 측분비 신호전달을 통해 전파되고 조화를 이룬다. 놀랍게도, 세포-대-세포의 소통을 방지하는 것은 또한, 정점, 초기-유도성 염증 모듈의 발현에서 가변성을 실질적으로 감소시키며, 이는, 측분비 신호전달이 염증 프로그램의 일부를 부가적으로 억제시킨다는 것을 제시한다. 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은, 세포의 이종성을 제어하는 데 있어서 세포-대-세포의 소통의 중요성을 강조하며, 다세포 집단이 복합적이며 동적인 반응을 구축하기 위해 사용하는 일반적인 전략을 드러낸다.

이러한 분석을 처음으로 이용하여, 본원에서 "코어 항바이러스" 유전자 시그너처, "이차 항바이러스" 유전자 시그너처, "성숙" 유전자 시그너처, "염증 유도성" 유전자 시그너처 및 "염증 샤프 정점" 유전자 시그너처로 지칭되는, 상이한 반응 요소들에 대한 일련의 정제된 유전자 시그너처들이 밝혀졌다. 이들 시그너처는 단일 세포의 응집성 기에서 발현되는 유전자이다. 이들 유전자 시그너처 각각은 하기 표 1 내지 표 5에서 제공된다.

표 1. 코어 항바이러스 시그너처 유전자

표 1A. 코어 항바이러스 시그너처 유전자의 서브셋

표 2. 이차 항바이러스 시그너처 유전자

표 2A. 이차 항바이러스 시그너처 유전자의 서브셋

표 3. 성숙 시그너처 유전자

표 3A. 성숙 시그너처 유전자의 서브셋

표 4. 염증 유도성 시그너처 유전자

표 4A. 염증 유도성 시그너처 유전자의 서브셋

표 5. 염증 샤프 정점 시그너처 유전자

표 5A. 염증 샤프 정점 시그너처 유전자의 서브셋

조정제는, 수지상 세포-관련 동요에 반응성인 유전자로서 확인된 하나 이상의 표적 유전자, 또는 하나 이상의 표적 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현을 조정하는 데 사용된다. 이들 표적 유전자는, 예를 들어, 수지상 세포를 조정제와 접촉시킨 후, 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현에 대한 효과가 존재하는 경우 그 효과를 모니터링함으로써 확인된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시그너처 유전자는 표 1 내지 표 5A에 열거된 것들로부터 선택된다. 조정제는 하나 이상의 표적 유전자, 또는 하나 이상의 표적 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현에 직접적으로 작용할 수 있고/있거나 조정제는 표적 유전자(들)와 연관있는 것으로 알려진 유전자 또는 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 조정함으로써 하나 이상의 표적 유전자, 또는 하나 이상의 표적 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현에 간접적으로 작용할 수 있다.

일부 구현예에서, 표적 유전자는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)이다. 일부 구현예에서, 조정제는 TNFR의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 조정제는 TNFR과 연관있는 유전자, 예컨대 비제한적인 예로, 하기 표 6에 나타낸 것들 유래의 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 표 6에서 밑줄 친 유전자는 TNFR이 부재하는 경우, 예를 들어 녹아웃된 경우, 상향조절되는 유전자이며, 밑줄 치지 않은 유전자는 TNFR이 부재하는 경우, 예를 들어 녹아웃된 경우, 하향조절되는 유전자이다.

표 6.

일부 구현예에서, 표적 유전자는 Toll/인터루킨-1 수용체(TIR) 도메인-함유 어댑터 단백질(TIRAP)이다. 일부 구현예에서, 조정제는 TIRAP의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 조정제는 TIRAP과 연관있는 유전자, 예컨대 비제한적인 예로, 하기 표 7에 나타낸 것들 유래의 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 표 7에서 밑줄 친 유전자는 TIRAP가 부재하는 경우, 예를 들어 녹아웃된 경우, 상향조절되는 유전자이며, 밑줄 치지 않은 유전자는 TIRAP가 부재하는 경우, 예를 들어 녹아웃된 경우, 하향조절되는 유전자이다.

표 7.

일부 구현예에서, 표적 유전자는 Stat1이다. 일부 구현예에서, 조정제는 Stat1의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 조정제는 Stat1과 연관있는 유전자, 예컨대 비제한적인 예로, 하기 표 8에 나타낸 것들 유래의 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 표 8에서 밑줄 친 유전자는 Stat1이 부재하는 경우, 예를 들어 녹아웃된 경우, 상향조절되는 유전자이며, 밑줄 치지 않은 유전자는 Stat1이 부재하는 경우, 예를 들어 녹아웃된 경우, 하향조절되는 유전자이다.

표 8.

일부 구현예에서, 표적 유전자는 인터페론 생성 조절자(IFNR)이다. 일부 구현예에서, 조정제는 IFNR의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 조정제는 IFNR과 연관있는 유전자, 예컨대 비제한적인 예로, 하기 표 9에 나타낸 것들 유래의 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 표 9에서 밑줄 친 유전자는 IFNR이 부재하는 경우, 예를 들어 녹아웃된 경우, 상향조절되는 유전자이며, 밑줄 치지 않은 유전자는 IFNR이 부재하는 경우, 예를 들어 녹아웃된 경우, 하향조절되는 유전자이다.

표 9.

일부 구현예에서, 표적 유전자는 하기 표 10, 표 11 또는 표 12에 열거된 것들 유래의 하나 이상의 유전자이다. 일부 구현예에서, 조정제는 표적 유전자(들)의 발현, 활성 및/또는 기능을 변경시킨다. 표 10, 표 11 및/또는 표 12에서 밑줄 친 유전자는 표적 유전자가 부재하는 경우, 예를 들어 녹아웃된 경우, 상향조절되는 유전자이며, 밑줄 치지 않은 유전자는 표적 유전자가 부재하는 경우, 예를 들어 녹아웃된 경우, 하향조절되는 유전자이다.

표 10.

표 11.

표 12.

본원에 제공되는 기술의 감도는 밀접하게 관련된 세포 아군(subpopulation)을 검출 및 정의할 수 있게 한다. 이들 기술은 세포의 별개의 서브셋에서 선택적으로 유도되는 유전자 반응 모듈, 예를 들어, 시그너처를 확인할 수 있게 한다. 단일 세포들 간의 상관도 분석은 세포 회로를 재구성하고 이들 모듈의 조절자를 확인하는 데 있어서 유용하다.

최근의 분자적 연구에서, "동종의" 집단으로부터 유래되는 경우에도, 개별 세포는, 중요한 기능적 결과와 더불어(문헌[Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M. & Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature 459, 428-432, doi:10.1038/nature08012 (2009);Sharma, S. V. et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell 141, 69-80, doi:10.1016/j.cell.2010.02.027 (2010); Gascoigne, K. E. & Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer cell 14, 111-122, doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002 (2008); Feinerman, O. et al. Single-cell quantification of IL-2 response by effector and regulatory T cells reveals critical plasticity in immune response. Molecular Systems Biology 6, 1-16, doi:papers2://publication/doi/10.1038/msb.2010.90 (2010)]), 유전자 발현, 단백질 수준 및 표현형 출력에서 상당한 차이를 나타낼 수 있는 것으로 밝혀졌다(문헌[Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M. & Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature 459, 428-432, doi:10.1038/nature08012 (2009); Cohen, A. A. et al. Dynamic Proteomics of Individual Cancer Cells in Response to a Drug. Science 322, 1511-1516, doi:10.1126/science.1160165 (2008); Niepel, M., Spencer, S. L. & Sorger, P. K. Non-genetic cell-to-cell variability and the consequences for pharmacology. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 556-561, doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015 (2009); Sharma, S. V. et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell 141, 69-80, doi:10.1016/j.cell.2010.02.027 (2010); Gascoigne, K. E. & Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer cell 14, 111-122, doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002 (2008)]). 그러나, 세포의 이종성에 대한 기존의 연구는 전형적으로, 소수의 미리-선택된 RNA만 측정하거나(문헌[Yu, M. et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature 487, 510-513, doi:10.1038/nature11217 (2012); Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E. & Van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature 463, 913-918, doi:10.1038/nature08781 (2010)]), 단백질을 동시에 측정하였는데(문헌[Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M. & Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature 459, 428-432, doi:10.1038/nature08012 (2009); Cohen, A. A. et al. Dynamic Proteomics of Individual Cancer Cells in Response to a Drug. Science 322, 1511-1516, doi:10.1126/science.1160165 (2008); Niepel, M., Spencer, S. L. & Sorger, P. K. Non-genetic cell-to-cell variability and the consequences for pharmacology. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 556-561, doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015 (2009); Sharma, S. V. et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell 141, 69-80, doi:10.1016/j.cell.2010.02.027 (2010); Gascoigne, K. E. & Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer cell 14, 111-122, doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002 (2008); Dalerba, P. et al. Single-cell dissection of transcriptional heterogeneity in human colon tumors. Nature Biotechnology 29, 1120-1127, doi:10.1038/nbt.2038 (2011); Bendall, S. C. & Nolan, G. P. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science (New York, NY) 332, 677-678, doi:10.1126/science.1206351 (2011)]), 왜냐하면, 게놈 프로파일링 방법(문헌[Bendall, S. C. & Nolan, G. P. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science (New York, NY) 332, 677-678, doi:10.1126/science.1206351 (2011); Altschuler, S. J. & Wu, L. F. Cellular Heterogeneity: Do Differences Make a Difference? Cell 141, 559-563, doi:10.1016/j.cell.2010.04.033 (2010); Kalisky, T., Blainey, P. & Quake, S. R. Genomic Analysis at the Single-Cell Level. Annual review of genetics 45, 431-445, doi:papers2://publication/doi/10.1146/annurev-genet-102209-163607 (2011); Kalisky, T. & Quake, S. R. Single-cell genomics. Nature Methods 8, 311-314 (2011)])은 바로 최근까지 단일 세포에 적용될 수 없었기 때문이다(문헌[Islam, S. et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research, doi:papers2://publication/doi/10.1101/gr.110882.110 (2011); Tang, F. et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols 5, 516-535, doi:10.1038/nprot.2009.236 (2010); Tang, F. et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods 6, 377-382, doi:10.1038/nmeth.1315 (2009); Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012); Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N. & Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports, doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003]). 본원에서, 단일-세포 RNA-Seq는, 포유류 시스템 모델에서 리포다당류(LPS)에 의해 자극된 골수 유래의 수지상 세포(BMDC)의 반응에서 이종성을 조사하는 데 이용되었다. 광범위하며 이전에는 관찰되지 않은 바이모달 변동은, 선택된 전사의 RNA-형광 인 시추 혼성화에 의해 독립적으로 입증된, RNA 전사의 부화도(abundance) 및 스플라이싱 패턴 둘 모두에서 발견되었다. 특히, 수백 개의 주요 면역 유전자는, 놀랍게도 집단 평균에서 매우 높게 발현되는 유전자조차도, 개별 세포에 걸쳐서 바이모달형으로 발현된다. 더욱이, 단일 세포에 걸친 스플라이싱 패턴은, 이전에는 관찰되지 않은 수준의 이종성을 나타내며: 집단 수준에서 스플라이스 이소폼을 복수 개로 가지는 유전자의 경우, 개별 세포는 하나의 특정한 이소폼의 우세한 발현 쪽으로의 편향을 나타낸다. 본원에 제공되는 실시예에 의해 나타나는 바와 같이, 이들 세포-대-세포 차이는 세포의 상태 및 세포 회로의 용도 둘 모두에서 이종성에 의해 유발된다. 바이모달성(bimodality) 중 일부는 BMDC가 밀접하게 관련되어 있지만 별개의 알려진 성숙도 상태에 있음을 반영하는 한편, 다른 바이모달 패턴은 동일한 성숙도 상태에 있는 세포에도 존재하며, 이는 일치하는 세포들 간의 주요 조절성 회로의 용법의 차이를 반영한다. 예를 들어, 137개의 매우 가변적이지만 공동조절되는 항바이러스 반응 유전자의 모듈이 확인되었다. 녹아웃 마우스 유래의 BMDC를 사용하여, 본원에 제시되는 연구들은, 이 항바이러스 모듈에서 바이모달성은 마스터 항바이러스 전사 조절자 Stat2 및 Irf7을 수반하는 인터페론 회로를 통해 전파될 수 있음을 언급한다. 이 연구는, 세포들 간의 광범위한 기능적 다양성을 밝히고, 세포 상태 및 회로를 해석하는 데 있어서, 비편향된 단일-세포 게놈학의 힘 및 유망성을 언급한다.

상기 분석은, 동일한 조건 및 전반적인 상태에서 단일 세포에 대한 전사체들 간의 공동변동이 어떻게, 이의 차별적인 용법이 상당한 세포 이종성을 촉진하는 조절성 회로의 확인 및 조립에 일조할 수 있는지 언급하고 있는 개념 입증을 제공한다. 구체적으로는, 가변적인 회로(도 19)에서, 인터페론 신호전달은 Stat2 및 Irf7의 유도에 필요한데, 즉, 가변적인 항바이러스 클러스터 유전자를 유도하는 작용을 한다. 실험은 명확하게 결정하는 것은 아니지만, 회로의 성분은 그 자체가 관찰된 이종성을 유발한다. 하나의 설득력있는 가능성은, 업스트림 노이즈가 인터페론-신호전달 경로로부터 우선 Stat2 및 Irf7으로, 그 다음으로 표적 유전자로 전파된다는 것이다. 이 가정은 Stat 단백질 수준 및 핵 위치화에서 관찰된 변동에 의해 지지된다. 또한, 포유류 세포에서 바이러스 복제 동안에 Irf7의 과발현이 Ifn-β 생성에서 이종성을 감소시키고, Irf7 전좌가 바이러스 자극원 하에 Ifn-β 생성과 상관적임을 언급하는 최근의 연구에 의해서도 지지된다(문헌[Zhao, M., Zhang, J., Phatnani, H., Scheu, S. & Maniatis, T. Stochastic Expression of the Interferon-? Gene. PLoS biology 10, e1001249 (2012); Apostolou, E. & Thanos, D. Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression. Cell 134, 85-96 (2008); Rand, U. et al. Multi-layered stochasticity and paracrine signal propagation shape the type-I interferon response. Molecular Systems Biology 8, doi:10.1038/msb.2012.17 (2012)]). 주목할만하게는, 인터페론-자극된 유전자(예를 들어, Isg15) 및 Irf7 및 Stat2의 수준과 강하게 상관적인 인터페론-유도성 단백질의 발현에서 가변성이 또한 관찰되었다. 이는, 균일한 Ifn-β 자극을 이용하는 이전의 연구에서는 관찰되지 않았으며(문헌[Zhao, M., Zhang, J., Phatnani, H., Scheu, S. & Maniatis, T. Stochastic Expression of the Interferon-β Gene. PLoS biology 10, e1001249 (2012)]), 이는, 인터페론 피드백의 가변성이 다운스트림 이종성을 유발한다는 가정을 지지한다.

유사한 전략은 스플라이싱에서 바이모달성의 결과를 알아보기 위해 잠재적으로 사용될 수 있었다. 불과 18개 세포를 관찰하더라도, 바이모달 스플라이싱 패턴의 흥미로운 예는, 이소폼이 별개의 기능적인 결과를 가지는 유전자에 대해 관찰되었다. 예를 들어, 스플라이싱 조절자 Srsf3 및 Srsf7은 각각, 즉, 포함되는 경우, 넌센스-매개의 붕괴를 통한 분해를 위해 RNA를 표적으로 하는 "포이즌 카세트 엑손"을 포함하는 것으로 알려져 있다(문헌[Aenkoe, M.-L. et al. The RNA-binding landscapes of two SR proteins reveal unique functions and binding to diverse RNA classes. Genome Biology 13, doi:10.1186/gb-2012-13-3-r17 (2012)]). 이들 엑손은 집단 수준에서 매우 약하게 발현되지만, 단일 세포(세포 S13, 도 20) 중 하나는 포이즌화된 이소폼을 독점적으로 높은 수준으로 발현하였다(Srsf3 및 Srsf7 둘 모두의 경우, 11개 세포는 다른 것을 독점적으로 발현함). Srsf3 자체는 음성 피드백 고리에서 그 자신의 포이즌 카세트 엑손의 포함을 증가시키는 데 관여하기 때문에(문헌[Aenkoe, M.-L. et al. The RNA-binding landscapes of two SR proteins reveal unique functions and binding to diverse RNA classes. Genome Biology 13, doi:10.1186/gb-2012-13-3-r17 (2012)]), S13은 사실상 최고 수준의 Srsf3 활성을 나타낼 수 있다. 보다 많은 수의 세포로 암(arm)되는 경우, 상관도 분석은 Srsf3의 잠재적인 표적을 확인하는 데 사용될 수 있었다. 한편, 다른 조절 유전자에서 스플라이싱 차이는 발현 다양성을 추가로 증강시킬 수 있으며: 예를 들어, Irf7의 상이한 이소폼에 의해 인코딩되는 단백질(세포에서 바이모달형으로 스플라이싱됨(도 3c))은 시험관 내에서 인터페론-반응성 유전자를 차별적으로 활성화시킨다(문헌[Ning, S., Huye, L. E. & Pagano, J. S. Regulation of the Transcriptional Activity of the IRF7 Promoter by a Pathway Independent of Interferon Signaling. Journal of Biological Chemistry 280, 12262-12270 (2005)]). 이들 예는, 스플라이싱에서 이종성은 반응 인코딩의 또 다른 잠재적인 층을 나타낼 수 있음을 제시한다.

본원에 제공되는 연구는, LPS 자극에 대한 BMDC의 전사적 반응에서 광범위한 바이모달성은 유전자 발현, 다른 스플라이싱, 및 조절성 회로 활성을 반영하였음을 발견한다. 유전자 발현에서, 집단 평균에서 높게 발현되는 것들을 비롯하여 주요 면역 단백질을 인코딩하는 바이모달형으로 발현되는 수백 개의 전사체가 확인되었다. 일부 유전자에서 변동은 상이한 성숙 상태의 소수의 아집단으로 인한 것인 한편, 다른 것들은 항바이러스 조절성 회로의 바이모달 활성을 반영한다. 단일 세포에 대한 공동변동은 집단 척도 측정에서 구별될 수 없는 개선된 기능적인 유전자 모듈의 분해에 일조할 수 있다. 특히, 최근의 집단-척도 연구에서(문헌[Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012)]), STAT 단백질에 의해 제어되는 항바이러스 유전자 뿐만 아니라 성숙 유전자에 대해 농화된 808개의 "후기-유도되는" LPS 유전자로 구성된 큰 클러스터가 확인되었다. 이들 2개의 서브셋은 집단-수준 데이터 단독을 토대로 해서는 따로 티징(teasing)될 수 없었으나, 단일 시점으로부터의 단일-세포 데이터는 상이한 단일 세포에서 발현되는 바와 같이 이들을 명백하게 구별할 수 있다. 마찬가지로, 단일 세포들 간의 다른 스플라이싱에서 발견된 예상치 못한 일반적인 편향(skewing)은 이 과정의 분자적인 측면을 수정한다. 두 현상 모두, 세포 회로의 재구성을 위한 "동요 시스템"으로서 각각의 세포를 처리할 수 있게 한다(문헌[Angelo, K. et al. A biophysical signature of network affiliation and sensory processing in mitral cells. Nature 488, 375-378, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature11291 (2012); Sachs, K., Perez, O., Pe'er, D. & al, e. Causal protein-signaling networks derived from multiparameter single-cell data. Science (New York, NY) (2005)]). 실제로, 18개 단일 세포로부터의 데이터를 이용하고 유도성 유전자에 중점을 두어, 본원의 연구는, 어떻게 상이한 조절자가 인터페론-유발성 항바이러스 회로 내에서 이들의 공동-다양화 표적에 연결될 수 있었는지를 '개념 입증'으로서 언급하였으며, 이는 후속해서 녹아웃 모델에서 입증되었다. 마지막으로, 다수의 분석들이 증폭 노이즈의 가능한 영향을 제거하기 위해 높게 발현된 유전자에 중점을 두었지만, 데이터는 또한, 크기가 큰 비-코딩 RNA와 같은 보다 적절하게 발현되는 전사체들 중에서 상당한 바이모달성을 드러낸다(도 21). 이러한 관찰은, 집단에서 이들 전사체의 보다 낮은 발현 수준(문헌[Cabili, M. N. et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes & development 25, 1915-1927 (2011)])은 이들을 낮은 수준으로 발현하는 세포 모두가 아니라 이들을 높은 수준으로 발현하는 적은 수의 세포의 결과일 수 있으며, 추가적인 기술적 향상은 이들 2개의 가정을 구분하는 데 필요할 것이라는 흥미로운 가능성을 제시한다(도 9). 이와 같이, 단일-세포 측정은 이들 전사체의 발견, 주석화 및 분석을 촉진하는 데 일조할 것이다.

이들 결과를 다른 단일 세포 RNA-Seq 데이터 세트와 비교하면, (시험관 내 대 생체 외) 분석된 조직의 소스, (안정 상태 대 역동적으로 반응하는) 개별 세포의 생물학적 상태, 및 세포의 미세환경에서의 이종성은 모두 임의의 개별 시스템 내의 단일-세포 이종성의 규모에 영향을 미치는 경향이 있음을 가리킨다. 복잡한 조직(예컨대, 소팅되지 않은 골수, 상이한 발달 단계의 배아, 이종성 종양 및 희귀한 임상적 검체)에 적용되는 경우(문헌[Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M. & Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature 459, 428-432, doi:10.1038/nature08012 (2009);Todd, R. & Margolin, D. H. Challenges of single-cell diagnostics: analysis of gene expression. Trends Mol . Med . 8, 254-257 (2002)]), 단일-세포 게놈학에서 확인되는 가변성은 신규 세포 분류화 도식을 결정하고, 전이 상태를 확인하고, 이전에는 인지되지 않은 생물학적 구별을 발견하고, 이들을 분화시키는 마커를 맵핑하는 데 일조할 수 있다. 이 잠재성을 충족시키는 것은, (극미량의 입력 물질로 인한 기술학적 및 RNA 전사의 짧은 버스트(burst)로 인한 생물학적으로) 단일-세포 게놈학에 본래 존재하는 높은 수준의 노이즈를 해결하기 위한 신규의 실험적인 전략을 개발할 필요가 있을 것이다(문헌[Taniguchi, Y. et al. Quantifying E. coli Proteome and Transcriptome with Single-Molecule Sensitivity in Single Cells. Science 329, 533-538, doi:10.1126/science.1188308 (2010); Cai, L., Dalal, C. K. & Elowitz, M. B. Frequency-modulated nuclear localization bursts coordinate gene regulation. Nature 455, 485-490, doi:nature07292 [pii]10.1038/nature07292 (2008)]). 실험적 제조에서의 기술적 진보를 신규 산출적 접근법과 커플링하는 미래의 연구는, 수백 개 내지 수천 개의 단일 세포를 토대로, 세포내 회로를 재구성하고, 세포 상태 및 유형을 나열 및 재정의하고, 세포의 게놈 척도 상에서 세포의 의사 결정에 대한 이해를 근본적으로 변형시키기 위해 분석할 수 있게 한다.

본원에서 제공되는 연구는 또한, 2,000개 초과의 SMART-Seq(문헌[Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012)) 단일 세포 골수 수지상 세포(BMDC) RNA-Seq 라이브러리를 생성하고 분석하기 위해 미세유체 시스템을 이용한다. BMDC는, 이들이 일차적이며, 유사분열후이고, 병원성 성분에 반응하여, 집단 수준에서 잘 특징화된 염증 및 항바이러스 사이토카인에 대한 강력하며 생리학적으로 적절한 전사 프로그램을 유도하기 때문에, 단일 세포 반응의 연구를 위한 매력적인 시스템이다(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009).; Chevrier, N. et al. Systematic Discovery of TLR Signaling Components Delineates Viral-Sensing Circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011); Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012); Takeuchi, O. & Akira, S. Pattern Recognition Receptors and Inflammation. Cell 140, 805-820, doi:10.1016/j.cell.2010.01.022 (2010); Shalek, A. K. et al. Nanowire-mediated delivery enables functional interrogation of primary immune cells: application to the analysis of chronic lymphocytic leukemia. Nano Lett. 12(12):6498-504. doi: 10.1021/nl3042917 (2012)). 처음에, BMDC를, 자극전과, LPS, PAM3CSK 및 폴리I:C(각각 그람-음성 박테리아, 그람-양성 박테리아 및 바이러스 RNA의 합성 모방체 유래)로 자극한 후 4개의 시점(1시간, 2시간, 4시간, 6시간)에서 프로파일링하였다. 이들 별개의 스냅샷의 경우, 단일 세포 노이즈의 일시적이고 반응-특이적인 구조가 조사되었다. 자극 및 시점에 대한 단일 세포 변동의 변화를 평가하기 위해, 신규 네스티드 통계학적 모델을 개발하였으며, 이를 이용하여, 각각의 유전자의 단일 세포 발현 분포를 매개변수화하였다. 각각의 병원체 성분이 집단 수준에서 별개의 일시적인 프로그램을 활성화하는 한편, 개별 반응성 세포는 각 반응 내에서도 급격하게 가변적인 거동을 나타낸다. 염증 회로에서, 발현 이종성의 2개의 일시적으로 별개의 패턴이 확인되었으며: 일부 회로들은 초기에 강하게 동기화되며, 시간이 지남에 따라 위상이완(dephase)되는, 반면, 다른 것들은 노이즈하게 유도된다. 한편, 항바이러스 유전자 회로는 노이즈하게 개시되며, 시간이 지남에 따라 밀접하게 동기화되게 된다.

특히, 본원에 제시되는 연구는, 집단 측정에서 가려지는 조숙 "초기 항바이러스 반응자"의 희귀한 집단을 발견하였으며, 이들의 반응이 측분비 신호전달을 통해 집단 전체에서 증폭됨을 가정한다. 이 가정을 시험하기 위해, 각각의 세포를 밀봉된 미세유체 챔버에서 개별적으로 자극하였으며, 대부분의 세포들은 주요 항바이러스 반응 유전자를 유동하는 데 실패한 것으로 확인되었다. 그러나, 놀랍게도, 염증 반응은 이들 단리된 세포에서 덜 가변적이며, 이는, 세포내 소통이 상이한 회로에 대한 노이즈를 제한할 수도 있고 증가시킬 수도 있음을 언급한다. 인터페론 수용체가 결핍된 DC를 분석하는 것은, 이들 발견 중 다수를 요약하며, 이는 인터페론 피드백이 항바이러스 반응뿐만 아니라 염증 반응에서 공동저해 및 노이즈의 조화를 이루는 데 필수적임을 보여준다. 마지막으로, 모델에 의해 지명된 주요 세포내 조절자가 삭제된 DC를 시험하여, 이 과정을 제어하는 주요 회로 성분을 입증하였다. 이 연구는, 세포간 회로 및 세포내 회로를 재구성하는 단일 세포에 대한 가변성을 어떻게 이용하는지, 그리고 게놈 척도에서 세포의 의사 결정에 대한 이해에 대해 언급한다.

본 개시내용의 조성물 및 방법은 1,700개 초과의 SMART-Seq 단일세포 RNA-Seq 라이브러리를 제조하기 위해 미세유체-기재의 접근법을 이용하며, 상이한 병원체 성분 및 관련 동요에 대한 BMDC의 역동적인 반응을 검체화한다(예를 들어, 문헌[Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:10.1038/nbt.2282 (2012)]). 별개의 유전자 모듈은 상이한 일시적인 가변성 프로파일을 특징으로 하며, 이는, 이들 검출가능하게 발현하는 세포 내에서 mRNA 수준 및 검출가능한 수준에서 주어진 mRNA 전사를 발현하는 세포의 분획 둘 모두의 변화로 인한 것이다. BMDC 집단의 평균 일시적인 반응은 단일-세포 수준에서 근본적인 동시적이지 않으나 연속적인 과정으로 인한 것이며: 각각의 검체화된 시점에서, 각각의 모듈에 대해, 일부 세포들은 일시적인 연속체 상의 다른 것들보다 더 '진보된'다. 특히, 몇몇 "조숙" 세포가 발견되었으며, 집단 측정에서 가려졌으며, 인터페론을 생성하고 코어 항바이러스 모듈을 초기에 활성화시킨다. 이론에 의해 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이들 조숙 세포는 인터페론-매개의 측분비 신호전달을 통해 집단에서 항바이러스 반응의 유발에 관여하는 것으로 여겨진다.

집단 반응의 조화를 이루는 데 있어서 측분비 신호전달의 역할을 이해하기 위해, 본원에서 제공되는 연구는 신규 실험적 접근법을 개발하여, 밀봉된 미세유체 챔버에서 세포를 개별적으로 자극하여, 세포-대-세포의 소통을 방지하였다. 이는 후기 시점에서 항바이러스 반응의 산포 및 조화를 차단하며, 이는, 이들 "조숙" 세포가 고유의(native) 집단 반응을 개시하고 조화를 이루는 데 있어서 중요한 역할을 함을 제시한다. 더욱이, 인터페론 수용체가 결핍된 BMDC 또는 분비 저해제(브레펠딘 A, 'GolgiPlug')나 단백질 합성 저해제(사이클로헥시마이드)로 처리된 BMDC는 LPS로 자극된 경우, "코어" 항바이러스 반응 유전자를 유도하는 데 실패한 것으로 확인되었다. 놀랍게도, 측분비 신호전달 또는 인터페론 신호전달의 저해는 또한, 초기의 가파른 정점 유도 패턴으로 염증 반응 유전자 모듈을 발현하는 세포 분획에서 상당한 증가를 초래하였으며, 어떻게 역동적인 집단-수준 양성 측분비 피드백 고리 및 음성 측분비 피드백 고리 둘 모두 면역 반응에서 변동을 촉진하고 저지할 수 있는지를 강조하였다.

BMDC 집단 내에서 개별 세포의 거동은 면역 반응 동안에 매우 역동적이며, 디지털 변동 및 아날로그 변동 둘 모두는 다양한 시점, 자극 및 모듈에 대해 변한다. 이들 패턴(집단-수준 측정에서 가려짐)은, 어떻게 세포 집단이 복합적인 동적 반응의 조화를 이루기 위해 세포내 제어 전략 및 세포간 제어 전략을 둘 다 이용할 수 있는지에 대한 원리를 밝힌다. 본원에 제시되며 상이한 시점 및 자극, 및 연관된 통계학적 분석, 및 물리적, 유전적 및 생화학적 동요에서 수득되는 단일-세포 프로파일링 데이터 세트는 이들 세포내 제어 전략 및 세포간 제어 전략을 분해하는 데 필수적인 입력 및 접근법을 제공한다.

우선, 단일-세포 발현 분포의 통계학적 분석은, 동적인 반응 동안에, 특정 전사체를 검출가능한 수준으로 발현하는 세포 분획뿐만 아니라 발현 세포 내에서의 mRNA 수준 둘 모두가 변함을 밝히고 있다. 이들 2개 기능들의 상호작용은 일시적인 반응 프로파일의 부유한 다양성을 인코딩할수 있다. 예를 들어, 후기-유도되는 "코어" 항바이러스 유전자는 초기 시점에서 매우 약한 평균 발현을 나타내지만, 몇몇 "조숙" 세포에서는 높게 발현된다. 대조적으로, "정점" 염증 유전자의 진행성 약화는, 모든 세포들에서 발현의 균일하며 점차적인 감소가 아닌, 이들 전사체를 발현하는 세포 분획에서의 변화를 반영한다. 이 거동의 편재성은, 집단 발현 프로파일의 변화를 전적으로 세포내 사건탓으로만 하는 경향이 있는 회로 재구축을 위한 통상적인 산출적 접근법에 이의를 제기한다. 그보다는, 이들 관찰은, 세포 집단이, 모든 세포들에게 보편적인 정밀한 세포내 회로를 통해서 뿐만 아니라 이종성 단일 세포들 간의 세포간 피드백 기전을 이용하여, 복잡한 평균 반응을 생성할 수 있음을 제시한다. 복수의 반응 프로그램(도 26f)을 특징화하는 바이모달성의 초기 변화는, 신속한 면역 반응을 유도하는 가장 효율적인 방법이, 임의의 세포로 하여금 이를 보다 효율적으로 수행하도록 하게 하는 것이 아니라, 보다 많은 세포들로 하여금 주어진 임무를 수행하도록 하는 것임을 제시할 수 있었다.

