CN109906230A - 用于基因治疗的内体溶解剂 - Google Patents
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Abstract
式(I)的化合物及其药学上可接受的盐或溶剂合物，用作特别地用于递送可用于基因治疗的核酸的内体溶解剂，其中Ar是任选地被一个或多个基团R3进一步取代的芳基；A是亲脂性、疏水性部分；R1是磷酸二酯、磷酸三酯、硫醚或酰胺基团；X是未取代的或取代的C6‑C24亚烷基或亚烯基，其任选地被一个或多个‑NR9‑、‑O‑或‑S‑连接基打断，R2是‑YC(R4)(R5)CO2R6。
Description
本发明涉及在基因治疗中用作内体溶解剂(endosomolytic agents)的化合物、包含它们的药物组合物及其在药物中的用途。
发明背景
核酸作为治疗剂具有巨大潜力。然而，将核酸容易地递送至细胞核是其在医学中广泛使用的障碍。极性大分子例如核酸不能简单地穿过亲脂性细胞膜，不同于为简单的过程的小亲脂性分子。在自然界中，极性分子通过主动转运，胞吞作用和吞噬作用进行运输。据信，大分子例如核酸和蛋白质通过胞吞作用运输并最终进入细胞内的膜结合区室，称为内体。作为质子泵的结果，这些内体在内容物水解之前变酸化，导致核酸在其内部降解。
可以利用干扰内体膜而不引起免疫应答的小分子来帮助将核酸载体递送至细胞核。此外，适合的分子必须选择性地干扰酸性内体的膜，而不是它们与体内接触的任何膜。
破坏脂双层的试剂典型地由于具有表面活性特性起作用。极性亲水结构域和非极性亲脂结构域的存在导致它们位于脂双层与水性环境之间的界面处。形成本发明的分子包含叔羧酸，其在离子化时是高极性的，但在质子化时分配到水/有机两相体系的有机相中是足够的非极性。因此，这些分子将在内体的较低pH下改变构象，导致它们具有内体溶解(endosomolytic)性质，因此允许极性大分子穿过膜进入细胞质。用于该目的叔羧酸的功效已在本领域中得到证实，参见Thomas等人，J.Am.Chem.Soc.，(1995)117，pp.2949-2950。
发明概述
本发明涉及一类新的化合物，据信它们提供选择性地干扰内体的脂双层膜的能力，使其内容物穿过膜进入细胞质，从而接近细胞核。这种干扰是通过化合物采用锥形形状并且在pH～5或以下的环境中变成亲脂性来实现的。然后，具有锥形形状的化合物可与双层的均匀成形的组成脂质相互作用，破坏结构并使膜不稳定。在中性pH下，分子是极性的并且不采用锥形形状，因此不会以使其不稳定的方式与膜相互作用。因此，仅在较低的pH下，如在内体内发现的，化合物能够破坏膜的脂双层，并且在本文中是化合物的选择性。因此，据信本发明的化合物可用于通过转染将核酸递送至细胞核。因此它们可用于基因治疗。
因此，本发明提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物
其中
Ar是任选地被一个或多个基团R3取代的芳基；
A是亲脂性、疏水性部分；
R1是磷酸二酯、磷酸三酯、硫醚或酰胺基团；
X是未取代的或取代的C6-C24亚烷基或亚烯基，其任选地被一个或多个-NR9-、-O-或-S-连接基打断，其中R9是C1-C6烷基；
R2是-YC(R4)(R5)CO2R6；
Y是共价键或-(CH2)m-，其中m是1、2或3；
R4和R5相同或不同且各自为取代或未取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基；
R6是氢原子或未取代或取代的C1-C6烷基；
R3部分各自相同或不同且各自选自卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、C1-C6烷氧基和-YC(R4)(R5)CO2R6，且其中R3部分是-YC(R4)(R5)CO2R6，它可以与R2相同或不同；
其中R4、R5和R6是未取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素原子、羟基、C1-C6烷氧基和-NR7R8，其中R7和R8相同或不同且各自为C1-C6烷基。
本发明还提供了基因治疗载体，其包含如上所述的本发明的化合物。
本发明还提供了药物组合物，其包含如上所述的本发明的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，或包含如上所述的本发明的化合物的基因治疗载体，和药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明还提供了用于治疗人或动物体，例如用于基因治疗的如上所述的本发明的化合物、包含本发明的化合物的基因治疗载体或本发明的药物组合物。
本发明还提供了用于通过施用基因治疗载体治疗和/或预防疾病的如上所述的本发明的化合物、包含本发明的化合物的基因治疗载体或本发明的药物组合物。
本发明还提供了上述本发明的化合物或包含本发明的化合物的基因治疗载体在制备用于基因治疗的药剂中的用途。
本发明还提供了产品，其包含用于同时、分开或依次用于基因治疗的如上所述的本发明的化合物和基因治疗载体。
本发明还提供了用于治疗和/或预防需要施用基因治疗载体的疾病的方法，所述方法包括对需要这类治疗的患者施用有效量的如上所述的本发明的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物与基因治疗载体的组合。
在一个具体的实施方案中，本发明的化合物可以与基因治疗组合使用，以便预防和/或治疗肿瘤疾病。
附图简述
图1显示以不同脂质:DNA比改变内体溶解性化合物在脂多聚复合物(lipopolyplex)中的用量对报道基因表达的影响。
图2显示以不同脂质:DNA比添加内体溶解性化合物至脂多聚复合物对报道基因表达的影响。
本发明实施方案的详细描述
当声明上述式(I)的化合物中的任何基团未取代或被取代(或任选取代)时，该基团可以是未取代的，或被一个或多个取代基取代。典型地，这类基团未被取代或被一个或两个取代基取代。
用于药物的式(I)的化合物的盐可以为药学上可接受的盐。然而，其他盐可用于制备本发明中使用的化合物或其药学上可接受的盐。基于选择和制备药学上可接受的盐的标准原理描述于例如Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection andUse，ed.P.H.Stahl&C.G.Wermuth，Wiley-VCH，2002中。用于本发明的化合物的适合的药学上可接受的盐包括加成盐，其可以例如通过将本发明中使用的化合物的溶液与药学上可接受的碱溶液混合而形成。适合的药学上可接受的盐可包括碱金属盐，例如钠盐或钾盐；碱土金属盐，例如钙盐或镁盐；铵盐；和与适合的有机配体形成的盐，例如季铵盐，和葡甲胺盐。此外，当本发明中使用的化合物携带碱性部分，例如胺基时，其适合的药学上可接受的盐可包括酸加成盐，其可例如通过混合本发明中使用的化合物的溶液与药学上可接受的酸的溶液形成，如盐酸，硫酸，甲磺酸，富马酸，马来酸，琥珀酸，乙酸，苯甲酸，柠檬酸，酒石酸或磷酸。
本发明在其范围内包括上述式(I)的化合物的溶剂化物。这些溶剂化物可以与常规的有机溶剂形成，例如烃溶剂如苯或甲苯；氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷；醇溶剂如甲醇、乙醇或异丙醇；醚溶剂如乙醚或四氢呋喃；或酯溶剂如乙酸乙酯。或者，式(I)的化合物的溶剂化物可以与水形成，在这种情况下它们是水合物。
可存在于本发明中使用的化合物上的适合的烷基包括直链和支链的C1-6烷基，例如C1-3烷基，和直链和支链的C10-20烷基。C1-6烷基的典型实例包括甲基和乙基，和直链或支链丙基，丁基和戊基。具体的烷基包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基，2,2-二甲基丙基和3-甲基丁基。衍生的表述例如“C1-6烷氧基”应相应地解释。C10-20烷基的典型实例是十一烷基，十六烷基和十八烷基。
可存在于本发明中使用的化合物上的适合的烯基包括直链和支链的C2-6和C10-24烯基。适合的烯基还包括末端烯基如烯丙基和非末端烯基如巴豆基。烯基可以是顺式或反式。C2-6烯基的典型实例包括乙烯基和烯丙基，和直链或支链、末端或非末端、顺式-或反式-丁烯基、戊烯基和己烯基。具体的烯基包括乙烯基和烯丙基。C10-24烯基的典型实例包括直链、末端或非末端、顺式或反式-烯基。更典型地，它们可能仅包含反式-或末端双键。烯基可具有与其长度允许的一样多的双键，典型地，一个，两个或三个双键，更典型地，一个双键。
可存在于本发明中使用的化合物上的适合的炔基包括直链和支链C2-6炔基。适合的炔基还包括末端炔基，例如乙炔基和炔丙基和非末端炔基，例如丁-2-炔基。典型的例子包括乙炔基和炔丙基。
如本文所用，术语“亚烷基”是指衍生自烷基的二价饱和脂族基团。典型地，这类基团是C6-24亚烷基。适合的亚烷基包括亚十一烷基，亚十二烷基，亚十三烷基，亚十四烷基，亚十五烷基，亚十六烷基，亚十七烷基，亚十八烷基，亚十九烷基和亚二十烷基。当本发明的化合物包含任选取代的直链或支链的亚烷基链时，这种链可任选地被一个或多个取代基取代。适合地，这种链是未取代的，单取代的或二取代的。典型地，这种链是未取代的或单取代的。在一个实施方案中，此类链未被取代。在另一个实施方案中，此类链是单取代的。在进一步的实施方案中，此类链是二取代的。
如本文所用，术语“亚烯基”是指衍生自烯基的二价不饱和脂族基团。这些基团可包含顺式或反式双键，并且可包含多个双键。典型地，这种基团将包含一个，两个或三个双键，更典型地，一个双键。这些基团可以是直链或支链的。典型地，这样的基团将是直链的。当本发明的化合物包含任选取代的直链或支链亚烯基链时，这些链可任选地被一个或多个取代基取代。适合地，这种链是未取代的，单取代的或二取代的。典型地，这种链是未取代的或单取代的。在一个实施方案中，此类链未被取代。在另一个实施方案中，此类链是单取代的。在进一步的实施方案中，此类链是二取代的。
如本文所用，术语“芳基”是指C6-C14的单价碳环芳族基团，其衍生自单个芳环或多个稠合芳环。适合的芳基包括苯基，萘基和蒽基，典型地，苯基或萘基，更典型地，苯基。
如本文所用，术语“卤素”包括氟，氯，溴和碘原子，典型地，氟，氯或溴。
如本文所用，术语“磷酸二酯”是指式O＝P(OR)(OR')OH的基团，其中R和R'是通过碳原子与氧键合的含碳基团，典型地，R和R'选自未取代或取代的烷基，烯基，炔基，亚烷基，亚烯基和芳基。特别地，R和R'是如在本文中所定义的X和A。
如本文所用，术语“磷酸三酯”是指式O＝P(OR)(OR')OR”的基团，其中R、R'和R”是通过碳原子与氧键合的含碳基团，典型地，R、R'和R”选自未取代的或取代的烷基，烯基，炔基，亚烷基，亚烯基和芳基。特别是R和R'是如在本文中所定义的X和A，并且R”可以是烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，碳环或杂环基。