이러한 세포간 제어 전략의 중요성에 대한 일례는, 측분비 신호전달이 단일 세포 거동의 몇 가지 별개의 일시적인 패턴을 구축하는 데 있어서 중요한 역할을 한다는 발견이다. 특히, 본원의 연구는, LPS 자극 후 1시간째에 Ifnb1 및 "코어" 항바이러스 유전자를 발현하는 소수의 "조숙" 세포를 밝히고 있으며, IFN-β의 분비를 통해, 집단 반응의 조화를 이루기 위해 다른 세포에서 "코어" 항바이러스 유전자를 활성화하는 데 일조한다는 것을 밝히고 있다. 이들 세포는, "코어" 항바이러스 모듈의 대략 100개 유전자의 발현을 제외하고는, 집단의 나머지와 구별되지 않음을 주지한다.

본원에 제시되는 실험 데이터는, 관찰된 "조숙" 세포가 효율적이며 시기적절한 집단 반응을 가능하게 하는 데 중요한 프라이밍된 개시제인 것 같음을 제시한다. 우선, LPS 첨가 후 상이한 시점에서 분비를 저해하는 브레펠딘 A(GolgiPlug) 실험은, "코어" 항바이러스 반응에 대한 주요 측분비 신호가 초기에 대략 1시간째에 분비됨을 제시한다. 보다 중요하게는, "온-칩" 단리 실험은, 이들 "조숙" 세포로부터의 측분비 신호전달 없이, 단지 작은 비율(20%)의 세포만이 인큐베이션 4시간 후에도 그 자체가 LPS에 대한 감소된 "코어" 항바이러스 반응을 개시할 수 있음을 보여준다. 따라서, 이들 데이터는, "조숙" 세포가, LPS에 대한 1시간째의 반응에서 Ifnb1을 발현하도록 프라이밍된 특수하며, 가능하게는 확률적으로 정의된, 후생학적 상태에 있는 세포를 나타낼 수 있음을 제시한다. 인터페론-매개의 소통을 비롯한 측분비 신호전달은 또한, 후기 시점에서 유도성 유전자("정점" 염증)의 서브셋을 약화시키는 작용을 한다. 종합하자면, 이들 관찰은, "온-칩", 녹아웃 및 화학적 조정 실험에서 관찰된 항바이러스 경로 및 염증 경로 간의 교차저해에 대한 모델(도 29)을 제시한다. 이 모델에서, 소수의 세포 유래의 항바이러스 피드백은 세포 서브셋으로부터 항염증 사이토카인의 발현 및 분비를 유도하고, 이는 즉, 근접한 세포의 염증 반응을 약화시킨다. 중요하게는, 이 모델은 또한, 균일한 과량의 세포외 신호전달 분자(예를 들어, IFN-β)을 제시하는 것이 아니라 별개의 반응 서브셋들 간의 균형을 표적으로 하는 다른 치료적 전략을 제시한다(예를 들어, 문헌[Banchereau, J. & Pascual, V. Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus and Other Autoimmune Diseases. Immunity 25, 383-392, doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2006.08.010 (2006); Hall, J. C. & Rosen, A. Type I interferons: crucial participants in disease amplification in autoimmunity. Nature Reviews Rheumatology 6, 40-49, doi:http://dx.doi.org/10.1038/nrrheum.2009.237 (2010)] 참조).

시그너처 유전자의 선택을 위한 자동화된 절차

본 발명은 또한, 다양한 치료적 및/또는 진단적 적응증에 유용한 유전자 시그너처를 결정하는 방법을 제공한다. 이들 방법의 목적은, 관심 대상이 되는 과정과 관련하여 유용한 정보를 제공할 유전자의 작은 시그너처를 선택하는 것이다. 기본적인 개념은, 상이한 유형들의 정보가, 전체 게놈(20 k 초과의 유전자)의 "공간"을 연관 유전자의 서브셋들로 상이하게 분할되는 것을 수반할 수 있다는 것이다. 이러한 전략은, 시그너처 크기에 대한 제약을 고려할 때, 이들 분할의 최상의 범위를 가지도록 설계된다. 예를 들어, 이러한 전략의 일부 구현예에서, 2가지 유형의 정보가 존재한다: (i) 일시적인 발현 프로파일; 및 (ii) 기능적 주석(functional annotation). 제1 정보 소스는 유전자를 공동-발현되는 유전자 세트로 분할한다. 정보 소스는 유전자를 공동-기능성의 유전자 세트로 분할한다. 그런 다음, 각각의 세트로부터 원하는 수의 대표물이 있도록, 예를 들어, 각각의 공동-발현 세트로부터 적어도 10개의 대표물, 및 각각의 공동-기능성 세트로부터 적어도 10개의 대표물이 있도록, 작은 유전자 세트를 선택한다. 복수 개의 정보 소스를 이용하여(따라서, 복수 개의 분할을 "커버"하는 것을 목표로) 연구할 때의 문제점은, 컴퓨터 과학 이론에 세트-커버(Set-Cover)로서 알려져 있다. 이 문제점은 (이의 NP-난해(NP-hardness)로 인해) 최적으로 해결될 수는 없지만, 작은 인자 내에서 근사될 수는 있다. 일부 구현예에서, 각각의 세트로부터 대표물의 원하는 수는 1 이상, 2 이상, 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상,5 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상 또는 100 이상이다.

이 전근법의 중요한 특징은, 시그너처의 크기(이후, 이 제약 하에 있을 수 있는 최상의 범위를 확인함); 또는 원하는 범위 수준(이후, 범위 요구를 충족시킬 수 있는 최소의 시그너처 크기를 선택함)이 주어질 수 있다는 점이다.

이 과정에 대한 예시적인 구현예는 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 제시되는 다양한 유전자 시그너처들의 선택이다.

시그너처 유전자의 용도

본 발명은 다양한 진단적 및/또는 치료적 적응증에서, 뿐만 아니라 치료 분자를 스크리닝하거나 그렇지 않다면 확인하는 다양한 방법들에서 사용하기 위한 수지상 세포 관련 유전자 시그너처를 제공한다. 본 발명의 맥락에서 "시그너처"는 제한없이, 이들의 다형성, 돌연변이, 변이체, 변형, 아단위, 단편 및 다른 분석물 또는 검체-유래의 측정값과 더불어, 핵산을 포함한다.

예시적인 시그너처는 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 나타나 있으며, 본원에서 집합적으로 특히 "수지상 세포-연관 유전자", "수지상 세포-연관 핵산", "시그너처 유전자" 또는 "시그너처 핵산"으로서 지칭된다.

이들 시그너처는, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 제1 수준을 검출하는 단계, 및 검출된 수준을 시그너처 유전자 또는 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준의 대조군과 비교하는 단계에 의해, 개체에서 면역 반응 및/또는 비정상적인(aberrant) 수지상 세포 반응을 진단하거나, 예측하고/하거나 단계화(staging)하는 방법에 유용하며, 여기서, 검출된 수준과 대조군 수준 간의 차이는 개체에 면역 반응 및/또는 비정상적인 수지상 세포 반응이 존재한다는 것을 가리킨다.

이들 시그너처는, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제1 시점에서 검출하는 단계, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제2 시점에서 검출하는 단계, 및 제1 시점에서 검출된 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제2 시점에서 검출된 발현, 활성 및/또는 기능의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응 및/또는 비정상적인 수지상 세포 반응을 모니터링하는 방법에 유용하며, 여기서, 제1 시점에서 검출된 수준과 제2 시점에서 검출된 수준 간의 변화는 개체에서 면역 반응 및/또는 비정상적인 수지상 세포 반응의 변화를 가리킨다.

이들 시그너처는, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및/또는 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 검출된 수준을 토대로, 비정상적인 면역 반응, 자가면역 반응 및/또는 염증 반응과 같은 면역 반응 및/또는 비정상적인 수지상 세포 반응의 위험이 있거나, 면역 반응 및/또는 비정상적인 수지상 세포 반응을 앓고 있는 환자군을 확인하는 방법에 유용하다. 이들 시그너처는 또한, 치료 또는 치료법의 효능을 측정하기 위해, 비정상적인 면역 반응(들) 및/또는 비정상적인 수지상 세포 반응(들)에 대한 치료 및 치료법을 수행하고 있는 개체들을 모니터링하는 데 유용하다. 이들 시그너처는 또한, 환자가 치료 또는 치료법에 반응성인지 결정하기 위해, 비정상적인 면역 반응(들) 및/또는 비정상적인 수지상 세포 반응(들)에 대한 치료 또는 치료법을 수행하고 있는 개체들을 모니터링하는 데 유용하다. 이들 시그너처는 또한, 비정상적인 면역 반응 및/또는 비정상적인 수지상 세포 반응의 증상을 치료하거나, 이의 진행을 지연시키거나, 그렇지 않다면 완화하는 데 효과적일 치료법 및 치료를 선택하거나 변형시키는 데 유용하다. 본원에 제공되는 시그너처는, 질환의 특이적인 상태에 있는 환자의 그룹을, 치료의 선택을 용이하게 하는 정확성을 가지고 선택하는 데 유용하다.

이들 시그너처 유전자는 또한, 치료법, 백신, 이식 또는 다른 치료적 개입에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 방법에 유용하다. 예를 들어, 하나 이상의 시그너처 유전자의 발현 수준은 투여전 및 투여후 다양한 시점들에서 검출될 수 있으며, 이들 수준은 본원에 제공되는 단일 세포 방법을 이용해 분석될 수 있다. 어떤 유전자가 코호트 또는 다른 응집성 기에서 발현되고 있는지, 및/또는 어떤 세포 아군이 이들 유전자를 독점적으로 발현하고 있는지 결정함으로써, 실행자는, 어떤 코호트(들) 및/또는 어떤 경로(들)가 면역 반응 및/또는 비정상적인 수지상 세포 반응을 발생시키는 데 관여하는 지 결정할 수 있을 것이다.

본 발명은 또한, 하나 이상의 시그너처 핵산에 결합하는 검출 시약이 구비되어 있는 키트를 포함한다. 본 발명은 또한, 검출 시약의 어레이, 예를 들어, 하나 이상의 시그너처 핵산에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 적합한 검출 시약은, 키트 형태로 함께 포장되는 시그너처 핵산의 일부에 상보적인, 상동적인 핵산 서열, 예컨대 올리고뉴클레오타이드 서열을 가짐으로써, 하나 이상의 시그너처 핵산을 특이적으로 확인하는 핵산을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 시그너처 유전자의 단편일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 200개, 150개, 100개, 50개, 25개, 10개 이하의 뉴클레오타이드일 수 있다. 키트는, 이들을 매트릭스에 결합시키기 위한 시약, 대조군 제형(양성 및/또는 음성) 및/또는 검출가능한 표지, 특히, 예컨대 플루오레세인, 녹색 형광 단백질, 로다민, 시아닌 염료, 알렉사 염료(Alexa dye), 루시퍼라제, 방사성표지와 함께, 개별 용기에 포함되거나 개별적으로 포장될 수 있다. 분석법을 수행하기 위한 설명서(예를 들어, 서면형의 설명서, 테이프, VCR, CD-ROM 등)가 키트에 포함될 수 있다. 분석법은 예를 들어, 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같은 노던 혼성화 또는 샌드위치 ELISA의 형태일 수 있다. 예를 들어, 키트는 PCR, 핵산 서열화 등을 비롯하여 본원에 기술되는 방법들 중 임의의 방법을 수행하기 위한 시약 및 지침을 포함할 수 있다. 다른 예로, 키트는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 기질 어레이를 포함한다.

수지상 세포 및 이의 용도

수지상 세포(DC)는 내감염성을 포함하고/하거나 이에 기여하며 자가관용을 조정하는 다수의 면역 반응들에 관여한다. DC는 T-세포 인지 및/또는 반응성을 제어하는 능력을 가진다.

DC는, 상이한 병원체, 예를 들어, 미생물 성분에 대한 반응에서 별개의 방식으로 성숙되고 따라서 상이한 숙주 면역 반응을 개시할 수 있기 때문에, 내감염성을 유도하는 것으로 알려져 있다(예를 들어, [Steinman & Banchereau. "Taking dendritic cells into medicine." Nature, vol. 449: 419-426 (2007); doi:10.1038/nature06175]). 본원에 제공되는 조정제는 이들 면역 반응을 방해하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 조정제는 표 1 내지 표 5A의 하나 이상의 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능을 조정한다. 일부 구현예에서, 이들 조정제는 DC 성숙을 차단하거나 그렇지 않다면 저해한다. 일부 구현예에서, 이들 조정제는 DC의 하나 이상의 기능을 변경시키거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치며, 이로써 예를 들어, 보호성 T_H1 표현형으로부터 비-보호성 T_H2 표현형으로 T-세포 반응을 조정한다.

DC는 또한, 면역원성을 증강시킴으로써 감염을 치료 및 예방하기 위한 다양한 백신 적응증들의 설계 및 창출에 유용하다. 이들 적응증에서, 백신은 하나 이상의 조정제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 백신은 수지상 세포의 성숙을 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 조정제를 전달한다. 일부 구현예에서, 백신은 하나 이상의 T-세포 반응, 예를 들어, 보호성 T_H1 표현형의 유도를 변경시키거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 조정제를 전달한다.

DC는 또한, T 세포 면역성을 조절하는 능력으로 인해 암에 대한 다양한 치료 백신들의 설계 및 창출에 유용하다(예를 들어, [Banchereau & Palucka. Dendritic Cells as Therapeutic Vaccines Against Cancer. Nature, vol. 5: 296-306 (2005); doi:10.1038/nril592); 및, Palucka et al. "Building on dendritic cell subsets to improve cancer vaccines." Curr Op Immunol, 22: 258-63 (2010); doi:10.1016/j.coi.2010.02.010] 참조).

예를 들어, DC는 백신에서 보조제로서 사용된다. 미성숙 DC는 관용성을 유도하는 것으로 알려져 있는 한편, 성숙 DC는 면역성을 유도한다. 미성숙 DC는 주로, 항원-포착 세포로서 작용하는 한편, 성숙 DC는 주로 항원-제시 세포로서 작용한다. 따라서, 조정제는, DC 또는 DC 집단의 성숙도를 조정하기 위해, 예를 들어, 원하는 결과를 토대로 성숙 DC와 미성숙 DC 간의 균형을 시프트(shift)하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 조정제는 관용성이 바람직한 경우 미성숙 DC 표현형으로 시프트하는 데 사용될 수 있으며, 면역성이 바람직한 적응증에서, 조정제는 성숙 DC 표현형으로 시프트하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조정제는 DC 또는 DC 집단의 가소성(plasticity)을 조정하는 데 사용된다. 예를 들어, 조정제는, DC 또는 DC 집단을 DC의 특정 서브셋으로 시프트하기 위해, 예를 들어, 랑게르한스 세포, 간질성 DC(interstitial DC) 및 형질세포양 DC(plasmacytoid DC)로 시프트하거나 이들로부터 시프트하기 위해 사용될 수 있거나; 특정한 DC 분화 경로로 시프트하기 위해, 예를 들어, 골수성 경로로의 또는 골수성 경로로부터 및/또는 림프성 경로로 또는 림프성 경로로부터 시프트하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은, 하나 이상의 수지상 세포 반응을 조정하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조정하는"은, 하나 이상의 유전자의 발현을 상향조절하거나 그렇지 않다면 증가시키는 것, 하나 이상의 유전자의 발현을 하향조절하거나 그렇지 않다면 감소시키는 것, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 저해하거나 그렇지 않다면 감소시키는 것, 및/또는 하나 이상의 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 증강시키거나 그렇지 않다면 증가시키는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "수지상 세포의 반응을 조정하는"은, 임의의 다양한 수지상 세포의 기능 및/또는 활성을 조정하는 것을 포함하며, 비제한적인 예로, 수지상 세포의 성숙을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 수지상 세포의 면역 반응을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 수지상 세포의 항바이러스성 면역 반응, 예를 들어, 코어 항바이러스 반응 및/또는 이차 항바이러스 반응을 비롯한 수지상 세포의 항바이러스성 면역 반응을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 수지상 세포의 염증성 면역 반응, 예를 들어, 유도성 염증 반응 및/또는 가파른 정점 염증 반응을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 수지상 세포의 Toll-유사 수용체(TLR) 반응을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; T 세포 및 B 세포 보충을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; T_H1-세포 반응(들)의 DC 촉진을 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; T_H2-세포 반응(들)의 DC 유도를 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; DC의 다운스트림에 있는 임의의 세포에 대한 DC 유도, 영향 또는 다른 효과를 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 조절 T 세포(Treg), Th17 세포, 기억 T 세포 및 다른 T 세포를 비롯한 T 세포의 DC 유도를 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 예를 들어, 성숙한 표현형과 미성숙한 표현형 사이에서 및/또는 DC의 서브셋들 사이에서, DC 표현형의 시프트를 조절하는 네트워크를 제어하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 수지상 세포의 적어도 하나의 기능 또는 생물학적 활성을 조작하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 병원체-구동성 T 세포 극성화의 수지상 세포 제어를 조작하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것; 및/또는 DC에 의해 분비되는 사이토카인, 케모카인 및 다른 분자들의 생성을 조작하거나 그렇지 않다면 이에 영향을 미치는 것을 포함한다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 코어 항바이러스 조정제는 막관통 수용체, 예컨대 비제한적인 예로, IFNAR1, TLR3, TLR4, IL28RA, TLR9, IFNAR2, COLEC12, SCARA3, MSR1, FCER1G 및 KIR2DS4로 이루어진 군으로부터 선택되는 막관통 수용체이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 코어 항바이러스 조정제는 포유류 내인성 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 트레티노인(tretinoin), 또는 비-포유류 내인성 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 살모넬라 미네소타(salmonella minnesota) R595 리포다당류, 메제레인(mezerein), 3-데옥시-2-옥툴로소닉산(2)-지질 A, E. coli B5 리포다당류 및 바필로마이신 A1(bafilomycin A1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-포유류 내인성 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 코어 항바이러스 조정제는 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 화학적 키나제 저해제 약물, 예컨대 SB203580 또는 H-7, 또는 또 다른 화학적 약물, 예컨대 리포다당류, 폴리 rI:rC-RNA, E. coli B4 리포다당류, 스탈리마이신(stallimycin), 브로모데옥시유리딘, 2-아미노퓨린, 리바비린(ribavirin), CpG ODN 1668, 프리스탄(pristane), 이미퀴모드(imiquimod), 데시타빈(decitabine), 살모넬라 엔테리카 혈청형 아보르투스 에퀴(Salmonella enterica serotype abortus equi) 리포다당류, CpG ODN 1826, 콘카나마이신 A(concanamycin A), 폴리 dA-dT, 이오노마이신(ionomycin), 푸코이딘(fucoidin), CpG ODN 2216, AL 108, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 에피갈로카테신-갈레이트, 클로로퀸, 3M-011, 카르비마졸(carbimazole), 3M-001, Pam3-Cys, 로시글리타존(rosiglitazone) 및 지질 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 시약, 독성제 또는 다른 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 코어 항바이러스 조정제는 생물학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 페긴트론(pegintron), 폰톨리주맙(fontolizumab) 및 인터페론 베타-1a로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 약물이다.