如本文所用，术语“硫醚”是指式R-S-R’的基团，其中R和R’是通过碳原子与硫键合的含碳基团。特别地，R和R'是如在本文中所定义的X和A。
如本文所用，术语“酰胺”是指式RC(＝O)NR'R”的基团，其中R、R'和R”是氢或通过碳原子与碳或氮键合的含碳基团，典型地，R、R'和R”是氢或选自未取代的或取代的烷基，烯基，炔基，亚烷基，亚烯基和芳基。特别地，R和R'之一是X，而另一个如在本文中所定义，和R”是氢或C1-C6烷基。
如本文所用，术语“胆固醇基”是指如下所示的基团
当式(I)的化合物具有一个或多个不对称中心时，它们可因此作为对映异构体存在。当本发明中使用的化合物具有两个或更多个不对称中心时，它们可另外作为非对映异构体存在。本发明应理解为延伸至所有这些对映异构体和非对映异构体及其任何比例的混合物的用途，包括外消旋体。除非另有说明或示出，否则式(I)和下文描述的式子旨在表示所有单独的立体异构体及其所有可能的混合物。此外，式(I)的化合物可以以互变异构体形式存在，例如 除非另有说明或示出，否则式(I)和下文描述的式子旨在表示所有单独的互变异构体及其所有可能的混合物。
应当理解，式(I)中或下文所示的式子中存在的各个独立原子实际上可以以其任何天然存在的同位素的形式存在，其中最丰富的同位素是优选的。因此，举例来说，式(I)中或下文描述的式子中存在的各个个别原子可以作为1H、2H(氘)或3H(氚)原子，典型地为1H存在。类似地，举例来说，式(I)中或下文所描述的式中存在的各个独立碳原子可以作为12C、13C或14C原子存在，典型地为12C。
在本发明的一个实施方案中，A是-R10CH(OR12)R11CH(OR13)Z，其中R12和R13相同或不同且各自为C10-C24烷基或烯基，R10和R11相同或不同且各自为共价键或-(CH2)s-基团，其中s是1、2或3，Z是氢原子或C1-C3烷基。适合地，R12和R13是C12-C22，更适合地是C14-C20，仍然更适合地是C16-C18烷基或烯基。典型地，A是-CH2CH(OR12)CH2OR13，特别是(R)-2,3-二(十八烷基氧基)丙基。在另一个实施方案中，A是未取代的或取代的C17-C35基团，其包含类固醇的稠合环系，典型地，是未取代的或取代的C17-C28基团，其包含类固醇的稠环系统，更典型地A是甾族基团，甚至更典型地，A是胆固醇基。
Ar是芳基。典型地，Ar是萘基或苯基。更典型地，Ar是苯基。
典型地，基团Ar被至少一个基团R3取代，所述基团R3具有式-YC(R4)(R5)CO2R6且与基团R2相同或不同。更典型地，Ar被一个基团R3取代，所述基团R3具有式-YC(R4)(R5)CO2R6且与R2相同或不同。甚至更典型地，Ar被一个基团R3取代，所述基团R3具有式-YC(R4)(R5)CO2R6且与基团R2相同。仍然更典型地，Ar被一个基团R3取代，所述基团R3具有式-CH2C(CH3)2CO2CH3或-CH2C(CH3)2CO2H且与基团R2相同。
典型地，本发明的化合物具有式(II)的结构
其中Ar、A、X、R1和R2如上述所定义。R3a具有式-YC(R4)(R5)CO2R6且与基团R2相同或不同，且R3b各自相同或不同且各自选自卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基或C1-C6烷氧基。Y、R4、R5和R6如上述所定义。p和q各自为0-6的整数，典型地各自为0-3的整数，更典型地各自为0或1，甚至更典型地p是1且q是0。更典型地R3a与R2相同。甚至更典型地R3a与R2相同且所有的R3b均相同。仍然更典型地R3a与R2相同且所有的R3b均为氢。最典型地，R3a与R2相同且为-CH2C(CH3)2CO2CH3或-CH2C(CH3)2CO2H，且所有的R3b均为氢。
典型地，本发明的化合物具有式(III)的结构
其中A、X、R1、R2和R3a如上述所定义。R3b如上述所定义，其中额外选择为氢原子。更典型地R3a与R2相同。甚至更典型地R3a与R2相同且所有的R3b均相同。仍然更典型地R3a与R2相同且所有的R3b均为氢。最典型地，R3a与R2相同且为-CH2C(CH3)2CO2CH3或-CH2C(CH3)2CO2H，且所有的R3b均为氢。
R1是磷酸二酯、磷酸三酯、硫醚或酰胺基团。其中R1是酰胺，其可以具有形式XC(＝O)NRA或AC(＝O)NRX，其中R是氢或含碳有机基团，典型地R是氢或C1-C6烷基，更典型地R是氢。典型地R1是磷酸二酯或磷酸三酯基团。更典型地，R1是磷酸二酯基团。
典型地，Y是-(CH2)m-，其中m是1、2或3。更典型地Y是-CH2-。
典型地R4和R5相同或不同且各自为C1-C6烷基，任选地为C1-C3烷基。更典型地R4和R5相同且各自为C1-C6烷基。甚至更典型地R4和R5相同且各自为C1-C3烷基。仍然更典型地R4和R5均为甲基。
典型地R6是氢原子或C1-C3烷基。更典型地R6是氢原子或甲基。
典型地X是直链或支链未取代或取代的C8-C20亚烷基或亚烯基，其任选地被一个或多个-NR9-、-O-或-S-连接基打断，其中R9是C1-C6烷基。更典型地X是直链或支链未取代或取代的C8-C20亚烷基或亚烯基，其任选地被1、2或3个不相邻-NR9-、-O-或-S-连接基打断。甚至更典型地X是直链或支链C8-C20亚烷基或亚烯基，例如C10-C20、C10-C18或C11-C17亚烷基或亚烯基。仍然更典型地X是直链C8-C20亚烷基或亚烯基，例如C10-C20、C10-C18或C11-C17亚烷基或亚烯基。
本发明的具体的新的化合物包括：
化合物1：3,3'-(5-(11-(((2-氯苯氧基)(((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯；
化合物2：3,3'-(5-(11-(((((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸),铵盐；
化合物3：3,3'-(5-(11-((((S)-2,3-双(十八烷基氧基)丙氧基)(2-氯苯氧基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯；
化合物4：3,3'-(5-(11-((((S)-2,3-双(十八烷基氧基)丙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸),铵盐；
化合物5：3,3'-(5-(17-(((2-氯苯氧基)(((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)磷酰基)氧基)十七烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯；
化合物6：3,3'-(5-(17-(((((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)十七烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸),铵盐。
式(I)的化合物可以使用本领域技术人员已知的标准技术和试剂制备，例如下述那些和实施例的那些。
其中R1是磷酸二酯或磷酸三酯的化合物
其中R1表示磷酸二酯的式(I)的化合物可以由本领域技术人员从其中R1表示磷酸三酯的相应化合物、采用本领域已知的标准反应如水解来制备。
其中R6表示氢原子的式(I)的化合物可以由本领域技术人员从其中R6表示未取代或取代的烷基的相应酯、采用本领域已知的标准反应如水解来制备。
其中R1是磷酸三酯基团且R6是未取代的或取代的烷基的式(I)的化合物可以由式(IV)的化合物来制备：
其中A如上述所定义且Ra是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环或杂环基团；通过下列步骤进行：与活化剂反应，由羟基生成离去基，随后与式(V)的化合物反应：
其中Ar、X和R2如上述所定义。
式(IV)的化合物可以通过下列步骤制备：使式(VI)的化合物
其中Ra如上述所定义；与式A-OH的化合物(其中A如上述所定义)和碱反应。式A-OH的化合物可以商购或易于由本领域技术人员合成。
式(V)的化合物可以由(VII)的化合物来制备
其中Ar、R2和X如上述所定义，且PG是指醇的保护基；例如，如果PG是指-CPh3，其中Ph是苯环，则脱保护可以通过与三异丙基硅烷和浓盐酸反应来进行。
式(VII)的化合物可以通过式(VIII)的化合物
其中X'是指得到式(VII)的化合物中如上述所定义的基团X所需的基团且PG如上述所定义；与式(IX)的化合物的交叉偶联反应，例如Suzuki反应来制备
其中Ar和R2如上述所定义。例如，式(VIII)的化合物可以与9-硼杂二环[3.3.1]壬烷反应。可以使得到的产物与式(IX)的化合物和四(三苯基膦)钯(0)、碳酸钾和二甲基甲酰胺一起反应。
式(VIII)的化合物可以通过使式(X)的化合物
其中X'如上述所定义；采用本领域技术人员已知的标准技术反应来制备。例如，如果PG是指-CPh3，则可以通过与碱，随后与三苯基甲基氯反应来进行。式(X)的化合物可以商购或易于由本领域技术人员由商购化合物来合成。
式(IX)的化合物可以由式(XI)的化合物
其中R4、R5和R6如上述所定义；与碱、然后与式(XII)的化合物反应来制备
其中Ar如上述所定义且u是0-2的整数。
式(XII)的化合物可以通过式(XIII)的化合物
其中Ar和u如上述所定义；与溴化剂反应来制备。式(XIII)的化合物可以商购或易于由本领域技术人员合成。
其中R1是硫醚的化合物
其中R1是硫的式(I)的化合物可以由式(XIV)的化合物
其中Ar、X和R2如上述所定义；与式A-SH的化合物(其中A如上述所定义)和碱反应来制备。
式(XIV)的化合物可以由式(V)的化合物、通过与溴化剂或混合物例如四溴甲烷和三苯基膦反应来合成。
上述式A-SH的化合物可以由式A-OH的化合物通过与硫化氢反应来合成。
其中R1是酰胺的化合物
其中R1是酰胺的式(I)的化合物可以具有式XC(＝O)NR14A(参见式(XV))或AC(＝O)NR14X(参见式(XVI))的酰胺基团。
其中Ar、R2、X和A如上述所定义且R14是氢原子或烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环或杂环基团。
式(XV)的化合物的适合的切断的实例如下方案1中所示。类似切断可如对式(XVI)的化合物进行。
基于上述切断的合成路径如下所述。
式(XV)的化合物可以由式(XVII)的化合物与式A-NHR14的化合物的缩合反应制备，其中A和R14如上述所定义。
式(XVII)的化合物可以由式(XVIII)的化合物、通过用本领域已知的许多试剂例如氧化银(I)氧化来合成。
式(XVIII)的化合物可以由式(XIX)的化合物来合成。例如式(XIX)的化合物可以通过Swern氧化被氧化成式(XVIII)的化合物。
式(XIX)和(XVIII)的化合物可以由上述式(V)的化合物、通过本领域已知的反应来合成。例如，通过活化羟基，然后进行与衍生自甲醛的1,3-二噻烷的极反转反应，且最终氧化产物，得到醇或醛。
其中R14不是氢的式A-NHR14的化合物可以由式A-NH2的化合物通过与烷化剂等反应来合成，其中控制以确保单取代。
式A-NH2的化合物可以由式A-N3的化合物来合成，例如通过用三苯基膦和水的四氢呋喃溶液还原。
式A-N3的化合物可以由上述式A-OH的化合物来合成，例如通过使用叠氮酸的Mitsonobu反应，得到叠氮化物。
式(XVI)的化合物可以通过与式(XV)的化合物类似的方法，使用本领域众所周知的标准技术来制备。
在任意上述合成顺序期间，有必要和/或期望保护所关注的任意分子上的敏感性或反应性基团。这可以通过常规保护基实现，例如描述在Protective Groups in OrganicChemistry，ed.J.F.W.McOmie，Plenum Press，1973；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley&Sons，第3版，1999中的那些。使用本领域中已知的方法在任意便利的随后阶段除去保护基。
已经表明，本发明化合物通过其内体溶解特性是有效的转染增强剂。因此，设计本发明化合物以掺入脂质体膜中，化合物-脂质体复合物又与质粒DNA结合。因此，本发明的化合物可用于基因治疗，即将转基因寡核苷酸递送至细胞。转基因寡核苷酸包括编码治疗性蛋白质(DNA)、RNA以及参与基因沉默的核酸如siRNA或反义RNA的基因。本发明的化合物可另外用于递送蛋白质/肽。
本发明的化合物可以与任意用于递送转基因寡核苷酸/多核苷酸或蛋白质/肽的适合方法组合。
可以使用本发明的化合物在体外将转基因寡核苷酸(或蛋白质/肽)递送至细胞。然而，在本发明的上下文中，转基因寡核苷酸(或蛋白质/肽)典型地在体内被递送至细胞。本发明的化合物还可以用于在体外将转基因寡核苷酸(或蛋白质/肽)递送至细胞，然后在体内将细胞植入受试者。这类技术是本领域众所周知的。
迄今为止，患者中的大多数基因治疗试验都是使用病毒载体进行的。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。虽然本发明的化合物典型地用于非病毒递送方法，但其更容易处理并且几乎没有安全性问题。最简单的非病毒传递系统是使用裸寡核苷酸/多核苷酸(最好是质粒DNA)。本发明的化合物可与裸寡核苷酸/多核苷酸结合使用。寡核苷酸/多核苷酸也可以在例如脂质体(脂复合物)，聚合物囊泡，多聚复合物(polyplex)，脂多聚聚合物内递送或与树枝状大分子组合。此外，可以使用无机纳米颗粒和细胞穿透肽。这些技术在本领域中是众所周知的。
在本发明的上下文中，“基因治疗载体”是指包括转基因寡核苷酸/多核苷酸的任意元件，其被递送至细胞。例如，转基因寡核苷酸/多核苷酸可以存在于质粒载体内(对于裸DNA)，典型地，一旦位于靶细胞内则其包含用于表达寡核苷酸/多核苷酸的控制元件。脂复合物、多聚复合物、脂多聚复合物等也可以被视为基因治疗载体。多聚复合物是指聚合物(例如缩合剂如PEI)与转基因寡核苷酸/多核苷酸的复合物。脂复合物是指脂质和转基因寡核苷酸/多核苷酸的复合物。脂质可以采取例如脂质体或胶束的形式。术语脂多聚复合物是指聚合物(例如缩合剂)、转基因寡核苷酸/多核苷酸和脂质的复合物。形成多聚复合物、脂复合物和脂多聚复合物的方法是本领域众所周知的。
本发明的化合物典型地用于脂复合物/脂多聚复合物中，或者与将转基因材料递送至靶细胞的脂质体组合或者作为其组成部分。
当本发明的化合物与脂复合物或脂多聚复合物(例如脂质体)一起或作为其一部分施用时，相对于脂质的量，本发明的化合物的量(例如通过闪烁计数测定)可以为1-50mol％。典型地，本发明的化合物的量为5-50mol％，更典型地为10-50mol％，甚至更典型地为20-50mol％，仍然更典型地为20-40mol％，最典型地为约20mol％。脂质可以是任何已知适合用于脂复合物或脂多聚复合物的脂质(典型地，用于脂质体或胶束)。已知在这方面有用的脂质包括磷脂和固醇(sterols)。特别有用的脂质包括磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，PEG磷脂，胆固醇衍生物和bola两亲型分子(bolaamphiphiles)。特别地，脂质可以是二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二油酰基磷脂酰丝氨酸或其盐(DOPS)，半琥珀酸胆固醇酯(CHEMS)，胆固醇或油酸，或其任何组合。脂质:核酸磷酸酯(nucleic acid phosphate)含量的摩尔比可以为0.1:1至40:1。典型地，该比例为0.1:1至36:1，更典型地为0.4:1至20:1，更典型地为0.4:1至12:1，甚至更典型地为0.6:1至5:1，仍然更典型地为0.6:1至2:1，最典型地为0.8:1至2:1。
例如，化合物相对于脂质总量的量可以为20-40mol％，且总脂质与DNA的摩尔比可以为2:1至5:1。
本发明还提供了药物组合物，其包含如上所述的本发明的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂合物，以及一种或多种药学上可接受的载体。在一个实施方案中，组合物可进一步包含基因治疗载体。
本发明的药物组合物可采取适合肠胃外，静脉内，口服，口腔，鼻腔，局部，眼或直肠施用的形式，或适合通过吸入或吹入施用的形式。在一个具体实施方案中，所述化合物适用于肠胃外施用。
在一些实施方案中，例如当使用裸寡核苷酸时，配制药物组合物用于直接施用于所需组织。例如，包含本发明化合物和例如裸寡核苷酸的药物组合物可以通过静脉内注射，直接注射到肌肉，肿瘤部位或皮肤上来施用。
式(I)的化合物可以配制用于通过注射进行肠胃外施用，例如通过推注或输注。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如在玻璃安瓿或多剂量容器中，例如玻璃小瓶。用于注射的组合物可以采取诸如油性或水性载体中的悬浮液，溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂，稳定剂，防腐剂和/或分散剂。或者，组合物可以是粉末形式，用于在使用前用适合的载体(例如无菌无热原水)构建。
对于口服施用，药物组合物可以采用例如片剂，锭剂或胶囊的形式，例如通过常规方法用药学上可接受的赋形剂制备，例如粘合剂(例如预胶化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖)，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁，滑石粉或硅胶)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或乙醇酸钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法包衣。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液，糖浆或悬浮液的形式，或者它们可以作为干燥产品存在，用于在使用前用水或其他适合的载体构建。这些液体制剂可以通过常规方法用药学上可接受的添加剂制备，例如悬浮剂，乳化剂，非水性载体或防腐剂。如果适合，制剂还可含有缓冲盐，矫味剂，着色剂或甜味剂。
对于局部施用，本发明中使用的化合物可以方便地配制成适合的软膏，其含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分。特定的载体包括例如矿物油，液体石油，丙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯，乳化蜡和水。或者，可以将本发明中使用的化合物配制在适合的洗剂中，该洗剂含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分。具体的载体包括例如矿物油，硬脂山梨坦，聚山梨醇酯60，十六烷基酯蜡，鲸蜡硬脂醇，苯甲醇，2-辛基十二烷醇和水。
对于眼部施用，本发明中使用的化合物可以方便地配制成等渗的，经pH调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，其中包含或不含防腐剂，例如杀菌剂或杀真菌剂，例如硝酸苯汞，苯扎氯铵或醋酸氯己定。或者，对于眼部施用，化合物可以配制成软膏例如凡士林。
对于直肠施用，本发明中使用的化合物可以方便地配制成栓剂。这些可以通过将活性成分与适合的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放活性成分。这些材料包括例如可可脂，蜂蜡和聚乙二醇。
预防或治疗特定病症所需的本发明中使用的化合物的量将根据所选择的化合物和待治疗的患者的状况的不同而变化。然而，一般而言，对于口服施用，每日剂量可以为约10ng/kg至1000mg/kg，典型地为100ng/kg至100mg/kg，例如约0.01mg/kg至40mg/kg体重；且对于胃肠外施用，约10ng/kg至50mg/kg体重。
本发明的化合物可以与包含转基因寡核苷酸的基因治疗载体同时，分开或依次施用。例如，基因治疗载体可以存在于与本发明的化合物相同的药物组合物中。或者，本发明的基因治疗载体和化合物可以存在于单独的药物组合物中。当基因治疗载体和本发明的化合物在单独的组合物中时，在一个实施方案中，它们可以同时施用(即同时给药)。或者，可以依次施用本发明的基因治疗载体和化合物(即，在基因治疗载体之前或之后立即施用本发明的化合物)。在又一个实施方案中，本发明的基因治疗载体和化合物可以分开施用(即，本发明的化合物在基因治疗载体之前或之后施用，例如以2分钟至2小时的时间间隔施用，更具体地，5分钟至1小时或甚至更具体地10分钟至30分钟)。
本发明化合物在与基因治疗载体组合用于治疗和/或预防各种人类疾病、包括肿瘤疾病和家族遗传疾病时是有益的。