일부 구현예에서, 조정제는, "이차 항바이러스" 유전자 시그너처 유래의 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 표 2 및 2A에 열거된 것들 유래의 하나 이상의 유전자의 발현을 조정하는 데 사용된다. 본원에서, 이들 조정제는 "이차 항바이러스 조정제(들)"로 지칭된다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 이차 항바이러스 조정제는 키나제, 예컨대 비제한적인 예로, MAPK9, EIF2AK2, CRKL, MET, TBK1, MAP3K7 및 JAK1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키나제이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 이차 항바이러스 조정제는 막관통 수용체, 예컨대 비제한적인 예로, TLR4, TLR3 및 IFNAR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 막관통 수용체이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 이차 항바이러스 조정제는 비-포유류 내인성 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로 살모넬라 미네소타 R595 리포다당류이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 이차 항바이러스 조정제는 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 화학적 키나제 저해제 약물, 예컨대 LFM-A13, 또는 또 다른 화학적 약물, 예컨대 폴리 rI:rC-RNA, 리포다당류 및 R-WIN 55,212로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 시약, 독성제 또는 다른 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 성숙 조정제는 키나제, 예컨대 비제한적인 예로, IKBKB, MAP2K4, PRKCD, MTOR, MAPKAPK2, PRKCB, LYN, MAPK14, DDR1, TGFBR1, PRKCA, AKT1, RAF1, SHC1, CSF1R, IRAK4, PRKCQ, SPHK1, MAP4K1, RPS6KB1, GSK3B, FES, MAP3K7, MAP3K8, SRC, CHUK, PTK2, PIK3R1, MAP2K7, MAPK9, RPS6KA5, MAPK8, BTK, EGFR, MAP2K6, PDPK1, PRKG1, FLT3, TYK2, CDK9, ACVR2B, CDK10, MAST2, MAPK11, FGFR3, PIM1, ACVRL1, FGFR2, MARK2, PBK, PLK3, MAP3K14, NME1, HIPK2 및 ERBB2로 이루어진 군으로부터 선택되는 키나제이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 성숙 조정제는 막관통 수용체, 예컨대 비제한적인 예로, CD40, TLR4, TLR9, FAS, TLR7, CD5, IL27RA, TLR2, TLR3, CD28, ICAM1, LTBR, TLR8, FCGR2A, TYROBP, TNFRSF10A, TLR5, TREM2, IGHM, CD2, TNFRSF8, IL6R, CLEC7A, CHRNA1, ITGB3, AGER, TNFRSF6B, TLR6, TNFRSF11A, TRA@ (TRA, T 세포 수용체 알파 유전자 좌로 알려져 있음), FCGR2B, NGFR, IGF1R, TNFRSF1A, IL1RL2, CD300C, CD86 및 MS4A2로 이루어진 군으로부터 선택되는 막관통 수용체이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 성숙 조정제는 포유류 내인성 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 프로스타글란딘 E2, 히알루론산, ATP, 트레티노인, 에탄올, 하이드로겐 퍼옥사이드, 부티르산, 아라키돈산, 요산, 콘드로이틴 설페이트 A, 아데노신, 헤파린, Ca2+, 히스타민, L-메티오닌, 일산화탄소, 사이클릭 AMP, 라우르산, 에피네프린, 11,12-에폭시에이코사트리엔산, 베타-에스트라디올, 리폭신 A4, L-글루탐산, 디하이드로테스토스테론, 프로게스테론, 카이누렌산(kynurenic acid), 메발론산, 5,6-에폭시에이코사트리엔산, L-오르니틴, 말론산, 엘라이드산(elaidic acid), N(오메가)-하이드록시아르기닌, 디메틸글리신, 17-에피에스트리올, D-갈락토사민, 하이드로코티손, 엽산, 헤민(hemin), 글루코사민, 혈소판 활성화 인자, 글리코실포스파티딜이노시톨, 팔미톨레산(palmitoleic acid) 및 글루타티온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유류 내인성 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 성숙 조정제는 비-포유류 내인성 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, E. coli 리포다당류, 리포테이코산(lipoteichoic acid), E. coli B5 리포다당류, N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, 자이모산 A, 15-데옥시-델타-12,14 -PGJ 2, 펩티도글리칸, 우르솔릭산(ursolic acid), 강글리오사이드 GD3, 자이모산, 헤모조인(hemozoin), 프로스타글란딘 A1, 메제레인, E. coli 혈청형 0127B8 리포다당류, 살모넬라 미네소타 R595 리포다당류, 리시놀레산(ricinoleic acid), 튜니카마이신(tunicamycin) 및 아피게닌(apigenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-포유류 내인성 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 성숙 조정제는 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 화학적 키나제 저해제 약물, 예컨대 SB203580, 워트만닌(wortmannin), PD98059, SP600125, Sb202190, U0126, LY294002, AG490, KN 93, 비스인돌릴말레이미드 I, Ro31-8220, 스타우로스포린(staurosporine), Bay 11-7082, H89, Go 6976, 타이포스틴 AG 1478, PD 169316, PP1, 8-브로모구아노신 3',5'-사이클릭 모노포스페이트, 1-o-헥사데실-2-o-메틸-rac-글리세롤, 미리스토일화된 PKC제타 슈도기질 펩타이드 저해제, KT 5926 및 8-클로로페닐티오-아데노신 3',5'-사이클릭 모노포스페이트이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 성숙 조정제는 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 또 다른 화학적 약물, 예컨대 리포다당류, ssRNA40, N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르, 카페인산 페네틸 에스테르, S-니트로소글루타티온, W7, E. coli B4 리포다당류, 포볼 미리스테이트 아세테이트, CpG ODN 2006, CpG ODN 1826, 폴리 rI:rC-RNA, ATP-감마-S, 심바스타틴, EGTA, 나이스타틴(nystatin), N-아세틸-L-시스테인, 3M-001, 트라닐라스트(tranilast), 탑시가긴(thapsigargin), Pam3-Cys-Ser-Lys4, DETA-NONOate, 레시퀴모드(resiquimod), CpG ODN 1668, 살모넬라 엔테리카 혈청형 아보르투스 에퀴 리포다당류, 3-메틸아데닌, 뮤라부타이드(murabutide), CpG 올리고뉴클레오타이드, R5020, 로바스타틴, 시롤리무스, 부클라데신, 에피갈로카테신-갈레이트, 멜팔란, 3M-011, 이마티닙(imatinib), zVAD-FMK, Pam3-Cys, 아스피린, 블레오마이신, 덱사메타손, 상글리페린 A(sanglifehrin A), 메톡스살렌(methoxsalen), 보르테조밉(bortezomib), 캄토테신, 모노포스포릴 지질 A, 3M-002, 파클리탁셀, 피롤리딘 디티오카르바메이트, 니켈, 트리코스타틴 A, 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), 커큐민, 덱스트란 설페이트, 레스베라트롤(resveratrol), 포스콜린(forskolin), 슈라민(suramin), 프리스탄(pristane), 7-에틸-10-하이드록시-캄토테신, Ni2+, 트로바플록사신, 페난트리딘(phenanthridine), 브리오스타틴 1(bryostatin 1), UCN-01, 빈블라스틴, 에토포사이드, 사이클로헥시마이드, 옥살리플라틴(oxaliplatin), [Lys15,Arg16,Leu27]VIP(1-7)GRF(8-27), 플루바스타틴(fluvastatin), 시글리타존(ciglitazone), 니코틴, 에이코사펜텐산(eicosapentenoic acid), 로시글리타존, 이오노마이신, 펜톡시필린(pentoxifylline), 니플룸산(niflumic acid), [Ac-His1,D-Phe2,Lys15,Arg16,Leu27]VIP-(3-7)-GRF-(8-27), 미페프리스톤(mifepristone), 글리오톡신, 플라보피리돌, 타네스피마이신(tanespimycin), 로테논, GCS-100, 미다졸람, 1-알파, 25-디하이드록시 비타민 D3, 데시타빈, 3,3'-디인돌릴메탄, A23187, 엔티노스탓(entinostat), 지도부딘(zidovudine), 시티딜릴-3'-5'-구아노신, 테트란드린(tetrandrine), 발프로산(valproic acid), 시스플라틴, 토레미펜(toremifene), 퀴나크린(quinacrine), 비타민 E, 보리노스탓(vorinostat), GW3965, 이소부틸메틸크산틴, 풀베스트란트(fulvestrant), Sn50 펩타이드, 클로베타졸 프로피오네이트, D609, 벤젠, 에포틸론 B(epothilone B), 스퍼민 니트릭 옥사이드 복합체, 메틸셀렌산, 데페록사민, 트로글리타존, 1'-아세톡시샤비콜 아세테이트, 파리칼시톨(paricalcitol), 비소, 이미퀴모드(imiquimod), GLP-1-(7-34)-아미드, S-(2,3-비스팔미토일옥시프로필)-시스테인-GDPKHPKSF, 9-cis-레티노산, 카드뮴, 술린닥 설파이드, 로틀레린(rottlerin), 13-cis-레티노산, 니트로푸란토인, N-Ac-Leu-Leu-노르루시날(norleucinal), 다시노스탓(dacinostat), Ro41-5253, 토실페닐알라닐 클로로메틸 케톤, 랄록시펜(raloxifene), 세리바스타틴(cerivastatin), 파노비노스탓(panobinostat), 피세틴(fisetin), 트리니트로벤젠설폰산, CpG ODN 2216, 오크라톡신 A(ochratoxin A), 아족시메탄, 에피카테신 갈레이트, 포볼 에스테르, MALP-2s, S-니트로소-N-아세틸-DL-페니실라민, 롤리프람(rolipram), 락타시스틴, 반응성 산소종, 카본 테트라클로라이드, 포볼 12,13-디데카노에이트, 폴리에틸렌 글리콜, 디이소프로판올니트로사민, N(1)-구아닐-1,7-디아미노헵탄, 알데스루킨(aldesleukin), 4-하이드록시타목시펜, 탈리도마이드, 독소루비신, 설포라판(sulforafan), 메틸니트로니트로소구아니딘, SU6656, CGS 21680, 다우노루비신, 오메가-N-메틸아르기닌, 린시도민(linsidomine), 파수딜(fasudil), 5-플루오로우라실, 디에틸스틸베스트롤, 모르핀, 미토마이신 C, 리바비린, S-니트로소-N-아세틸페니실라민, 소듐 오르토바나데이트, Am 580, 프레드니솔론, 클로로퀸, 갈락토실세라마이드-알파, 겜시타빈, 9,10-디메틸-1,2-벤즈안트라센, BAPTA-AM, 메틸프레드니솔론, 인도메타신, CP-55940, 도세탁셀, 메만틴(memantine), 아부틴(arbutin), 목세스트롤(moxestrol), 2,2,2-트리클로로에탄올, 다누세팁(danusertib), 아나스토로졸, 페리포신(perifosine), 비스포스포네이트, 메페남산(mefenamic acid), 글루타티온 에틸 에스테르, 빈플루닌, 폴리이노신산(polyinosinic acid), 스파포식산(sparfosic acid), 레티노이드, 빈크리스틴, 페나세틴, 지질 A, 디메틸니트로사민, 게니스테인(genistein), 2-데옥시글루코스, 피오글리타존, O6-벤질구아닌, 베릴륨 설페이트, 벤조(아)피렌 7,8-디하이드로디올, 메틸암포테리신 B, 리오시구아트(riociguat), O-(클로로아세틸카르바모일)퓨마길롤, 데포스타틴(dephostatin), 아트라센탄(atrasentan), 티피파닙(tipifarnib), 봉크레크산(bongkrekic acid), 나타마이신(natamycin), 10-데카르바모일미토마이신 C, 페녹소디올, 포타슘 시아나이드, 3,4-메틸렌디옥시암페타민, (-)-갈로카테신 갈레이트, 1베타,25-디하이드록시비타민 D3, 17-알파-에티닐에스트라디올, 살리실산(salicylic acid), 3-데아자네플라노신(3-deazaneplanocin) 및 독시사이클린(doxycycline)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 시약, 화학적 독성제 또는 다른 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 성숙 조정제는 생물학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 사이클로스포린 A, 헤모시아닌, 에타네르셉트(etanercept), 엔테로톡신 B, 로미뎁신(romidepsin), 아달리무맙(adalimumab), 인터페론 베타-1b, 아토시반(atosiban) 및 데피브로타이드(defibrotide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 정점 염증 조정제는 키나제, 예컨대 비제한적인 예로, IRAK4, CHUK, IKBKG, IKBKB, MAP2K1, MARK2, MAP3K14, TBK1, IRAK3, TGFBR2, LYN, EIF2AK2, MAPK8, KIT, RIPK2, PRKCA, CDK9, SPHK1, PRKCD, EGFR, MAP3K7, TXK, MAP3K8, MAPKAPK2, MAPK10, IRAK2, IKBKE, RAF1, JAK2, ADRBK1, TEK, MAPK9, MET, MAPK14, ITK, BMPR2, FLT3, PRKD1, TYK2, PRKCQ, MERTK, MAPK1, AKT2, MAPKAPK5, JAK1 및 PIK3CG로 이루어진 군으로부터 선택되는 키나제이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 정점 염증 조정제는 막관통 수용체, 예컨대 비제한적인 예로, TLR4, IL28RA, IFNAR1, FAS, TLR7, CD14, TLR3, TNFRSF1A, TLR5, CD40, ICAM1, TLR9, SIGIRR, MSR1, IL10RA, FCGR2B, FCGR2A, IL27RA, TLR2, CD28, PLAUR, MARCO, UNC5B, THBD, IFNGR1, IL10RB, CD86, IL1R1, FCGR1A, IL1RL1, IL6R, TNFRSF18, RARRES2, TNFRSF1B, EPOR, TRA@, IL17RA, TRB@ (또한, TRB, T 세포 수용체 베타 유전자 좌로 알려져 있음) 및 CD300C로 이루어진 군으로부터 선택되는 막관통 수용체이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 정점 염증 조정제는 포유류 내인성 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 히알루론산, 베타-에스트라디올, 프로스타글란딘 E2, 요산, 뉴로프로텍틴 D1(neuroprotectin D1), 혈소판 활성화 인자, 스테아르산, 트레티노인, 팔미트산, 프로게스테론, D-스핑고신, 스퍼민, 하이드로겐 퍼옥사이드, 류코트리엔 D4, 하이드로코티손, 라우르산, 지방산, 11,12-에폭시에이코사트리엔산, 체노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 리놀렌산, ATP, 리토콜산(lithocholic acid), 지질, 아라키돈산, 알데하이드, 메틸 팔미테이트, L-시스틴, L-타르타르산, 아르기닌, 부티르산, D-글루코스, L-오르니틴, 1,4-글루칸, 타우롤리토콜산(taurolithocholic acid), 글로보트리아오실세라마이드, 세로트산(cerotic acid), D-에리트로-C16-세라마이드, 디메틸글리신, 22(R)-하이드록시콜레스테롤, L-트리요오도티로닌, 메발론산, 알코올, 베타-카로텐 및 D-갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유류 내인성 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 정점 염증 조정제는 비-포유류 내인성 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 살모넬라 미네소타 R595 리포다당류, E. coli B5 리포다당류, 자이모산, N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, E. coli 혈청형 0127B8 리포다당류, 리포테이코산(lipoteichoic acid), E. coli 리포다당류, 펩티도글리칸, 메제레인, 만난(mannan), 카라게에난, 유비퀴논 9, 브레펠딘 A(brefeldin A), 폴리아민, 만노실화된 리포아라비노만난, 이소쿼시트린(isoquercitrin), 사이클로말토덱스트린, 사이클로피아존산(cyclopiazonic acid), 2-머캅토아세테이트, 바필로마이신 A1, 헤모조인, 리포아라비노만난, MALP-2R, 실리붐 마리아눔 추출물(Silybum marianum extract), 다당류, 15-데옥시-델타-12,14 -PGJ 2, 포볼 12,13-디부티레이트, 시린긴(syringin), 이소부틸아민 및 글루쿠론옥실로만난으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-포유류 내인성 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 정점 염증 조정제는 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, SP600125, U0126, SB203580, LY294002, PD98059, PP1, 워트만닌, Bay 11-7082, Go 6976, PS-1145, JAK 저해제 I, merck C, 비스인돌릴말레이미드 I 및 타이포스틴 B56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 키나제 저해제이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 정점 염증 조정제는 또 다른 화학적 약물, 예컨대 리포다당류, 살모넬라 엔테리카 혈청형 아보르투스 에퀴 리포다당류, 트로바플록사신, 레시퀴모드(resiquimod), 덱사메타손, 사이클로헥시마이드, 트리니트로벤젠설폰산, MALP-2s, E. coli B4 리포다당류, 폴리 rI:rC-RNA, 캄토테신, Pam3-Cys, Pam3-Cys-Ser-Lys4, CpG ODN 1668, CpG 올리고뉴클레오타이드, 심바스타틴, 파클리탁셀, 게니스테인, 포볼 미리스테이트 아세테이트, N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르, 트리암시놀론 아세토나이드, 탑시가긴(thapsigargin), 피크릴 클로라이드, 1-알파, 25-디하이드록시 비타민 D3, 5-N-에틸카르복사미도 아데노신, 피롤리딘 디티오카르바메이트, 세룰레타이드(ceruletide), 마그네슘 설페이트, GW3965, 코티손 아세테이트, 라니티딘(ranitidine), 로플루밀라스트(roflumilast), 3-메틸아데닌, Ni2+, 덱스트란 설페이트, 글루코코티코이드, 에피갈로카테신-갈레이트, 오존, 겜피브로질(gemfibrozil), 트리시리빈(triciribine), 파모티딘(famotidine), 트라넥사민산(tranexamic acid), 그레파플록사신(grepafloxacin), 아세타미노펜, 다이드제인(daidzein), 베파판트(bepafant), IDN-6556, ZFA-fmk, BQ 123, 펜톡시필린(pentoxifylline), 아연, 클로로퀸, 알파-토코페롤, 트리암시놀론 헥사세토나이드, 에다라본(edaravone), 라베프라졸(rabeprazole), 오카다익산(okadaic acid), CP-55940, 이오노마이신, 카페인산 페네틸 에스테르, Z-DEVD-FMK, 폴리믹신 B(polymyxin B), 팔미토일-Cys((RS)-2,3-디(팔미토일옥시)-프로필)-Ala-Gly-OH, 시티딜릴-3'-5'-구아노신, BQ-788, 멜팔란, N-아세틸-L-시스테인, 스탈리마이신, 25-하이드록시콜레스테롤, 부클라데신, A23187, 수니티닙(sunitinib), 락타시스틴, 액티노마이신 D, 메틸프레드니솔론, 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), SR 144528, 비타민 E, 클라리트로마이신(clarithromycin), 살메테롤(salmeterol), 메바스타틴, 브로모데옥시유리딘, CpG ODN 1826, 모노포스포릴 지질 A, 2,4-디니트로플루오로벤젠, 보리노스탓(vorinostat), TO-901317, 에리트로마이신, 미소프로스톨(misoprostol), PD184352, 디에틸말레에이트, 암모늄 클로라이드, 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘, 블레오마이신, 알렌드론산(alendronic acid), 파테놀라이드(parthenolide), 토실페닐알라닐 클로로메틸 케톤, 니페디핀(nifedipine), 로시글리타존, 데시프라민, 일로마스탓(ilomastat), 니코틴, 13-cis-레티노산, 트리코스타틴 A, cis-유로칸산(cis-urocanic acid), 로수바스사틴(rosuvastatin), 미코페놀산(mycophenolic acid), 사이클로포스파미드, 8-브로모-cAMP, 에이코사펜텐산(eicosapentenoic acid), 에스트로겐, 올레오일-에스트론, 8-사이클로펜틸-1,3-디프로필크산틴, 카테올롤(carteolol), N-포르밀-Nle-Leu-Phe, NSC 270012, 달세트라핍(dalcetrapib), MK2206, GSK2118436, 덱사메타손/토브라마이신, 데옥시스퍼구알린(deoxyspergualin), RP 48740, 포스포마이신(fosfomycin), NSC 95397, 바시트라신(bacitracin), 티로피반(tirofiban), 덱사나비놀(dexanabinol), 롤리프람(rolipram), 커큐민, 디클로페낙(diclofenac), N-포르밀-Met-Leu-Phe, 반응성 산소종, 오메가-N-메틸아르기닌, 타크롤리무스, 피리니식산(pirinixic acid), 발프로산(valproic acid), 티오아세타미드, 시스플라틴, 프로필티오우라실, 5-아자시티딘, 갈락토실세라마이드-알파, 디포스포릴 지질 A, 겐타마이신 C1, CpG ODN M362, PF-251802, PF-4308515, GTS 21, 화합물 48/80, 베스나리논(vesnarinone), 글리옥살, 2,4-디니트로티오시아나토벤젠, 에날라프릴랏(enalaprilat), 트레할로스 디미콜레이트(dimycolate), bis-pom-pmea, BAPTA-AM, 레스베라트롤, S-니트로소글루타티온, 로바스타틴 및 클로로프로마진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 시약, 독성제 또는 다른 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 정점 염증 조정제는 생물학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 사이클로스포린 A, 엔테로톡신 B, 리시노프릴(lisinopril), 압식시맙(abciximab) 및 엡티피바타이드(eptifibatide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 유도성 염증 조정제는 키나제, 예컨대 비제한적인 예로, CHUK, IKBKB, TBK1, MAP2K1, MAPK1, LYN, IKBKG, MAP3K8, IKBKE, MAP3K7, NEK7, AKT1, GSK3B, MAPKAPK2, INSR, LRRK2, PRKCB, JAK2, CARD11, MET, MAPK9, IRAK4, MAPK14, EGFR, MAP3K14, RET, MAP2K4, PIK3R1, RIPK2, PRKCE, MAPK8, MAP2K6, ERBB2, CSF1R, PLK4, PLK2, PRKCD, SPHK1, MAPK11, EIF2AK3, PIK3CA, MERTK, SYK, KDR, MARK2, JAK1 및 RAF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 키나제이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 유도성 염증 조정제는 막관통 수용체, 예컨대 비제한적인 예로, TLR4, TLR3, IFNAR1, TLR9, CD40, IL28RA, TNFRSF1A, TLR2, CD14, MRC1, CD244, NCR1, KLRC4-KLRK1/KLRK1, FAS, FCER1G, IL1R1, LEPR, PGRMC1, MSR1, TNFRSF18, Klra4 (includes others), ITGB3, IL4R, FCGR2A, TNFRSF1B, TREM2, NCR3, TLR5, TLR7, ICAM1, TLR8, IGF1R, FCER2, IL6R, AGER, CD28, IL11RA, ITGB1, SIGLEC7, TYROBP 및 GFRA1로 이루어진 군으로부터 선택되는 막관통 수용체이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 유도성 염증 조정제는 포유류 내인성 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, ATP, 프로스타글란딘 E2, 프로게스테론, 히알루론산, 베타-에스트라디올, 슈퍼옥사이드, 라우르산, 요산, 팔미트산, 하이드로겐 퍼옥사이드, 트레티노인, 히스타민, 벤질아민, 폴리(ADP-리보스), 에탄올, 올레산, 글루타티온, 일산화탄소, 콜레스테롤, 스핑고신-1-포스페이트, 아르기닌, N-아세틸글루코사민, 테스토스테론, 포스파티드산, 니아신아미드, UDP, 니트릭 옥사이드, 강글리오사이드 GD1a, 감마-리놀렌산, 8-옥소-7-하이드로데옥시구아노신, 멜라토닌, 알코올, D-갈락토사민, 강글리오사이드, 철, 류코트리엔 D4, 류코트리엔 C4, 5'-메틸티오아데노신, 글리코체노데옥시콜레이트, 리놀레산, 뉴로프로텍틴 D1, 하이드로코티손, 소듐 클로라이드, 헤파린, 프로스타글란딘 E1, 4-페닐부티르산, 사이클릭 AMP, 지방산, 체노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid), UTP, 콜레칼시페롤, 리폭신 A4, 트롬복산 A2, 아실-조효소 A, 게라닐게라닐 파이로포스페이트, 아라키돈산, 포름알데하이드, 타우린, 프로스타글란딘 D2, L-글루탐산, 아난다미드, 2-메톡시에스트라디올, 어드밴스드 글리카티온 최종-생성물, D-글루코스, 세피압테린(sepiapterin), 바닐릭산(vanillic acid), D-에리트로-C16-세라마이드, 시트룰린, 메발론산 및 베타-카로텐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유류 내인성 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 유도성 염증 조정제는 비-포유류 내인성 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 펩티도글리칸, 살모넬라 미네소타 R595 리포다당류, E. coli 혈청형 0127B8 리포다당류, E. coli 리포다당류, 자이모산, 인지질, 바필로마이신 A1, 루테올린(luteolin), E. coli B5 리포다당류, 카라게에난, 우르솔릭산(ursolic acid), 아피게닌, 2-사이클로헥센-1-온, 리포테이코산(lipoteichoic acid), 겔다나마이신(geldanamycin), 망간, N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, 이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin), 사이클로말토덱스트린, 벤질 이소티오시아네이트, 피케아탄놀(piceatannol), 나린게닌(naringenin), 헤모조인, 프로스타글란딘 A1, 호노키올(honokiol), 프레그나-4,17-디엔-3,16-디온, 리포아라비노만난, D-시스테인, 8-프레닐캠페롤(8-prenylkaempferol), 시나핀산(sinapinic acid), (S)-노코클라유린((S)-norcoclaurine), 퓨마길린(fumagillin), 15-데옥시-델타-12,14 -PGJ 2, 담즙산, 프로스타글란딘 J2, 이소류신 및 진세노사이드 Rg1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-포유류 내인성 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 유도성 염증 조정제는 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, Bay 11-7082, PD98059, U0126, SB203580, LY294002, JAK 저해제 I, 1L-6-하이드록시메틸-카이로-이노시톨 2-(R)-2-O-메틸-3-O-옥타데실카르보네이트, 타이포스틴 AG 1296, 워트만닌(wortmannin), Ro31-8220, SC68376, PS-1145, SP600125, PP2/AG1879 티로신 키나제 저해제, AG490, PP1, 비스인돌릴말레이미드 I, 타이포스틴 AG 127, 허비마이신(herbimycin), Go 6976, Sb202190, H89, 칼포스틴 C(calphostin C), Rp-cAMPS, Tpl2 키나제 저해제, CGP77675, Ro 31-7549, 타이포스틴 AG 1288, 8-브로모구아노신 3',5'-사이클릭 모노포스페이트, SB 220025, AR-12, 에브스타틴(erbstatin), KT 5926, 타이포스틴 47 및 스타우로스포린(staurosporine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 키나제 저해제이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 유도성 염증 조정제는 또 다른 화학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 리포다당류, 폴리 rI:rC-RNA, 레시퀴모드(resiquimod), CpG 올리고뉴클레오타이드, E. coli B4 리포다당류, 지질 A, CpG ODN 1826, Pam3-Cys-Ser-Lys4, 덱사메타손, CEP-1347, 포볼 미리스테이트 아세테이트, 로시글리타존, 살모넬라 엔테리카 혈청형 아보르투스 에퀴 리포다당류, 시글리타존(ciglitazone), MALP-2s, 트리니트로벤젠설폰산, CpG ODN 1668, CGS 21680, 메틸 2-시아노-3,12-디옥솔레안-1,9-디엔-28-오에이트, 사이클로헥시마이드, 피롤리딘 디티오카르바메이트, 로나파닙(lonafarnib), 페로스 설페이트, 리소포스파티딜콜린, Pam3-Cys, 피콜린산(picolinic acid), 타크롤리무스, 아스피린, 덱스트란 설페이트, 카본 테트라클로라이드, 레스베라트롤(resveratrol), 2-아미노퓨린, 커큐민, 블레오마이신, 3-메틸아데닌, GW3965, 캄토테신, 메토트렉세이트, 보르테조밉(bortezomib), 셀레콕십(celecoxib), 트리부티린(tributyrin), 담배 연기, 아라키도닐트리플루오로메탄, 심바스타틴, 티오아세타미드, 에피갈로카테신-갈레이트, 리포올리고당류, 암포테리신 B, 트리암시놀론 아세토나이드, 피오글리타존, 나이스타틴, 3M-002, 퍼옥시니트라이트, S-(2,3-비스팔미토일옥시프로필)-시스테인-GDPKHPKSF, 어유(fish oil), 인도메타신, 살리실산, 아르세나이트(arsenite), 피리니식산(pirinixic acid), 퀘세틴(quercetin), 파테놀라이드(parthenolide), 펜레티나이드(fenretinide), 파클리탁셀, A23187, 테모졸로마이드, 테트라클로로디벤조디옥신, 아토바스타틴(atorvastatin), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid), N-아세틸-L-시스테인, 란소프라졸(lansoprazole), 루틴(rutin), 리모나반트(rimonabant), 셀레늄, 이소프로테레놀, 액티노마이신 D, ATP-감마-S, 빈블라스틴, 부클라데신, 신남알데하이드, 템폴(tempol), 탈리도마이드, 토포테칸, 디에틸스틸베스트롤, 플루바스타틴(fluvastatin), 13-cis-레티노산, 프로테아좀 저해제 PSI, 페릭 니트릴로트리아세테이트, N-Ac-Leu-Leu-노르루시날(norleucinal), 에토포사이드, 미코페놀산(mycophenolic acid), 클로로퀸, 탄닌산, 라베프라졸(rabeprazole), 3M-011, 포스콜린, 오카다익산(okadaic acid), 독소루비신, SB 216763, 2',3'-디알데하이드 ATP, NCX-4040, 캅사제핀(capsazepine), 5-아미노살리실산, 헥사메톡시플라본, 토실라이신 클로로메틸 케톤, 코티코스테로이드, 3M-001, 사이토칼라신 D, 시스플라틴, 크립토탄쉬논(cryptotanshinone), 메틸렌 시안, L-N6-(1-이미노에틸)-라이신, 니트로프루싸이드(nitroprusside), N-아세틸스핑고신, 미페프리스톤(mifepristone), 5-아자시티딘, 텔미사탄(telmisartan), 엡셀렌(ebselen), 프로스타글란딘, 캡사이신, 독시사이클린, SR 144528, 피페린, 프라바스타틴(pravastatin), 카르보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존, 에틸 피루베이트, 클렌부테롤(clenbuterol), 아우라노핀(auranofin), 타목시펜, 미노사이클린(minocycline), TGAL 코폴리머, 칸나비디올(cannabidiol), Sn50 펩타이드, 벤조(아)피렌, 실리비닌(silibinin), 1'-아세톡시샤비콜 아세테이트, 니메술라이드(nimesulide), 로페콕십(rofecoxib), 이소부틸메틸크산틴, 디에틸말레에이트, 트라닐라스트(tranilast), 디피리다몰(dipyridamole), 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘, 풀베스트란트(fulvestrant), 이미퀴모드(imiquimod), 17-알파-에티닐에스트라디올, 트리플루살(triflusal), 토실페닐알라닐 클로로메틸 케톤, 캅토프릴(captopril), 플루티카손(fluticasone), 피세틴(fisetin), 니코틴, 벤질옥시카르보닐-Leu-Leu-Leu 알데하이드, cis-유로칸산(urocanic acid), 푸코이딘, N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르, 게니스테인, 아족시메탄, 에피카테신 갈레이트, 이오노마이신, 트로글리타존, NS-398, 세리바스타틴(cerivastatin), 알로퓨리놀(allopurinol), 8-클로로아데노신, AZD8055, 클로르페니라민, 디에틸티오카르바메이트, LY311727, BN 50730, 1-(1-글리세로)도데카-1,3,5,7,9-펜타엔, 비스퍼옥소(피콜리나토)옥소바나데이트, 에틸 바닐린, 벤즈니다졸(benznidazole), CE-2072, 메타프로테레놀 설페이트, n-6 도코사펜타엔산, AGN194204, 콜린 페노피브레이트, 에이코사펜텐산(eicosapentenoic acid), 로사탄 포타슘, 반코마이신, 브리오스타틴 1, 우레탄, 에스트로겐, 메틸프레드니솔론, U73122, 메트포르민(metformin), 베자피브레이트(bezafibrate), 디클로페낙(diclofenac), 크로시돌라이트 아스베스토스(crocidolite asbestos), 아세토바닐론(acetovanillone), N-포르밀-Met-Leu-Phe, 반응성 산소종, SU6656, 2-시아노-3,12-디옥솔레안-1,9-디엔-28-오익산, 세막시닙(semaxinib), 스트렙토조신, 녹차 폴리페놀, S-니트로소-N-아세틸페니실라민, 5-N-에틸카르복사미도 아데노신, 락타시스틴, N-(3-(아미노메틸)벤질)아세타미딘, 펜톡시필린(pentoxifylline), 타네스피마이신(tanespimycin), 메드록시프로게스테론 아세테이트, 설포라판(sulforafan), 프로프라놀롤, 알파-토코페롤, 아부틴(arbutin), trans-신남알데하이드, 헤스페리딘(hesperidin), 시타글립틴(sitagliptin), 데스-Arg(10)-칼리딘, 라이신 클로닉시네이트(lysine clonixinate), 바필로마이신 A, 대두 이소플라본, 하이드록실 라디칼, 마리마스탓(marimastat), 질레우톤(zileuton), 부메타나이드(bumetanide), 옥사제팜, 메타스탓(metastat), 펠로디핀(felodipine), 감마 토코페롤, 피릴아민(pyrilamine), 미크로시스틴(microcystin), 에폭시에이코사트리엔산, 레미펜타닐(remifentanil), 라미나란(laminaran), 플루니솔라이드(flunisolide), 이부프로펜, 9,10-디메틸-1,2-벤즈안트라센, 모르핀, 피마게딘(pimagedine), zVAD-FMK 및 S-니트로소글루타티온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 시약, 화학적 독성제 또는 다른 화학적 약물이다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 유도성 염증 조정제는 생물학적 약물, 예컨대 비제한적인 예로, 사이클로스포린 A, 인플릭시맙(infliximab), 인터페론 베타-1a, NF-카파B 데코이, 엔테로톡신 B, 폰톨리주맙, 아나킨라(anakinra), 헤모시아닌, 포도씨 추출물 및 에타네르셉트로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 약물이다.

조정제의 용도

본 발명에 따른 치료 물질의 투여는, 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 이송, 전달, 관용 등을 제공하기 위해 제형 내로 혼입되는 다른 제제와 함께 투여될 것으로 이해될 것이다. 복수 개의 적절한 제형들은 모든 약사에게 알려져 있는 처방서에서 확인될 수 있다: 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), 특히 Blaug, Seymour에 의한 챕터 87]. 이들 제형으로는, 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질들, 소포를 포함하는 지질(양이온성 또는 음이온성)(예컨대, Lipofectin™), DNA 컨쥬게이트, 무수 흡수 페이스트, 수-중-유 에멀젼 및 유-중-수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 젤, 및 카보왁스를 포함하는 반-고체 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물들 중 임의의 혼합물은, 제형 내의 활성 성분이 제형에 의해 불활성화되지 않으며, 제형이 투여 경로와 생리학적으로 융화성이며 관용성인 한, 본 발명에 따른 치료 및 치료법에 적절할 수 있다. 약사에게 잘 알려져 있는 제형, 부형제 및 담체와 관련된 부가적인 정보에 대해서는, 문헌[Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)], 및 이들에서의 인용을 참조한다.

조정제를 포함하는 본 발명의 치료 제형은, 면역-관련 장애, 비정상적인 면역 반응 및/또는 예를 들어 암과 같은 신생물 형성 질환(neoplastic condition)과 연관된 증상을 치료하거나 완화하는 데 사용된다. 본 발명은 또한, 면역-관련 장애 또는 비정상적인 면역 반응과 연관된 증상을 치료하거나 완화하는 방법을 제공한다. 치료 계획은, 면역-관련 장애 또는 비정상적인 면역 반응을 앓고 있는(또는 발병의 위험이 있는) 개체, 예를 들어, 인간 환자를, 표준 방법을 이용하여 확인함으로써 수행된다. 예를 들어, 조정제는 자가면역 질환 및/또는 염증성 장애의 치료에서 유용한 치료 도구이다. 소정의 구현예에서, 조정제의 사용은 예를 들어, 소정의 병원체 및 다른 감염성 질환에 대한 것으로 고려된다. 조정제는 또한, 예를 들어, 이식 거부반응을 예방하거나, 지연시키거나 그렇지 않다면 경감시키고/시키거나, 이식의 생존율을 연장하기 위해, 다양한 이식 적응증에서 유용한 치료 도구이다. 조정제는 또한, 비정상적인 수지상 세포 반응을 나타내는 유전적 결함을 가진 환자에서 유용하다.

조정제는 또한, 자가면역 장애, 염증성 질환, 암을 비롯한 증식 장애 등에 대한 백신에서 및/또는 백신 보조제로서 유용하다. 이들 유형의 장애의 치료를 위한 보조제들의 조합은, 자가면역성에 관여하는 표적화된 자가-항원, 즉, 자기항원으로부터 매우 다양한 항원들, 예를 들어, 수초 염기성 단백질; 염증성 자가-항원, 예를 들어, 아밀로이드 펩타이드 단백질, 또는 이식 항원, 예를 들어, 동종항원과 조합하여 사용하기에 적합하다. 항원은 단백질 유래의 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 하기들 중 임의의 단편을 포함할 수 있다: 당류, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 자기항원, 아밀로이드 펩타이드 단백질, 이식 항원, 알레르겐 또는 다른 거대분자 성분. 일부 경우에서, 하나 초과의 항원이 항원 조성물에 포함된다.

자가면역 질환으로는, 예를 들어, 후천성면역결핍증후군(AIDS, 자가면역 성분을 포함하는 바이러스 질환), 원형 탈모, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역성 애디슨질환, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이질환(AIED), 자가면역성 림프증식증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성자반(ATP), 베체트질환, 심근증, 복강스프루우-포진성피부염(celiac sprue-dermatitis hepetiformis); 만성피로 면역기능이상 증후군(chronic fatigue immune dysfunction syndrome; CFIDS), 만성염증성탈수초성 다발성신경병증(CIPD), 반흔성유천포창(cicatricial pemphigold), 한랭응집소질환, 크레스트증후군(crest syndrome), 크론질환, 데고질환(Degos' disease), 소아기-피부근염, 원판상루푸스(discoid lupus), 본태성 혼합성 한랭글로불린혈증(essential mixed cryoglobulinemia), 섬유근통-섬유근염, 그레이브스질환, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반증(ITP), IgA 신증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸 질환), 소아 류마티스 관절염, 메니에르질환, 혼합결합조직질환, 다발성 경화증, 중증근무력증, 악성빈혈, 결절성다발성동맥염, 다발연골염, 다선증후군(polyglandular syndrome), 류마티스다발근통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경병증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 경피증(전신성 경화증(SS)이라고도 알려져 있는 진행성 전신성 경화증(progressive systemic sclerosis; PSS)), 쇼그렌 증후군, 강직-인간 증후군(stiff-man syndrome), 전신성 홍반성 낭창, 타카야수 동맥염(Takayasu arteritis), 일시적인 동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함한다.

일부 구현예에서, 조정제는 개체에서, 염증성 성분을 가진 자가면역 질환, 예컨대 비정상적인 염증 반응의 증상을 치료하거나, 이의 진행을 지연시키거나, 그렇지 않다면 완화하는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 조정제는 비정상적인 수지상 세포 반응과 연관되어 것으로 알려져 있는 자가면역 질환을 치료하는 데 유용하다.

염증성 장애는 예를 들어, 만성 및 급성 염증성 장애를 포함한다. 염증성 장애의 예로는, 알츠하이머질환, 천식, 아토피성 알러지, 알러지, 아테롬성 동맥경화증, 기관지천식, 습진, 사구체신염, 숙주편대이식질환, 용혈성 빈혈, 골관절염, 패혈증, 뇌졸중, 조직 및 장기의 이식, 맥관염, 당뇨병성 망막증 및 기계환기기 유도성 폐손상(ventilator induced lung injury)을 포함한다.

이들 면역-관련 장애와 연관되어 있는 증상으로는, 예를 들어, 염증, 열, 부정 수소(general malaise), 열, 통증(종종 염증이 생긴 영역에 국한되어 있음), 빠른 맥박, 관절 통증 또는 아픔(관절통), 빠른 호흡 또는 다른 비정상적인 호흡 패턴, 오한, 혼미, 방향 감각 상실, 불안, 현기증, 기침, 호흡 곤란, 폐 감염, 신부전, 호흡 부전, 부종, 체중 증가, 점액농성 재발(mucopurulent relapse), 악액질(cachexia), 천명(wheezing), 두통 및 복부 증상, 예컨대 복통, 설사 또는 변비를 포함한다.

치료의 효능은, 특정한 면역-관련 장애의 진단 또는 치료를 위한 임의의 공지된 방법과 관련하여 결정된다. 면역-관련 장애의 하나 이상의 증상의 완화는, 조정제가 임상적 이점을 부여한다는 것을 가리킨다.

조정제를 면역-관련 장애 또는 비정상적인 면역 반응을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것은, 다양한 실험적 또는 임상적 목적들 중 임의의 목적이 달성되는 경우, 성공적인 것으로 간주된다. 예를 들어, 조정제의 환자에의 투여는, 면역-관련 장애 또는 비정상적인 면역 반응과 연관된 증상들 중 하나 이상이 완화되거나, 감소되거나, 저해되거나 더 나아간, 즉 악화된 상태로 진행되지 않는 경우, 성공적인 것으로 간주된다. 조정제의 환자에의 투여는, 면역-관련 장애 또는 비정상적인 면역 반응이 차도가 있거나 더 나아간, 즉 악화된 상태로 진행되지 않는 경우, 성공적인 것으로 간주된다.

조정제의 치료적 유효량은 일반적으로, 치료 목적을 달성하는 데 필요한 양에 관한 것이다. 더욱이, 투여에 필요한 양은 특이적인 표적에 대한 조정제의 특이성에 따라 다를 것이며, 또한, 투여되는 조정제가 이것이 투여되는 자유 부피의(free volume) 다른 개체로부터 소진되는 속도에 따라 다를 것이다.

조정제는 약제학적 조성물의 형태로 다양한 질환 및 장애의 치료를 위해 투여될 수 있다. 이러한 조성물의 제조에 관련된 원리 및 고려사항들, 뿐만 아니라 성분 선택에 관한 지침은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends,Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa.,1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York]에 제공된다.

폴리펩타이드-기재의 조정제가 사용되는 경우, 표적에 특이적으로 결합하며 치료 기능을 보유하는 가장 작은 단편이 바람직하다. 이러한 단편은 화학적으로 합성될 수 있고/있거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)] 참조). 제형은 또한, 치료될 특정 적응증에 필요한 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 가진 화합물을 하나 초과로 포함할 수 있다. 다른 예로, 또는 이에 더하여, 조성물은 예를 들어, 세포독성제, 사이토카인, 화학치료제 또는 성장-저해제와 같이 이의 기능을 증강시키는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는, 의도되는 목적에 효과적인 양으로 조합해서 존재한다.

본원에서 인용되는 모든 공개문헌 및 특허 문서는, 각각의 이러한 공개문헌 또는 문서가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 나타나 있는 것과 같이, 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 공개문헌 및 특허 문서의 인용은, 이를 관련 있는 선행 기술로 허용하려는 것이 아니며, 동일물의 내용 또는 날짜에 관한 임의의 허용을 구성하지도 않는다. 본 발명은 현재 작성된 명세서에 의해 기술되어 있으며, 당업자는, 본 발명이 다양한 구현예들에서 시행될 수 있으며, 상기 상세한 설명 및 하기의 실시예는 예시를 목적으로 하는 것이며, 하기의 청구항을 제한하는 것이 아니다.