可能是急性或慢性的肿瘤疾病包括增殖性疾病，尤其是癌症和癌症相关并发症(包括骨骼并发症，恶病质和贫血症)。特定类别的癌症包括血液系统恶性肿瘤(包括白血病和淋巴瘤)和非血液系统恶性肿瘤(包括实体肿瘤癌症，肉瘤，脑膜瘤，多形性胶质母细胞瘤，神经母细胞瘤，黑素瘤，胃癌和肾细胞癌)。慢性白血病可能是髓样或淋巴样。白血病的种类包括淋巴细胞性T细胞白血病，慢性粒细胞白血病(CML)，慢性淋巴细胞/淋巴样白血病(CLL)，毛细胞白血病，急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，骨髓增生异常综合征，慢性中性粒细胞白血病，急性淋巴细胞性T细胞白血病，浆细胞瘤，免疫母大细胞白血病，套细胞白血病，多发性骨髓瘤，急性巨核细胞白血病，急性巨核细胞白血病，前髓细胞性白血病和红白血病。淋巴瘤的种类包括恶性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，淋巴母细胞性T细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，MALT1淋巴瘤和边缘区淋巴瘤。非血液恶性肿瘤的种类包括前列腺癌，肺癌，乳腺癌，直肠癌，结肠癌，淋巴结癌，膀胱癌，肾癌，胰腺癌，肝癌，卵巢癌，子宫癌，宫颈癌，脑癌，皮肤癌，骨癌，胃癌和肌肉癌。
最常见的家族遗传疾病包括安格尔曼(Angelman)综合征，卡纳万病，夏-马-图三氏病，色盲，猫叫样哭泣，囊性纤维化，唐氏综合症，杜兴肌营养不良，血色病，血友病，克兰费尔特(Klinefelter)综合征，神经纤维瘤病，苯丙酮尿，多囊肾病，帕-魏二氏综合征，镰状细胞病，脊髓性肌萎缩，泰-萨克斯病，特纳综合征和22q11.2缺失综合征。本发明的化合物适于作为基因替代治疗中的关键组分起作用，因此可有效治疗家族遗传疾病。
在下文中通过参考实施例更详细地解释本发明，所述实施例不应被视为限制性的。
实施例
参比例1
2-氯苯基3-O-胆固醇基磷酸酯,三乙基铵盐
将1,2,4-三唑(2.76g，40.0mmol)溶于无水四氢呋喃(100ml)，并向剧烈搅拌的溶液中加入三乙胺(4.90ml，3.56g，35.2mmol)，随后滴加2-氯苯基二氯磷酸酯(2-chlorophenylphosphodichloridate)(2.40ml，3.65g，14.9mmol)，并将该反应混合物在环境温度下搅拌40min。通过过滤除去大量氯化三乙基铵的白色沉淀，向得到的澄清无色上清液中加入胆固醇(3.88g，10.0mmol)，并将该反应混合物在环境温度下再搅拌4h。将该反应混合物倾入碳酸氢三乙基铵溶液(1M，200ml)，并萃取到二氯甲烷(200ml)中。再将有机相用碳酸氢三乙基铵(2x 200ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后真空除去溶剂，得到白色无定形固体。将其与二异丙基醚一起研磨，得到标题化合物(5.18g，7.64mmol)，为白色结晶固体。
δ1H(CDCl3)：7.71(d，1H，ClPh.C3-H)；7.31(d，1H，ClPh.C6-H)；7.18(6，1H，ClPh.C4-H)；6.93(t，1H，ClPh.C5-H)；5.30(m，1H，Chol.C6-H)；4.17(bm，1H，-O3PO-Chol.C3-H)；3.05(bm，6H，N(CH 2CH3)3)；2.42-2.33和1.97-1.76(2x bm，3H和5H，Chol.C1,2,4,7-H)；1.31(t，9H，N(CH2CH 3)3；)；1.57-1.00(bm，22H，Chol.C脂环族-H和Chol.C脂族-H)；0.97(s，3H，C19-H 3)；0.91(d，3H，Chol.C21-H)；0.86(d，6H，Chol.C24,25-H 3)；0.66(s，3H.Chol.C18-H 3)。C39H65ClO4PN理论值：C＝69.05％，H＝9.66％；测定值：C＝68.90％，H＝9.70％。m/z(ES+)：678(MNEt3 +，60％)；779(M(NEt3)2 +，100％)。mp.＝138℃(分解)(未校准)。
参比例2
(R)-2,3-二(十八烷基氧基)丙基磷酸2-氯苯酯,三乙基铵盐
将1,2,4-三唑(1.56g，22.6mmol)溶于无水四氢呋喃(50ml)，并向剧烈搅拌的溶液中加入三乙胺(2.85ml，2.08g，20.6mmol)，随后滴加2-氯苯基二氯磷酸酯(1.37ml，2.07g，8.43mmol)，并将该反应混合物在环境温度下搅拌1h。通过过滤除去大量氯化三乙基铵的白色沉淀，向得到的澄清无色上清液中加入溶于无水四氢呋喃(10ml)的1,2-O-二十八烷基-Sn-甘油(2.50g，4.19mmol)，并将该反应混合物在环境温度下再搅拌过夜。将该反应混合物倾入去离子水(100ml)，并剧烈振摇至得到均匀乳液，然后在环境温度下静置30min。将该乳液萃取到二氯甲烷(100ml)中。再将有机相用碳酸氢三乙基铵(100ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后真空除去溶剂，从乙醚(100ml)中蒸发固体残余物得到白色蜡状无定形固体。将粗产物用硅胶纯化(6％甲醇/1％三乙胺/二氯甲烷)，得到标题化合物(2.88g，3.24mmol)，为白色固体细粉。
δ1H(CDCl3)：7.53(d，1H，ClPh.C3-H)；7.28(d，1H，ClPh.C6-H)；7.12(t，1H，ClPh.C4-H)；6.92(t，1H，ClPh.C5-H)；3.83(s，2H，-O3POCH 2-)；3.50-3.37(bm，4H，2x-OCH 2-)；3.33-3.26(bm，3H，-OCH<和-O3POCH 2-)；3.07(bm，6H-)，NCH 2CH3)3)；1.42(bm，4H，2x-CH 2CH2O-)；1.20-1.15(bm，69H(-)，N(CH2CH 3)3和2x-(CH 2)15-)；0.80(t，6H，2x-O(CH2)17CH 3)。C45H84O6ClP.C6H15N理论值：C＝68.92％，H＝11.23％，N＝1.58％；测定值：C＝66.11％，H＝10.53％，N＝0.41％。m/z(ES+)：88.8(MNEt3 +，100％)；809.7(MNa+，45％)。mp.＝54-56℃(未校准)。
参比例3
1,3-(5-溴苯)-双-甲醇
向剧烈搅拌的维持在～0℃下在冰浴中的氢化铝锂(7.2g，190mmol)在无水四氢呋喃(500ml)中的混悬液中滴加5-溴间苯二甲酸二甲酯(23.6g，86.5mmol)在无水四氢呋喃(100ml)中的溶液，历时2h，然后使该反应混合物达到环境温度，同时剧烈搅拌过夜。然后向其中滴加去离子水(7.2ml)，然后滴加氢氧化钠溶液(3M，7.2ml)，再滴加去离子水(21.6ml)。通过过滤从澄清无色上清液中除去浅灰色沉淀，真空除去溶剂，得到标题化合物(15.3g，70.6mmol)，为白色结晶固体。
δ1H(d6-DMSO)：6.96(s，2H，Arom.C4,6-H)；6.81(s，1H，Arom.C2-H)；4.14(s，4H，2x-CH 2OH)。C8H7O2Br理论值：C＝44.27％，H＝4.18％；测定值：C＝44.81％，H＝4.26％。m/z(EI+)：216/218(M+，15％)。mp.＝88-90℃(未校准)。
参比例4
5-溴-1,3双(溴甲基)苯
向在无水二氯甲烷(500ml)中的1,3-(5-溴苯)-双-甲醇(31.5g，145mmol)中加入四溴甲烷(103.0g，311mmol)，随后滴加三苯基膦(81.5g，311mmol)在无水二氯甲烷(150ml)中的溶液，将该反应混合物在环境温度下再搅拌过夜。真空除去溶剂，得到澄清深红棕色粘性油状物，将其再溶于二氯甲烷(500ml)，并滴加到剧烈搅拌的冰冷乙醚(1.5l)中。通过过滤除去三苯基膦氧化物沉淀，从得到的澄清上清液中真空除去溶剂，得到精细结晶浆液。将粗产物用硅胶纯化(二氯甲烷)，得到浅黄色结晶固体，使其从二氯甲烷/己烷1:2中重结晶，得到标题化合物(30.0g，87.5mmol)，为大的无色针状晶体。
δ1H(CDCl3)：7.47(s，2H，Arom.C4,6-H)；7.34(s，1H，Arom.C2-H)；4.40(s，4H，2x-CH 2Br)。m/z(CI)：340/342/344/346(M+，10％)；278/280/282(MNH4 +-Br，100％)；261/263/265(M+-Br，50％)。C8H7Br3理论值：C＝28.03％，H＝2.06％；测定值：C＝28.21％，H＝2.00％。mp.＝94-96℃(未校准)。
参比例5
1,3-(5-溴苯)-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯
向溶于无水四氢呋喃(100ml)和在-78℃下在干冰/丙酮浴中搅拌的异丁酸甲酯(7.35ml，6.55g，64.1mmol)中滴加二异丙基氨基锂在庚烷/乙苯/四氢呋喃中的溶液(2M，35.3ml，70.6mmol)。将该反应混合物在-78℃搅拌2h，然后滴加在无水四氢呋喃(15ml)中的5-溴-1,3-双(溴甲基)苯(10.0g，29.2mmol)，将该反应混合物在-78℃再搅拌2h，然后达到环境温度，同时搅拌过夜。真空除去溶剂，将得到的黄色浆液倾入饱和氯化铵溶液(200ml)，萃取到二氯甲烷(200ml)中。将有机相用去离子水(200ml)，然后用盐水(200ml)洗涤，用无水硫酸镁干燥，真空除去溶剂，得到黄色结晶固体。将粗产物从热异丙基醚中重结晶(首批200ml；第二批50ml)，得到标题化合物(8.73g，22.7mmol)，为无色细针状物。
δ1H(CDCl3)：7.10(s，2H，Arom.C4,6-H)；6.77(s，1H，Arom.C2-H)；3.66(s，6H-CO2CH 3)；2.77(s，4H，Arom.C1,3CH 2-)；1.16(s，12H，2x-C(CH 3)2CO2-)。C18H25O4Br理论值：C＝56.11％，H＝6.54％；测定值：C＝56.23％，H＝6.58％。m/z(ES+)：407/409(MNa+，100％)。mp.＝127-129°(未校准)。
参比例6
1-三苯基甲氧基-10-十一碳烯
向溶于无水二氯甲烷(300ml)的十一碳-10-烯-1-醇(10.07g，59.13mmol)中加入无水三乙胺(9.10ml，6.61g，65.3mmol)，然后在搅拌下逐步加入三苯基甲基氯(17.33g，62.16mmol)，并将该反应混合物在环境温度下搅拌过夜。通过过滤除去结晶氯化三乙基铵，真空除去溶剂，得到橙棕色粘性油状物。将粗产物用硅胶纯化(己烷)，得到标题化合物(21.96g，53.22mmol)，为澄清无色粘性油状物。
δ1H(CDCl3)：7.48-7.44和7.33-7.21(2x bm，6H和9H，C三苯甲基-H)；5.90-5.76(bm，1H，-CH＝CH2)；5.04-4.92(bm，2H，-CH＝CH 2)；3.06(t，2H，-CH 2OCPh3)；2.09-2.02(bm，2H，-CH 2CH2OCPh3)；1.68-1.58(bm，2H，-CH 2CH＝CH2)；1.41-1.23(bm，12H，-(CH 2)6-)。C30H36O理论值：C＝87.33％，H＝8.80％；测定值：C＝87.35％，H＝8.78％。m/z(EI+)：412.4(M+，2％)；335.3((M-Ph)+，2％)。