실시예

수행된 실험 및 달성된 결과를 포함하는 하기의 실시예는 단지 예시를 위해 제공되며, 본 발명에 대해 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1: 물질 및 방법

세포 배양, 소팅 및 용해: 6주령 내지 8주령의 암컷 B6 마우스의 골수 유래의 수지상 세포(BMDC)의 배양물을 이전에 기술된 바와 같이 제조하였다(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009); Chevrier, N. et al. Systematic Discovery of TLR Signaling Components Delineates Viral-Sensing Circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011)]). 시험관 내에서 배양한 지 9일째에, 세포를 이전에 기술된 바와 같이(Ibid) 리포다당류(LPS, Invivogen)로 4시간 동안 자극하고, 세포를 얼음 상에서 15 mL 코니칼 튜브로 옮긴 다음, 5 μM 칼세인 AM 및 5 μM 에티듐 호모다이머(EthD-1, Invitrogen)를 첨가한 후, 단일 칼세인-양성 세포 및 EthD-1-음성 세포를, 각각이 1% 2-머캅토에탄올(Qiagen, Valencia, CA)이 보충된 5 ㎕ TCL 완충제를 포함하고 있는 96-웰 플레이트의 개별 웰로 소팅하였다. 원심분리 후, 플레이트를 -80℃에서 즉시 동결하였다. 인큐베이터로부터의 제거와 용해 사이에 경과한 총 시간은 15분 미만이었다. cDNA 합성 직전에, 세포를 얼음 상에서 해동한 후, 이들을 최종 용출 없이 2.2x RNAClean SPRI 비드(Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA)를 사용하여 정제하였다. RNA가 포착된 비드를 공기-건조한 다음, cDNA 합성을 위해 즉시 처리하였다. 세포를 포함하지 않는 웰을 또한, 음성 대조군으로서 제조하고, 10,000개 세포의 앙상블로부터 총 RNA를 집단 검체로서 추출하였다(하기 참조).

cDNA 합성 및 증폭: SMARTer Ultra Low RNA 키트(Clontech, Mountain View, CA)를 사용하여, 증폭된 cDNA를 제조하였다. 12 μM 3' SMART 프라이머(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT₍₃₀₎N-1N (N은 A, C, G 또는 T임; N-1은 A, G 또는 C임), SEQ ID NO: 273) 1 ㎕, H₂O 1 ㎕ 및 반응 완충제 2.5 ㎕를 RNA-포착된 비드 상에 첨가하였다. 비드를 피펫팅에 의해 잘 혼합하였다. 혼합물을 72℃에서 3분 동안 가열한 다음, 얼음 상에 두었다. 제1가닥 cDNA를, 5x 제1가닥 완충제 2 ㎕, 100 mM DTT 0.25 ㎕, 10 mM dNTP 1 ㎕, 12 μM SMARTer II A 올리고(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX(X는 전매 특허의(proprietary) SMARTer 올리고 서열에서 미공개된 염기임), SEQ ID NO: 274) 1 ㎕, 100 U SMARTScribe RT 및 10 U RNase 저해제를 총 부피 10 ㎕로 하여 첨가하고, 42℃에서 90분 동안, 이후 70℃에서 10분 동안 인큐베이션함으로써, 이 RNA 프라이머를 사용하여 합성하였다. 제1가닥 cDNA를, 실온의 AMPure XP SPRI 비드(Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA) 25 ㎕를 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합한 다음, 실온에서 8분 동안 인큐베이션함으로써, 정제하였다. 양호한 분리가 구축된 후, 상층액을 비드로부터 제거하였다. 상기 단계들 모두를, PCR 생성물을 포함하지 않는 깨끗한 룸에서 수행하였다. cDNA를, 10x Advantage 2 PCR 완충제 5　㎕, 10 mM dNTP 2 ㎕, 12 μM IS PCR 프라이머(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT, SEQ ID NO: 275) 2 ㎕, 50x Advantage 2 폴리머라제 믹스 2 ㎕ 및 H₂O 39 ㎕를 총 부피 50 ㎕로 첨가함으로써, 증폭시켰다. 이후 PCR을, 95℃에서 1분 동안, 95℃에서 15초, 65℃에서 30초 및 68℃에서 6분으로 구성된 사이클 21회, 이후 최종적인 신장을 위해 72℃에서 추가 10분 동안 수행하였다. AMPure XP SPRI 비드 90 ㎕를 첨가하고, 80% 에탄올로 세정함으로써, 증폭된 cDNA를 정제하였다. 분자 계수(문헌[Kivioja, T. et al. Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nature Methods 9, 72-74, doi:10.1038/nmeth.1778 (2011)] 참조)(도 9 및 도 10)를 위해, SMARTer II A 올리고를, 4개의 랜덤 염기를 포함하는 통상적인 RNA 올리고뉴클레오타이드(Barcoded SMARTer II A 올리고: 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTNNNNrGrGrG-3', SEQ ID NO: 276)로 대체하였다.

cDNA 전단(shearing) 및 라이브러리 구축: 정제 완충제(Clontech)를 증폭된 cDNA에 첨가하여, 총 부피를 76 ㎕로 되게 하였다. cDNA를, 빈도 스위핑 모드(frequency sweeping mode)(Covaris S2 machine, Woburn, MA)에서 5분 동안 10% 듀티 사이클(Duty Cycle), 5% 강도 및 200 사이클/버스트(Cycles/Burst)로 하여 100 ㎕ 튜브에서 전단하였다. 전단된 cDNA를 2.2부피의 AMPure XP SPRI 비드를 사용하여 정제하였다.

Illumina 서열화(Illumina sequencing)를 위해 인덱스드 페어드-엔드 라이브러리(Indexed paired-end library)를 하기의 변형을 수반하면서 기술된 바와 같이 제조하였다(문헌[Levin, J. Z. et al. Comprehensive comparative analysis of strand-specific RNA sequencing methods. Nature Methods 7, 709-715 (2010)] 참조). 첫째로, 상이한 인덱싱 어댑터(8-염기 바코드를 포함함)를 각각의 라이브러리에 사용하였다. 둘째로, 연결 생성물(ligation product)을 0.7부피의 AMPure XP SPRI 비드 클린업을 2차례 사용함으로써 크기별로 선별하였으며, 첫번째 차례 시 출발 부피는 100 ㎕였다. 셋째로, GC 완충제 및 2 M 베타인과 함께 Phusion High-Fidelity DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR을 수행하였다. 넷째로, 유니버셜 인덱싱 프라이머(정방향 프라이머 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC (SEQ ID NO: 277), 역방향 프라이머 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (SEQ ID NO: 278))를 사용하는 PCR에서 어닐링 온도로서 55℃를 사용하였다. 다섯째로, PCR을 12 사이클로 수행하였다. 여섯째로, 1.0부피의 AMPure 비드를 2차례 사용하여 PCR 프라이머를 제거하였다.

집단 대조군 및 음성 대조군: 양성(집단) 대조군의 경우, PrepEase RNA Spin 키트(Affymetrix, Santa Clara, CA)를 사용하여 10,000개 세포로부터, BioAnalyzer(Agilent, Santa Clara, CA)에 의해 측정되는 바와 같이, 총 RNA 13.8 ng을 단리하였다. 총 RNA 1 ng을, cDNA 증폭 단계에서 12사이클만 사용하는 점을 제외하고는, 상기 과정들에서 사용하였다. 음성 대조군의 경우, 상기 과정들 모두를, TCL-완충제-함유 웰에서 제로 소팅된 세포로 출발하여 수행하였다. Illumina 라이브러리 구축의 최종 PCR에서 18 사이클을 사용하였다.

판독 트리밍 (Read trimming) 및 맵핑 (mapping): 역방향 전사 동안, SMART 폴리머라제는, 전사의 5' 말단 및 3' 말단으로부터 기원하는 단편들에 대한 제2 판독 시작에, 각각 짧은 어댑터(SMARTer II A 올리고) 및 긴 어댑터(SMART 프라이머 올리고)를 첨가한다. 맵핑 판독 전에, 명령줄 독립변수(command line argument) -l 1 -e 100 -v 1 -b 28 -a -100로 하여 Btrim64를 사용하여 이들 어댑터 서열을 제거하였다. 어댑터 서열을 제2 판독의 대략 1/3로부터 트리밍하였다. 트리밍된 판독을, 디폴트 매개변수와 함께 Tophat v1.4.1(문헌[Trapnell, C., Pachter, L. & Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics 25, 1105-1111, doi:10.1093/bioinformatics/btp120 (2009)])을 사용하여 마우스 게놈의 mm9 버전으로 맵핑하였다. 게놈 맵핑을 이용하여, 통합적 게놈 뷰어(Integrative Genome Viewer)(문헌[Robinson, J. T. et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology 29, 24-26, doi:10.1038/nbt.1754 (2011)])에서 데이터를 시각화하고, 하기 기술되는 바와 같이 라이브러리 품질 메트릭 세트를 산출하였다.

짧은 어댑터(5' 말단)가 트리밍된 판독은, 트리밍되지 않은 판독과 대략 동일한 비율로 맵핑되었다. 그러나, 긴 어댑터(3' 말단)이 트리밍된 판독 쌍은 종종, 트리밍 후에도 polyA 신장부(stretch)를 포함하였으며, 매우 낮은 비율(1% 미만)로 맵핑되었다. 이들 판독은 전사의 3' 말단으로부터 기원해야 하기 때문에, 이러한 낮은 맵핑 백분율은 전사의 3' 말단으로부터 판독을 소모(depletion)시킨다. 이러한 소모는 SMART 프로토콜의 부산물인 3' 포함 편향을 취소할 수 있다(하기 참조)(문헌[Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012)]).

독특한 mRNA 분자의 정량화: 4-뉴클레오타이드 랜덤 바코드 서열을 포함하도록 SMARTer 올리고를 변형한 3개의 단일-세포 라이브러리를 처리하는 경우, 상기 기술된 바와 같이 SMARTer II A 올리고를 포함하는 판독을 단리하고 트리밍하였다. 그런 다음, 4개의 부가적인 염기(바코드에 상응함)를 트리밍하고, 이후의 처리를 위해 유지시켰다. 트리밍된 판독을 상기 기술된 바와 같이 마우스 mm9 게놈에 맵핑하였다. 그런 다음, 각각의 유전자에 대해, 올바른 가닥 상의 엑손 서열로 맵핑된 이들 판독의 서브셋을 확인하고, 이들의 오리저널 4-뉴클레오타이드 바코드를 회수(retrieve)하였다. 각각의 유전자에 대한 바코드의 독특한 수를 계수하고, 단일-세포 유전자 발현의 대안적인 정량화로서 사용하였다. 독특한 분자 바코드 계수 및 TPM 추정값 둘 모두를 3가지 세포들 모두에 제공하였다.

라이브러리 품질 메트릭(quality metrics): 게놈 맵핑 비율, 각각의 전사의 커버지리 변동 계수, 각각의 라이브러리에서 리보좀 RNA의 분획 및 위치상 포함 편향을 비롯한 라이브러리 품질 메트릭을 PicardTools 버전 1.42(picard.sourceforge.net)를 이용하여 게산하였다. 이 데이터에서 3' 편향은 이전의 보고와 비교해 덜 관찰되었으며(문헌[Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012)]), 이는 짐작하건대 상기 주지된 라이브러리 구축의 차이로 인한 것이었다(도 22).

발현 수준 계산: 보우타이 인덱스(Bowtie index)(문헌[Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, S. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology 10, doi:10.1186/gb-2009-10-3-r25 (2009)])를 UCSC 공지유전자(knownGene) 전사체 (문헌[Fujita, P. A. et al. The UCSC Genome Browser database: update 2011. Nucleic Acids Research, doi:10.1093/nar/gkq963 (2010)])를 토대로 제작하였으며, 페어드-엔드 판독(paired-end read)을, 명령줄 옵션 -q --phred33-quals -n 2 -e 99999999 -l 25 -I 1 -X 1000 -a -m 200로 하여 Bowtie v 0.12.7을 이용하여 이 인덱스에 직접 정렬하였다. 다음, RSEM v1.11(문헌[Li, B. & Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics 12, doi:10.1186/1471-2105-12-323 (2011)])을 이들 정렬 상에서 디폴트 매개변수와 함께 진행하여, 발현 수준을 추정하였다. RSEM의 유전자 수준 발현 추정값(tau)을 1,000,000으로 곱하여, 각각의 유전자에 대한 전사체/10⁶(transcript per million; TPM) 추정값을 수득하였다. 발현 수준을 log 공간(log-space)으로 변형하기 위해, ln(TPM+1)을 취하였다. "평균" 단일-세포 발현 수준을 계산할 때, 18개 단일 세포 각각의 TPM 수준의 평균을 먼저 내었으며, 그런 다음, 이 평균 추정값을 log 공간으로 변형하였다.

동일한 절차들을 BMDC를 LPS로 자극한 후, RNA-Seq 시간 경과로 구성된, 이전에 공개된 데이터세트에 적용하였다(문헌[Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012)]). 이 데이터세트를 사용하여, 자극전과 비교해 LPS로 자극한 후 4시간째에 집단에서 적어도 2배 유도된 632개 유전자의 세트를 확인하였다. 이들 유전자를 도 2a, 도 2d 및 도 4b에서 분석하였다.

RNA 형광 인 시추 혼성화 (FISH): RNA-FISH 프로브(Panomics)를 사용하여 25개의 상이한 mRNA 전사체에 대해 발현 수준을 인 시추에서 측정하였다. 간략하게는, BMDC를 시험관 내에서 8일째에 Cd11c(Miltenyi Biotech) 상에서 소팅하고, 폴리-l-라이신이 코팅된 유리 커버슬립 상에 평판하였다. 다음날 아침, 일부 세포들을 이전에 기술된 바와 같이 LPS로 자극하였다(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009); Chevrier, N. et al. Systematic Discovery of TLR Signaling Components Delineates Viral-Sensing Circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011)]). 고정 전 10분째에, 세포 배양 배지를 HBSS 중의 Alexa-350 소맥 배아 응집소(Wheat Germ Agglutinin; WGA, Invitrogen)의 1:500 희석액으로 대체하였다. 후속해서, 세포를 제조업체의 권고에 따라 고정하고 염색하였다. 밤새 큐어링(curing)한 후, Slowfade(Invitrogen)로 마운팅된 커버슬립을 Metamorph 소프트웨어가 구비된 에피형광 현미경(Olympus)을 사용하여 x, y 및 z에서 60x 배율(1.42 NA, 오일 침지)로 래스터 스캐닝(raster scanning)하였다. 평균적으로, 100개의 개별 3-차원 스택(stack)들을 각각의 검체로부터 취하였다. 모든 검체들에 대해, 4-색 이미지화를 수행하여, 하기의 정보를 수득하였다: 여기(ex) 405 nm - WGA & DAPI 염색; 각각 ex 488nm, ex 546nm, ex 647nm - 프로브 1, 2, 및 3.

수득된 이미지를 2상(phase)으로 처리하였다. 우선, 셀프로파일러(CellProfiler)(문헌[Carpenter, A. et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology 7, doi:10.1186/gb-2006-7-10-r100 (2006)])를 사용하여, UV 필터 세트(ex 405 nm)를 사용하여 취한 이미지들의 각각의 스택에 대한 위치 및 세포수를 측정하였다. 밝게 염색된 핵 영역(DAPI)을 사용하여, 개별 핵을 확인한 다음, 더 흐릿한 막 윤곽(WGA)으로부터 각각의 세포의 규모를 측정하기 위한 시드(seed)로서 사용하였다. 그런 다음, 개별 세포의 위치 및 규모를 소프트웨어를 사용하여 각각의 이미지화 위치에 대해 추출하였다. 그런 다음, 각각의 컬러 채널에 대해, 개별 mRNA를 확인하고, 이전에 기술된 분석 패키지를 사용하여 Matlab에서 계수하였다(문헌[Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A. & Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods 5, 877-879, doi:10.1038/nmeth.1253 (2008)]). 그런 다음, 확인된 mRNA를 셀프로파일러의 출력(output)을 사용하여 개별 세포에 분배(allot)하였다. 최종적인 분석 및 플로팅(plotting)을 또한, Matlab을 사용하여 수행하였다. 디스플레이된 RNA-FISH 이미지를 Adobe Photoshop을 사용하여 의사 색채법(false-color)을 수행하고, 오버레이하였다.

모든 RNA FISH 히스토그램에 대해, 계수를 구간화하고(n은 50임), Matlab에서 5개 구간의 윈도우로 스무딩(smoothing)하였다. 대조군으로서, LPS로 자극하지 않은 BMDC를 또한, 분석하여, 유도성-유전자 RNA-FISH 프로브의 특이성을 확실시 하였다(도 23).

스플라이싱 분석의 경우, 통상적인 RNA 피쉬 프로브(Panomics)를 하기와 같이 Irf7 또는 Acpp로 설계하였다:

2개의 구성적인 Irf7 프로브들 간의 bDNA의 수의 차이로 인해, 구성적인 프로브 B의 경우 약간 더 양호하게 결합되며, 따라서 계수가 보다 높았다. 그 결과, 메트릭인 프로브 A 계수/(프로브 A counts + 프로브 B counts) (도 3c의 히스토그램에서 사용됨)는 평균 약 0.45(약 0.5 대신)로 정상적으로 분포된다. 이소폼-특이적인 프로브를 구성적인 프로브 B에 대해 플로팅하면, 유사한 곡선이 수득되었다(도 3c를 도 15와 비교함). 세포는, 구성적인 프로브(Irf7)에 대한 계수된 mRNA의 수가 적어도 5인 경우 또는 다른 엑손 계수의 합계가 적어도 5인 경우에만 포함되었다. Acpp의 경우, n은 615개 세포이며; Irf7의 경우, n은 490이다.

면역형광 (IF) 측정: IF 공동염색을 이전에 기술된 바와 같이 RNA-FISH 염색 후 바로 수행하였다(문헌[Chevrier, N. et al. Systematic discovery of TLR signaling components delineates viral-sensing circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011); Shalek, A. K. et al. Nanowire-Mediated Gene Silencing in Primary Immune Cells: Identification of Patient-specific Responses in Chronic Lymphocytic Leukemia. In Review (2012)]). Stat1, pStat1, 및 Stat2 항체는 모두 1:200으로 사용하였으며, Santa Cruz Biotechnology사로부터 입수하였다. 평균 형광 수준 및 총 형광 수준, 뿐만 아니라 핵에 위치한 형광의 %를, 상기와 같이, 개별 세포 및 이들의 핵의 위치 및 규모를 이용하여 에피형광 이미지로부터 정량화하였다(도 17 및 도 18). 모든 단백질 히스토그램들에 대해, 계수를 구간화하고(n은 100임), Matlab에서 5개 구간의 윈도우로 스무딩하였다. 단일-평면 및 3-차원 스캔에 의해 유사한 결과가 수득되었다(데이터는 도시되지 않음).

단일-세포 qRT - PCR: 단일 BMDC를, 단일-세포-대-Ct 키트(Ambion)를 최소의 변형을 수반하여 사용하는 qRT-PCR용으로 제조하였다. 즉, 개별 BMDC를 권고된 용해 완충제 부피의 1/4로 소팅하고, 모든 후속적인 단계들을 매칭되도록 척도화하였다. 특이적인 표적 증폭 후, 엑소뉴클레아제 I 분해(NEB)를, 엑소뉴클레아제 I 0.5 ㎕, 엑소뉴클레아제 I 반응 완충제 0.25 ㎕ 및 물 1.75 ㎕를 각각의 검체에 첨가하고, 와동(vortex)하고, 원심분리하고, 37℃로 30분 동안 가열함으로써 수행하였다. 80℃ 열 불활성화를 15분 동안 수행한 후, 검체를 완충제 TE에서 1:5로 희석하였다. 단일 세포, 음성 대조군 및 집단 대조군(추출된 총 RNA를 사용하여 동일하게 제조됨)을 96x96 유전자 발현 칩(Fluidigm Biomark)을 사용하여 분석하였다(문헌[Dalerba, P. et al. Single-cell dissection of transcriptional heterogeneity in human colon tumors. Nature Biotechnology 29, 1120-1127, doi:10.1038/nbt.2038 (2011)]).

파노 인자 계산: 파노 인자(정상화된 표준 편차)를, 단일 세포 발현 수준 및 평균 단일 세포 발현 수준(log 공간, 상기 참조)에 대한 유전자 발현 값(log 공간)의 표준 편차의 비율로서 게산하였다. 도 2a 및 도 2b에서 회색 파선은 0.25의 일정한 파노 인자를 나타내며, 하기 표 S3에 나타낸 바와 같이, 높게 발현된 유전자들을 가변적인 유전자의 그룹과 비-가변적인 유전자의 그룹으로 광범위하게 분리하였다. 이들 2개 유전자 세트의 기능적인 농화(enrichment) 분석(하기 참조)은 사용된 파노 인자 역치(0.2 내지 0.3)의 작은 변화에도 매우 강력하였다.

표 S3. 세포 집단에서 평균을 기준으로 높게 발현되는 유전자

도 2a에서 청색 파선은 18개의 단일 세포에서 이들의 단일 세포 평균에 대한 최대 이론학적 표준 편차를 나타낸다. 이 이론학적 최대는 세포가 약 (μ+log(2))/2의 값으로 완벽하게 바이모달형으로 분포되는 경우 발생하며, 관계식: σ_최대= sqrt(18/17)*(μ+log(2))/2)로 표시된다.

가변적인/비-가변적인 유전자 세트의 기능적인 농화: 비-가변적인 높게 발현된 유전자 세트의 기능적인 농화(GO 주석화(annotation))를 DAVID v6.7을 사용하여 수행하였다(문헌[Huang, D. W., Sherman, B. T. & Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research 37, 1-13, doi:10.1093/nar/gkn923 (2009); Huang, D. W., Sherman, B. T. & Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols 4, 44-57, doi:10.1038/nprot.2008.211 (2009)]). 522개의 높게 발현된 유전자의 전체 목록을 백그라운드 세트로서 사용하였다. 도 2a 및 표 S3에 대해, 2개의 목록들을 조합하여, 하우스키핑 유전자 세트를 형성하였다. 제1 목록은 GO 주석화에서 정의된 리보좀 아단위 단백질의 세트이며(문헌[Huang, et al., Nucleic Acids Research 2009; Huang, et al., Nature Protocols 2009]), 제2 목록은 Qiagen 웹사이트로부터 다운로드한 보편적으로 사용되는 마우스 하우스키핑 유전자의 표로부터 취한다.

상관도 매트릭스 및 주성분 분석( PCA ): 632개의 유도된 유전자에 대한 PCA를 prcomp 기능을 사용하여 R에서 수행하였다. 유전자에 대한 가변성 패턴을 집단에서 상이한 전체적인 부화도와 적절하게 비교하기 위해, 각각의 유전자의 발현 값을, 단일 세포에 대한 제로 평균 및 단위 변동(unit variance)을 가지도록 변형하였다.

상관도 매트릭스를 log-척도의(그러나, 비-변형된) 유전자-발현 추정값을 토대로 계산하고, k-평균을 사용하여 매트릭스를 클러스터링하였다. "엘보우 방법(elbow method)"을 토대로 하는 5개의 클러스터의 매개변수(문헌[Diday, E. New approaches in classification and data analysis.(Springer-Verlag, 1994)])(데이터는 도시되지 않음)를 선택하였으나, 강하게 농화된 항바이러스 클러스터의 확인(및 이의 PC2와의 높은 중복도)은 매개변수 선택 또는 k-평균의 확률성(stochasticity)에 대해 매우 강력하였다.

632개 유전자의 세트에서, 이전의 연구로부터의 항바이러스 유전자 표적 세트(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009)])를 주석화하였다. Stat2 표적을, 동일하게 자극한(4시간째에) BMDC 세트 상에서, 이전에 정의된 "프로모터 ChIP 정점"의 세트로부터 주석화하였다(문헌[Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012)]). 클러스터-특이적인 농화 분석을, 632개 유도성 유전자의 전체 세트를 백그라운드 세트로서 사용하여, R에서 초기하학적 시험(hypergeometric test)을 사용하여 수행하였다.

집단 형광-활성화된 세포-소팅( FACS ) 분석 및 정량적인 역방향 전사 폴리 머라제 연쇄 반응( qRT - PCR ): BMDC를 LPS로 4시간 동안 자극하였다. 소팅 전 15분째에, 세포를, 반성숙(semi-mature; S) 또는 성숙(M) 세포를 정의한 Biolegend사의 11개 항체 각각으로 염색하였다: Cd83(S), Cd273(S), Ccr7(S), Cd40(S), Cd201(S), Cd137(S), Cd68(M), Cd120b(M), Cd53(M), Cd88(M) 및 Cd16/32(M). 시험되는 표면 마커 각각에 대해 양성 또는 음성인 1,000개 세포로 구성된 3개의 그룹을 1% 2-머캅토에타날이 보충된 완충제 TCL 100 ㎕에서 소팅하였다. 그런 다음, 총 RNA를 RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 20개 검체 각각으로부터 추출하였으며, cDNA를 이전에 기술된 바와 같이 Sensiscript RT(Qiagen)를 사용하여 제조하였다(문헌[Shalek, A. K. et al. Vertical silicon nanowires as a universal platform for delivering biomolecules into living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 1870-1875, doi:10.1073/pnas.0909350107 (2010)]). 그런 다음, 상이한 전사체에 대한 집단-와이드 발현 수준을 이전에 기술된 바와 같이 qRT-PCR을 사용하여 GAPDH에 관하여 분석하였다(문헌[Shalek, A. K. et al. Vertical silicon nanowires as a universal platform for delivering biomolecules into living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 1870-1875, doi:10.1073/pnas.0909350107 (2010))(도 15). qRT-PCR의 프라이머를 하기 표 S6에 제시한다.

표 S6. Fluidigm 단일 세포 qPCR 코드세트에 대한 유전자 목록, PCR 프라이머 쌍

스플라이싱 분석: 약 67,000개의 이전에 주석화된 다르게 스플라이싱된 사건들의 세트(스킵된(skipped) 엑손, 상호 배타적인 스플라이스 사건)를 다운로드하였다(문헌[Wang, E. T. et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature 456, 470-476, doi:10.1038/nature07509 (2008)]). MISO (문헌[Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M. & Burge, C. B. Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation. Nature Methods 7, 1009-1015, doi:10.1038/nmeth.1528 (2010)])를 디폴트 매개변수와 함께 진행하여, 단일 세포 및 집단 복제물 각각에서 모든 사건에 대한 스플라이싱%(percent spliced in; PSI))를 추정하였다. 대부분의 사건들은, MISO에 의해 분석되어야 하는 검체들 중 임의의 검체에서 충분한 깊이에서 발현되지 않았다. 나머지 4,338개 사건의 경우, 10,000개 세포 복제물 유래의 PSI 추정값은 밀접하게 상관되어 있는 것으로 주지되었다(평균 r은 0.91임). 3개 집단 복제물에 대한 PSI 값의 평균을 내었으며, 322개 유전자(28개 유전자는 적어도 2개의 다른 스플라이싱 사건을 가졌음)에서 352개의 "다르게 스플라이싱된" 사건에서 분석의 나머지 부분에 중점을 두었다(집단 PSI 평균은 20% 초과이며 80% 미만임).

그런 다음, 단일 세포에 대한 이들 352개의 다른 스플라이싱 사건의 PSI 분포를 검사하였다(도 3b). 높게 발현된 전사체로부터 오로지 신뢰할만한 스플라이싱 사건만 검사하는 것을 확실시하기 위해, 다르게 스플라이싱된 유전자가 해당 단일 세포 내에서 높은 수준으로 발현된(단일-세포 TPM은 250 초과임), 단일 세포/스플라이스 사건 쌍에 대한 PSI 추정값만 고려하였다. 이로써, 79개 유전자로부터 89개의 독특한 다른 스플라이스가 생성되었다. 이 필터를 적용한 후, 단일 세포에 대한 PSI 추정값의 히스토그램(도 3b, 상부)을 플로팅하였다. 도 3b(하부)는, 도 3b의 동일한 89개 스플라이스 사건(상부)에 대한 제1의 10,000-세포 복제물의 PSI 추정값의 히스토그램을 보여준다.

마우스: 본원에 제공된 고 처리량의 실시예를 위해, 6주령 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 야생형(wt), Tnfrsf1a^-/-x Tnfrsf1b^-/-(Tnfr, Irf1^-/-, Tirap^-/-, Il1rn^-/-, Ikbke^-/- _,Cxcr2^-/- _, Egr1^-/-, Fas^-/-, NZBWF1/J 및 Ifnβ1-eYFP 리포터 마우스를 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)로부터 입수하였다. Stat1^-/- 및 129/Sv 대조군 마우스를 Taconic(Hudson, NY)으로부터 구매하였다. Irf7^-/- 골수(BM)는 메사추세츠 의과대학의 Kate Fitzgerald로부터 제공받았다. Ifnr^-/- BM은 메사추세츠 종합 병원의 Nir Hacohen으로부터 제공받았다. ZFP36^-/-(TTP^-/-) 및 대조군 BM은 NIH/NIEHS의 Perry Blackshear로부터 제공받았다. Ifnar1-/-(Ifnr KO) 골수는 Nir Hacohen (메사추세츠 종합 병원)으로부터 제공받고; Il27-/-(Il27r KO) 골수는 Vijay Kuchroo(브리검 여성 병원(Brigham and Women's Hospital))로부터 제공받았다.

모든 동물들을 미국 메사추세츠주 캠브리지 소재의 MIT에서 종래의 무-병원체 시설에서 사육하고 유지시켰다(IUCAC 프로토콜: 0609-058015). 모든 실험들을 MIT(미국 메사추세츠주 캠브리지 소재)에 있는 동물 케어 위원회에 의해 기술되는 지침서에 따라 수행하였다.

세포 배양, 소팅 및 용해: 본원에 제공되는 고 처리량의 실시예에 대해, 6주령 내지 8주령의 암컷 B6 마우스의 골수 유래의 수지상 세포(BMDC)의 배양물을, 최소로 변형시키면서 이전에 기술된 바와 같이 제조하였다(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009); Chevrier, N. et al. Systematic Discovery of TLR Signaling Components Delineates Viral-Sensing Circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011)]). 즉, 단리된 골수를 10% DMSO가 보충된 순수한 태아 소 혈청에서 1 mL 당 5x10⁶(M)개 세포로 동결하였다. 각각의 진행 시, 단일 바이얼을 해동하고, 이전에 기술된 바와 같이 배양하였다(Ibid). 시험관 내에서 배양한 지 9일째에, 세포를 항-Cd11c 항체(Miltenyi Biotech)로 표지하고, 유세포-소팅하며, 양성 세포 중 상부 10%를 유지시켰다. 후속해서, 세포를 회전 침강(spin down)시킨 다음, 15 mL 코니칼 튜브에서 적절한 자극제가 보충된 배지에 1 mL 당 2 x 10⁵개 세포의 농도로 재현탁하고, 뚜껑을 약간 열어둔 채 인큐베이터에 두었다. 자극원(PAM3CSK(Invivogen), 폴리(I:C)[PIC](Enzo Life Sciences, 10 ㎍/mL), LPS(Invivogen, 100 ng/mL) 및 인터페론-β(Ifn-β)(R&D Systems, 1000 유닛/mL))을 이전에 기술된 바와 같이 사용하였다(Ibid). 특정 시점의 45분 전에, 세포를 회전 침강시키고, Hoechst 34580 염료(Life Technologies, 제조업체의 권고에 따름)가 보충된 완전 배지 1 mL 당 3 x 10⁵ M 세포의 농도로 재현탁한 다음, C₁ 현탁 시약(Fluidigm)과 7:3으로 혼합한 다음, C₁ 미세유체 칩 상으로 로딩하였다. 로딩 후, C₁ 미세유체 칩의 포착 포트 각각을 세포의 존재에 대해 광학적으로 조사하였다. 각각의 챔버에 존재하는 세포의 수를 핵의 수를 계수함으로써 결정하였다. 평균 단일 세포 포착률은 칩 당 72(평균) ± 13(표준 편차)이었다. 둘 이상의 세포를 포함하는 챔버의 평균 수는 8 ± 7이었다. 드문 복수의 포착 경우가 제시된 분석에서 (즉, 산출 분석에 의해) 자동적으로 여과되지 않았지만, 임의의 특이적인 발견(예를 들어, '조숙 세포')은 수동적인 조사에 의해 확인되었으며, 세포 더블릿(doublet) 또는 다른 세포 포착 사례 중 어느 것도 관여하지 않았음을 확인시켜 주었다. 마찬가지로, Hoechst 34580의 첨가는 본원에 제공되는 시스템에서 유전자 발현을 변경시키지 않음이 명백하게 확인되었다.

전체 전사체 증폭: 세포 단리 후, 세포를 용해하고 SMART-Seq하였다(문헌[Ramskold, 2011] 참조). 전체 전사체 증폭된 생성물(WTA)을 Illumina 서열화(Clontech)용 SMARTer Ultra Low RNA 키트를 사용하여 제조하였으며, 이와 더불어 mRNA-Seq 프로토콜을 하기의 변형을 수반하여 C1 상에서 진행시켰다:

세포 용해 믹스:

사이클링 조건 I:

a) 72℃, 3분

b) 4℃, 10분

c) 25℃, 1분

역방향 전사(RT) 반응 믹스:

사이클링 조건 II:

a) 42℃, 90분

b) 70℃, 10분

PCR 믹스:

사이클링 조건 III:

a) 95℃, 1분

b) 하기의 5 사이클:

i) 95℃, 20초

ii) 58℃, 4분

ii) 68℃, 6분

c) 하기의 9 사이클:

i) 95℃, 20초

ii) 64℃, 30초

ii) 68℃, 6분

d) 하기의 7 사이클:

i) 95℃, 30초

ii) 64℃, 30초

ii) 68℃, 7분

e) 72℃, 10분

라이브러리 제조 및 RNA- Seq : WTA 생성물을 C1 칩으로부터 수합하고, cDNA 라이브러리를 Nextera XT DNA 검체 제조 키트(Illumina)를 제조업체의 권고에 따라 최소의 변형과 함께 사용하여 제조하였다. 즉, 반응을 권고된 부피의 1/4에서 진행시키고, 태그화(tagmentation) 단계를 10분으로 연장하였다. PCR 단계 후, 96개 검체 모두를 라이브러리 정상화 없이 풀링(pooling)하고, 0.9x AMPure XP SPRI 비드(Beckman Coulter)로 2회 세정한 다음, 완충제 TE에서 용출하였다. 마지막으로, 풀링된 라이브러리를 Quant-IT DNA 고 감도 분석 키트(Invitrogen)를 사용하여 정량화하고, 고 감도 DNA 칩(Agilent)을 사용하여 검사한 다음, MiSeq(Illumina) 상에서 진행시켰다. 마지막으로, 검체를 HiSeq 2000 또는 HiSeq 2500을 사용하여 깊게 서열화하였다.