参比例7
1,3-[5-(三苯基甲氧基十一烷基)苯]-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯
向溶于无水四氢呋喃(60ml)和在～0℃下在冰浴中搅拌的1-三苯基甲氧基-10-十一碳烯(2.75g，6.66mmol)中滴加9-硼杂二环[3.3.1]壬烷在四氢呋喃(0.5M，16.0ml，8.0mmol)中的溶液。将该反应混合物在～0℃搅拌2.5h，然后加入1,3-(5-溴苯)-双(二甲基丙酸)二甲酯(3.00g，7.79mmol)与四(三苯基膦)钯(0)(0.61g，0.53mmol)、无水碳酸钾(2.60g)和无水二甲基甲酰胺(20ml)，将该反应混合物在85℃下在氩气气氛中回流过夜。然后将该反应混合物倾入饱和氯化铵溶液(200ml)，萃取到乙酸乙酯(200ml)中。将有机相用去离子水(200ml)，然后用盐水(200ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥。真空除去溶剂，得到澄清淡黄色粘性油状物，将粗产物用硅胶纯化(10％-20％乙醚/己烷)，得到标题化合物(2.67g，3.71mmol)，为澄清无色粘性油状物，静置时固化成白色蜡状固体。
δ1H(CDCl3)：7.46-7.42和7.31-7.19(2x bm，5H和10H，C三苯甲基-H)；6.75(s，2H，Arom.C4,6-H)；6.65(s，1H，Arom.C2-H)；3.65(s，6H，2x-CO2CH 3)；3.04(t，2H，-CH 2OCPh3)；2.78(s，4H，Arom.C1,3CH 2-)；2.50(t，2H，-CH 2OCPh3)；1.63-1.54(bm，4H，Arom.C5CH2CH 2-和-CH 2CH2OCPh3)；1.40-1.23(bm，14H，-(CH 2)7-)；1.15(s，12H，2x-C(CH 3)2CO20)。C48H62O5理论值：C＝80.18％，H＝8.69％；测定值：C＝75.97％，H＝8.37％。m/z(EI+)：718.0(M+，2％)；641.5((M-Ph)+，60％)。
参比例8
1,3-[5-(羟基十一烷基)苯]-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯
向溶于二氯甲烷/甲醇1:1(20ml)的1,3-[5-(三苯基甲氧基十一烷基)苯]-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(2.67g，3.71mmol)中加入三异丙基硅烷(2.0ml，1.55g，9.67mmol)，然后加入4滴浓盐酸。使该反应混合物成剧烈涡旋，并在环境温度下静置4h。真空除去溶剂，得到白色粘性浆液，将粗产物用硅胶纯化(0-5％甲醇/10％-20％乙酸乙酯/己烷)，得到标题化合物(1.07g，2.24mmol)，为澄清无色粘性油状物。
δ1H(CDCl3)：6.74(s，2H，Arom.C4,6-H)；6.65(s，1H，Arom.C2-H)；3.65(s，6H，2x-CO2CH 3)；3.63(t，2H，-CH 2OH)；2.78(s，4H，Arom.C1,3CH 2-)；2.50(t，2H，Arom.C5CH 2-)；1.58-1.51(bm，4H，Arom.C5CH 2CH2-和-CH 2CH2OH)；1.36-1.26(bm，14H，-(CH 2)7-)；1.15(s，12H，2x-C(CH 3)2CO2-)。C29H48O5理论值：C＝73.07％，H＝10.15％；测定值：C＝72.85％，H＝10.18％。m/z(EI+)：476.4(M+，5％)。
实施例9
3,3'-(5-(11-(((2-氯苯氧基)(((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(化合物1)
将3-O-胆固醇基磷酸2-氯苯酯三乙基铵盐(1.45g，2.14mmol)与1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑(1.25g，4.22mmol)一起溶于无水吡啶(10ml)和无水1-甲基咪唑(2ml)，将该反应混合物在环境温度下搅拌30min。然后向其中加入溶于无水吡啶(10ml)中的1,3-[5-(羟基十一烷基)苯]-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(0.84g，1.76mmol)，将该反应混合物在环境温度下搅拌过夜。真空除去溶剂，得到适度浑浊的橙黄色粘性油状物，将粗产物用硅胶纯化(30％乙酸乙酯/己烷)，得到标题化合物(1.50g，1.45mmol)，为澄清几乎无色粘性油状物。
δ1H(CDCl3)：7.49(d，1H，ClPh.C3 H)；7.40(d，1H，ClPh.C6 H)；7.25(t，1H，ClPh.C4 H)；7.12(t，1H，ClPh.C5 H)；5.37(bm，1H，Chol.C6 H)；4.37(bm，1H，-O3PO-Chol.C3 H)。4.17(m，2H，-CH 2OPO3-)；3.66(s，6H，2x-CO2CH 3)；2.79(s，4H，Arom.C1,3CH 2-)；2.51(t，2H，Arom.C5CH 2-)；2.41和1.99-1.10(m和bm，2H和44H，Chol.C脂环族 H和C脂族 H和-(CH 2)9-)；1.15(s，12H，2x-C(CH 3)2CO2-)；1.01(s，3H Chol.C19 H 3)；0.91(d，3H，Chol.C21 H 3)；0.87(d，6H，Chol.C24,25 H 3)；0.67(s，3H，Chol.C18 H 3)。C62H97PO8Cl理论值：C＝71.88％，H＝9.34％；测定值：C＝71.71％，H＝9.36％。m/z(ES+)：1057.6(MNa+，20％)。
实施例10
3,3'-(5-(11-(((((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸),铵盐(化合物2)
将3,3'-(5-(11-(((2-氯苯氧基)(((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(1.50g，1.45mmol)溶于二噁烷(10ml)，向其中加入氢氧化锂溶液(10％w/v，10ml)，将得到的两相反应混合物在60℃下剧烈搅拌至得到均匀乳液24h。将浑浊单相倾入去离子水(200ml)，通过滴加浓盐酸酸化至～pH＝1.0。将得到的致密白色沉淀萃取到氯仿(2x 200ml)中，用无水硫酸钠干燥合并的有机相。真空除去溶剂，得到澄清几乎无色树胶状物。用C18反相硅胶纯化粗产物(二氯甲烷/甲醇/水/浓氢氧化铵2:6:1:0.5)，得到无色无定形固体，将其与乙醚一起研磨，得到标题化合物(1.06g，1.12mmol)，为白色粉状固体。
δ1H(CHCl3)：6.83(s，2H，Arom.C4-6 H)；6.79(s，1H，Arom.C2 H)；5.36(m，1HChol.C6 H)；3.95(bm，1H，-O3POChol.C3 H)；3.83(dd，2H，-CH 2OPO3-)；2.80(s，4H，Arom.C1.3CH 2-)；2.53(t，2H，Arom.C5CH 2-)；2.50-2.31和2.05-1.50(2x bm，2H和6H，Chol.C1 ,2,4,7 H 2-)；1.48-1.08(bm，38H，Chol.C脂环族-H和C脂族-H和-(CH 2)9-)；1.13(s，12H，2x-C(CH 3)2CO2-)；1.02(s，3H，Chol.C19 H 3)；0.93(d，3H，Chol.C21 H 3)；0.87(d，6H，Chol.C24-25 H 3)；0.70(s，3H，Chol.C18 H 3)。C60H93PO8Cl.3(C6H15N)理论值：C＝68.39％，H＝10.42％，N＝4.43％：测定值：C＝69.07％，H＝10.30％，N＝2.36％。m/z(ES-)：895.6(M-H，100％)，527.5(M-Chol，10％)；465.6(Chol.OPO3H)-，20％)。
实施例11
3,3'-(5-(11-((((S)-2,3-双(十八烷基氧基)丙氧基)(2-氯苯氧基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(化合物3)
向溶于无水吡啶(20ml)和1-甲基咪唑(2ml)的混合物的(R)-2,3-二(十八烷基氧基)丙基磷酸2-氯苯酯三乙基铵盐(0.522g，0.59mmol)中加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑(0.25g，0.84mmol)，将得到的浑浊反应混合物在环境温度下搅拌30min。然后向其中加入1,3-(5-羟基十一烷基)苯-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(0.248g，0.52mmol)，将该反应混合物在环境温度下搅拌过夜。然后再加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑(0.25g，0.84mmol)，将该反应混合物在环境温度下再搅拌4小时。然后真空除去溶剂，将得到的浑浊油状液体重新混悬于乙酸乙酯(100ml)，用去离子水(2x 100ml)洗涤。将有机相用无水硫酸镁干燥，真空除去溶剂，得到澄清金黄褐色油状物。将粗产物用硅胶纯化(20％乙酸乙酯/己烷)，得到标题化合物(0.258g，0.21mmol)，为白色蜡状固体。
δ1H(CDCl3)：7.47(d，1H，ClPh.C3-H)；7.39(d，1H，ClPh.C6-H)；7.22(t，1H，ClPh.C4-H)；7.12(t，1H，ClPh.C5-H)；6.74(s，2H，Arom.C4-6-H)；6.65(s，1H，Arom.C2-H)；4.32-4.15(bm，4H，2x-O3POCH 2-)；3.65(s，6H，2x-CO2CHH 3)；3.57-3.38(bm，7H，-OCH<和3x-OCH 2-)；2.78(s，4H，Arom.C1-2-CH 2-)；2.50(t，2H，Arom.C5-CH 2-)；1.69(m，2H，-O3POCH2CH 2-)；1.57(m，6H，3x-OCH 2-)；1.25(bm，76H，-(CH 2)8-和2x-(CH 2)15-)；1.15(s，12H，2x-C(CH 3)2CO2-)；0.88(t，6H，2x-O(CH2)17CH 3)。m/z(ES，+90V)；1267.7(MNa+，100％)；1245.8(MH+，35％。mp.＝27.0-27.5℃(未校准)。
实施例12
3,3'-(5-(11-((((S)-2,3-双(十八烷基氧基)丙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸),铵盐(化合物4)
将3,3'-(5-(11-((((S)-2,3-双(十八烷基氧基)丙氧基)(2-氯苯氧基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(0.255g，0.20mmol)溶于二噁烷(2ml)，向其中加入10％氢氧化锂水溶液(1ml)。将两相反应混合物在60℃下剧烈搅拌过夜。将单相反应混合物倾入去离子水(50ml)，用浓盐酸酸化至pH～1.0。将得到的致密白色沉淀萃取到氯仿(3x 50ml)中，真空蒸发合并的有机相，得到无定形白色固体。通过反相硅胶纯化粗产物(Merck RP-18，二氯甲烷/甲醇/水4:12:3，+2％浓氨)，得到标题化合物(0.101g，0.09mmol)，为白色固体细粉。
δ1H(CDCl3)；6.98(s，1H，Arom.C2 H)；6.74(s，2H Arom.C4-6-H)；3.90-3.81(bm，4H，2x-O3POCH 2-)；3.60-3.40(bm，7H，-OCH<和3x-OCH 2-)；2.76(s，4H，Arom.C1-3-CH 2-)；2.56(t，2H，Arom.C5-CH 2-)；1.60-1.55(bm，6H，-O3POCH2CH 2-和2x-OCH2CH 2-)；1.25(bm，76H，-(CH 2)8-和2x-(CH 2)15-)；1.16(s，12H，-C(CH 3)2CO2-)；0.88(t，6H，2x-O(CH2)17CH 3)。m/z(ES，+27V)：1124.7(MNH4 +，35％)，1107.8(MH+，100％)。
参比例13
16-羟基十六烷酸甲酯
将16-羟基十六烷酸(10.28g，37.73mmol)混悬于甲醇(80ml)中，向其中加入1滴浓硫酸，将该反应混合物在80℃下回流2h。然后将冷却的反应混合物倾入饱和碳酸氢钠溶液(250ml)，并萃取到乙醚(2x250ml)中。将合并的有机相用无水硫酸镁干燥，真空除去溶剂，得到标题化合物(7.78g，27.16mmol)，为有光泽的白色结晶固体。
δ1H(CDCl3)；3.66(s，2H，CO2CH 3)，3.63(t，2H，CH 2OH)；2.29(t，2H，-CH 2CO2-)；1.63-1.53(bm，4H，-CH 2CH2OH和-CH 2CH2CO2-)；1.36-1.24(bm，2H，-(CH 2)11-)。C17H34O3理论值：C＝71.28％，H＝11.96％；测定值：C＝71.35％，H＝12.07％。m/z(ES，27V)；287.1(MH+，100％)。
参比例14
16-(三苯基甲氧基)十六烷酸甲酯
向溶于无水二氯甲烷(150ml)的16-羟基十六烷酸甲酯(6.0g，21.0mmol)中加入无水三乙胺(3.6ml，2.61g，25.8mmol)，然后加入三苯基甲基氯(6.42g，23.0mmol)，将该反应混合物在环境温度下搅拌过夜。真空除去溶剂，得到霜色结晶固体。将粗产物用硅胶纯化(5％乙醚/己烷)，得到标题化合物(9.32g，17.6mmol)，为白色结晶固体。
δ1H(CDCl3)；7.46-7.42和7.31-7.19(2x bm，5H和10H，C三苯甲基-H)；3.66(s，3H-CO2CH 3)；3.04(t，2H，-CH 2OCPh3)；2.30(t，2H，-CH 2CO2-)；1.64-1.57(bm，4H，-CH 2CH2OCPh3和-CH 2CH2CO2-)；1.28-1.24(bm，22H，-(CH 2)11-)，C25H48O3理论值：C＝81.77％，H＝9.15％；测定值：C＝81.85％，H＝9.18％。m/z(ES+)：551.3(MNa+，20％)；243.1(CPh3，100％)。mp.＝52.54℃(未校准)。
参比例15
16-三苯基甲氧基-1-十六醇
向在-0℃下在冰浴中剧烈搅拌的氢化铝锂(0.73g，19.2mol)在无水四氢呋喃中的混悬液中滴加16-(三苯基甲氧基)十六烷酸甲酯(9.0g，17.0mmol)。使该反应混合物达到环境温度，同时搅拌过夜。然后向剧烈搅拌的反应混合物中滴加去离子水(0.73ml)，然后滴加氢氧化钠溶液(3M，0.73ml)，最终滴加去离子水(2.19ml)。通过过滤除去浅灰色沉淀，真空蒸发得到的澄清无色上清液，得到标题化合物(7.97g，15.9mmol)，为澄清、无色粘性油状物，其缓慢地固化成白色结晶固体。
δ1H(CDCl3)；7.46-7.42和7.32-7.19(2x bm，5H和10H，C三苯甲基-H)；3.63(t，2H，-CH 2OH)；3.04(t，2H，-CH 2OCPh3)；1.64-1.54(bm，4H，-CH 2CH2OH和-CH 2OCPh3)；1.43-1.24(bm，24H，-(CH 2)12-)，C35H48O2理论值：C＝83.95％，H＝9.66％；测定值C＝84.14％，H＝9.72％。m/z(EI+)：500.5(M+，0.03％)；423.6(M+-Ph，1％)；243.3(CPh3 +，45％)。
参比例16
16-溴-1-(三苯基甲氧基)十六烷
向搅拌的溶于无水二氯甲烷(250ml)的16-三苯基甲氧基-1-十六醇(7.95g，15.9mmol)中加入无水三乙胺(4.40ml，3.19g，31.6mmol)，然后逐步加入四溴甲烷(5.79g，17.5mmol)、三苯基膦(4.58g，17.5mmol)。将深色反应混合物在环境温度下搅拌2h，然后真空除去溶剂，得到暗红色粘性油状物。将粗产物用硅胶纯化(0-5％乙醚/己烷)，得到标题化合物(6.93g，12.3mmol)，为白色结晶固体。
δ1H(CDCl3)；7.47-7.43和7.32-7.19(2x bm，6H和9H，C三苯甲基-H；(3.41(t，2H，-CH 2Br)；3.05(t，2H，-CH 2OCPh3)；1.90-1.81(bm，2H，-CH 2CH2Br)；1.64-1.57(bm，2H，-CH 2OCPh3)；1.45-1.25(bm，24H，-(CH 2)12-)。C35H47OBr理论值：C＝74.58％，H＝8.41％，测定值C＝74.72％，H＝8.45％。m/z(EI+)：563/565(M+，1％)；485/487(M+-Ph，2％)；243(CPh3 +，100％)。mp.＝59-60℃(未校准)。
参比例17
17-三苯基甲氧基-1-十七碳烯
将16-溴-1-(三苯基甲氧基)十六烷(5.04g，8.94mmol)和三苯基膦(2.46g，9.38mmol)一起混悬于无水乙腈(5ml)中，在80℃下在氩气气氛中搅拌36h。冷却得到的澄清淡黄色树胶状物，然后溶于无水四氢呋喃(50ml)，在～0℃下在冰浴中搅拌，同时滴加二异丙基氨基锂的庚烷/乙苯/四氢呋喃溶液(2M，9.0ml，18.0mmol)。再搅拌10min后，加入低聚甲醛(paragormaldehyde)(0.535g，17.98mmol eqiv.CH2O)，将该反应混合物在～0℃搅拌1h，然后使其达到环境温度，同时搅拌过夜。将该反应混合物倾入饱和氯化铵溶液(100ml)，萃取到乙醚(100ml)中。将有机相用盐水(100ml)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。真空除去溶剂，得到澄清金黄棕色粘性油状物。将粗产物用硅胶(己烷)纯化，得到标题化合物(1.28g，2.58mmol)，为白色蜡状结晶固体。
δ1H(CDCl3)；7.47-7.43和7.32-7.20(2x bm，6H和9H，C三苯甲基-H)；5.89-5.75(cm，1H，-CH＝CH2)；5.03-4.90(bm，2H，-CH＝CH 2)；3.05(t，2H，-CH 2)；3.05(t，2H，-CH 2OCPh3)；2.03(m，2H，-CH 2CH＝CH2)；1.66-1.57(bm，2H，-CH 2CH2OCPh3)；1.37-1.19(bm，24H，-(CH2)12-)。C36H48O理论值：C＝87.04％，H-9.74％l测定值：C＝87.31％，H＝9.76％。
m/z(EI+)：496.5(M+,1％)：419.6(M+Ph，0.5％)；243.3(CPh3+90％)。
参比例18
1,3-[5-(三苯基甲氧基十七烷基)苯]-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯
向在～0℃下在冰浴中搅拌的17-三苯基甲氧基-1-十七碳烯(1.38g，2.78mmol)在无水四氢呋喃(20mo)中的溶液中滴加9-硼杂二环[3.3.1]壬烷在四氢呋喃中的溶液(0.50M，6.70ml，3.35mmol)，将该反应混合物在～0℃搅拌3h。然后向其中加入1,3-(5-溴苯)-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(0.974g，2.53mmol)与四(三苯基膦)钯(0)(0.20g，0.17mmol)、无水碳酸钾(0,85g)和无水二甲基甲酰胺(7.5ml)，将该反应混合物在85℃下在氩气气氛中回流过夜。将该反应混合物冷却至环境温度，倾入饱和氯化铵溶液(100ml)，萃取到乙酸乙酯(100ml)中。将有机相再用饱和氯化铵溶液(2x 100ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，真空除去溶剂。用硅胶纯化粗产物(20％乙醚/己烷)，得到标题化合物(1.14g，1.42mmol)，为柔软蜡状白色固体。
δ1H(CDCl3)：7.46-7.42和7.31-7.19(2x bm，5H和10H，C三苯甲基-H)；6.75(s，2H，Arom,C4.6-H)；6.67(s，1H，Arom.C2-H)；3.65(s，6H，x-CO2CH3)；3.04(T，2H,-CH2OCPh3)；2.78(s，4H，Arom,C1,3-CH2)；2.51(t，2H，Arom.C5-CH2)；1.64-1.54(bm，6H，Arom.C5CH2CH2-和CH2CH2CH2OCPh3)；1.26-1.24(bm，24H(CH2)12)；1.15(S，12h-C(CH3)2CO2-)；C53H74O5理论值：c＝80.75％，H＝9.29％，测定值：C＝77.44％，H＝8.93％，m/z(EI+)：802.5(M+，0.001％)；243.4(CPh3+，50％)。
参比例19