집단 대조군의 RNA- Seq: 집단 대조군을 RNeasy plus Micro RNA 키트(Qiagen)를 제조업체의 권고에 따라 사용하여 총 RNA를 추출함으로써 생성하였다. 후속해서, 수 중 RNA 1 ㎕를 용해 반응 믹스 2 ㎕에 첨가하고, 사이클링 조건 I(상기와 같음)을 사용하여 서모사이클링(thermocycling)하였다. 다음, RT 반응 믹스 4 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 사이클링 조건 II(상기와 같음)를 사용하여 서모사이클링하였다. 마지막으로, 총 RT 반응물 1 ㎕를 PCR 믹스 9 ㎕에 첨가하고, 혼합물을 사이클링 조건 III(상기와 같음)를 사용하여 서모사이클링하였다. 생성물을 정량화하고, 0.125 ng/㎕로 희석시키고, 라이브러리를 제조하고, 세정하고, 상기와 같이 시험하였다.

RNA 형광 인 시추 혼성화 (RNA-Fish): Ifit1, Tnf, Il6, B2m 및 Ifnb1에 대한 RNA-FISH(도 27)를 Panomics사의 프로브를 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(예를 들어, 문헌[Shalek, A. K. et al. "Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells." Nature 498, 236-240, doi:10.1038/nature12172 (2013)] 참조).

온-칩 세포 단리 및 시뮬레이션: 세포-대-세포의 소통을 차단하기 위해, 개별 BMDC를 포착 후에 C1 칩에서 자극하였다. 우선, 세포를 로딩하기 전에, C1 칩을 C1 차단 시약으로 예비차단한 다음, 완전 배양 배지와 함께 2시간 동안 예비차단하였다. 그런 다음, 비자극된 BMDC를 로딩한 다음, 적절한 자극원이 보충된 완전 배지로 세정하였다. 자극-가미된(laced) 완전 배지의 도입 후, 칩을 C1 시스템 내에서 37℃에서, 특이적인 분석법 시점 전 30분까지(즉, 4시간 자극 시점의 경우 3.5시간 동안) 유지시켰다. 그런 다음, 4시간째에 상기와 같이 세포를 Hoechst(Invitrogen)를 포함하는 배지로 칩 상에서 세정하고, 칩을 C1 시스템으로부터 제거한 후, 이미지화하고 진행시켰다. 용해 전에, 실온에서 30분 간격(본 발명자들의 "인 튜브" 검체의 로딩 시점에 상응함)은, 세포를 세정하고(15분), 이미지화하고(5분), 시약을 로딩하는(10분) 시간이었다. 마지막으로, 모크(mock) "온-칩" 실험을, 상기와 같이 세포를 로딩한 다음, 상기와 같이 LPS를 포함하지 않는 완전 배지를 도입함으로써 수행하였다.

사이토카인 첨가, GolgiPlug 및 사이클로헥시마이드 실험: 재조합 IL-4(Miltenyi Biotec), IL-6(Miltenyi Biotec), IL-10(R&D Systems), IL-12(Miltenyi Biotec), IL-15(Miltenyi Biotec), IL-27(R&D Systems), IL-35(AdipoGen)를 기술된 바와 같이 200 ng/mL에서 첨가하였다. GolgiPlug(BD Biosciences)를 다양한 시점들에서 1:1,000 희석으로 첨가하였다. 마지막으로, 사이클로헥시마이드를 자극 시점에서 또는 표준 4h LPS 대조군 동안에 500x 에탄올 스톡으로부터 100 ㎍/mL에서 첨가하였다.

RNA- Seq 데이터 처리: Nextera 라이브러리 제조로 인해 SMARTer 짧은 어댑터 서열 및 SMARTer 긴 어댑터 서열을 트리밍할 필요가 없다는 점을 제외하고는(예를 들어, 문헌[Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:10.1038/nbt.2282 (2012)] 참조), 원(raw) 서열화 데이터를 이전에 기술된 바와 같이 처리하였다(문헌[Shalek, Nature 2013]). 짧은 서열화 판독을 UCSC mm9 전사체에 정렬하였다(예를 들어, 문헌[Fujita, P. A. et al. The UCSC Genome Browser database: update 2011. Nucleic Acids Research, doi:10.1093/nar/gkq963 (2010)] 참조). 이들 정렬을 사용하여, 전사체 정렬률(trascriptomic alignment rate)을 추정하였으며, RSEM v 1.12에서 입력(input)으로도 사용하여(문헌[Li, B. & Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics 12, doi:10.1186/1471-2105-12-323 (2011)]), 모든 검체들에서 모든 UCSC mm9 유전자에 대한 유전자 발현 수준 (전사체/10⁶; TPM)을 정량화하였다. 게놈 맵핑을 Tophat v. 1.41을 이용하여 수행하고(문헌[Trapnell, C., Pachter, L. & Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics 25, 1105-1111, doi:10.1093/bioinformatics/btp120 (2009)]), 생성되는 정렬을 사용하여, 게놈 맵핑률, rRNA 오염, 및 3' 및 5' 위치적 편향(PicardTools)를 계산하였다. 모든 단일 세포들 중 적어도 1%에서 주목할 만한 수준(ln(TPM+1)은 1 초과임)으로 발현되지 않은 모든 유전자들을 폐기하여, 모든 추가적인 분석을 위해 10,313개 유전자를 남겨 두었다.

클러스터와 주성분(PC) 간의 통계학적으로 유의한 연관성을 결정: 어떤 모듈이, PC에 의해 정의된 바와 같이 데이터에서 가변성의 일차 소스와 유의하게 연관있는지 결정하기 위해, 최근에 개발된 통계학적 재검체화 접근법(문헌[Chung, N. C. & Storey, J. D. Statistical significance of variables driving systematic variation. arXiv, doi: uuid/22B6DA41-E02D-423F-87BC-211091235A51 (2013)])을 이용하여, 처음 3개의 PC와 연관있는 유전자를 결정하였다. 간략하게는, 처음 3개의 PC에 대한 각각의 유전자의 기여도를 독립적으로 제로 아웃(zero out)하고, 변형된 PC에 의해 설명되는 분산 변화를 검사함으로써, 각각의 면역 반응 유전자에 대한 F-통계량을 계산하였다. 그런 다음, 매트릭스에서 소수의 랜덤 열(n은 5임)을 순열로 만든 다음, 이들 합성적인 널 변수(null variable)에 대해 F-통계량을 계산하였다. 이 절차를 1,000회 반복하여, 널 통계량 세트를 생성하였다. 각각의 모듈의 통계학적 유의성을 평가하기 위해, 단측 맨-휘트니 검정(one sided Mann-Whitney test)을 수행하였다.

유전자 발현 변동의 매개변수 모델의 적합화: 공칭 매개변수 α, σ2 및 μ를, 일련의 네스티드 통계 모델(nested statistical model)을 이의 발현 분포에 적합화함으로써 각각의 조건에서 각각의 유전자에 대해 추정하였다(도 26a 및 도 26b). 모든 제시들은 LPS 반응에 중점을 두었으며, 여기서, 가장 많은 모듈로부터의 유전자를 유도한다. 우선, 면역 반응 유전자의 단일 세포 발현 분포가 (μ, σ²) 유니모달(unimodal) 로그정규 분포와 상용성인지를, 유전자 발현의 단일-세포 분포를 기술하는 문헌에서 이전에 사용된 바와 같이, 시험하였다(예를 들어, 문헌[Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y. & Tyagi, S. in PLoS Biol Vol. 4 e309 (2006)] 참조). 각각의 조건에서 각각의 유전자에 대해, 모든 log(TPM+1) 값의 평균 및 분산을 계산하고, 적합도 검정(goodness-of-fit test)을 이용하여, 이들 매개변수와 함께 로그정규 분포를 검정하였다. 분포의 아주 작은 소수(2.5%)만이, 주로 본 발명자들의 단일 세포 데이터에서 제로 값의 팽창으로 인해, 2-매개변수 모델에 의해 양호하게 기술되었다.

다음, α, σ² 및 μ에 대한 값을 추정함으로써, 각각의 단일-세포 유전자 발현 분포를 매개변수화하였다. 각각의 분포는 주어진 조건에서 주어진 유전자에 대한 단일 세포에 걸친 관찰된 발현 값에 상응한다. 발현 역치는 ln(TPM+1)이 1 초과인 것으로 설정하였으며, ln(TPM+1)이 0 초과이며 1 미만인 범위의 발현 수준은 전형적으로 엑손 서열로 맵핑된 매우 소수의 판독을 반영하며, 이들은 소량의 오염을 의미할 수 있는 것으로 관찰되었다. 따라서, α 값은, 전사 발현이 수준(ln(TPM+1)은 1 초과임)에서 검출된 세포 집단으로서 추정하였다. 그런 다음, 평균(μ) 및 분산(σ²)을 ln(TPM+1)이 1 초과인 모든 발현 값들의 log 공간에서 계산하였다. 이러한 3-매개변수 모델의 적합은 부가적인 적합도 검정을 이용하여 평가하였다. 분포의 대부분(92%)은 3-매개변수(μ, σ², α) 모델에 의해 양호하게 기술된 것으로 확인되었다(p는 0.01 미만임, 적합도 검정).

실시예 2. 골수 유래의 수지상 세포( BMCD )를 리포다당류(LPS)로 자극

게놈 척도에서 발현 가변성의 규모를 특징화하고, 이의 조절적인 함축 및 기능적인 함축을 해석하기 위해, 단일-세포 RNA-Seq를 이용하여, LPS 자극에 대한 BMDC의 반응의 이종성을 연구하였다. BMDC는 몇 가지 이유로, 단일-세포 분석에 대한 매력적인 모델 시스템이다. 우선, 그람-음성 박테리아의 성분이며 Toll-유사 수용체 4의 리간드인 LPS는 세포 반응을 동기화하고 일시적인 상(phasing)을 이동시키는 생리학적으로 관련 있으며 일정한 자극원이다(문헌[Tay, S. et al. Single-cell NF-κB dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature 466, 267-271, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature09145 (2010)]). 둘째로, LPS에 의한 활성화는 염증 및 항바이러스 사이토카인에 대한 강력한 전사 프로그램을 유도하며, 이 반응을 제어하는 성분들 중 다수는 '집단-와이드' 연구로부터 알려져 있다(문헌[Takeuchi, O. & Akira, S. Pattern Recognition Receptors and Inflammation. Cell 140, 805-820, doi:10.1016/j.cell.2010.01.022 (2010)]). 셋째로, LPS 자극은 유도되는 유전자에 대한 mRNA와 단백질 수준 간의 동기화를 증가시켜서, 단일-세포 분석에 대한 잠재적 혼란 변수(confounding factor)를 감소시켜야 한다(문헌[Taniguchi, Y. et al. Quantifying E. coli Proteome and Transcriptome with Single-Molecule Sensitivity in Single Cells. Science 329, 533-538, doi:10.1126/science.1188308 (2010), Li, G.-W. & Xie, X. S. Central dogma at the single-molecule level in living cells. Nature 475, 308-315 (2011)]). 마지막으로, 골수 배양물 유래의 분화된 DC는 유사분열후(post-mitotic)의 것이며, 세포 사이클의 효과를 대체적으로 제거한다(문헌[Kalisky, T., Blainey, P. & Quake, S. R. Genomic Analysis at the Single-Cell Level. Annual review of genetics 45, 431-445, doi:papers2://publication/doi/10.1146/annurev-genet-102209-163607 (2011); Ramos, C. A. et al. Evidence for Diversity in Transcriptional Profiles of Single Hematopoietic Stem Cells. PLoS Genetics 2, e159, doi:papers2://publication/doi/10.1371/journal.pgen.0020159.st008 (2006)]).

BMDC를 LPS로 자극시키고, 4시간 후 단일 세포를 수합하였다(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009); Chevrier, N. et al. Systematic Discovery of TLR Signaling Components Delineates Viral-Sensing Circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011)])(실시예 1). SMART-Seq를 이용하여(문헌[Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012)]), 18개 단일 BMDC(S1 내지 S18) 유래의 cDNA 라이브러리를 구축하였으며, 10,000개 세포로 구성된 3개의 복제물 집단, 및 2개의 음성 대조군(빈(empty) 웰)이 구축되었다. 이들 라이브러리 각각을, 검체 당 27백만 판독-쌍의 평균 깊이로 서열화하였다. 예상한 바와 같이, 음성 대조군 라이브러리 유래의 판독 중 0.25% 미만이 마우스 게놈에 정렬되었으며, 이들 검체를 모든 추가적인 분석으로부터 폐기하였다. 라이브러리 품질 메트릭(문헌[Levin, J. Z. et al. Comprehensive comparative analysis of strand-specific RNA sequencing methods. Nature Methods 7, 709-715 (2010)]), 예컨대, 게놈에의 정렬률, 리보좀 RNA 오염, 및 3' 또는 5' 포함 편향(coverage bias)은 모든 단일-세포 라이브러리 및 10,000-세포 복제물에 걸쳐 유사하였다. 각각의 검체에 대해, 발현 수준을, RSEM(문헌[Li, B. & Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics 12, 323-323 (2011)])(실시예 1)을 이용하여 모든 UCSC-주석화된 유전자들에 대해 계산하고(문헌[Hsu, F. et al. The UCSC Known Genes. Bioinformatics (Oxford, England) 22, 1036-1046, doi:10.1093/bioinformatics/btl048 (2006)]), 적어도 3개의 개별 세포에서 적절한 수준(전사체/10⁶(TPM)이 1 초과임)으로 발현되지 않은 유전자들은 모두 폐기하여, 추가적인 분석을 위해 6,313개 유전자를 보유하였다.

집단 복제물의 유전자 발현 수준이 서로 밀접하게 상관되어 있지만(피어슨 r은 0.98 초과임, log-척도, 도 1a), 개별 세포들 간의 유전자 발현 프로파일에는 상당한 변동이 있었다(r은 0.29 초과이며 0.62 미만이고, 평균은 0.48임, 도 1b, 도 5). 이 광범위한 세포-대-세포 변동에도 불구하고, "평균" 단일 세포에 대한 발현 수준(18개 단일 세포 모두에 대한 전사 발현 수준을 평균냄으로써 유래됨)은 집단 검체와 양호한 상관이 있었다(r은 0.79 초과이며 0.81 미만임)(도 1c, 도 5). 단일 세포들 간에 관찰된 상당한 유전자 발현 차이는 함께 평균을 내어 집단 프로파일을 형성하는 것을 확인시켜 준다.

증폭을 필요로 하지 않는 단일 분자 이미지화 기술인 RNA-형광 인 시추 혼성화(FISH)(문헌[Yu, M. et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature 487, 510-513, doi:10.1038/nature11217 (2012); Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E. & Van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature 463, 913-918, doi:10.1038/nature08781 (2010)])를 이용하여, 단일-세포 발현의 이종성이, 소량의 세포 RNA의 증폭과 연관된 기술적 노이즈가 아닌 실질적인 생물학적 차이를 반영하는지 입증하였다. 광범위한 발현 수준을 망라하기 위해 선택된 25개 유전자에 대해, RNA-FISH에 의해 검출된 유전자 발현 수준의 변동은 서열화 데이터에서 관찰된 이종성을 밀접하게 반영하였다(도 1d 내지 도 1h, 도 6). 예를 들어, 전형적인 하우스키핑 유전자(예를 들어, 베타-액틴(Actb), 베타-2-마이크로글로불린(B2m))의 빌현은 단일-세포 RNA-Seq 및 RNA-FISH 측정 둘 모두에서 로그정규 분포와 일치하였으며, 이는 이전의 연구와 일치하였다(문헌[Bengtsson, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research 15, 1388-1392, doi:papers2://publication/doi/10.1101/gr.3820805 (2005)]). 대조적으로, LPS에 대한 BMDC 반응에 관여하는 다수의 유전자들은 평균적으로 높게 발현되었지만, 로그정규 분포를 적합화하지 않는 이종성을 상당히 더 높은 수준으로 나타내었다. 극단적인 경우, 이들 유전자의 발현 수준은 개별 세포들 간에 약 1,000배 이하로 다양하였다(도 1e 내지 도 1h). 보다 일반적으로, 단일-세포 유전자 발현에서 높은 수준의 가변성은 광범위한 집단 발현 수준에 걸쳐 지속된 것으로 확인되었다(도 2a).

특히, 522개의 가장 높게 발현된 유전자(단일-세포 평균 TPM은 250 초과임, 표 S3) 중 281개는 낮은 가변성을 나타내었으며, 이들의 발현 수준은 단일 세포에 걸친 로그정규 분포에 의해 잘 기술되었다(RNA-Seq: 도 2b, 도 2c 상부, RNA-FISH (Actb, B2m): 도 6). 이들 281개의 유전자는 하우스키핑 유전자에 대해 농화되며, 리보좀 및 다른 구조 단백질들을 인코딩한다(본페로니(Bonferroni)-보정된 p는 1.5x10^-6임). 이는, 높게 발현되는 하우스키핑 유전자 및 '성장' 유전자가 세포들 간에 덜 가변적인 효모(문헌[Newman, J. R. S. & Weissman, J. S. Systems biology: many things from one. Nature 444, 561-562 (2006); Bar-Even, A. et al. Noise in protein expression scales with natural protein abundance. Nature Genetics 38, 636-643 (2006)]) 및 인간(문헌[Ram, O. et al. Combinatorial Patterning of Chromatin Regulators Uncovered by Genome-wide Location Analysis in Human Cells. Cell 147, 1628-1639 (2011)]) 세포에서 이전에 관찰된 것들과 일치한다.

그러나 놀랍게도, 다른 높게 발현된 유전자들 중 대부분은 바이모달 발현 패턴(241개의 매우 가변적인 유전자 중 185개, 도 2b, 도 2c 하부)을 나타내었으며: 이들 유전자에 대한 mRNA 수준은 많은 세포들에서 높았으나, 적어도 3개의 세포에서 단일-세포 평균보다 적어도 낮은 자릿수에 있었으며, 여기서, 부화도는 종종 매우 낮거나 또는 검출불가능하였다. 이 변동은 RNA-FISH에 의해 독립적으로 입증되었으며(예를 들어, Cxcl1, Cxcl10, Ifit1 및 기타: 도 6), 이는, 기술적인 노이즈의 결과가 아님을 확인시켜 주었다. 이 가변적인 세트는, 집단 수준에서 LPS로 자극 시 적어도 2배로 유도된 유전자에 대해 높게 농화되었으며(문헌[Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012)])(p는 2.7x10^-7임; 초기하학적인 검정), 항바이러스 및 염증 반응 요소 둘 모두를 포함하였으며, 이는, 높게 발현된 유전자들 사이에서 이러한 광범위한 가변성이 면역 반응의 특징일 것임을 제시한다. 바이모달 발현 패턴은 다수의 면역 반응 전사체를 특징화하지만, 일부 면역 반응 유전자들은 모든 세포에서 높게 발현되었으며(도 7), 이는, 모든 세포들이 LPS에 강력하게 반응하였음을 입증하는 것이다. 이들로는, 주요 케모카인 및 케모카인 수용체(Ccl3, Ccl4, Ccrl2), 사이토카인(Cxcl2) 및 LPS 반응의 다른 중요한 성분들(Tank)을 포함한다.

높게 발현된 전사체에서 이러한 변동율은 이전의 연구들에서는 관찰된 적이 없었다(문헌[Islam, S. et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research, doi:papers2://publication/doi/10.1101/gr.110882.110 (2011); Tang, F. et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols 5, 516-535, doi:10.1038/nprot.2009.236 (2010); Tang, F. et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods 6, 377-382, doi:10.1038/nmeth.1315 (2009); Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012); Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N. & Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports, doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003]). 예를 들어, 8개의 인간 배아 줄기세포의 공개된 SMART-Seq 데이터세트에서(문헌[Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012))(도 2a), 또는 말기 분화된 마우스 배아 섬유아세포 및 마우스 배아 줄기세포 유래의 단일 세포 RNA-Seq 데이터세트에서 매우 풍부한(집단 평균) 유전자에 대한 발현에서 훨씬 더 낮은 이종성이 확인되었다(문헌[Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N. & Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports, doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003])(도 8). 또한, (평균적으로) 높게 발현된 유전자에서 이러한 바이모달성은 중기-log 효모 세포 및 분열중인 인간 세포주에서 단백질 발현의 변동에 대한 게놈-척도 연구에서는 관찰되지 않았다(문헌[Newman, J. R. S. & Weissman, J. S. Systems biology: many things from one. Nature 444, 561-562 (2006); Bar-Even, A. et al. Noise in protein expression scales with natural protein abundance. Nature Genetics 38, 636-643 (2006); Sigal, A. et al. Variability and memory of protein levels in human cells. Nature 444, 643-646, doi:10.1038/nature05316 (2006)]. 따라서, 관찰된 바이모달성은 자극된 BMDC 집단에서 기능적으로 중요한 차이를 반영할 수 있는 것으로 가정되었다.

더욱이, 단일 세포에 대한 스플라이싱 패턴은 또한, 이전에는 관찰되지 않은 수준의 이종성을 나타내는데: 집단 수준에서 복수의 스플라이스 이소폼을 가진 유전자에 대해, 개별 세포는 하나의 특정한 이소폼을 주로 발현한다. 각각의 검체에서 이전에 주석화된 스플라이싱 사건의 빈도(스플라이싱된 %(percent spliced in), PSI)를, 이소폼 비율을 계산하기 위한 베이지안 틀(Bayesian framework)인 MISO를 이용하여 계산하였다(문헌[Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M. & Burge, C. B. Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation. Nature Methods 7, 1009-1015 (2010)). 놀랍게도, 집단-유래의 추정값이 매우 재현가능하였지만, 단일 세포는 엑손-포함 빈도에서 상당한 가변성을 나타내었다(도 3a, 도 3b).

PCR 증폭 단계(라이브러리 제조 방법에 대해 본질적인)는 잠재적으로는, 특히, '잭팟 효과'로 인해 약하게 발현되는 전사체의 경우, 이소폼 조절 가변성의 과대평가를 초래할 수 있었다는 가능성(문헌[Shiroguchi, K., Jia, T. Z., Sims, P. A. & Xie, X. S. Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 1347-1352 (2012)])을 조심스럽게 고려하였다. 그러나, 분석이, 단일 세포 내에서 매우 높게 발현된(단일 세포 TPM은 250 초과임) 89개의 다르게 스플라이싱된 엑손(집단 PSI는 0.2 초과이며 0.8 미만임)으로 제한되는 경우에조차, 개별 세포 중에서 스플라이싱 패턴에서 동일한 바이모달성이 여전히 관찰되었으며, 하나 또는 다른 스플라이스 변이체가 유사한 수준에서 둘 모두가 동시에 발현되는 대신에 매우 편향되어 발현된 것으로 확인되었다(도 3b).

몇몇 분자의 확률적인 과증폭이 스플라이싱 분석에 혼란을 줄 수 있다는 가능성을 추가로 제어하기 위해, 3개의 부가적인 단일 세포 cDNA 라이브러리를 약간 변형된 SMART-Seq 프로토콜(실시예 1)을 이용하여 제작하였으며, 여기서, 4개의 뉴클레오타이드 바코드를 역방향 전사 동안에 각각의 RNA 분자 상으로 도입하였다. 이 바코드를 PCR 증폭 및 라이브러리 제조를 통해 보유하였으며, 그로 인해, 본 발명자들은 서열화 라이브러리에서 표시되는 독특한 RNA 전사체의 수를 정량화할 수 있었다(도 9 및 실시예 1). 스플라이싱 분석을 적어도 15개의 독특한 바코드로 표시된 유전자로 제한하는 경우에조차, 집단 평균과 비교하여 단일 세포에서 이소폼 발현에서 강한 편향이 관찰되었다(도 10).

지금까지, 스플라이싱 패턴에서 단일-세포 변동은 단일 유전자에 대해서조차 드물게 연구되었으며, 게놈 척도에서는 전혀 분석된 바가 없다. 최근의 하나의 보고서(문헌[Waks, Z., Klein, A. M. & Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Molecular Systems Biology 7, 1-12, doi:papers2://publication/doi/10.1038/msb.2011.32 (2011)])는 2개의 유전자들에서 다른 이소폼의 변동을 연구하기 위해 RNA-FISH를 이용하였으며, 단일 세포에 걸친 이소폼 가변성(상이한 세포 유형들에서 차이가 나는 이종성의 수준)을 보다 낮은 수준으로 관찰하였다. 단일-세포 엑손 포함 수준을 정량화하기 위해 형광 리포터를 사용하는 또 다른 연구는 하나의 유전자에 대해 매우 가변적인 바이모달 스플라이싱 패턴을 관찰하였다(문헌[Gurskaya, N. G. et al. Analysis of alternative splicing of cassette exons at single-cell level using two fluorescent proteins. Nucleic Acids Research 40, doi:10.1093/nar/gkr1314 (2012)]).

세포들 간의 이소폼 비율의 광범위한 차이를 독립적으로 입증하기 위해, 2개의 유전자들(Irf7 및 Acpp, 도 3c, 도 3d)에서 구성적인 엑손 및 이소폼-특이적인 엑손을 표적으로 하는 RNA-FISH 프로브(문헌[Waks, Z., Klein, A. M. & Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Molecular Systems Biology 7, 1-12, doi:papers2://publication/doi/10.1038/msb.2011.32 (2011)])를 설계하였다. 전체적인 Irf7 수준에서 실질적인 발현 가변성이 개별 세포들 간에 관찰되었으며('구성적인' 프로브에 의해 반영되는 바와 같음, 도 3c, 하부 및 상부 패널), 이는 단일-세포 서열화 결과를 반영한다(또한 하기에 추가적으로 연구됨). 부가적으로는, 각각의 Irf7-발현 세포 내에서, 특이적인 엑손의 포함 또는 배제로의 편향(도 3c, 도 11, 중간 패널, 예를 들어, '높은'으로 표시된 세포 및 '낮은'으로 표시된 세포를 비교함)을 관찰하였다. Acpp에 대한 상호 배타적인 다른 최종 엑손을 검출하기 위해 설계된 2개의 프로브를 사용하여 유사한 결과가 수득되었다(도 3d). 따라서, 이들 연구는, 스플라이싱 이종성이, 집단 연구에서 관찰된 다른 이소폼의 '동시 발현'에 의해 종종 가려지는 현상인 단일 세포들 간의 보편적인 변동 방식이라는 것을 입증한다.

실시예 3. 관찰된 바이모달성의 소스 및 함축

본원에 기술되는 연구는 관찰된 바이모달성의 소스 및 기능적인 함축을 조사하기 위해 설계되었다. (평균적으로) 높게 그러나 바이모달형으로 발현된 유전자들 중에서 면역 반응 유전자의 농화는, 신호전달 회로의 활성화(문헌[Tay, S. et al. Single-cell NF-κB dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature 466, 267-271, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature09145 (2010)]), 프로모터 사건(문헌[Sanchez, A., Garcia, H. G., Jones, D., Phillips, R. & Kondev, J. Effect of Promoter Architecture on the Cell-to-Cell Variability in Gene Expression. PLoS Comput Biol 7, e1001100-e1001100 (2011)]) 또는 반응 시점(문헌[Nachman, I., Regev, A. & Ramanathan, S. Dissecting timing variability in yeast meiosis. Cell 131, 544-556 (2007)])에서, 별개의 기능적인 상태(예를 들어, 세포 아유형) 또는 확률적인 차이를 반영할 수 있다. 우선, 변동 중 적어도 일부는 시험관 내에서 분화된 BMDC에서 별개의 세포 상태를 반영할 수 있는 것으로 가정되었다. 특히, 적응 면역계를 프라이밍하기 위해 BMDC가 항원-포착 세포에서 항원-제시 세포로 전환되는 개발 과정을 통해, BMDC는 별개의 성숙 상태를 획득할 수 있는 것으로 이전에 보고된 바 있다(문헌[Banchereau, J. et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Annual Review of Immunology 18, 767-811 (2000)]). 성숙은 LPS와 같은 병원체-유래의 리간드에 반응하여, 또는 배양물에서 DC의 클러스터를 방해한 결과로서 발생할 수 있으며(문헌[Jiang, A. et al. Disruption of E-Cadherin-Mediated Adhesion Induces a Functionally Distinct Pathway of Dendritic Cell Maturation. Immunity 27, 610-624, doi:papers2://publication/doi/10.1016/j.immuni.2007.08.015 (2007)), 둘 모두는 특이적인 세포 표면 마커의 상향조절을 초래한다. LPS에 대한 반응에서 발생하는 사이토카인의 유도는 BMDC의 훨씬 더 성숙한 상태를 나타낸다.

면역 반응 유전자에서 전사적 변동이 존재하는 경우 얼마나 많은 정도가 별개의 성숙 상태로 인한 것인지 시험하기 위해, 비편향된 주성분 분석(PCA, 도 4a)을, LPS에 대한 집단-와이드 반응에서 적어도 2배로 유도된 632개 유전자에 중점을 둔 단일-세포 발현 프로파일 상에서 수행하였다(문헌[Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012)]). 적어도 2개의 별개의 세포 아군들이, 제1 주성분(PC1, 총 변동의 15%, 도 4a)에 의해 명백하게 구별가능한 데이터세트 내에서 확인되었다. 15개 세포들로 구성된 하나의 그룹은 항바이러스 및 염증 사이토카인(Tnf, Il1a, Il1b 및 Cxcl10) 둘 모두의 세트를 극히 높은 수준(TPM은 1,000 초과임)으로 발현하였으며, 반면, 3개의 세포로 구성된 제2 그룹은 이들 유전자 각각을 비록 검출가능하긴 하더라도 훨씬 더 낮은 수준으로 발현하였다(TPM은 50 미만임). Ccr7, Cd83, Serpinb9 및 Ccl22와 같은 다른 마커들은 반대되는 발현 패턴을 나타내었다(도 4b, 도 12). 이들 2개 그룹들을 구별하는 유전자들 중 다수는 BMDC 성숙의 마커로서 이전에 확인되었던 세포 표면 단백질(예를 들어, Cd83, Cd86 및 Ccr7)을 인코딩한다. 이들 관찰은, 15개 세포 및 3개 세포로 구성된 2개의 아집단들이 DC 성숙의 별개의 단계를 나타내며: Cd83, Cd86 및 Ccr7을 높게 발현하며 사이토카인을 낮게 발현하는 세포는 '반성숙 DC' 또는 클러스터-방해된 DC와 유사함(resemble)을 제시하며(문헌[Jiang, A. et al. Disruption of E-Cadherin-Mediated Adhesion Induces a Functionally Distinct Pathway of Dendritic Cell Maturation. Immunity 27, 610-624, doi:papers2://publication/doi/10.1016/j.immuni.2007.08.015 (2007); Lutz, M. B. Therapeutic potential of semi-mature dendritic cells for tolerance induction. Frontiers in immunology 3, 123, doi:papers2://publication/doi/10.3389/fimmu.2012.00123 (2012)]), 한편, 사이토카인을 높게 발현하는 세포는 '성숙중인 DC 또는 성숙 DC'를 나타냄을 제시한다. 또한, 15개의 성숙중 세포 중 2개(도 12)는 사이토카인 및 표면 마커 둘 모두를 인코딩하는 전사체를 더 높은 수준으로 발현하며, 이는 이들 세포가 가장 성숙한 DC임을 제시한다(도 5).

반성숙 BMDC 및 성숙중 BMDC가 단일 세포에 존재하는 것은, 몇 가지 방식으로 입증되었다. 먼저, 동일한 반성숙/성숙 그룹화를 RNA-FISH로 입증하였으며(도 13), 또한, 처음 2개의 주성분들(도 11, 표 S6) 중 각각 및 상이한 발현 수준을 망라하도록 선택된 96개의 유전자의 시그너처를 사용하여 단일-세포 정량적 역방향-전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR: Fluidigm BioMark HD)으로 입증하였다(문헌[Dalerba, P. et al. Single-cell dissection of transcriptional heterogeneity in human colon tumors. Nature Biotechnology 29, 1120-1127, doi:10.1038/nbt.2038 (2011)]). 둘째로, Cd11c+ BMDC의 서브셋을, 단일 세포 RNA-Seq에서 마커의 mRNA 수준이 성숙 그룹과 반성숙 그룹을 구별하는, 11개의 세포 표면 마커들 각각의 존재 또는 부재를 토대로, 소팅하였다. 그런 다음, qRT-PCR을 소팅된 집단의 각 쌍에서 사용하여, 서열화 데이터에서 2개의 그룹, 예를 들어, Tnf와 Cxcl10(성숙 아집단에서 높게 발현됨) 및 Ccl22와 Serpinb9(반성숙 아집단에서 높게 발현됨)을 구별하는 10개의 마커 유전자에 대한 mRNA 수준을 측정하였다. 사실상, 11개의 세포 표면 마커들 중 8개에 의해 소팅된 집단 쌍에 대해, 마커 발현 수준은 예상한 차이로 검출되었으며, 이는, 서열화-기재의 분류를 확인시켜 주었다(도 15). 이들 결과는 추가로, 단일-세포 RNA-Seq의 감도를 입증하며, 이것이 동일한 세포 유형에서조차, 밀접하게 관련되어 있는 별개의 성숙 상태들을 얼마나 효과적으로 구별할 수 있는지 언급한다.

실시예 4. 동일한 세포 상태의 세포들에서 조절성 회로에서 변동의 역할

별개의 성숙 상태는 관찰된 이종성 및 바이모달성의 작은 부분만을 설명하기 때문에, '동일한' 세포 상태(예를 들어, 15개의 성숙중인 세포)에 있는 세포들 중에서 조절성 회로의 변동의 역할을 그 다음으로 조사하였다. 이러한 가변적인 회로가 존재하는 경우, 전사 인자의 mRNA 수준과 이의 표적의 발현 사이에서 단일 세포에 대한 공동-변동(co-variation)은 잠재적인 조절적 상호작용을 나타낼 것이며, 더욱이, 조절자의 발현의 변동이 이의 표적의 가변성의 근간을 이룸을 제시할 것으로 추론되었다. 이러한 상관적 접근법은 상이한 조건들에서 측정되는 집단-수준 전사 프로파일로부터 조절적 연결을 성공적으로 확인하였다(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009); Nachman, I., Regev, A. & Friedman, N. in Bioinformatics Vol. 20 i248 (2004)]). 여기서, 동일한 조건에서 복수의 단일 세포에 이를 적용하도록 연구를 설계하였다.

이를 위해, 모든 단일 세포들에 대한 유도된 유전자의 모든 쌍들 간의 발현 프로파일에서 상관도를 계산하고, 세포에 대해 상관적인 방식으로 다양한 137개의 유전자의 클러스터를 확인하였다(도 4b). 클러스터의 유전자는 항바이러스 반응의 일원에 대해 매우 농화되었으며(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009)])(137개 유전자 중 60개, p는 2.5x10^-3임, 초기하학적 검정), 항바이러스 반응의 2개의 공지된 마스터 조절자인 Stat2 및 Irf7을 인코딩하는 전사체를 포함하였다. 클러스터를 또한, LPS로 자극한 DC에서 ChIP-Seq에 의해 이전에 결정된 바와 같이, Stat2 표적에 대해 농화시켰다(문헌[Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012))(73개/137개 유전자, p는 4.5x10^-5임, 초기하학적 검정). 이 '항바이러스 클러스터'의 유전자는 PCA의 제2 주성분(PC2, 변동의 8%, 도 4a, 도 4b)에 의해 강하게 구별되었다. 이들 항바이러스 유전자들 간의 상관도를 단일-세포 qRT-PCR(상기와 같이 동일한 96개 유전자 시그너처) 및 RNA-FISH(도 4c, 도 4d) 둘 모두를 이용하여 입증하였다. 주목할만하게는, 클러스터의 유전자의 대부분(100개/137개)은 세포에 대해 바이모달 발현을 나타내었으며(도 2c, 하부), 집단 수준에서 강하게 발현되었다(13개 유전자의 TPM은 250 초과임; 53개 유전자의 TPM은 50 초과임).

항바이러스 회로의 변동이 반응 동안에 어떻게 변할 수 있는지 추가로 특징화하기 위해, 단일-세포 qPCR 발현 프로파일링을 비자극된 BMDC에서와, LPS-자극 후 2시간, 4시간 및 6시간째에, 13개 유전자(9개의 항바이러스 클러스터 유전자, 2개의 균일하게 유도된 유전자, 및 2개의 하우스키핑 대조군)의 시그너처에 대해 수행하였다(도 16). 항바이러스 클러스터 유전자를 발현하는 세포의 %는 시간-의존적인 방식으로 증가하였으며(도 16), 항바이러스 마스터 조절자에 대해 높은 mRNA 수준을 나타내는 세포 분획의 변화에 의해 반영되었다. 대조적으로, 균일하게 유도된 유전자(Cxcl10, Clec4e)는 모든 세포들에서 2시간 후에 강력하게 유도되었다. 중요하게는, 다운스트림 표적 유전자와 마스터 조절자를 인코딩하는 전사체의 발현 수준 간의 정량적 상관도는 4시간째 시점과 6시간째 시점 둘 모두에서 존재하였다.

실시예 5. Stat2 및 Irf7의 수준 차이

이 항바이러스 반응 회로의 사용은 동일한 성숙도 상태의 BMDC들 간에 매우 가변적임을 관찰하여, 클러스터의 유전자의 발현에서 바이모달 변동은 Stat2 및 Irf7의 수준 차이와 관계가 있을 수 있음을 가정하였다. 이 경우, BMDC에서 이들 마스터 조절자를 동요시키면, 이들의 표적에서 발현 및 변동을 감소시킬 것으로 예상될 것이다. 이 가정을 시험하기 위해, 시그너처 유전자의 발현을 Irf7 녹아웃 (Irf7 -/-) 마우스 유래의 LPS-자극된 세포에서 단일-세포 qRT-PCR을 이용하여 측정하였다. 예상한 바와 같이, 이 동요는 가변적인 항바이러스 클러스터에서 대부분의 시그너처 유전자의 전사를 제거한 한편, 항바이러스 반응의 구성적인 요소는 상대적으로 영향을 받지 않은 채로 두었다(도 4e). 그러나, Stat2 발현 및 가변성 수준은 Irf7 녹아웃에 의해 영향을 받지 않았으며, 이는, Stat2가 반응 동안에 Irf7의 업스트림에서 또는 Irf7과 동시에 작용할 수 있음을 내포한다(문헌[Ning, S., Huye, L. E. & Pagano, J. S. Regulation of the Transcriptional Activity of the IRF7 Promoter by a Pathway Independent of Interferon Signaling. Journal of Biological Chemistry 280, 12262-12270 (2005); Ousman, S. S., Wang, J. & Campbell, I. L. Differential regulation of interferon regulatory factor (IRF)-7 and IRF-9 gene expression in the central nervous system during viral infection. Journal of Virology 79, 7514-7527 (2005)]). Stat2 및 Irf7 둘 모두는 인터페론-신호전달 경로의 표적이기 때문에, 인터페론 피드백이 Stat2, Irf7 및 클러스터 유전자의 발현 및 변동에 미치는 효과를 그 다음으로 시험하였다. 사실상, 인터페론 수용체 녹아웃(Ifnr-/-) 마우스 유래의 BMDC(문헌[Darnell, J. E., Jr., Kerr, I. M. & Stark, G. R. Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science (New York, N.Y.) 264, 1415-1421 (1994); Gough, D. J. et al. Functional crosstalk between type I and II interferon through the regulated expression of STAT1. PLoS biology 8, e1000361-e1000361 (2010)])를 자극한 경우, Stat2 및 Irf7 둘 모두, 뿐만 아니라 다른 클러스터 유전자 모두에 대한 발현이 상당히 감소된 것을 관찰하였다(도 4f).

Stat2 수준의 보다 초기의 변동은 4시간째에 Stat2 전사 자체를 비롯하여 항바이러스 클러스터에서 광범위한 변동의 근간을 이루는 한 가지 가능성(자가조절을 통해(문헌[Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012)]))이 있다. 예를 들어, 면역 반응 유전자(예를 들어, Ifit1) 대부분은 비자극된 세포에서 발현되지 않은 한편, Stat2 전사체는 LPS 자극 전에도 가변적으로 발현된다(도 16). 자극 전에 Stat2의 수준이 높은 세포는 4시간째 시점에서 항바이러스 클러스터를 발현하는 경향이 가장 클 수 있다.

이러한 연결점을 추가로 조사하기 위해, 세포를 Ifit1, Stat1 및 Stat2 mRNA 및 Stat1, pStat1 및 Stat2 단백질에 대해 공동염색하였으며(실시예 1, 도 17 및 도 18), 이들 mRNA/단백질 수준 및 단백질 위치화를 LPS로 0시간, 2시간 및 4시간 동안 자극한 BMDC에서 정량화하였다. 전체적인 단백질 수준이 시간 경과 동안 줄곧 모든 경우들에서 증가한 한편, 실질적인 이종성은 Stat1, pStat1 및 Stat2의 유도에서 확인되었다(도 17). 2시간째에, 모든 3개 단백질들은 이들의 발현 및 핵 전좌 둘 모두에서 이종성을 나타내었다. 4시간까지, 단백질 수준은 보다 균일해졌으며, 핵 전좌는 덜 우세하였다. Ifit1 mRNA 분포는 매우 유사한 패턴을 나타내었으며, 초기 시점에서 더욱 바이모달 발현을 나타내며, 4시간까지 더욱 균일해졌다. 그러나, 개별 세포 내에서 Stat 단백질 및 Ifit1 mRNA 수준은 초기에 상관적이지 않았으며(r ² 은 0.00 초과이며 0.12 미만임), 4시간째에 단지 매우 약하게 상관적이었다(r ² 은 0.00 초과이며 0.28 미만임). 이는, 표적의 mRNA 축적이 전사 조절자의 통합된 시공간적인 활성을 반영하며, 이는 단일 일시적인 스냅샷에 의해 잘 나타나지 않을 수 있다는 사실로 인한 것일 수 있다(문헌[Cai, L., Dalal, C. K. & Elowitz, M. B. Frequency-modulated nuclear localization bursts coordinate gene regulation. Nature 455, 485-490, doi:nature07292 [pii]10.1038/nature07292 (2008)]). 따라서, Ifit1 mRNA 수준이 높은 세포에서, Stat 단백질은 이미 핵을 떠났을 수 있다. 이러한 가정을 입증하는 것은, 단백질 및 복수의 전사체를 동시에 실시간으로 추적할 것을 필요로 하며(문헌[Cohen, A. A. et al. Dynamic Proteomics of Individual Cancer Cells in Response to a Drug. Science 322, 1511-1516, doi:10.1126/science.1160165 (2008)]), 이 과정은 일차 면역 세포 내의 내인성 형광 태그(문헌[Shalek, A. K. et al. Nanowire-Mediated Delivery Enables Functional Interrogation of Primary Immune Cells: Application to the Analysis of Chronic Lymphocytic Leukemia. Nano Lett 12, 6498-6504, doi:papers2://publication/doi/10.1021/nl3042917 (2012)])를 Stat 단백질에 특이적으로 첨가하는 것의 어려움에 의해 상당히 복잡해진다(문헌[Meyer, T., Begitt, A. & Vinkemeier, U. Green fluorescent protein-tagging reduces the nucleocytoplasmic shuttling specifically of unphosphorylated STAT1. GFP-tagging of STAT1 274, 815-826, doi:papers2://publication/doi/10.1111/j.1742-4658.2006.05626.x (2007)]). 역으로, 4시간째에도, Ifit1 mRNA 수준은 Stat1 및 Stat2의 단백질 수준보다 Stat1 및 Stat2 mRNA와 보다 양호하게 상관적이었다(도 18). Stat 단백질은 이들 자신의 유전자 발현을 자가조절하기 때문에(문헌[Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012)]), 이는 보다 초기의 조절적 사건의 가정과 일치한다.

실시예 6. 고 처리량의 미세유체-가능해진 단일 세포 RNA- SEQ

복잡한 진핵생물에서 10¹²개 세포를 표준적으로 조직 및 기관으로 그룹화하고, 나아가, 분자, 구조 및 기능을 공유하는 유형들로 세분한다. 그러나, 최근, 기능적으로 '동일한' 세포조차도 이들의 구성 분자는 크게 상이할 수 있으며(문헌[Taniguchi, Y. et al. Quantifying E. coli Proteome and Transcriptome with Single-Molecule Sensitivity in Single Cells. Science 329, 533-538, doi:10.1126/science.1188308 (2010); Tay, S. et al. Single-cell NF-?B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature 466, 267-271, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature09145 (2010); Raj, A. & Van Oudenaarden, A. Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression. Annual Review of Biophysics 38, 255-270, doi:10.1146/annurev.biophys.37.032807.125928 (2009); Cohen, A. A. et al. Dynamic Proteomics of Individual Cancer Cells in Response to a Drug. Science 322, 1511-1516, doi:10.1126/science.1160165 (2008); Altschuler, S. J. & Wu, L. F. Cellular Heterogeneity: Do Differences Make a Difference? Cell 141, 559-563, doi:10.1016/j.cell.2010.04.033 (2010); Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. & Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 17807-17812, doi:10.1073/pnas.0608512103 (2006); Paszek, P. et al. Population robustness arising from cellular heterogeneity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 11644-11649, doi:10.1073/pnas.0913798107 (2010); Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F. & Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 19306-19311, doi:10.1073/pnas.0807038105 (2008); Niepel, M., Spencer, S. L. & Sorger, P. K. Non-genetic cell-to-cell variability and the consequences for pharmacology. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 556-561, doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015 (2009); Sharma, S. V. et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell 141, 69-80, doi:10.1016/j.cell.2010.02.027 (2010); Gascoigne, K. E. & Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer cell 14, 111-122, doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002 (2008)]), 이러한 이종성은 외부 자극에 대해 실질적으로 상이한 반응을 초래할 수 있음이 점점 명확해지고 있다(문헌[Cohen, A. A. et al. Dynamic Proteomics of Individual Cancer Cells in Response to a Drug. Science 322, 1511-1516, doi:10.1126/science.1160165 (2008); Niepel, M., Spencer, S. L. & Sorger, P. K. Non-genetic cell-to-cell variability and the consequences for pharmacology. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 556-561, doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015 (2009); Sharma, S. V. et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell 141, 69-80, doi:10.1016/j.cell.2010.02.027 (2010); Gascoigne, K. E. & Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer cell 14, 111-122, doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002 (2008); Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M. & Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature 459, 428-432, doi:10.1038/nature08012 (2009)]). 이러한 가변성은 치료적 개입의 경우 불리한 것으로 증명될 수 있는 한편(문헌[Cohen, A. A. et al. Dynamic Proteomics of Individual Cancer Cells in Response to a Drug. Science 322, 1511-1516, doi:10.1126/science.1160165 (2008); Altschuler, S. J. & Wu, L. F. Cellular Heterogeneity: Do Differences Make a Difference? Cell 141, 559-563, doi:10.1016/j.cell.2010.04.033 (2010); Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M. & Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature 459, 428-432, doi:10.1038/nature08012 (2009); Spencer, S. L. & Sorger, P. K. Measuring and Modeling Apoptosis in Single Cells. Cell 144, 926-939, doi:10.1016/j.cell.2011.03.002 (2011)]), 잠재적인 집단-수준의 반응의 다양성을 증가시킴으로써 중요한 기능적인 역할을 하는 경향이 있다(문헌[Feinerman, O. et al. Single-cell quantification of IL-2 response by effector and regulatory T cells reveals critical plasticity in immune response. Molecular Systems Biology 6, 1-16, doi:papers2://publication/doi/10.1038/msb.2010.90 (2010); Veening, J.-W., Smits, W. K. & Kuipers, O. P. Bistability, Epigenetics, and Bet-Hedging in Bacteria. Annual Review of Microbiology 62, 193-210, doi:papers2://publication/doi/10.1146/ annurev.micro.62.081307.163002 (2008); Locke, J. C. & Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature reviews. Microbiology 7, 383-392, doi:10.1038/nrmicro2056 (2009); Thattai, M. & van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics 167, 523 (2004); Beaumont, H. J., Gallie, J., Kost, C., Ferguson, G. C. & Rainey, P. B. Experimental evolution of bet hedging. Nature 462, 90-93, doi:10.1038/nature08504 (2009); Chalancon, G. et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends in genetics : TIG 28, 221-232, doi:10.1016/j.tig.2012.01.006 (2012)]).

면역 시스템은 이의 잘-구축된 예이며: 면역 세포는 이들의 유형 및 기능 면에서 주목할 만하게 이질적이지만(문헌[Bendall, S. C. & Nolan, G. P. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science (New York, NY) 332, 677-678, doi:10.1126/science.1206351 (2011); Hashimoto, D., Miller, J. & Merad, M. Dendritic Cell and Macrophage Heterogeneity In Vivo. Immunity 35, 323-335, doi:papers2://publication/doi/10.1016/j.immuni.2011.09.007 (2011)]), 이들은 총괄하여 병원체에 대해 적절한 반응을 생성해야 한다. 집단-수준의 거동을 인코딩할 때뿐만 아니라 이들이 실패하여 소모되는 경우에도 사용되는 전략을 이해하는 것은 실질적인 임상적 관련성을 가진 근본적인 생물학적 문제점이다. 최근의 분자적 연구는, 통상적으로 기술적 노이즈 및 생물학적 노이즈에 의해 가려지는 정보제공의 기전을 밝히기 위한 단일 세포 접근법에 대한 잠재성을, 충분한 검체화와 더불어 입증하였다(문헌[Cohen, A. A. et al. Dynamic Proteomics of Individual Cancer Cells in Response to a Drug. Science 322, 1511-1516, doi:10.1126/science.1160165 (2008); Altschuler, S. J. & Wu, L. F. Cellular Heterogeneity: Do Differences Make a Difference? Cell 141, 559-563, doi:10.1016/j.cell.2010.04.033 (2010); Niepel, M., Spencer, S. L. & Sorger, P. K. Non-genetic cell-to-cell variability and the consequences for pharmacology. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 556-561, doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015 (2009); Sharma, S. V. et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell 141, 69-80, doi:10.1016/j.cell.2010.02.027 (2010); Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M. & Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature 459, 428-432, doi:10.1038/nature08012 (2009); Feinerman, O. et al. Single-cell quantification of IL-2 response by effector and regulatory T cells reveals critical plasticity in immune response. Molecular Systems Biology 6, 1-16, doi:papers2://publication/doi/ 10.1038/msb.2010.90 (2010); Bendall, S. C. & Nolan, G. P. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science (New York, NY) 332, 677-678, doi:10.1126/science.1206351 (2011)]). 그렇지만, 이들 연구의 대부분은 (필요에 의해) 입수가능한 시약 및 역할이 알려져 있는 잘 특징화된 마커에 중점을 두었으며, 면역 반응의 결정인자의 비편향된 발견을 방해한다.

신흥 단일 세포 게놈학 방법은 현재, 단일 세포의 거동을 전례 없이 상세하게 프로파일링하기 위해 서열화-기재의 접근법을 이용하는 가능성을 열어준다(문헌[Islam, S. et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research, doi:papers2://publication/doi/ 10.1101/gr.110882.110 (2011); Tang, F. et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols 5, 516-535, doi:10.1038/nprot.2009.236 (2010); Tang, F. et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods 6, 377-382, doi:10.1038/nmeth.1315 (2009); Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012); Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N. & Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports, doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003]). 원칙적으로, 게놈-와이드 단일 세포 접근법은 처음부터, 신규 세포 분류화 도식, 전이 상태, 인식되지 않은 생물학적 구별, 분자 회로 등을 결정하는 데 일조할 수 있었다. 이러한 잠재성을 충족하려면, (극미량의 입력 물질로 인한 기술학적 및 RNA 전사의 버스트(burst)로 인한 생물학적으로(문헌[Taniguchi, Y. et al. Quantifying E. coli Proteome and Transcriptome with Single-Molecule Sensitivity in Single Cells. Science 329, 533-538, doi:10.1126/science.1188308 (2010); Cai, L., Dalal, C. K. & Elowitz, M. B. Frequency-modulated nuclear localization bursts coordinate gene regulation. Nature 455, 485-490, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature07292 (2008)])), 단일-세포 측정에 본래 존재하는 높은 수준의 노이즈를 해결하는 데 필요한 척도를 달성하기 위한 신규의 실험적인 전략을 개발할 필요가 있다(문헌[Chalancon, G. et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends in genetics : TIG 28, 221-232, doi:10.1016/j.tig.2012.01.006 (2012); Newman, J. R. S. et al. in Nature Vol. 441 840-846 (2006); Munsky, B., Neuert, G. & van Oudenaarden, A. Using Gene Expression Noise to Understand Gene Regulation. Science (New York, NY) 336, 183-187, doi:10.1126/science.1216379 (2012); Balazsi, G., Van Oudenaarden, A. & Collins, J. J. Cellular Decision Making and Biological Noise: From Microbes to Mammals. Cell 144, 910-925, doi:10.1016/j.cell.2011.01.030 (2011)]).

통합된 미세유체 회로는 이러한 장애물을 극복하기 위한 세련된 해결책을 제시한다. 사실상, 세포 포착, 이미지화, 용해, 역방향 전사 및 증폭(PCR)을 비롯하여, 미세유체 디바이스 내에서 단일 세포 전체 전사체(WTA) 증폭 프로토콜에 연루된 각각의 단계를 수행하기 위한 방법론적인 전례가 존재한다(문헌[Taniguchi, Y. et al. Quantifying E. coli Proteome and Transcriptome with Single-Molecule Sensitivity in Single Cells. Science 329, 533-538, doi:10.1126/science.1188308 (2010); Tay, S. et al. Single-cell NF-κB dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature 466, 267-271, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature09145 (2010); Hong, J. W., Studer, V., Hang, G., Anderson, W. F. & Quake, S. R. A nanoliter-scale nucleic acid processor with parallel architecture. Nature Publishing Group 22, 435-439, doi:10.1038/nbt951 (2004); Huang, B. et al. Counting Low-Copy Number Proteins in a Single Cell. Science (New York, NY) 315, 81-84, doi:10.1126/science.1133992 (2007); Marcus, J., Anderson, W. & Quake, S. Microfluidic single-cell mRNA isolation and analysis. Analytical Chemistry 78, 3084-3089 (2006); Melin, J. & Quake, S. R. Microfluidic Large-Scale Integration: The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 36, 213-231, doi:10.1146/annurev.biophys.36.040306.132646 (2007); Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009)]). 이 연구에서, 상업적으로 입수가능한 미세유체 시스템(C1 단일 세포 자동 제조 시스템, Fluidigm)을 단일-세포 SMART-seq mRNA 전사체 라이브러리를 제조하도록 개조하였다. 시스템은 개별 세포를 96개 이하로 단리하고, 각각의 단리된 세포에 다단계 분자 생물학 프로토콜을 적용한 다음, 반응 생성물을 칩 캐리어 상의 SBS-포맷 웰에 출력한다. SMART-Seq(문헌[Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012)])는 각각의 웰로부터 생성된 이중가닥 cDNA를 Illumina 서열화 라이브러리로 변환한다.

수천 개 골수 수지상 세포에 대한 단일 세포 RNA- Seq 프로파일링: Fluidigm C1 단일-세포 자동 제조 시스템을 이용하고, 고-처리량 cDNA 라이브러리 구축 프로토콜과 조합하여, 총 2000개 내지 3000개의 단일 골수-유래의 수지상 세포(BMDC)로부터 RNA-Seq 준비 라이브러리를 생성하였다(문헌[Toriello, N. et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 20173 (2008); Chevrier, N. et al. Systematic Discovery of TLR Signaling Components Delineates Viral-Sensing Circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011); Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012)). BMDC는, 유사분열 후에 집단 수준에서 일차적이며 잘-특징화되기 때문에 단일 세포 반응을 연구하기 위한 양호한 모델 시스템을 나타내며, 강한 병원체성 자극원의 첨가를 통해 동기화될 수 있다(문헌[oriello, N. et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 20173 (2008)]). 18개의 '동종의' 자극받은 단일 BMDC들 사이의 반응 가변성을 검사하는 이전의 실시예는 노이즈의 발생 및 이의 분자적 결정인자를 검사할 수 없게 하였다. 더욱이, 하나의 자극원에 대해 중점을 두는 것은, 상이한 자극원들에 대한 회로 활성화 및 이종성의 프로파일링 및 대조화(contrasting)를 방지하였다.

본원에 기술되는 연구는 이들 의문점을 해결하기 위해 설계하였다. 먼저, 게놈-와이드 mRNA 발현 반응을, 3개의 별개의 병원체성 자극원(문헌[Chevrier, N. et al. Systematic Discovery of TLR Signaling Components Delineates Viral-Sensing Circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011)])(리포다당류(LPS; 그람-음성 박테리아 및 TLR4 작용제의 성분), 폴리이노신산:폴리시티딜산(폴리(I:C), PIC; 바이러스-유사 이중가닥 RNA 및 TLR3 작용제), 및 PAM3CSK(PAM; 박테리아 지질펩타이드 및 TLR2 작용제의 합성 모방체))을 사용하여 BMDC Toll-유사 수용체(TLR) 신호전달을 활성화시킨 후 5개의 시점(0시간, 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간)에서 프로파일링하였다. 각 조건에 대해, 96개 이하의 세포(평균 85 ± 10%)를 포착하는 단일 C1 IFC를 진행시켰고, 라이브러리를 또한, 10,000개 세포(집단 대조군)로부터 생성하였다. 모두에서, LPS, PIC 및 PAM에 각각 상응하는 311개 세포, 212개 세포 및 146개 세포뿐만 아니라 약 4000개의 부가적인 세포(하기 기술됨)를 프로파일링하였다.

이들 검체 각각을 10⁶개 판독 쌍의 평균 깊이로 서열화하고, 발현 추정값(전사체/10⁶; TPM)을 모든 UCSC-주석화된 유전자에 대해 계산하였다(문헌[Li, B. & Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics 12, 323-323 (2011)]). 수득된 라이브러리는 마찬가지로, 공개된 SMART 데이터와 유사하게 높은 품질을 가졌다(문헌[Ramskold, D. et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nature Biotechnology 30, 777-782, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nbt.2282 (2012); Shalek, A. K. et al. Nanowire-mediated delivery enables functional interrogation of primary immune cells: application to the analysis of chronic lymphocytic leukemia. Nano Lett. 12(12):6498-504. doi: 10.1021/nl3042917 (2012)]). 전사체 맵핑 비율 중앙값은 약 50% 내지 60%인 한편, 게놈 맵핑 비율 중앙값은 약 70% 내지 80%였다. 상당한 비율의 판독(약 10%)은 트리밍될 수 없는 어댑터 서열의 오염으로 인해 맵핑에 실패하였으며, 이는, cDNA 라이브러리가 전사체 맵핑 비율에서 보이는 것보다 훨씬 더 높은 품질을 가지고 있음을 제시한다. 한편, 3' 편향 수준은 이전에 관찰되었던 것보다 더 높았으나, Nextera 데이터(Illumina 웹사이트에서 입수가능함)로부터 이전에 공개된 것들과 매우 유사하였다.

발현-방향의 단일 세포 측정은, 응집되고 유사한 프로토콜을 사용하여 생성된 세포 집단으로부터의 데이터와 비교된 경우, 밀접하게 일치하였다. 인 실리코(in silico ) 단일-세포 평균 RNA-Seq 데이터와 집단 측정 간의 상관도는 높았다(R은 약 0.9임, 도 24a). 이는, 동일한 벌크-집단 검체의 복제물에 대한 2개의 상이한 라이브러리 구축 방법들 간의 비교에서 관찰되는 상관도를 능가하는 향상을 나타낸다(문헌[Levin, J. Z. et al. Comprehensive comparative analysis of strand-specific RNA sequencing methods. Nature Methods 7, 709-715 (2010)]). 이 상관도는 발현 스펙트럼에 걸쳐서 강력하였다. 상관도는, 일단 약 30개 세포가 다른 인 실리코 단일-세포 평균에 포함되었다면, 정체(plateau)되는 경향이 있었다.

유전자를 집단 수준 검체 내에서 이들 3개 자극원에 대한 이들의 차별적인 일시적인 반응을 토대로 클러스터링하였다(도 24b). 집단-기재의 측정은 이전에 진행한 마이크로어레이-기재의 실험과 밀접하게 일치하고 개선되었다(하기 기술됨)(문헌[Chevrier, N. et al. Systematic Discovery of TLR Signaling Components Delineates Viral-Sensing Circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011)]). 특히, 분석은, NF-kB의 표적에 대해 매우 농화된 몇몇의 이전에 발견된 클러스터(염증 프로그램, 클러스터 VI, VII), 뿐만 아니라 인터페론 반응성 유전자에 대해 매우 농화된 별개의 클러스터(클러스터 I,II)를 반복하였다(도 24b). 광범위하게는, 항바이러스 유전자는 전형적으로 집단 및 단일 세포 수준 둘 모두에서 "후기-유도"되었으며, 대부분의 염증 반응 유전자는 초기(1시간 내지 2시간째)에 가파르게 정점에 도달하였다. 여전히, 이후에 정점에 도달한 후기-유도성 염증 유전자(클러스터 VI) 세트가 존재하였다.

실시예 7. 면역 반응 동안 세포들 간의 변동

단일 세포 데이터로부터 세포 회로의 개선: 집단-수준 경로의 이 광범위한 정의로부터, 보다 높은 해상도의 구조를, 단일 세포에서의 유전자들의 발현 값들을 토대로 유전자들을 서브-클러스터링함으로써 조사하였다(검정색 선, 도 24b). 클러스터 분석과 더불어, 비편향된 주성분 분석(PCA)을 또한, 시간경과 데이터세트에서 약 800개의 단일 세포 모두에서 수행하였다.

고 해상도의 데이터는, 집단 수준에서는 구분될 수 없었던 정제된 회로 세트에 유전자가 할당되게 할 수 있는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 모든 항바이러스 유전자들은 LPS 및 PIC에 노출된 후 후기의 시점에서 집단-수준의 유도를 나타낸 한편, 102개 유전자의 클러스터(클러스터 1D)는 이들의 전반적인 유도 수준을 토대로 할 뿐만 아니라, 단일 세포 서브셋 내에서 일관성있는(coherent) 발현을 토대로 구별되는 것으로 관찰되었다(부록 도면). 이 모듈의 유전자는 항바이러스 및 인터페론 반응 유전자에 대한 급격한 농화를 나타내는 한편, 클러스터 1A 내지 클러스터 1C의 유전자는 유사한 기능적 패턴을 나타내지 않는다. 클러스터 1D의 유전자는 또한, PCA 분석에서 제1 주성분(PC1)에의 기여도에 의해 강하게 구별된다. 따라서, 클러스터 1D는 BMDC의 "코어" 항바이러스 반응을 나타내는 것으로 칭해졌다. 주목할만하게는, 코어 항바이러스 유전자와 비-코어 항바이러스 유전자 간의 분리는 집단 수준 측정으로부터 쉽게 식별되지 않으며, 이전의 RNA-Seq(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009)]) 또는 마이크로어레이(문헌[Chevrier, N. et al. Systematic Discovery of TLR Signaling Components Delineates Viral-Sensing Circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011)]) 실험 중 어느 곳에서도 관찰되지 않았다.

마찬가지로, 제2 주성분(PC2)의 높은 투사 스코어에 의해 광범위하게 표시되는 염증 프로그램은 복수의 별개의 회로로 분리될 수 있는 것으로 관찰되었다. 다수의 표준적인 염증 마커(즉, TNF, IL1A, CXCL2)는 LPS에 대해 "샤프 정점" 반응을 나타낸다(문헌[Takeuchi, O. & Akira, S. Pattern Recognition Receptors and Inflammation. Cell 140, 805-820, doi:10.1016/j.cell.2010.01.022 (2010)], 클러스터 3c)(이들 유전자는 반응에서 초기에 가파르게 유도되며 후기의 시점에서 하향조절됨). 대조적으로, LPS와 PAM 간에 공유되는 다른 클러스터(클러스터 3b, 3d)는 시간경과를 통해 내내 증가된 수준의 유도를 나타낸다. 이들 2개의 클러스터는 집단 수준 측정과 매우 유사한 것으로 보이지만, 클러스터 3b 유전자는 제3 주성분(PC3)에 대한 강한 투사 스코어에 의해 표시되며, 수지상 세포의 성숙에 대한 마커, 특히 세포 표면 마커, 수용체 및 수송체(CD83, CD86, CCR7), 및 T 세포와의 적절한 소통 및 T 세포의 활성화에 필수적인 사이토카인(CCL17 및 CCL22)에 대해 매우 농화된다. 이들 유전자는 LPS에 대한 반응에서 높게 존재하고 유도되지만, 세포의 별개의 서브셋에서만 그러하다.

개선된 단일 세포 회로는 면역 반응에서 주요한 역할을 할 수 있는 신규 분자적 조절자의 확인을 가능하게 한다. 예를 들어, "성숙" 클러스터(PC3에 대한 높은 투사 스코어에 의해 표시됨)는 BMDC 성숙의 많은 잘 알려진 마커들을 포함하지만, 시그너처 중 유전자의 나머지들은 전사 인자, G 단백질 연결 수용체, lincRNA 및 막관통 단백질의 부유한 목록(rich list)을 상쇄하며, 공지된 성숙 마커와의 이들의 강한 단일-세포 상관도는 이들이 적응 면역계를 활성화시키는 역할을 한다는 것을 내포한다. 이들 유전자 중 다수는 BMDC 성숙에서, 또는 심지어 면역 반응의 조절에서조차, 특징화된 역할을 가지지 않는다.

전사 인자 IRF8 및 막관통 단백질 TMEM39A와 같은 다른 것들은, 미공지된 분자적 기전을 통해 자가면역 질환과 상당히 연관되어 있다. 마찬가지로, "코어" 항바이러스 모듈의 개선은, 핵-도트(nuclear-dot) 연관 단백질(예를 들어, Sp100 및 Sp140), 염색질 조절자(예를 들어, Phf11), 추정상 전사 조절자(예를 들어, Znfx1) 및 유비퀴틴 리가제(예를 들어, Dtx3l)를 비롯하여 이전에는 특징화되지 않은 조절자의 잠재적인 역할을 강조한다.

일시적인 이종성 및 발달적인 이종성은 연속 스펙트럼에 의해 정의된다: 주성분 분석은, 다수의 별개의 서브그룹으로 분리하는 것이 아니라, 수지상 세포는 세포의 변동의 연속적인 장면(landscape)에 대한 개별 지점을 나타냄을 가리킨다. 예를 들어, 제1 주성분은 이들의 자극 시점을 토대로 단일 세포를 광범위하게 분리하는 한편, 임의의 주어진 데이터세트 내의 세포에 대한 PC1의 로딩 간에는 상당한 산포(spread)가 존재한다(도 24d).

이는 특히, 세포가 자극후 4시간째의 코어 항바이러스 반응을 동기화하기 시작함에 따라 후기의 시점과 명백하게 구별되는 반응 초기(1시간 및 2시간)에 참(true)이 된다. 그러나, 항바이러스 반응과는 대조적으로, 단일 세포들 간의 성숙도의 다양성은 LPS 시간 경과의 기간 동안 꾸준하게 증가하는 것으로 보인다. 확인되는 회로는 서브셋 세포에서 유도될 뿐이지만, 유도의 매우 가변적인 수준은 중간 상태의 연속 범위를 유발한다(도 24f). 이들 연구는, 3개의 자극 시간경과 각각에서, 또는 각각의 개별 시점에서도, 별개의 PCA 분석을 수행한 후 명확하게 정의되는, 개별 아집단을 확인할 수 없었으며, 이는, 시스템에서 관찰되는 단일 세포 노이즈의 연속적인 특성을 강조한다. 이는, 면역 세포의 동종의, 유사분열후의 동기화된 집단으로서 사전에(upfront) 선별된 실험 시스템의 반영인 듯 하다.

단일 세포 데이터의 매개변수화: 18개의 개별 BMDC 전사체에 대한 이전의 분석에서, 광범위한 바이모달성은 단일 세포들 간의 개별 유전자 발현 수준에서 관찰되었으며, 대부분의 전사체들은 RNA-Seq 또는 RNA-FISH에 의해 모든 세포에서 검출되지 않았음을 관찰한다. 그러나, 본 실험의 척도는 단일 조건으로부터 단일 세포 데이터를 모델링하고 매개변수화하기 시작하기에 충분한 척도를 제공한다. 따라서, 본원에서 연구들은 일련의 네스티드(nested) 통계학적 모델을 각각의 단일 세포 분포에 적합화하려고 시도하였으며, 처음에는 LPS 반응 유전자에 대한 효과에 중점을 두었다. 소 비율(약 5%)의 전사체는 유니모달 log-정규 분포(평균(뮤) 및 표준 편차(시그마)에 의해 매개변수화함)에 의해 잘 기술되었지만, 나머지는, 전사체를 무시못할 만한 수준(ln(TPM)은 1 초과임)으로 발현하는 세포의 %를 정의한 제3 매개변수(알파)의 도입에 의해 통계학적으로(공산비 검정(likelihood ratio test), P는 0.01 미만임) 이득을 얻었다. 바이모달 분포로서 단일 세포 데이터의 이러한 명확한 매개변수화를 통해, 본 발명자들은 단일 세포 이종성을 2개 성분으로 나눌 수 있으며: 하나의 가변성 수준은 전사체를 발현하는 세포의 %에 의해 표시되며(본원에서 지칭되는 바와 같이 알파로서 매개변수화됨, 이는 디지털 노이즈임), 제2 층은 발현 세포들 중에서 RNA 수준의 산포를 반영한다(본원에서 지칭되는 바와 같이 시그마로서 매개변수화됨, 이는 아날로그 노이즈임).

대부분의(약 80% 내지 90%, 적합도 검정, SM) 단일 세포 분포는 이 3-매개변수(명확하게는 바이모달) 분포에 의해 잘 기술되었으며, 신규 매개변수화가, 단일 세포 노이즈의 변화를 시스템적으로 분석하는 데 광범위하게 적용될 수 있음을 내포한다. 흥미롭게는, 하나의 LPS 시점에서 3-매개변수 분포에 적합화되지 않은 대부분의(70% 내지 80%) 전사체는 정규 분포의 혼합 모델에 의해 잘 기술되었으며, 또 다른 시점에서 적합도 검정을 또한 실패하였으며, 이는, 복수개가 존재하여 이들 유전자에 대한 "버스팅 상태(bursting state)"를 조절하였음을 제시한다.

정량적 염색질 수준은 단일 세포 노이즈 매개변수와 일치한다: mRNA 수준과 염색질 상태 간의 강한 상관도는 잘 기술되어 있지만(예를 들어, 문헌[Ram, O. et al. Combinatorial Patterning of Chromatin Regulators Uncovered by Genome-wide Location Analysis in Human Cells. Cell 147, 1628-1639 (2011); Garber, M. et al. A High-Throughput Chromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals. Molecular Cell 47, 810-822, doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030 (2012)]), 여기서 단일 세포 데이터는 신규 수준에서 이 관계의 재분석을 가능하게 한다. 종종 ChIP-Seq로 분석되는 히스톤 마크의 집단 맵은 광범위한 정량적 범위를 나타낸다. 염색질 마크는 DNA 분자로부터 존재하거나 부재하기 때문에, 프로모터에서 활성 마크의 정량적인 염색질 측정은, 전체적인 집단 발현 수준이 아니라, 유전자의 디지털 노이즈 수준, 즉, 전사체를 발현하는 세포의 %와 상관적이어야 하는 것으로 추론되었다. 사실상, 집단 발현 수준에 대해 제어한 후에도, 유전자에 대한 단일 세포 분포의 알파 매개변수와, 유전자의 프로모터에 존재하는 K27의 집단 수준 간에 강한 관계가 관찰되었다. 아주 대조적으로, 전사체를 발현하는 세포의 %에 대해 제어한 후, 정량적 염색질 수준과 집단 수준 mRNA 발현 간에 어떠한 관계도 관찰되지 않았다. 이들 관계는 활성 염색질 마크 K27ac뿐만 아니라 RNA PolII 수준에 대해서는 강력하였으나, H3K4me3에 대해서는 강력하지 못하였으며, 이는, K27ac가 활성 전사와 보다 밀접하게 상관적이라는 이전의 관찰과 일맥상통한다.

면역 반응 회로의 별개의 이종성 프로파일: 단일 세포 분포의 매개변수화를 적용하여, 실험 조건에 대한 면역 반응 회로의 단일 세포 이종성의 변화를 분석하였다. 이 연구는, 전형적으로 집단 연구로부터 "후기-유도되는" 것으로 분류되는 코어 항바이러스 프로그램의 구조를 조사하고(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009)]), 이전의 연구에서 반응의 스냅샷 동안에 실질적인 바이모달성을 확인함으로써, 시작하였다(문헌[Chevrier, N. et al. Systematic Discovery of TLR Signaling Components Delineates Viral-Sensing Circuits. Cell 147, 853-867, doi:10.1016/j.cell.2011.10.022 (2011)]). 주요 항바이러스 유전자가 이들의 발현 패턴을 단일 세포에 대해 바이모달에서 유니모달로 시프트함에 따라, 항바이러스 반응에서 가장 유의미한 단일 세포 패턴은 2시간째 시점과 4시간째 시점 사이에 발생하였다. 그러나, 디지털 노이즈에서 이러한 시프트는 아날로그 노이즈의 상당한 감소를 동반하며, 또한 다시 모든 매개변수들에서 가장 급격한 시프트가 2시간째와 4시간째 사이에 발생한다(중앙 시그마 시프트는 0.6 내지 0.9이며. p값은 3.5x10^^-5임). 따라서, 단일 세포는, 후기 시점에서 코어 항바이러스 유전자의 강력하고 밀접하게 조절된 발현에 의해 나타나는 관찰된 시간경과 동안에 이들의 항바이러스 반응을 밀접하게 동기화한다.

염증 프로그램에 참여하는 유전자는 이들의 항바이러스 대응과 비교해 완전히 반대되는 일시적인 이종성 프로파일을 나타내는 경향이 있다. 특히, Il1a 및 TNF-알파와 같은 표준적인 항염증 사이토카인을 비롯하여 샤프 정점 반응을 나타내는 유전자(클러스터 IIIc)는 초기 시점에서 가파르게 유도되었으나, 반응에서 후기에는 하향조절된다. 이러한 일시적인 위상이완(dephasing)의 정확한 원인은 알려져 있지 않지만, 교차-저해 피드백 고리 및 RNA 분해 인자들이 정점 반응을 생성하는 데 관여할 수 있다. 현저하게는, 이들 벌크 발현 추정값의 동역학(dynamics)은 거의 대부분 디지털 노이즈의 변화로 인한 것으로 관찰되었다. 이들 전사체를 발현하는 세포의 %는 모든 일시적인 전이 사이에 상당한 변화를 나타낸 한편, 발현 세포의 분포를 나타내는 매개변수는 비자극 시점을 비롯하여 반응 전체 동안에 통계학적으로 변하지 않았다.

염증 유전자의 별개의 클러스터(클러스터 IIId)는 시간경과에 걸쳐서 계속적으로 유도되며, 코어 항바이러스 클러스터와 유사한 디지털 노이즈의 패턴을 나타내며, 또한 가장 유의미한 시프트가 2시간째 시점과 4시간째 시점 사이에 발생하였다. 그러나, 항바이러스 동기화와는 대조적으로, 이 회로의 아날로그 노이즈에서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 따라서, 후기-유도되는 항바이러스 및 염증 유전자는 LPS에서 집단 수준에서 유사한 일시적인 프로파일을 보이는 한편, 2개의 반응은 4시간째 시점에서 상이한 이종성 프로파일을 나타내며, 전자는 밀접하게 조절된 회로와 유사하지만, 후자는 더 많은 노이즈 유도를 나타낸다. 종합하자면, 이들 분석은, 기능적으로 별개의 LPS 반응 모듈의 광범위하게 상이한 일시적인 이종성 패턴을 강조하며, 밀접하게 조절된 회로와 노이즈 회로 둘 모두를 구별하는 단일 세포 RNA-seq의 능력을 예시한다.

자극에 대한 단일 세포 노이즈의 변화: PIC 및 PAM은 각각 항바이러스 및 염증 경로의 특이적인 길항제이지만, LPS는 BMDC 집단에서 방어 프로그램들 둘 모두를 활성화시킬 수 있는 것으로 이전에 주지된 바 있다(문헌[Takeuchi, O. & Akira, S. Pattern Recognition Receptors and Inflammation. Cell 140, 805-820, doi:10.1016/j.cell.2010.01.022 (2010)]). TLR4 신호전달의 비-특이적인 특성을 고려하면, 면역 반응 회로는 보다 방향성의 자극원에 대응하여 다르게 거동할 수 있는 것으로 가정되었다.

예를 들어, PIC에의 노출은 항바이러스 클러스터에서 단일 세포 이종성을 감소시킬 수 있는 것으로 가정되었다. 그러나, 항바이러스 일시적인 이종성 패턴은 LPS와 비교해 PIC 시간경과에서 약간 지연된 것으로 관찰되었다. 특히, 코어 유전자는 4시간째 시점과 6시간째 시점 사이에서 바이모달 발현에서 유니모달 발현으로 전이하였으며, 항바이러스 동기화의 지연은, 사실상 PIC가 더 약한 자극원으로서 작용하였음을 가리켰다. 이들 관찰은 이전의 보고와 일맥상통한다.

그러나, 염증 회로의 일시적인 가변성 패턴은 PAM에 노출된 후 크게 차이가 났다. LPS 반응에서와 같이, 가파른 정점 반응 유전자는 초기 시점에서 발현 세포의 %의 가파른 유도를 나타내었다. 그러나, 이들 유전자는 2시간째의 시점에서 "정점" 대신에 "정체"되는 경향이 있으며, 후기 시점에서 비동기화되는 데 실패하였다(디지털 노이즈 또는 아날로그 노이즈에서 통계학적으로 유의한 변화는 없음). 마찬가지로, 염증 회로는 동기화하기 시작하였으며(T=2시간째와 4시간째 사이의 아날로그 노이즈의 상당한 감소, p값은 0.0014임), 후기 시점에서 이들의 반응은 LPS 반응 동안 항바이러스 코어 회로롸 유사한 것으로 확인되었다. 별개의 자극원에 노출된 후 이들 회로의 변화하는 일시적인 노이즈 패턴은, 단일 세포 이종성은 전적으로 비제약형 전사 확률성의 결과인 것은 아니지만, 그 대신, 면역 반응 동안에 조절되는 제어되는 현상임을 강하게 주장한다. 따라서, 다음의 연구는 단일 세포 가변성을 유발하는 데 있어서 세포내 결정인자 및 세포간 결정인자 둘 모두의 역할을 추가로 조사하였다.

실시예 8. 일시적인 노이즈의 환경적 결정인자

내부 성분의 가변적인 수준은 반응 표현형의 차이를 유발할 수 있지만(문헌[Taniguchi, Y. et al. Quantifying E. coli Proteome and Transcriptome with Single-Molecule Sensitivity in Single Cells. Science 329, 533-538, doi:10.1126/science.1188308 (2010); Tay, S. et al. Single-cell NF-κB dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature 466, 267-271, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nature09145 (2010); Raj, A. & Van Oudenaarden, A. Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression. Annual Review of Biophysics 38, 255-270, doi:10.1146/annurev.biophys.37.032807.125928 (2009); Cohen, A. A. et al. Dynamic Proteomics of Individual Cancer Cells in Response to a Drug. Science 322, 1511-1516, doi:10.1126/science.1160165 (2008); Altschuler, S. J. & Wu, L. F. Cellular Heterogeneity: Do Differences Make a Difference? Cell 141, 559-563, doi:10.1016/j.cell.2010.04.033 (2010); Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. & Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 17807-17812, doi:10.1073/pnas.0608512103 (2006); Paszek, P. et al. Population robustness arising from cellular heterogeneity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 11644-11649, doi:10.1073/pnas.0913798107 (2010); Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F. & Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 19306-19311, doi:10.1073/pnas.0807038105 (2008); Niepel, M., Spencer, S. L. & Sorger, P. K. Non-genetic cell-to-cell variability and the consequences for pharmacology. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 556-561, doi:10.1016/j.cbpa.2009.09.015 (2009); Sharma, S. V. et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell 141, 69-80, doi:10.1016/j.cell.2010.02.027 (2010); Gascoigne, K. E. & Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer cell 14, 111-122, doi:10.1016/j.ccr.2008.07.002 (2008)]), 세포의 미세환경의 국소적인 차이는 이종성의 외부적이며 혼란을 주는 소스를 제공할 수 있다(문헌[Fan, R. et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nature Biotechnology 26, 1373-1378, doi:10.1038/nbt.1507 (2008); Gomez-Sjoeberg, R., Leyrat, A., Pirone, D., Chen, C. & Quake, S. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry 79, 8557-8563 (2007); Huang, S. Non-genetic heterogeneity of cells in development: more than just noise. Development 136, 3853-3862, doi:papers2://publication/doi/10.1242/dev.035139 (2009); Kalisky, T., Blainey, P. & Quake, S. R. Genomic Analysis at the Single-Cell Level. Annual review of genetics 45, 431-445, doi:papers2://publication/doi/10.1146/annurev-genet-102209-163607 (2011); Lecault, V. et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nature Methods 8, 581-586, doi:papers2://publication/doi/10.1038/nmeth.1614 (2011); Loewer, A. & Lahav, G. We are all individuals: causes and consequences of non-genetic heterogeneity in mammalian cells. Current opinion in genetics & development 21, 753-758, doi:10.1016/j.gde.2011.09.010 (2011); Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G. & Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab on a Chip 7, 987, doi:10.1039/b705266a (2007); Raser, J. M. Control of Stochasticity in Eukaryotic Gene Expression. Science (New York, NY) 304, 1811-1814, doi:10.1126/science.1098641 (2004)]). 각각의 BMDC의 반응은, 즉 부가적인 세포내 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 사이토카인 및 케모카인에 대한 mRNA의 발현에 의해 지배된다. 따라서, 느린 확산과 커플링된 이종성의 세포간 신호전달은 환경적인 조건에서 부유한 국소적 다양성을 쉽게 유발할 수 있으며, 강제로 각각의 세포가 상이한 제약들 하에 이의 반응을 산출하도록 한다.

일정한 인터페론 자극은 항바이러스 반응으로부터 바이모달성을 제거한다: 이전에는 인터페론(IFN) 신호전달의 이차 웨이브(wave)의 가변성이 4시간째 시점에서 항바이러스 반응에서 관찰된 광범위한 바이모달성에 관여한 것으로 가정되었다(문헌[Shalek, A. K. et al. Nanowire-mediated delivery enables functional interrogation of primary immune cells: application to the analysis of chronic lymphocytic leukemia. Nano Lett. 12(12):6498-504. doi: 10.1021/nl3042917 (2012)]). 이를 추가로 시험하기 위해, BMDC를 IFN-β로 직접 자극하여, 세포 모두에게 이 항바이러스 피드백에의 동일한 접근을 제공하였다. 자극 후 2시간째에(IFN-β는 2시간째에 LPS 하에 정점을 이루기 때문에, 4시간째 LPS에 상응함(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009)]), 항바이러스 클러스터의 디지털 노이즈의 급격한 시프트가 관찰되었으며, 주요 유전자는 IFN-β 하에 LPS에서의 바이모달 발현 분포로부터 유니모달 발현 분포로 시프트되었다. 이러한 발견은, 항바이러스 유전자의 발현에서 초기 이종성은 세포내 시점의 차이에서 발생하는 것이 아니며(문헌[Nachman et al., Dissecting timing variability in yeast meiosis, Cell 131, 544-556 (2007)]), 그보다는 IFN-β 노출 시 차이로 인한 것임을 제시한다. 이는, 선택된 세포 세트에서 LPS 자극 하에 0시간째부터 2시간째에 나타나는 Ifnb1 mRNA 발현의 초기 발생과 관련하여, 세포의 서브셋이 사실상 인터페론 신호전달의 일차 웨이브를 발생시키는 데 관여할 수 있으며, 이는 결국 IFN-β가 전체 집단을 가림(enshroud)에 따라, 항바이러스 반응을 동기화함을 제시한다. 이러한 경우, IFN-β 및 이의 최측근을 생성한 세포는 자가분비 신호전달 및 측분비 신호전달로 인해 초기 항바이러스 유도를 나타낼 것으로 예상될 것이다.

세포들의 드문 집단은 후기-유도되는 항바이러스 유전자를 초기 시점에서 조숙하게 발현한다: 이 가정을 뒷받침하여, LPS로 자극한 지 불과 1시간 후에 항바이러스 반응 유전자의 조숙 발현을 나타낸 3개의 세포가 흥미롭게 발견되었다. 이들 세포는 Ifit1을 비롯한 일반적인 항바이러스 시그너처의 강력한 발현뿐만 아니라 제2 주성분에 대한 이들의 투사에 의해 명백하게 구별될 수 있었다. 이 집단의 존재를 입증하기 위해, Ifit1 및 Ifnb1의 발현에 대해 세포를 공동염색하는 RNA-FISH를 수행하였다. 따라서, 이 집단은 존재하지만, 드문 집단이다.

측분비 신호전달의 제거(ablation)는 세포의 이종성을 급격하게 변경한다: 매우 제안적이긴 하지만, "초기 반응자" 아집단의 발견은, 세포내 신호전달이 집단에서 항바이러스 동기화에 필요하다는 것을 명백하게 보여주지 않는다. 이 가정을 입증하는 것은, 세포를 단리하고 이들을 개별적으로 배양하는 방법을 필요로 한다. 측분비 신호전달의 부재 시, 전자의 가정은 디지털 항바이러스 노이즈에서 시프트를 제시할 것이다.

이를 달성하기 위해, 비자극된 BMDC를 C1 IFC 상에 로딩하고 단리한 다음, 밀봉된 미세유체 챔버 내부에서 각각의 세포를 LPS로 개별적으로 자극하도록 처리하였다. 표준 자극 프로토콜을 밀접하게 반영하기 위해, C1 시스템을, LPS-가미된 배지를 IFC의 세정 포트 중 하나를 통해 전달하도록 프로그래밍한 다음, 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 정상적인 이미지화, 용해 및 cDNA 합성 및 증폭을 수행하였다. 중요하게는, 이 온-칩 자극에 대한 세포 밀도(4.5 nL 당 1개 세포)는 정상적인 인-튜브 자극(5 nL 당 1개 세포)과 밀접하게 매칭되었으며, 이 실험을 기존의 LPS 데이터와 직접 비교할 수 있었다. 본래 가정된 바와 같이, 측분비 신호전달의 부재는 항바이러스 반응을 강하게 비동기화하였다. 디지털 노이즈의 급격한 증가는, 항바이러스 유전자 분포가 유니모달(벌크 LPS 자극)로부터 바이모달(온-칩 자극)로 시프트됨에 따라 관찰되었다. 주목할만하게는, 세포 서브셋(확인된 초기 반응자에 유사한 경향이 있음)은 코어 항바이러스 반응의 강력한 활성화를 나타내었다. 마찬가지로, 측분비 신호전달의 제거는 모든 BMDC에 대한 성숙 과정을 심각하게 제한하였으며, 이는 모든 세포들에서 성숙 마커의 발현을 제거하였다. 이는 아마도, BMDC에서 성숙을 유도하는 것으로 알려져 있는 TNF-매개의 신호전달의 저지로 인한 것이다. 여전히, 모든 유도되는 유전자들이 측분비 신호전달의 부재 하에 상이하게 거동하지는 않았으며: 다수의 후기-유도성 염증 유전자는 영향을 받지 않았으며, 이는 단리된 세포가 미세유체 챔버에서 LPS에 대한 자연적인 반응을 겪을 수 있었음을 입증한다.

이를 시험하기 위해, 단리에 의해 제거한 다음, C1 IFC의 내부에서 4시간 동안 자극된 개별 BMDC에 의해 측분비 신호전달을 제거하였다. 정상적인 활성화 조건을 매칭하기 위해, C1 시스템을, LPS-가미된 배지를 IFC의 세정 포트 중 하나를 통해 전달하도록 프로그래밍한 다음, 세포를 37℃에서 자극 기간 동안 인큐베이션한 후, 정상적인 이미지화 및 용해를 수행하였다. 중요하게는, 이 온-칩 자극에 대한 세포 밀도(4.5 nL 당 1개 세포)는 정상적인 인-튜브 자극(5 nL 당 1개 세포)과 밀접하게 매칭되었으며, 그로 인해 이 둘을 직접 비교할 수 있었다. 본래 가정된 바와 같이, 측분비 신호전달의 부재는 항바이러스 반응을 강하게 비동기화하였다. 세포의 작은 서브셋에서 주요 항바이러스 마커의 일관성있는 유도의 제한이 항바이러스 유전자 분포를 유니모달로부터 바이모달로 시프트함에 따라, 디지털 노이즈의 급격한 증가가 관찰되었다. 중요하게는, 모든 유도되는 유전자들이 측분비 신호전달의 부재 하에 상이하게 거동하지는 않았으며: 다수의 후기-유도성 염증 유전자는 영향을 받지 않았으며, 이는 단리된 세포가 미세유체 챔버에서 LPS에 대한 자연적인 반응을 겪을 수 있었음을 입증한다.

측분비 신호전달의 존재는 항바이러스 동기화에 필수적이긴 하지만, 세포내 소통은 다른 면역 반응 회로에 반대되는 효과를 가진다. 놀랍게도, 측분비 신호전달의 제거는 LPS 자극 후 4시간째에 디지털 노이즈 및 아날로그 노이즈 둘 모두를 급격하게 감소시켰다. TNF, Il1a 및 INHBA와 같은 표준적인 염증 마커들은 모두 측분비 제거 시 바이모달 분포에서 유니모달 분포로 시프트하였다(2시간째 시점에서 이들의 일정한 발현과 유사함). 따라서, 결과는 이 비동기화의 업스트림 결정인자로서 측분비 신호전달을 강하게 시사하며, 세포내 소통이 항바이러스 경로 및 염증 경로 둘 모두에서 이종성을 유발하는 데 있어서 수행하는 광범위한(때때로 반대되는) 역할을 강조한다.

인터페론 피드백은 염증 이종성을 증가시킨다: 온-칩 단리 실험은 모든 측분비 신호전달을 둔감하게 저지하기 때문에, 상기 관찰된 결과에 관여하는 개별 측분비 신호 또는 측분비 신호들의 조합을 분간할 수 없다. 개별 신호전달 경로의 역할을 보다 구체적으로는 다루기 위해, 이 연구는 특이적인 수용체 분자가 결핍된 녹아웃 마우스의 프로파일링에 의존하였다. 염증 노이즈의 업스트림 소스를 보다 양호하게 이해하기 위해, 이 연구는 TNF 수용체가 결핍된 마우스 유래의 BMDC의 프로파일링으로 시작하였다. 이전의 발견 및 가정과 일치하여, TNFR-/- BMDC는 성숙 마커의 유도를 나타내지 않았다. 그러나, 다수의 가파른 정점 반응 유전자는 4시간째 시점에서 야생형 BMDC 및 TNFR-/- BMDC 둘 모두에서 매우 유사한 분포를 나타내었다. IL1 수용체가 결핍된 BMDC를 프로파일링하는 경우 유사한 결과가 나타났으며; BMDC는 성숙에 실패하였으나, 샤프 정점 반응 유전자들 사이에서 일관성있는 변화는 관찰되지 않았다.

인터페론 수용체 녹아웃(Ifnar1^-/-) 마우스 유래의 BMDC를 다음으로 프로파일링하였다. 예상한 바와 같이, 그리고 이전의 발견에 따라(문헌[Shalek, A. K. et al. Nanowire-mediated delivery enables functional interrogation of primary immune cells: application to the analysis of chronic lymphocytic leukemia. Nano Lett. 12(12):6498-504. doi: 10.1021/nl3042917 (2012)]), 인터페론 신호전달의 저해는 항바이러스 유전자의 발현을 전적으로 차단하였다. 항바이러스 경로의 절제는 본질적으로 완료되었으며, 어떠한 세포도 임의의 항바이러스 반응을 나타내지 않았으며, 이는 "초기 반응자"조차 이들의 항바이러스 반응을 활성화시키기 위해 IfnB의 자가분비 신호전달을 필요로 할 수 있음을 내포한다. 그러나, 염증 "샤프 정점" 유전자는 이들 녹아웃 세포에서 디지털 가변성 및 아날로그 가변성 둘 모두의 크게 감소된 수준을 다시 한 번 나타내었다. 온-칩 자극 유래의 세포와 밀접하게 클러스터링된 Ifnar1-/-, 및 LPS와 비교하여 노이즈의 시프트는 두 실험 사이에서 상당히 상관적이었다. 항바이러스 경로를 유도하는 데 있어서 인터페론 신호전달의 공지된 역할을 고려할 때, 이들 발견은 염증-반응 비동기화의 일차적인 업스트림 기전으로서 광범위한 항바이러스 교차-저해를 일관성있게 가리킨다.

실시예 9. "클러스터-방해된" 세포의 제거

상기 실시예에서, BMDC는 별개의 성숙 상태에 상응하는 2개의 별개의 아집단에 속하는 것이 확인되었다. BMDC 성숙은, BMDC가 적응 면역계를 프라이밍하기 위해, 항원-포착 세포로부터 항원-제시 세포로 전환되는 발달 과정이다(예를 들어, 문헌[Jiang, A. et al. Disruption of E-Cadherin-Mediated Adhesion Induces a Functionally Distinct Pathway of Dendritic Cell Maturation. Immunity 27, 610-624, doi:10.1016/j.immuni.2007.08.015 (2007)] 참조). 성숙은, LPS와 같은 병원체-유래의 리간드에 대응하여, 또는 배양 중인 BMDC의 클러스터를 방해한 결과로서 발생할 수 있으며(Ibid.), 이 둘 모두는 특이적인 세포-표면 마커를 상향조절한다. 병원체-의존적인 성숙은 병원체 노출 후 연장된 기간에 걸쳐 발생하며, 세포는 데이터세트에서 발달 연속체(developmental continuum)에 속한다(도 24d 및 도 24e).

그러나, '클러스터 방해'로도 지칭되는 병원체-독립적인 성숙은 배양 과정의 공지된 인공물(artifact)이며, 자극 전에 발생하고, 별개의 세포 상태를 나타낸다. 따라서, '동종의' 집단으로부터 유전자 발현 변동의 변화를 적절하게 측정하기 위해, 본원에 제공되는 연구는 모든 추가적인 분석으로부터 모든 클러스터-방해된 세포들을 제거하고자 하였다.

18개 세포 상에서 PCA를 수행한 이전의 실시예에서, 제1 주성분(PC1)은 이들 2개 세포의 집단들을 식별한 것으로 확인되었다. PC1 로딩이 높은 다수의 유전자들은 세포-표면 수용체 Ccr7, Cd83 및 Cd86과 같은 BMDC 성숙의 공지된 마커였다(문헌[Jiang Immunity 2007]). 이들 유전자는 병원체-의존적인 성숙 경로 및 병원체-독립적인 성숙 경로 둘 모두에서 상향조절되며, 따라서, 모두 LPS 시간 경과에서 집단-수준에서 유도된다(문헌[Amit, I. et al. Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogen responses. Science 326, 257-263, doi:10.1126/science.1179050 (2009); Shalek, Nature 2013]). PC1 유전자 중에서, Lyz1은 가장 강한 로딩을 가졌으며, 클러스터-방해된 세포의 최상의 식별자였다. 이는 15개의 성숙중인(비-클러스터 방해된) 세포에서 (ln(TPM+1)은 9 초과임)였으나, 3개의 클러스터-방해된 세포들에서 완전히 부재(TPM은 0임)하였다. 더욱이, Lyz1은 병원체-의존적 성숙을 수행중인 2개 세포에서 차별적으로 조절되지 않았으며, 이는 LPS 시간 경과 내내 이의 단일 세포 수준 또는 집단 평균화된 수준에서 적절하게 변하지 않았다. 마찬가지로, 상보적인 마커(Serpinb6b)를 확인하였으며, 이 마커는 클러스터-방해된 세포에서만 높게 발현되는 것으로 확인되었으나, 모든 다른 세포들에서는 부재하였으며, 그러나, LPS 시간 경과 동안에 이의 전반적인 발현을 눈에 띄게 변화시키지 않았다. 따라서, 이들 마커는 병원체-의존적 성숙을 수행중인 세포에서 차별적으로 조절되는 경향이 낮으며, 이들 마커 전사체의 발현 패턴은 클러스터 방해된 세포를 확인하는 방법을 제공한 것이 추론되었다. 2개 마커를 독립적으로 확인하기 위해, 추가적인 qRTPCR 분석을 자극 전에 CD83(성숙 마커) 발현을 위해 예비-소팅된 세포 상에서 수행한 다음, 2개의 소팅된 아집단(CD83+, CD83-)을 LPS로 4시간 동안 자극하였다. 2개 아집단에서 2개 mRNA의 수준을 자극 전과 자극 후에 측정하였다. 이들 연구는, 이들 마커가 병원체 반응에 대한 2개의 아집단들을 명백하게 구별한다는 것을 성공적으로 입증하였다.

사용된 프라이머:

이에, 모든 잠재적으로 클러스터-방해된 세포를 엄격하게 제거하기 위해, Lyz1의경우 ln(TPM+1)이 6 미만이거나 Serpinb6b의 경우 ln(TPM+1)이 4 초과인 모든 라이브러리를 추가적인 분석으로부터 배제하였다. 이는 예외없이 각각의 실험에 대해 수행하였다.

클러스터 방해는 "코어" 항바이러스 모듈의 초기 활성화와 연결점이 없었음을 확인하기 위해, LPS로 1시간 동안 자극한 실험과 LPS로 4시간 동안 "온-칩" 자극한 실험 모두에 대해 클러스터 방해 마커의 발현과 "코어" 항바이러스 모듈의 활성화 간의 상관도가 없었던 것으로 확인되었다.

본 발명은 기재된 상세한 설명 및 실시예에 의해 기술되어 있으며, 당업자는, 본 발명이 다양한 구현예들에서 시행될 수 있으며, 상기 상세한 설명 및 실시예는 예시를 목적으로 하는 것이며 하기의 청구항을 제한하려는 것이 아님을 인지할 것이다.

<110> The Broad Institute, Inc. President and Fellows of Harvard College Shalek, Alexander K. Satija, Rahul Hongkun, Park <120> Dendritic Cell Response Gene Expression, Compositions of Matters and Methods of Use Thereof <130> BRDI-031/001WO 322122-2082 <140> PCT/US14/30429 <141> 2014-03-17 <150> US 61/787,378 <151> 2013-03-15 <160> 369 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 1 gcaattattc cccatgaacg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 2 tcatcagacc ccagaaaagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 3 ctaaggccaa ccgtgaaaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 4 gaacgtctcc tcgtgtccat 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 5 actggtctag gacccgagaa g 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 6 gatgcgcatt ttgatggtt 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 7 tatggtccag ctgccattc 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 8 gctggagtca gttaccgtca a 21 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 9 atgatggctt ggccagtg 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 10 ttctggtgct tgtctcactg a 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 11 ctcctgagac tattcccaca gaa 23 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 12 ccagggaaac ctcctcaga 19 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 13 catccacgtg ttggctca 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 14 tgcccttgct gttcttctct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 15 ttctgtgcct gctgctcata 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 16 ctgtgcattt acaccgacaa c 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 17 ctccttgtca ttttccaggt g 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 18 aaagaaactg aagcctttct cg 22 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 19 tgatgcaatc cggatcaa 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 20 atcgcaaaga cggaagga 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 21 gcctccatcc tgtttctcag 20 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 22 ctgggattca cctcaagaac atc 23 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 23 gccgtcattt tctgcctca 19 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 24 aaaatcatcc aaaagatact gaacaa 26 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 25 gaagattctg gaccccacct a 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 26 acacagggcc cgttacttct 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 27 cagttttcgt gggacactca 20 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 28 ttgggatagc tatacgacaa ataaga 26 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 29 gctcccagcg ctataaaaac t 21 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 30 tcctcctcag accgctttt 19 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 31 ctattaaccg tgttcaaaac atgaa 25 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 32 tctaaacagg gccttgcag 19 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 33 gcaagatgca ccaagatgag 20 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 34 tgaactgctc agcccaca 18 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 35 ctggcttcca tcatgaacaa 20 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 36 gggagagtct ttgcctgatt c 21 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 37 gattcagact ccaggggaca 20 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 38 cagctcagag aggtcaggaa a 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 39 ccagtgccaa cagtagtgac a 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 40 ttggttaaat gacctgcaac a 21 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 41 acctgtcctg tgtaatgaaa gacg 24 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 42 gctaccaaac tggatataat cagga 25 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 43 atcatcacct ttgccgagtc 20 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 44 gagctgggcc attcacac 18 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 45 acagcacctt atggctctct g 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 46 cttcagcact ttcttccgag a 21 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 47 gagccagatc ctccctgact 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 48 tgaggccacc attagagagg 20 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 49 gcttttgtta atggtgttgc tg 22 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 50 agtcgaccca gtctctgact ct 22 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 51 aagattgcca aggccaga 18 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 52 gcacttgtgc tacctgtcca 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 53 gcattggttc ccctgagata 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 54 cagcaaaaat tcgccctaaa 20 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 55 catggacccc aactgctc 18 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 56 ttcaaggatc actcatactt cagc 24 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 57 cagttcctct cagtcccaag at 22 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 58 tggccttgtt agaccgtga 19 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 59 catgatggac ttggagttgc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 60 cactgctcag gtccactgtc 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 61 acgagcaaat ggtgaaggag 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 62 cagctgggga agtcattttt 20 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 63 ggtcgtgacc aagtataaga tgg 23 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 64 ctgatcaaga aaatcatcct tcc 23 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 65 tacctgctgg ctggatgg 18 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 66 agtggatcaa agccatccag 20 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 67 ttgtagtttt ggagctctgt cg 22 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 68 catcaccacc attcccact 19 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 69 aggaaccctc cgaagactat g 21 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 70 tgtgctgagg agactcgatg 20 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 71 acgccactgt cgcttttc 18 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 72 gatgctcttc cgagctgtg 19 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 73 cgctgtgctg gaggaact 18 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 74 ttgcagagat ggatactatg aagc 24 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 75 atccctccac cctatgacaa 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 76 gcttcaacgt ggacgaagac 20 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 77 tgtggacctc agcaaggtg 19 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 78 ggagaagctg atggcttgg 19 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 79 tgggtggaac tgctcgtaat 20 <210> 80 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 80 cgtgctcagt agagcagctt ag 22 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 81 aggcaactga gcaaagcaac 20 <210> 82 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 82 atttcgcttc gggactagc 19 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 83 gcagcacaac atacggaaaa 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 84 ggaacagctg gaacagtggt 20 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 85 attccccagg aaaggctgt 19 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 86 cagcactctc ttcagcctct c 21 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 87 cctcggagga acaaagaagt aa 22 <210> 88 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 88 gacgggcttg aggaacag 18 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 89 tcttctcatt cctgcttgtg g 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 90 ggagcctttg aaagacctca a 21 <210> 91 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 91 gaggcccaag ggtttcag 18 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 92 aaaggaccct ccaatccaaa 20 <210> 93 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 93 cagggcagac caagaattg 19 <210> 94 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 94 agcaccgtgg tcacaaaac 19 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 95 aacagctttc gatgaagcca t 21 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 96 ttcacgacac accagatcct 20 <210> 97 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 97 cagagcagga gccagagc 18 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 98 acattgctgc tgctacttgc 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 99 gaacaacagc ctgaacatgg 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 100 gtgggaacca gaggagaaca 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 101 actgtaacct gctgcccaag 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 102 cgccaggttt gattcttcag 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 103 aaccccagat gctgacaaag 20 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 104 gggacagcct ttcctactac c 21 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 105 aaggcctagg cgagaatgtt 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 106 ggcaaattca acggcacagt 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 107 tcagaatcgc cgagctaaat 20 <210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 108 atgaggaggc tcccctttc 19 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 109 tcaagccatc cttgtgctaa 20 <210> 110 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 110 ccatcagcag atcattctag acaa 24 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 111 ttggtgaagc caggctagag 20 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 112 ccagaagatg gtgtggtgtt t 21 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 113 ccacggaggg agagaaaatc 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 114 ccaacaggca ggaatcactc 20 <210> 115 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 115 ccatcccaat ggcgtatc 18 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 116 acgttaccag caactgaaac c 21 <210> 117 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 117 tggaacagcc caaacagc 18 <210> 118 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 118 tggagatcct agtgacaaaa atcc 24 <210> 119 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 119 cttgccctgg accacaaa 18 <210> 120 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 120 catccggagc agagacca 18 <210> 121 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 121 ggctggcagc tcgattag 18 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 122 gaaaaccaaa aaggctgtgg 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 123 gcggcaacta cagcctagag 20 <210> 124 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 124 cccagaccgc agtatccat 19 <210> 125 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 125 gtgacctctc ttccctgtca ct 22 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 126 ctccgtgcta cccactcact 20 <210> 127 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 127 cggtgcagtg tcagcttc 18 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 128 ggtggtggag agtgaggact 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 129 ggtccgagaa cagagtggtt 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 130 tcgtcgtcct cgagatgatt 20 <210> 131 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 131 gccagggctt ggaagatt 18 <210> 132 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 132 cggcatctgc tagctcagt 19 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 133 gagtcctcag cgagaccttg 20 <210> 134 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 134 ccaagagcgt tttcccaat 19 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 135 gcgaggccac acagatatta c 21 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 136 agcgtaatgc gagaaacctc 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 137 gggacttaat caacgcaagc 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 138 gattcggcag gtgagttgtt 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 139 accagaggca tacagggaca 20 <210> 140 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 140 ggccatctgg tggttcac 18 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 141 tcccaccttg tctccagtct 20 <210> 142 <211> 27 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 142 ttcagtttat acagaattgt cgtcttg 27 <210> 143 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 143 ccaaagtctt ttaggtggca tc 22 <210> 144 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 144 cgcctccttt tcctctcat 19 <210> 145 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 145 ccattttctc caacatccaa tc 22 <210> 146 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 146 cagtatgttc ggcttcccat tc 22 <210> 147 <211> 25 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 147 caagatgttg ctgtatcatc atagg 25 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 148 ccggatggga acagtgtaga 20 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 149 gatcatcttg ctggtgaatg agt 23 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 150 gtggaatctt ccggctgtag 20 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 151 ttgacatagc agcatgtgga t 21 <210> 152 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 152 cactaccagt tcccactcca g 21 <210> 153 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 153 tggtattctc gccgatgtag t 21 <210> 154 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 154 agcaacaagc caagcacac 19 <210> 155 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 155 cacgtgtgtt gcgtcagtc 19 <210> 156 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 156 tgctgctggt gatgatgc 18 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 157 tgagagctgc gatatgttac g 21 <210> 158 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 158 cagggtcaag gcaagcctc 19 <210> 159 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 159 cgtccttgcg agagggatc 19 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 160 ctttggttct tccgttgagg 20 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 161 tgaatgtact gcacctcctc a 21 <210> 162 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 162 tcacagtgga tgccaaagg 19 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 163 aagggagcac agcaaacaga 20 <210> 164 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 164 ggcgtaggca caggtcat 18 <210> 165 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 165 tgagcacggg gatacagc 18 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 166 cctggttcat catcgctaat c 21 <210> 167 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 167 cacctgcaat tccaaaatct ta 22 <210> 168 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 168 gcagagccct ttttgataat gt 22 <210> 169 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 169 cttctaatga agtgctccag acc 23 <210> 170 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 170 tcccggttga cctcactc 18 <210> 171 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 171 agagggctgt ggtggagaa 19 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 172 atctcctggg cttggctatc 20 <210> 173 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 173 tggttagctt ctgaggacac atc 23 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 174 catgaagagg cagtgctttg 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 175 ttgggagaga aagcttctgg 20 <210> 176 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 176 gagcgctcac gaacagttg 19 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 177 tgggtattgc ttgggatcca 20 <210> 178 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 178 ccaggtagct atggtactcc agaa 24 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 179 tcactgcctt ccttggaaat 20 <210> 180 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 180 tccatgtctt gggatctgg 19 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 181 atggggtggc atcatgtagt 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 182 tgtagtgtgg tgacccttgc 20 <210> 183 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 183 ggcatatccg gtcaccagt 19 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 184 agcagcagcg agtagtctga 20 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 185 ggcttccgat agagctgtga 20 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 186 ccccagcatc ttcaccttta 20 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 187 tgttgttcca gcactctgtc a 21 <210> 188 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 188 tccaggcaga acacgacat 19 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 189 tccagtaaag gggatgatcg 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 190 agtgcagctc cacctctctg 20 <210> 191 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 191 agcaggagca gcagcttt 18 <210> 192 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 192 gggaggtgag ctcctcagt 19 <210> 193 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 193 tgcggttgtg agcctctt 18 <210> 194 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 194 aagtatttct ggcagtcctc ctc 23 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 195 cctccaaagg atgtcaatca a 21 <210> 196 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 196 ctgtcactat cccggagttc a 21 <210> 197 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 197 atgattgcca agtgcagga 19 <210> 198 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 198 ggcaacagca atatggagaa a 21 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 199 cagacacacc tgagctggaa 20 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 200 accgtttggg agagatccat 20 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 201 cacagcctcg gcatatttct 20 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 202 tcagtgattc tcggtgtcct c 21 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 203 agtgccttcc tcctcttgtg 20 <210> 204 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 204 tcgtaacact ttgcaaatcc a 21 <210> 205 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 205 ttcctcctgt atggcttgct 20 <210> 206 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 206 tgagccagtc tgctgatttc 20 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 207 gcaaacagct cgaaggagac 20 <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 208 ggattggaac agcaaggatt t 21 <210> 209 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 209 gggaagaaaa ttgctgtttc ac 22 <210> 210 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 210 caccgaatac ccaaattttg aa 22 <210> 211 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 211 gccccaggta agcaaactt 19 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 212 cctcaattag gaggcactgg 20 <210> 213 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 213 cctcaacatc agtgctcttc at 22 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 214 caggcgaatc tttttcttgc 20 <210> 215 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 215 aggatgtagc gtccaaatgc 20 <210> 216 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 216 catcggtgat gttcattttc c 21 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 217 ttgcattttc cagctgaatg 20 <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 218 aacttgctgt gggtgaccat 20 <210> 219 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 219 tctgtacggg atcttcttgg a 21 <210> 220 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 220 gtagctgccg aaggtgga 18 <210> 221 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 221 ttggttaaga aaaggcttcc aa 22 <210> 222 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 222 tatgggtgag gacggtcag 19 <210> 223 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 223 tccagatatt gcaccagacg 20 <210> 224 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 224 cctggggtaa ttaaggctgt g 21 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 225 ggtctgggcc atagaactga 20 <210> 226 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 226 gaacttctta aacagcggct tc 22 <210> 227 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 227 ggcttccgtg ggaagaat 18 <210> 228 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 228 agttgcccat cctcacatct 20 <210> 229 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 229 ggtctgtgag cccatgct 18 <210> 230 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 230 cagcctttgc agaactacct g 21 <210> 231 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 231 tgggtatccg atgtccacaa t 21 <210> 232 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 232 tgagcatctt gttacccttg c 21 <210> 233 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 233 gccaagttca tcatacacgt tc 22 <210> 234 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 234 gtactggggg ttggtccag 19 <210> 235 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 235 tctgagcgtt cacgttgg 18 <210> 236 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 236 tcagctgctc ctgccttt 18 <210> 237 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 237 aggaatatca aagttgcggt attt 24 <210> 238 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 238 cctcctggcg agtcactg 18 <210> 239 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 239 ccacctttat tttaggtttc ttgg 24 <210> 240 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 240 gatctgcgca aaagtcctgt 20 <210> 241 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 241 cataggctgt ccagttttct tgt 23 <210> 242 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 242 agatggtgat gggcttccc 19 <210> 243 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 243 ctgtccaacg catccttttt 20 <210> 244 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 244 accttctcca gggggaatc 19 <210> 245 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 245 gtcttttgat gtgaagaggt tcaa 24 <210> 246 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 246 cgccattatg attcagagac tg 22 <210> 247 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 247 cttcagggca ttgaagtcgt 20 <210> 248 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 248 ctgaccctct ccccttgc 18 <210> 249 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 249 agttggcagc tgtgcgtaa 19 <210> 250 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 250 cttctgctgg gctcttcgt 19 <210> 251 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 251 ccatggattc tttggagttt g 21 <210> 252 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 252 gaactgtatc aaaagcagca caa 23 <210> 253 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 253 cacctggcaa acctccat 18 <210> 254 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 254 ctggaaaggc tcccatagat ac 22 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 255 gtcaatcttg aagcagcgaa t 21 <210> 256 <211> 18 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 256 atgcactggt ggggtttc 18 <210> 257 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 257 gttgggagtg ccacagatg 19 <210> 258 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 258 tccttcagac gcacactctc 20 <210> 259 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 259 tgcggcaagc aacatataaa 20 <210> 260 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 260 gctccaggtc tcgcttctt 19 <210> 261 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 261 tgtattcgtc gatgatttcc aa 22 <210> 262 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 262 atgacggtga ccagagtgc 19 <210> 263 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 263 ctcccgcaaa caacagagtt 20 <210> 264 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 264 gctcatcaat ttctctgaag ca 22 <210> 265 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 265 cctttaagtc ctgccagctt c 21 <210> 266 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 266 ctccttcttg gggatctgc 19 <210> 267 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 267 cagatggctc tgcaggaag 19 <210> 268 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 268 tgccatagtt tcattgttag aagc 24 <210> 269 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 269 tgtcttcttc ttgccgatcc 20 <210> 270 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 270 gttggatttg gtggctcatc 20 <210> 271 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 271 cgaaggatgt gctggtctg 19 <210> 272 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 272 ttctttgttt ccatggctca 20 <210> 273 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMART primer <220> <221> misc_feature <222> (56) <223> n is a, c or g <220> <221> misc_feature <222> (57) <223> n is a, c, g, or t <400> 273 aagcagtggt atcaacgcag agtacttttt tttttttttt tttttttttt tttttnn 57 <210> 274 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMARTer II A Oligo <220> <221> misc_feature <222> (26)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 274 aagcagtggt atcaacgcag agtacnnnnn 30 <210> 275 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS PCR primer <400> 275 aagcagtggt atcaacgcag agt 23 <210> 276 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Barcoded SMARTer II A Oligo <220> <221> misc_feature <222> (24)..(27) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (28)..(30) <223> g may be a ribonucleotide <400> 276 aagcagtggt atcaacgcag agtnnnnggg 30 <210> 277 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal indexing forward primer <400> 277 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45 <210> 278 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal indexing reverse primer <400> 278 caagcagaag acggcatacg agat 24 <210> 279 <211> 17 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 279 gagcatgggt ggcatgg 17 <210> 280 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 280 cagaatgggc tgcagtagaa 20 <210> 281 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 281 gacatcactg cagccataca a 21 <210> 282 <211> 17 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 282 ccatgccacc catgctc 17 <210> 283 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 283 agttgctatc ttcgggttca g 21 <210> 284 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 284 accacatcct tggtgacatt 20 <210> 285 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 285 caaacactcc actggtcctt 20 <210> 286 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 286 aggtttcacc acatccttgg 20 <210> 287 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 287 ggcaaattca acggcacagt 20 <210> 288 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 288 agatggtgat gggcttccc 19 <210> 289 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 289 aagcagtggt atcaacgcag agtgcggggg gaaaaggggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 290 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 290 aagcagtggt atcaacgcag agtagagggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 291 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 291 aagcagtggt atcaacgcag agtacgaggg gggctgtttc agggtttggg ttagtgagcc 60 tcatcctggc ggttatttta tagtaaagaa cattcaagtg ctctgcctac ctagggccct 120 gtgaa 125 <210> 292 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 292 aagcagtggt atcaacgcag agtcgggggg gaaaaggggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 293 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 293 aagcagtggt atcaacgcag agtagcgggg agggctgttt cagggtttgg gttagtgagc 60 ctcatcctgg cagttatttt atagtaaaga acattcaagt gctctgccta cctagggccc 120 tgtga 125 <210> 294 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 294 aagcagtggt atcaacgcag agtccggggg gcaaagggct gtttcagggt ttgggttagt 60 gagcctcatc ctggcagtta ttttatagta aagaacattc aagtgctctg cctacctagg 120 gccct 125 <210> 295 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 295 aagcagtggt atcaacgcag agtcgagggg ggctgtttca gggtttgggt tagtgagcct 60 catcctggca gttattttat agtaaagaac attcaagtgc tctgcctacc tagggccctg 120 tgaag 125 <210> 296 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 296 aagcagtggt atcaacgcag agtcccgggg gaaaaggggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 297 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 297 aagcagtggt atcaacgcag agtagcgggg agggctgctt cagggtttgg gttagtgagc 60 ctcatcctgg cagttatttt atagtaaaga acattcaagt gctctgccta cctagggccc 120 tgtga 125 <210> 298 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 298 aagcagtggt atcaacgcag agtagagggg gagggctgtt tcagggcttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 299 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 299 aagcagtggt atcaacgcag agtagcgggg agggctgttt cagggtttgg gttagtgagc 60 ctcatcctgg cagttatttt atagtaaaga acattcaagt gctctgccta cctagggccc 120 tgtga 125 <210> 300 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 300 aagcagtggt atcaacgcag agtcccgggg gaaaaggggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 301 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 301 aagcagtggt atcaacgcag agtgtatggg caacgcagag taatcgggga gggctgtttc 60 agggtttggg ttagtgagcc tcatcctggc agttatttta tagtaaagaa cattcaagtg 120 ctctg 125 <210> 302 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 302 aagcagtggt atcaacgcag agtaaggggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 303 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 303 aagcagtggt atcaacgcag agtaaggggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 304 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 304 aagcagtggt atcaacgcag agtgtctggg gggagggctg tttcagggtt tgggttagtg 60 agcctcatcc tggcagttat tttatagtaa agaacattca agtgctctgc ctacctaggg 120 ccctg 125 <210> 305 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 305 aagcagtggt atcaacgcag agtgtatggg caacgcagag taatcgggga gggctgtttc 60 agggtttggg ttagtgagcc tcatcctggc agttatttta tagtaaagaa cattcaagtg 120 ctctc 125 <210> 306 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 306 aagcagtggt atcaacgcag agtagcgggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 307 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 307 aagcagtggt atcaacgcag agtcccgggg gaaaaggggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 308 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 308 aagcagtggt atcaacgcag agtaaggggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 309 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 309 aagcagtggt atcaacgcag agtagcgggg agggctgttt ttgggtttgg gttagtgagc 60 ctcatcctgg cagttatttt atagtaaaga acattcaagt gctctgccta cctagggccc 120 tgtga 125 <210> 310 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 310 aagcagtggt atcaacgcag agtggtcggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 311 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 311 aagcagtggt atcaacgcag agtcccgggg gaaaaggggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 312 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 312 aagcagtggt atcaacgcag agtagggggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 313 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 313 aagcagtggt atcaacgcag agtgtatggg caacgcagag taatcgggga gggctgtttc 60 agggtttggg ttagtgagcc tcatcctggc agttatttta tagtaaagaa cattcaagtg 120 ctctg 125 <210> 314 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 314 aagcagtggt atcaacgcag agtagcgggg agggctgttt cagggtttgg gttagtgagc 60 ctcatcctgg cagttatttt atagtaaaga acattcaagt gctctgccta cctagggccc 120 tgtga 125 <210> 315 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 315 aagcagtggt atcaacgcag agttccgggg ggcaaagggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtactct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 316 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 316 aagcagtggt atcaacgcag agtaaggggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 317 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 317 aagcagtggt atcaacgcag agtcagaggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 318 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 318 aagcagtggt atcaacgcag agtagagggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 ccccatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 319 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 319 aagcagtggt atcaacgcag agtaagcggg ggagggctgt ttcagggttt gggttagtga 60 gcctcatcct ggcagttatt ttatagtaaa gaacattcaa gtgctctgcc tacctagggc 120 cctgt 125 <210> 320 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 320 aagcagtggt atcaacgcag agtggggggg ctgtttcagg gtttgggtta gtgagcctca 60 tcctggcagt tattttatag taaagaacat tcaagtgctc tgcctaccta gggccctgtg 120 aagca 125 <210> 321 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 321 aagcagtggt atcaacgcag agtcgagggg ggctgtttca gggtttgggt tagtgagcct 60 catcctggca gttattttat agtaaagaac attcaagtgc tctgcctacc tagggccctg 120 tgaag 125 <210> 322 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 322 aagcagtggt atcaacgcag agtcccgggg gaaaaggggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 323 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 323 aagcagtggt atcaacgcag agttccgggg ggcaaagggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 324 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 324 aagcagtggt atcaacgcag agtaaggggg gagggctgtt tcagggcttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 325 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 325 aagcagtggt atcaacgcag agtcccgggg gaaaaggggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 326 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 326 aagcagtggt atcaacgcag agttccgggg ggcaaagggc tgtctcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct 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transcript <400> 366 aagcagtggt atcaacgcag agttccgggg ggcaaagggc tgtttcaggg tttgggttag 60 tgagcctcat cctggcagtt attttatagt aaagaacatt caagtgctct gcctacctag 120 ggccc 125 <210> 367 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 367 aagcagtggt atcaacgcag agtagagggg gggggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctttg 125 <210> 368 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 368 aagcagtggt atcaacgcag agtagagggg gagggctgtt tcagggtttg ggttagtgag 60 cctcatcctg gcagttattt tatagtaaag aacattcaag tgctctgcct acctagggcc 120 ctgtg 125 <210> 369 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary SMARTer amplified PCR partial transcript <400> 369 aagcagtggt atcaacgcag agtgtctggg gggagggctg tttcagggtt tgggttagtg 60 agcctcatcc tggcagttat tttatagtaa agaacattca agtgctctgc ctacctaggg 120 ccctg 125

Claims

하나 이상의 수지상 세포 반응을 조정하는 방법으로서,
수지상 세포 또는 수지상 세포의 집단을, 조정제의 부재하에서의 수지상 세포 또는 수지상 세포의 집단의 하나 이상의 반응과 비교하여, 하나 이상의 수지상 세포 반응을 변형시키기에 충분한 양의 조정제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
조정제는, 표 1 내지 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 조절하는 하나 이상의 표적 유전자, 또는 하나 이상의 표적 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 조정하는 제제인, 방법.
제2항에 있어서,
원하는 유전자 또는 표적 유전자들의 조합은, 하나 이상의 수지상 세포 반응의 양성 조절자 또는 하나 이상의 수지상 세포 반응의 음성 조절자로서 선택되고 확인되는, 방법.
제3항에 있어서,
조정제는, 수지상 세포의 성숙을 조절하는 하나 이상의 유전자를 조정하는 것; 수지상 세포의 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 유전자를 조정하는 것; 수지상 세포의 항바이러스성 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 유전자를 조정하는 것; 및 수지상 세포의 염증성 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 유전자를 조정하는 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 수지상 세포 반응(들)을 조정하기에 충분한 양으로 존재하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
조정제는 항체, 가용성 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 제제, 펩타이드 제제, 핵산 제제, 핵산 리간드 또는 저분자 제제인, 방법.
제5항에 있어서,
제제는 항체인, 방법.
제6항에 있어서,
항체는 모노클로날 항체인, 방법.
제6항에 있어서,
항체는 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 완전한 인간 모노클로날 항체인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
조정제는 키나제, 막관통 수용체, 화학적 약물, 생물학적 약물, 키나제를 조정하는 제제, 막관통 수용체를 조정하는 제제, 화학적 약물을 조정하는 제제, 및 생물학적 약물을 조정하는 제제로부터 선택되는 하나 이상의 제제인, 방법.
수지상 세포의 반응과 연관있는 시그너처 유전자, 유전자 시그너처 또는 다른 유전적 요소를 확인하는 방법으로서,
a) 수지상 세포를, 수지상 세포 반응의 저해제 또는 수지상 세포의 반응을 증강시키는 제제와 접촉시키는 단계; 및
b) 단계 (a)에 의해 발현이 조정되는 시그너처 유전자, 유전자 시그너처 또는 다른 유전적 요소를 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
제10항에 있어서,
c) 수지상 세포 반응의 저해제 또는 수지상 세포의 반응을 증강시키는 제제와 접촉된 수지상 세포에서 단계 (b)에서 확인되는 시그너처 유전자, 유전자 시그너처 또는 유전적 요소의 발현을 동요(perturbing)시키는 단계; 및
d) 발현이 단계 (c)에 의해 조정되는 표적 유전자를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서,
수지상 세포 반응의 저해제는, 표 1 내지 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 조절하는 표적 유전자, 또는 하나 이상의 표적 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 저해하는 제제인, 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서,
수지상 세포의 반응을 증강시키는 제제는, 표 1 내지 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 조절하는 표적 유전자, 또는 하나 이상의 표적 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능을 증강시키는 제제인, 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서,
제제는 항체, 가용성 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 길항제, 펩타이드 길항제, 핵산 길항제, 핵산 리간드 또는 저분자 길항제인, 방법.
표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 검출하는 단계, 및 검출된 수준을, 시그너처 유전자 또는 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준의 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 진단하는 방법으로서,
여기서, 검출된 수준과 대조군 수준 간의 차이는 개체에 면역 반응이 존재함을 가리키는, 방법.
제15항에 있어서,
면역 반응은 자가면역 반응인, 방법.
제15항에 있어서,
면역 반응은 염증 반응인, 방법.
표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 제1 수준을 제1 시점에서 검출하는 단계, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 제2 수준을 제2 시점에서 검출하는 단계, 및 제1 시점에서 검출된 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제2 시점에서 검출된 발현, 활성 및/또는 기능의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 모니터링하는 방법으로서,
여기서, 제1 시점에서 검출된 수준과 제2 시점에서 검출된 수준에서의 변화는 개체에서 면역 반응의 변화를 가리키는, 방법.
제18항에 있어서,
면역 반응은 자가면역 반응인, 방법.
제18항에 있어서,
면역 반응은 염증 반응인, 방법.
표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 검출하는 단계, 및 검출된 수준을, 시그너처 유전자 또는 유전자 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 수준의 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 비정상적인 수지상 세포 반응을 진단하는 방법으로서,
여기서, 검출된 수준과 대조군 수준 간의 차이는 개체에 비정상적인 수지상 세포 반응이 존재함을 가리키는, 방법.
제21항에 있어서,
비정상적인 수지상 세포 반응은 자가면역 반응인, 방법.
제21항에 있어서,
면역 반응은 염증 반응인, 방법.
표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 제1 수준을 제1 시점에서 검출하는 단계, 표 1, 표 1A, 표 2, 표 2A, 표 3, 표 3A, 표 4, 표 4A, 표 5 및 표 5A에 열거된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 시그너처 유전자, 또는 하나 이상의 시그너처 유전자의 하나 이상의 생성물의 발현, 활성 및/또는 기능의 제2 수준을 제2 시점에서 검출하는 단계, 및 제1 시점에서 검출된 발현, 활성 및/또는 기능의 수준을 제2 시점에서 검출된 발현, 활성 및/또는 기능의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에서 비정상적인 수지상 세포 반응을 모니터링하는 방법으로서,
여기서, 제1 시점에서 검출된 수준과 제2 시점에서 검출된 수준에서의 변화는 개체에서 수지상 세포 반응의 변화를 가리키는, 방법.
제24항에 있어서,
비정상적인 수지상 세포 반응은 자가면역 반응인, 방법.
제24항에 있어서,
비정상적인 수지상 세포 반응은 염증 반응인, 방법.