1,3-[5-羟基十七烷基)苯]-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯
向溶于二氯甲烷/甲醇1:1(10ml)的1,3-[5-三苯基甲氧基十七烷基)苯]-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(1.14，1.42mmol)中加入三异丙基硅烷(1.00ml，0.773g，4.88mmol)，然后加入2滴浓盐酸。使该反应混合物成剧烈涡旋，然后在环境温度下静置3h。真空除去溶剂，用硅胶纯化粗产物(10％-20％乙酸乙酯/己烷)，得到标题化合物(0.53g，0.94mmol)，为澄清无色粘性油状物，其在延长静置时固化得到白色结晶固体。
δ1H(CDCl3)：6.74(s，2H.Arom.C4,6-H)；6.64(s，1H，Arom.C2-H)；3.65(s,6H，2x-CO2CH3)；3.63(t，2H，-CH2OH)；2.78(s，4H，Arom.C1,3-CH2)；2.51(t，2H-CH2OH)；1.61-1.52(gm，2H，-CH2CH2OH)；1.36-1.23(bm，28H，-(CH2)14-)；1.14(s，12H，2x-C(CH3)2CO2-)。C35H60O5理论值：C＝74.95％，H＝10.78％；测定值：C＝74.88％，H＝10.80％。m/z(EI)：560.6(M+2％)。mp＝25.26℃(未校准)。
实施例20
3,3'-(5-(17-(((2-氯苯氧基)(((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)磷酰基)氧基)十七烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(化合物5)
将2-氯苯基3-O-胆固醇基磷酸酯,三乙基铵盐(0.58g，0.86mmol)与1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑(0.85g，2.86mmol)溶于无水吡啶(4ml)和无水1-甲基咪唑(0.8ml)，将该反应混合物在环境温度下搅拌30min。然后向其中加入溶于无水吡啶(4ml)的1,3-[5-羟基十七烷基)苯]-双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(0.39g，0.70mmol)，将该反应混合物在环境温度下搅拌过夜。真空除去溶剂，得到黄色粘性油状物和结晶固体，用硅胶纯化粗产物(20％乙酸乙酯/己烷)，得到标题化合物(0.40g，0.36mmol)，为澄清无色粘性油状物。
δ1H(CDCl3)：7.47(d，ClPh C3-H)；7.40(d，1H，ClPh C6-H)；7.23(t，1H，ClPh C4-H)；7.09(t，1H，ClPh C5-H)；6.74(s，2H，Arom.C4-6-H)；6.65(s，1H，Arom.C2-H)；5.36(bm，1H，Chol.C6-H)；4.33(bm，1H，-O3PO-Chol.C3-H)；4.17(dd，2H，-CH 2OPO3-)；3.65(s，6H，2x-CO2CH 3)；2.78(s，4H，Arom.C1,3CH 2-)；2.50(t，2H，Arom.C5CH 2-)；2.47和2.03-1.00(m和bm，2H和56H，Chol.C脂环族-H和C脂族-H和-(CH 2)15-)；1.14(s，12H，2x-CCH 3)2CO2-)；1.01(s，3H，Chol.C19 H 3)；0.91(d，3H，Chol.C21 H 3)；0.86(d，6H，Chol.C24,25 H 3)；0.67(s，3H，Chol.C18 H 3)；C68H108PO8Cl理论值：C＝72.92％，H＝9.72％；测定值：C＝72.96％，H＝9.72％。m/z(ES+)：1136.4(MNH4 +，40％)。
实施例21
3,3'-(5-(17-(((((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)十七烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸),铵盐
向溶于二噁烷(2.5ml)的3,3'-(5-(17-(((2-氯苯氧基)(((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)磷酰基)氧基)十七烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯(0.41g，0.36mmol)中加入氢氧化锂溶液(10％w/v，2.5ml)，将得到的两相反应混合物在60℃下剧烈搅拌至得到均匀乳液过夜。然后将浑浊粘性乳液溶于去离子水(50ml)，通过滴加浓盐酸酸化至pH＝1.0。将得到的致密白色沉淀萃取到氯仿(2x100ml)中，将合并的有机相用无水硫酸钠干燥，真空除去溶剂，得到白色精细结晶固体。用C18反相硅胶(二氯甲烷/甲醇/水2:6:1；1％浓氢氧化铵)纯化粗产物，得到标题化合物(0.18g，0.14mmol)，为精细白色固体。
δ1H(CD3OD)：6.71(s，1H，Arom.C2- H)；6.67(s，1H，Arom.C4,6-H)；5.23(m，1H，Chol.C6-H)；3.83(bm，1H，-O3PO-Chol.C3-H)；3.74(bm，2H，-CH 2OPO3-)；2.67(s，4H，Arom.C1, 3CH 2-)；2.43(t，2H，Arom.C5CH 2-)；2.38-2.22和1.87-1.70(2x bm，2H和6tH，Chol.C1,2,4, 7 H 2-)；1.47-1.05(bm，50H，Chol.C脂环族 H和C脂族 H和-(CH 2)15-)；1.03(s，12H，2x-C(CH 3)2CO2-)；0.89(s，3H，Chol.C19 H 3)；0.77(d，3H，CholC21 H 3)；0.74(d，3H，Chol.C26,27 H 3)；0.56(s，3H，Chol.C18 H 3)。m/z(ES-)；980.0(M-，100％)。
实施例22
使用脂多聚复合物转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞
材料
使用标准分子克隆技术构建包含在人巨细胞病毒立即早期启动子控制下的细菌β-半乳糖苷酶基因的质粒pEGlacZ。通过用HindIII和BclI裂解pGFP-N1(Clontech)以除去报道基因片段衍生7676碱基对(bp)。然后通过HindIII将来自pSV-β-半乳糖苷酶(Promega)的β-半乳糖苷酶编码区插入BamHI片段。然后使用阴离子交换柱(QiagenLtd)纯化质粒DNA。将每个碱基对的平均分子量计算为620.84Da(310.5Da：单磷酰化核苷酸)。然后基于单负电荷与每个核苷酸结合确定质粒上的负电荷的量。
包含氨基酸序列YHRRQRSRRRRRRSGRHRRRHRRGCR的R26肽即人鱼精蛋白P2蛋白衍生的肽由Peptide Protein Research Ltd.，Bishop’s Waltham，U.K.提供，且通过Fmoc固相肽化学、根据Atherton和Sheppard的方法合成。(Ref：Atherton，E.；Sheppard，R.C.(1989)。Solid Phase peptide synthesis：a practical approach.Oxford，England：IRL Press)。
二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、油酸(顺式-十八烷酸)、胆固醇、半琥珀酸胆固醇酯(CHEMS)、干氯仿和缓冲成分由Sigma-Aldrich Company Ltd.Dorset，UK提供。放射性标记的3H-胆固醇(1-α,2-α(n)-3H胆固醇)由Amersham，UK提供。
方法
脂质体制备
在100ml圆底烧瓶中以表1中所示的不同组合将化合物2(实施例10)、DOPC、胆固醇和油酸至每批次总计60μmol与2μl 3H胆固醇一起溶于4mL干氯仿。通过在60℃旋转蒸发形成脂质薄膜，进一步用冷冻干燥器干燥过夜。通过在60℃与剧烈搅拌下在1.5-2mM直径玻璃珠存在下添加4mL去离子水和30mL 1M NaOH使脂质薄膜再水化，谨慎地维持pH在7.5-8.0的范围，导致形成多层脂质体(MLV)。
小的单层脂质体(SUVs)由MLV使用French Press(SLM Aminco)在1000psi压力下生产。制备后，取出20mL等分部分用于闪烁计数，以便测定最终脂质浓度。通过动态光散射设备(Coulter N4Plus)检查SUV制品的粒径，并且将其测定至80-110nm的单峰直径范围。
表1
| 脂质 | 批号1 | 批号2 | 批号3 | 批号4 |
| mol％ | mol％ | mol％ | mol％ | |
| 化合物2 | 1 | 5 | 20 | 40 |
| DOPC | 40 | 40 | 40 | 60 |
| 胆固醇 | 39 | 35 | 20 | 0 |
| 油酸 | 20 | 20 | 20 | 0 |
多聚复合物制备
用去离子水制备144μg/ml为DNA缩合剂的R26肽和60μg/ml质粒DNA的储备溶液。通过在涡旋下向R26溶液中滴加质粒DNA混合等体积的每种成分。多聚复合物的电荷比为3.9:1(肽正电荷残基与DNA负电荷磷酸盐)。
脂多聚复合物制备
用10mM HEPES缓冲液pH 8-15μg/ml DNA当量稀释多聚复合物制品。用相同缓冲液稀释批号1-4的脂质体，得到4种浓度，使得最终脂质：DNA磷酸酯之比为2:1、5:1、12:1和36:1。通过在涡旋下向脂质体混悬液中滴加等体积的多聚复合物溶液形成脂多聚复合物。
CHO细胞转染
将CHO细胞以100 000个细胞/孔接种入24-孔板的包含10％透析的胎牛血清(FCS，Gibco BRL)的Opti-MEM(Gibco BRL)培养基并且维持在37℃下在5％CO2温育箱中24h，然后进行实验。在转染前在Opti-MEM(Gibco BRL)中洗涤1次粘附细胞。除去洗涤培养基并且用0.5ml Opti-MEM替换，向其中加入167μl脂多聚复合物(5μgDNA当量)。在一式三份的孔中测试各脂多聚复合物制品。将细胞在37℃下在5％CO2气氛中再温育4h，然后除去培养基和无细胞结合的脂多聚复合物，并且添加1ml新鲜培养基(Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)+谷氨酸、天冬酰胺、腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和10％FCS。
将细胞再培养72h，然后收获，抽吸培养基，用1ml磷酸盐缓冲盐水将细胞洗涤2次。通过添加200μl/孔裂解缓冲液(Promega)裂解细胞，并且在轨道混合器上将板搅拌15min。将裂解物转入各埃彭道夫管，通过用移液管尖刮取谨慎取出粘附细胞，然后除去。通过在离心机中离心5min除去细胞碎片，然后将上清液转入澄清埃彭道夫管。
如下使用鼻塞酶测定试剂盒(Promega)测定β-半乳糖苷酶(β-gal)活性水平：将50μl细胞提取物与试剂盒底物O-基-β-D-半乳糖吡喃糖苷一起在37℃下在缓冲溶液中温育30min。通过添加150μl 1M碳酸钠终止反应，在420nm测定吸光度(Multiskan Ascent读板仪，Labsystems)。从校准曲线中插入吸光度值以得到以mU/ml计的酶活性。由此将这些值参照如通过BCA测定试剂盒(Pierce)测定的裂解物蛋白质浓度校准并且表示为mUβ-gal/mg蛋白质。
结果
结果如图1中所示。包含胆固醇、油酸和DOPC混合物的脂多聚复合物在无化合物2或1mol％化合物2存在下导致几乎无或无β-半乳糖苷酶表达，而对于在较低脂质与DNA之比为2:1下的制品(批号4)，报道基因表达岁化合物含量增加而增加。当胆固醇/油酸成分完全被40mol％化合物2取代时，表达最高。在较高脂质与DNA之比下，表达水平并不显著，但5:1脂质与DNA和20mol％化合物2的制品除外。
实施例23
材料
材料如实施例22中所述。
方法
脂质体制备
在化合物2存在和不存在下评价包含DOPC和CHEMS的阴离子脂质体组合物。遵循实施例22中的方案，以便使用在先的成分的组合按照表2中所示的摩尔比制备SUV。对于批号5和6，这些SUV的单峰直径分别为125nm和143nm。
表2
| 脂质 | 批号5 | 批号6 |
| mol％ | mol％ | |
| 化合物2 | 20 | 0 |
| DOPC | 60 | 60 |
| CHEMS | 20 | 40 |
多聚复合物制备
用去离子水制备144μg/ml作为DNA缩合剂的R26肽和60μg/ml质粒DNA的储备溶液。通过在涡旋下向R26溶液中滴加质粒DNA混合等体积的每种成分。多聚复合物的电荷比为3.9:1(肽正电荷残基与DNA负电荷磷酸盐)。
脂多聚复合物制备
遵循实施例22的方案。对于批号5&6脂质体，进行稀释至0.6:1、0.8:1和5.5:1之比。通过在涡旋下向脂质体混悬液中滴加等体积的多聚复合物溶液形成脂多聚复合物。
CHO细胞转染
遵循实施例22的方案。
结果
结果如图2中所示。用包含胆固醇基官能团和阳离子羧酸酯的单一部分取代胆固醇/油酸/对得到较为简单的系统，其用于研究化合物2的内体溶解特性。因此，将不包含化合物2或包含20mol％化合物2的脂多聚复合物直接与后者比较，导致高的、显著水平的β-半乳糖苷酶表达，超过0.6:1-5.5:1之比的脂质:DNA，其中观察到的最高水平为0.8:1的脂质:DNA。这与在不存在化合物2的情况下制备的脂多聚复合物超过脂质与DNA的等效范围(其中表达水平不可检测)相反，因此证实了化合物2作为转染增强剂的有效性。
本文呈现的数据证实本发明的化合物通过其内体溶解特性是有效转染增强剂。
Claims (23)
1.式(I)的化合物，
其中
Ar是任选地被一个或多个基团R3进一步取代的芳基；
A是亲脂性、疏水性部分；
R1是磷酸二酯、磷酸三酯、硫醚或酰胺基团；
X是未取代的或取代的C6-C24亚烷基或亚烯基，其任选地被一个或多个-NR9-、-O-或-S-连接基打断，其中R9是C1-C6烷基；
R2是-YC(R4)(R5)CO2R6；
Y是共价键或-(CH2)m-，其中m是1、2或3；
R4和R5相同或不同且各自为取代或未取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基；
R6是氢原子或未取代或取代的C1-C6烷基；
R3部分各自相同或不同且各自选自卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、C1-C6烷氧基和-YC(R4)(R5)CO2R6，且其中当R3部分是-YC(R4)(R5)CO2R6时，它可以与R2相同或不同；
其中R4、R5和R6是未取代的或被1、2或3个取代基取代，所述取代基选自卤素原子、羟基、C1-C6烷氧基和-NR7R8，其中R7和R8相同或不同且各自为C1-C6烷基；
或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
2.权利要求1的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中A是-R10CH(OR12)R11CH(OR13)Z，其中R12和R13相同或不同且各自为C10-C24烷基或烯基，R10和R11相同或不同且各自为共价键或-(CH2)s-基团，其中s是1、2或3，Z是氢原子或C1-C3烷基；或者A是包含类固醇稠合环系的未取代或取代的C17-C35基团。
3.权利要求1或2的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中A是(R)-2,3-二(十八烷基氧基)丙基或胆固醇基。
4.权利要求1-3任一项的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中芳基Ar是苯基。
5.权利要求1-4任一项的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其包含至少一个R3基团，所述R3基团具有式-YC(R4)(R5)CO2R6且与基团R2相同或不同。
6.权利要求1-5任一项的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述化合物具有如下结构：
其中A、X、R1和R2如在权利要求1中所定义，R3a具有式-YC(R4)(R5)CO2R6且与基团R2相同或不同，且R3b各自相同或不同且各自选自氢原子、卤素原子、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基或C1-C6烷氧基，且其中Y、R4、R5和R6如在权利要求1中所定义。
7.权利要求1-6任一项的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R1是磷酸二酯或磷酸三酯基团。
8.权利要求1-7任一项的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中Y是-CH2-。
9.权利要求1-8任一项的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R4和R5是未取代的C1-C6烷基。
10.权利要求1-9任一项的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R6是氢原子或未取代的C1-C3烷基。
11.权利要求1-10任一项的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中X是-(CH2)n-，其中n是10-20。
12.权利要求1-11任一项的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述化合物是如下化合物之一：
3,3'-(5-(11-(((2-氯苯氧基)(((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯；
3,3'-(5-(11-(((((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸),铵盐；
3,3'-(5-(11-((((S)-2,3-双(十八烷基氧基)丙氧基)(2-氯苯氧基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯；
3,3'-(5-(11-((((S)-2,3-双(十八烷基氧基)丙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)十一烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸),铵盐；
3,3'-(5-(17-(((2-氯苯氧基)(((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)磷酰基)氧基)十七烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸)二甲酯；
3,3'-(5-(17-(((((3R,10R,13R)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)十七烷基)-1,3-亚苯基)双(2,2-二甲基丙酸),铵盐。
13.基因治疗载体，其包含权利要求1-12任一项的化合物。
14.权利要求13的基因治疗载体，其为多聚复合物、脂复合物或脂多聚复合物。
15.权利要求14的基因治疗载体，其中脂复合物或脂多聚复合物包含脂质体。
16.药物组合物，其包含权利要求1-12任一项的化合物或权利要求13、14或15的基因治疗载体和药学上可接受的载体或稀释剂。
17.权利要求1-12任一项的化合物、权利要求13、14或15的基因治疗载体或权利要求16的药物组合物，用于治疗人或动物体。
18.权利要求1-12任一项的化合物、权利要求13、14或15的基因治疗载体或权利要求16的药物组合物，用于基因治疗。
19.权利要求1-12任一项的化合物或权利要求13、14或15的基因治疗载体在制备用于基因治疗的药剂中的用途。
20.产品，其包含用于同时、分开或依次用于基因治疗的权利要求1-12任一项的化合物和基因治疗载体。
21.用于治疗和/或预防需要施用基因治疗载体的疾病的方法，其包括对有这类治疗需求的患者施用有效量的权利要求1-12任一项的化合物与基因治疗载体的组合。
22.权利要求21的方法，其中权利要求1-12任一项的化合物与基因治疗载体同时、依次或分开施用。
23.权利要求21或22的方法，其中所述基因治疗载体如在权利要求14或15中所定义。
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Address after: Brussels Applicant after: UCB biopharmaceutical Co.,Ltd. Address before: Brussels Applicant before: UCB BIOPHARMA SPRL |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |