CN109897105A - Ev71病毒的单克隆抗体、其制备方法及其检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明提供了EV71病毒的单克隆抗体、其制备方法及其检测试纸条。EV71病毒的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO:2所示。获得了可以广泛识别病毒VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白的单克隆抗体；本发明获得了标记胶体金后性质依然稳定的金标抗体，并成功表达了可以与抗体的Fc端结合的Protein A蛋白，为试纸条的制备提供了条件；获得了可以快速有效检测EV71病毒存在的试纸条。这为手足口病病原体诊断和临床救治方法的制定提供了快速有效的指导。EV71快速检测试纸条的出现为防控和救治手足口病提供了有力的依据。

Description

EV71病毒的单克隆抗体、其制备方法及其检测试纸条

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及EV71病毒的单克隆抗体、其制备方法及其检测试纸条。

背景技术

近年来，我国各地区相继爆发手足口病疫情，患者以1-5岁婴幼儿为主，有少数成人患者病例报道。临床症状主要有：发热，温度一般在38℃左右；恶心、呕吐、食欲不振；手、足、口腔、臀部出现近圆形状疱疹或斑状皮疹。患者大多数可以自愈，但重症患者常伴有心、脑、肺等人体重要器官炎症如心肌炎、脑炎和肺水肿等并发症，有极少数患者甚至还会因此失去生命(Yu XJ,Liang MF,et al：Fever with Thrombocytopenia Associated with aNovel Bunyavirus in China,NEJM,(10.1056/NFJMoalol0095)was published on March16,2011,at NEJM.Org.)。据目前研究发现引起手足口病的病毒有20多种，其中以1958年首次提出的柯萨奇病毒(Coxsackieviruses)A16型即CA16病毒和1969年首次提出的肠道病毒71型即EV71病毒为主。CA16病毒引发的手足口病，患者一般可以自愈，死亡率极低。而EV71病毒引发的手足口病除常见病症外还往往引发患者脑膜炎、脊髓灰质炎等危及生命的中枢神经系统并发症和心肌炎、肺水肿等涉及人体重要脏器的并发症。因此，EV71病毒引起的手足口病致残率和死亡率极高。EV71病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，电镜下观察病毒颗粒是直径大小为25nm左右的20面体对称结构，毒粒呈球形但无囊膜和突起结构，遗传物质为单股正链RNA。EV71病毒的衣壳蛋白由4种蛋白质构成，分别为VP1、VP2、VP3以及VP4，其中VP4蛋白位于毒粒内部，VP1、VP2、VP3蛋白位于毒粒表面，因此VP1、VP2、VP3蛋白与EV71的免疫原性相关。此外，根据VP1蛋白的突变情况可以把EV71病毒分为3个亚型，分别命名为亚型A、B和C。亚型B又可分为亚型B1～B5，亚型C分为亚型C1～C4，目前我国流行的EV71病毒感染病例主要是亚型C4(Li L,He Y,Yang H,et al.Genetic characteristics of humanenterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 inShenzhen,People′s Republic of China.J Clin Microbiol.2005,43:3835-3839.)。该病毒在1969年于美国实验室第一次被分离出(Hagiwara A,Tagaya I,Yoneyama T.Epidemicof hand,foot and mouth disease associated with enterovirus 71infection.Intervirology.1978,9(l):60-63.)，先后在欧洲南部的保加利亚和中部的匈牙利两国流行。据保加利亚相关卫生机构1975年统计数据显示该病毒引发的手足口病患者共有750例，致瘫率为19.87％，致死率为5.87％(Chumakov M,Voroshilova M,ShindarovL,Lavrova I,Gracheva L,Koroleva G,et al.Enterovirus 71 isolated from cases ofepidemic poliomyelitis-like disease in Bulgaria.Arch Virol.1979,60(3-4):329-340.)。20世纪末，东南亚地区发生了大范围的EV71病毒感染事件，中国也有类似病例报告。1981年我国上海首次检查出该病毒的存在，此后我国各地不断有EV71病毒感染病例出现，尤其是2007年我国山东地区爆发大范围手足口病疫情，感染人数近4万，死亡人数14例。由于EV71病毒引起的手足口病发病急、传染快、涉及病患心里和身体抵抗力低且致死率、致残率高，我国卫生部已将其列入丙类传染病进行防控治疗，并于2008年公开发布了《手足口病预防控制指南》。因此，EV71预防疫苗的研究，手足口病例的快速而有效的检测，治疗性抗体的制备，具有重要的临床意义和社会价值。

目前，我国针对EV71单克隆抗体的制备主要以VP1蛋白作为抗原，对于VP1蛋白的获取主要有两种方式，一种是采用体外分子构建的方法，将VP1蛋白的全基因提取后连接到载体上后，利用大肠杆菌等菌株进行原核表达。这种方法的缺点是首先表达的抗原与自然状态下存在的抗原具有很大的差异，抗原无法在原核表达过程中进行翻译后修饰，包括糖基化修饰和蛋白结构的正确折叠。其次是获得抗原中会有一部分表达菌株自身产生的蛋白，尽管后期经过系统的纯化，但表达菌株蛋白仍然会有残存并会影响免疫结果和检测结果。有时，原核表达还会造成蛋白的不正确折叠而形成难以纯化和回复正确折叠结构的包涵体。另外，原核表达过程中还可能造成蛋白质水解，从而破坏抗原的完整性。另一种免疫原的选择是根据分析VP1蛋白的抗原表位最终确定一段连续的抗原表位，一般是10个氨基酸左右作为抗原。这种方法的缺点是抗原由10个左右氨基酸组成必须要偶联载体才具有较强的免疫原性，但是同时偶联的载体可能会干扰单克隆抗体的筛选和检测。同时，短肽作为抗原仅可以筛选出针对病毒线性表位的抗体，无法筛选出针对病毒空间表位的抗体，这严重缩小了抗体的检测范围同时也增加了假阳性结果出现的概率(Jee YM,Cheon DS,Kim K,Cho JH,Chung YS,Lee J,et al.Genetic analysis of the VP1 region of humanenterovirus 71 strains isolated in Korea during2000.Arch Virol.2003,148(9):1735-1746.)。

目前，针对EV71病毒的检测方法主要有分离病毒法、检测核酸法、检测血清型法。

(1)分离病毒法

主要是依靠从患者疱疹液、唾液、咽拭子、肛拭子中分离病毒后接种到细胞中进行培养，最后电镜下分析病毒类型。虽然这种方法准确性较高，但是EV71病毒属于高危病毒，若安全措施不当很容易造成病毒泄露从而引发更大范围的疫情扩散。因此，卫生部明确规定，EV71病毒的实验必须在PII实验室进行安全操作。但是就目前我国研究机构数据统计显示，国内实验室尤其是地方实验室规格符合PII实验室标准要求的很少，这就给医院诊断手足口病带来了麻烦。此外，EV71病毒的培养一般需要7-10天，导致诊断时间总体太长，这可能会延误患者就诊从而导致病情恶化造成医疗纠纷(Edna R Caceda,Tadeusz JKochel.Application of modified shell vial culture procedure for arbovirusdetection[J].PLoS ONE.2007，2(10):e1034.)。

(2)检测核酸法

主要是依赖RT-PCR技术，这种技术虽然有很高的灵敏度，但是检测过程中需要特异性引物，若引物选择不当，可能会造成漏诊、误诊。并且实验结果虽然是阳性却不能确保样本中存在的EV71病毒是否是活病毒。如果经临床治疗的患者是核酸检测EV71病毒阳性，但体内病毒却是无治病能力的病毒，可能会为患者带来生命和财产的极度损害，同时也会导致医院和研究机构名誉和信誉降低。

(3)检测血清型法

主要是依据肠道病毒血清型遗传资料进行分析，但是目前全球有关肠道病毒血清型遗传的数据库并不完善，不同亚型病毒株可能存在交叉反应的研究也不够广泛，这种检测方法很难做到特异性检测(Mizuta K,Aoki Y,Suto A,et al.Cross-antigenicityamong EV71 strains from different genogroup isolated in Yamagata，Japan，between 1990 and 2007[J].Vaccine.2009,27(24):3153-3158.)。

因此，目前临床诊断迫切需要一种快速、简捷、准确度高、特异性强的检测方法，而本发明恰好弥补了EV71快速、有效检测的空白。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的一个方面，提供了一种EV71病毒的单克隆抗体，所述EV71病毒的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO:2所示。

根据本发明的第二方面，还提供了一种EV71病毒的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：利用CPE计数法或者细胞活性检测法测定EV71病毒的滴度；培养、扩增和纯化EV71全病毒；以纯化的所述EV71全病毒颗粒作为抗原免疫小鼠；取免疫成功的小鼠的脾细胞与对数生长期的NS-1细胞融合并获得融合成功的杂交瘤细胞；以有限倍数稀释法结合ELISA检测法筛选单株阳性杂交瘤细胞；以及采用杂交瘤细胞诱生小鼠腹水发获得所述EV71病毒的单克隆抗体。

在上述EV71病毒的单克隆抗体中，所述单克隆抗体为IgG₁型抗体，并且所述单克隆抗体的重链为Kappa型。

根据本发明的第三方面，还提供了一种用于检测EV71病毒的试剂盒、试纸条或者试剂，所述试剂盒、试纸条或者试剂包含上述单克隆抗体。

在上述试剂盒、试纸条或者试剂中，所述单克隆抗体是通过胶体金标记的。

在上述试剂盒、试纸条或者试剂中，所述试纸条包括加样垫、金标垫、NC膜反应垫和吸水垫。

在上述试剂盒、试纸条或者试剂中，所述试剂盒包括加样区、手执区、检测区、质控区和干燥区。

本发明具有以下有益效果：

(1)获得了含有核酸的完整EV71病毒，并且病毒具有稳定的遗传性。使用RD细胞扩增的病毒根据核酸的有无可以分为两类，含核酸的完整病毒和不含核酸的病毒空壳。这种病毒在RD细胞中扩增的结果具有广泛的生物意义和病毒学研究价值；

(2)获得了可以稳定表达单克隆抗体的杂交瘤细胞；

(3)获得了可以广泛识别病毒VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白的单克隆抗体；

(4)获得了标记胶体金后性质依然稳定的金标抗体，并成功表达了可以与抗体的Fc端结合的Protein A蛋白，为试纸条的制备提供了条件；

(5)获得了可以快速有效检测EV71病毒存在的试纸条。这为手足口病病原体诊断和临床救治方法的制定提供了快速有效的指导。EV71快速检测试纸条的出现为防控和救治手足口病提供了有力的依据。

附图说明

图1示出了RD细胞感染EV71病毒30h后病变情况。

图2示出了WST-1试剂检测EV71病毒滴度值。

图3示出了RD细胞培养扩增EV71病毒种类。

图4示出了SDS-PAGE凝胶电泳分析RD细胞培养的EV71病毒组成成分。

图5示出了BALB/c小鼠个体之间以及与阴性对照之间差异比较。

图6示出了杂交瘤细胞株的ELISA筛选。

图7示出了杂交瘤细胞核型分析。

图8示出了SDS-PAGE分析单克隆抗体纯化图。

图9示出了试纸条检测A-2B₈2A₆抗体亚型。

图10示出了单克隆抗体A-2B₈2A₆的ELISA、WESTERN-BLOTTING特异性分析(注：VP1分子量为34kDa，加上GST标签后为60kDa；VP2为30kDa，加GST后为56kDa；VP3为26kDa加上GST后为52kDa)。

图11示出了胶体金溶液。

图12示出了金标抗体最适浓度选择。

图13示出了反应试纸条主要组成部分。

图14示出了加入卡槽后试纸条结构图。

图15示出了EV71病毒检测结果。

具体实施方式

本文所用的缩略语通常为本领域技术人员所熟知的，或者可以是根据基础知识易于理解的。

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

1、缩略语

HFMD：Hand Foot and Mouth Disease，手足口病。

EV71：Enterovirus71，肠道病毒71型。

rpm：每分钟转速。

PEG：聚乙二醇。

kDa：相对分子质量单位。

TCID50：Tissue Culture Infective Dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量。

CPE：cytopathic effect，致细胞病变效应。

HAT：Hypoxanthine,Aminopterin,Thymidine，次黄嘌呤，甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷。

HT：Hypoxanthine,Thymidine，次黄嘌呤，胸腺嘧啶核苷。

DMSO：Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜。

VH：Heavy-chain variable region，抗体重链可变区。

VL：Light-chain variable region，抗体轻链可变区。

ELISA：Enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附实验。

2、关键术语定义

BALB/c：白变种实验室老鼠，与众多常用亚系一样，起源于小家鼠Mus musculus。从1920年它们在纽约诞生至今，BALB/c小鼠在全球研究机构繁衍了超过200代，广泛用于免疫学、生理学的动物实验。

Protein A：是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。

NC膜(Nitrocellulose filter membrane)：硝酸纤维素膜，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。

western-blot：经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

免疫胶体金技术：以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl₄)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

3.1 EV71病毒的滴度测定及其培养、扩增和纯化

3.1.1 EV71病毒的滴度测定

EV71病毒滴度测定：病毒滴度的测定有多种方法，此处我们测定病毒滴度的目的主要是为EV71病毒的培养扩增提供依据，故本发明采用TCID50(培养细胞半数感染量)测定作为主要实验参数。根据国际生物组织规定选择RD细胞为EV71病毒标准培养细胞。利用两种方法确定病毒滴度，分别为CPE记数法和细胞活性检测法。

(1)CPE计数法：将原浓度病毒稀释10倍后，以10为倍数连续梯度稀释到10^-10，等体积侵染提前一天培养在96孔板中的RD细胞，细胞密度为3×10⁵个/mL。连续30h后，显微镜下肉眼观察96孔板中每孔细胞病变情况。以一半以上RD细胞发生病变孔作为阳性孔，一半以下细胞发生病变孔为阴性孔。最后通过Karber计算病毒滴度值为10^-6.5/100μL(见图1和表2)。

表2 Karber法统计数据

根据Karber统计法：TCID50＝10^L-D(S-0.5)。L为病毒最高稀释倍数的对数，此处为-1；D为稀释倍数的对数之差，此处为1；S为出现CPE阳性孔的比率总和，此处为6。

则：TCID50＝10^{-1-1×(6-0.5)}＝10^-6.5，即本发明提供的EV71病毒毒力TCID50＝10^-6.5。

(2)细胞活性检测法：病毒侵染细胞后会影响细胞的活性和状态，影响细胞正常生长，而线粒体内的脱氢酶活性可以直接反应细胞活性状态。WST-1试剂是一种新型的细胞活性指示剂，它可以与细胞线粒体内的脱氢酶产生还原反应，生成橙黄色的甲臜。细胞活性越高，颜色反应越深；细胞活性越低、状态越差，颜色反应越浅。利用酶标仪450nm波长可以直接检测WST-1与细胞线粒体脱氢酶反应物甲臜的生成量。因此，利用WST-1试剂可以更加灵敏、快捷的计算病毒滴度值，值为10^-6.5/100μL(见图2)。综合分析这两种方法，我们最终确定该病毒TCID50(组织细胞培养半数感染量)值为10^-6.5/100μL。

3.1.2 EV71病毒的培养扩增和收集

(1)EV71病毒以100TCID50/100μL滴度接种到密度为3×10⁵个/mL，处于生长对数期的RD细胞中，37℃、CO₂细胞培养箱孵育48h。

(2)EV71病毒的收集：观察接种病毒的RD细胞，若细胞出现80％左右CPE时，收集细胞及其上清液，并反复冻融3-5次，800rpm离心去除沉淀，收集上清。

3.1.3 EV71病毒的纯化、浓缩

(1)病毒的超滤和浓缩：0.22μm微孔滤膜过滤病毒液后，使用100kDaa超滤浓缩管3000rpm离心1h后收集病毒浓缩液。

(2)病毒的超速离心：采用30％蔗糖梯度密度离心病毒液，离心机使用转子为SW27rotor的超速离心机，100000g，离心4小时后收集病毒颗粒。结果发现RD细胞培养的EV71病毒存在两部分，一部分为含有核酸的全病毒，一部分是不含有核酸只含有外壳蛋白的病毒颗粒(见图3)。本文选用含有核酸的EV71病毒部分作为免疫抗原并利用SDS-PAGE凝胶电泳分析病毒颗粒成分(见图4)。为保证病毒滴度，将病毒分装后冻存到-80℃冰箱备用。

3.2动物免疫

免疫之前需要小鼠眼眦取血，判断小鼠健康状况以及不同小鼠之间是否存在显著差异。若差异显著，则需要重新选购免疫小鼠以保证实验的科学准确性。本发明选用中科院生物物理所提供的标准品抗EV71病毒抗体A9作为一抗，HRP标记羊抗鼠抗体作为二抗，上面纯化的EV71病毒作为底物，通过酶联免疫实验技术，验证本发明使用的10只BALB/c小鼠之间结合EV71病毒能力的差异性是否显著。结果如图5所示，10只小鼠免疫前血清与EV71病毒结合能力的平均值为0.2266，10只小鼠免疫前血清与EV71病毒结合能力的标准差值为0.0106，符合生物统计学要求。同时，我们还特意设置了PBS缓冲液作为阴性对照，通过生物统计学数据显示BALB/c小鼠免疫前血清与缓冲液对比不存在显著差异。因此，本发明使用的BALB/c小鼠符合免疫学实验要求。

以上述纯化的病毒颗粒作为抗原，同时免疫10只6-8周龄雄性BALB/c小鼠。免疫共分5次，第一次免疫需要将抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后皮下多点免疫小鼠。第2-4次免疫将抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后腹腔免疫小鼠。最后一次免疫，抗原用生理盐水稀释后直接注射小鼠尾静脉。

3.3杂交瘤细胞融合、阳性筛选和核型分析

3.3.1杂交瘤细胞融合

取免疫后的BALB/c小鼠眼静脉丛血，结合ELISA法检测其血清中是否产生与EV71病毒具有强结合的多克隆抗体。若ELISA检测值阳性，则取其脾细胞与对数生长期的NS-1细胞融合。利用HAT选择培养基筛选融合成功的杂交瘤细胞，用有限倍数稀释法结合ELISA检测法筛选单株阳性杂交瘤细胞。经过大量筛选实验最终获得一株核型稳定、分泌抗体能力强并且分泌的单克隆抗体可以与病毒强结合的细胞株(见图6)，命名为C-2B₈2A₆。

3.3.2交瘤细胞核型分析

秋水仙素处理杂交瘤细胞株C-2B₈2A₆使细胞停留在细胞分裂中期，染色体形状呈线性较整齐的排列在细胞核内，吉姆萨染色剂着色染色图后可在油镜下清晰地观察到杂交瘤细胞染色体。BABL/C小鼠脾细胞含40对染色体，NS-1细胞含58对染色体，则杂交瘤细胞应该含98对染色体(见图7)。

3.4鼠源单克隆抗体大量表达、纯化及特异性分析

3.4.1单克隆抗体大量表达本发明采用杂交瘤细胞诱生小鼠腹水法获得大量单克隆抗体。首先用液体石蜡油腹腔注射BALB/c小鼠，3天后将培养至对数期的C-2B₈2A₆杂交瘤细胞1×10⁷个腹腔注射小鼠，10天后抽取小鼠腹水，每隔一天抽取一次共抽3次。

3.4.2单克隆抗体纯化

利用Protein A柱纯化单克隆抗体，最终获得分子量为约162kDa，重链为55kDa、轻链为26kDa左右的单克隆抗体(见图8)，命名为A-2B82A6。

3.4.3单克隆抗体亚型分析

使用SIGMA-ALDRICH公司的IsoQuick^TM Kit for Mouse Monoclonal Isotyping单克隆抗体亚型分析试纸条分析A-2B₈2A₆抗体亚型，结果：A-2B₈2A₆抗体为IgG₁型抗体，重链为Kappa型(见图9)。

3.4.4单克隆抗体特异性分析

单抗特异性分析分为两部分，第一部分是抗体识别抗原的蛋白亚基。尤其是病毒作为抗原时其抗原位点通常位于病毒表面，可能是一种蛋白，也可能是多种蛋白共同作用。第二部分是抗体与抗原结合通常是抗体本身的特有属性，一株杂交瘤细胞分泌的抗体具有其自身独特的基因序列。这是同一种抗原不同抗体的特异性部分。

3.4.4.1单抗A-2B₈2A₆特异性识别EV71病毒外壳蛋白

EV71病毒衣壳蛋白主要有VP1～VP4，四种蛋白组成，VP1～VP3这三种蛋白主要位于EV71病毒表面，是目前国际上公认的抗体识别位点。为检测A-2B₈2A₆单克隆抗体的特异性，我们分别表达了VP1～VP3三种蛋白，由于这三种蛋白都是带有GST标签的蛋白，因此为排除GST蛋白干扰，我们特性安排了GST蛋白作为试验的对照。通过ELISA法和WESTERN法检测分析，该单克隆抗体可以与病毒颗粒的VP1、VP2、VP3三个蛋白结合，并且与VP2的结合能力最强，VP3其次，VP1最弱。本实验说明本发明提供的抗体A-2B₈2A₆具有广谱结合EV71病毒的能力(见图10)。

3.4.4.1抗体可变区DNA序列分析

(1)培养C-2B₈2A₆杂交瘤细胞至对数期,收集细胞并加入Trizol试剂后,反复冻融3次细胞。

(2)提取杂交瘤细胞RNA并测定其浓度为1mg/ml。

(3)利用RT-PCR技术逆转录获得杂交瘤细胞的cDNA序列并纯化cDNA。

(4)使用Invitrogen5’RACE system试剂盒提取A-2B₈2A₆抗体cDNA序列。

(5)将抗体cDNA序列连入pGEM-T Easy载体并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞快速扩增DNA。

(6)测定抗体cDNA序列并分析抗体重链和轻链可变区基因序列。结果如下：A-2B₈2A₆重链可变区基因序列-VH如SEQ ID NO:1所示，SEQ ID NO:1序列如下：

ATGAGCACTGAACACGGACCCCTCACCATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGCGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTGGTAACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAGGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATCGGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAA-2B82A6轻链可变区基因序列-VL如SEQ ID NO:2所示，SEQ ID NO:2序列如下：

ATGGATTCTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTTCTAATCAGTGCCTTAGTCATAATGTCCAGAGGACAGATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCTTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCAGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTATGATAGTTCCCCATCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG

3.5免疫胶体金试纸条制备

3.5.1柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液

使用事先硅化好的500mL玻璃烧杯，加入100mL去离子水加热至沸腾后加入10mg的HAuCl₄粉末使溶液终浓度为0.1mg/mL。然后加入2.0mL浓度为1％的柠檬酸三钠缓冲液，边加热边搅拌5min左右，待溶液冷却后发现溶液呈现酒红色(见图11)。为验证胶体金溶液的稳定性，将其4℃静置一个月，检查胶体金溶液是否有沉淀现象。结果证明本发明提供的胶体金溶液于4℃放置一个月后未见沉淀产生，溶液依然保持酒红色，即该胶体金溶液性质稳定，适于试纸条的研发。

3.5.2金标抗体制备

(1)抗体与胶体金反应最适pH选择

一般抗体与胶体金反应的最适pH值应该是在抗体本身等电点的基础上加0.5即胶体金pH＝抗体pI+0.5。本发明提供抗体等电点为0.8左右，故我们选择8.5作为胶体金溶液pH值。

(2)抗体最适浓度选择

将待标记的抗EV71病毒抗体A-2B₈2A₆逐级稀释后(由0.5mg/mL-0.001mg/mL，另设对照管)加入等量的胶体金溶液，一段时间后观察颜色与对照组变化相同的抗体浓度即是最低抗体浓度。最适标记胶体金用抗体的浓度应该是最低抗体浓度的120％，因此A-2B₈2A₆抗体最适标记浓度是0.12mg/ml(见图12)。本发明最终确定选用抗体最合适浓度为0.12mg/ml。

(3)金标抗体制备

a)0.1M K₂CO₃溶液调节抗体pH值为8.5。

b)加入纯化后的单克隆抗体，轻轻搅拌10min,抗体终浓度为0.12mg/mL。4℃静置20min，使胶体金充分吸附抗体。

c)加入10％的BSA作为稳定剂，使其终浓度达到1％。室温放置10min后，移入4℃环境下静置过夜。

d)4℃环境下2000rpm离心10min,取上清；10000rpm离心30min，去上清，沉淀用稀释液稀释到2mg/mL。

e)4℃放置反应溶液1个月观察有无聚集情况产生。

3.5.3试纸条的组装

(1)材料的选择：如图13所示，本发明提供试纸条主要组成部分包括加样垫、金标垫、NC膜反应垫、吸水垫。如图14所示，试纸条组装后组成部分包括：加样区、检测区、质控区和手执区。

(2)检测试纸条的使用：本发明提供试纸条可有效检测浓度为5ug/ml的EV71病毒(见图15)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 天承南运（天津）科技有限公司

<120> EV71病毒的单克隆抗体、其制备方法及其检测试纸条

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagcactg aacacggacc cctcaccatg aacttcgggc tcagcttgat tttccttgtc 60

cttgttttaa aaggtgtcca gtgtgaagtg aagctggtgg agtctggggg aggcttagtg 120

aagcctggag ggtccctgaa actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cagtagctat 180

accatgtctt gggttcgcca gactccggcg aagaggctgg agtgggtcgc aaccattagt 240

agtggtggtg gtaacaccta ctatccagac agtgtgaagg gccgattcac catctccaga 300

gacaatgcca ggaacaccct gtacctgcaa atgagcagtc tgaggtctga ggacacggcc 360

atgtattact gtgcaagaca tcgggcctgg tttgcttact ggggccaagg gactctggtc 420

actgtctctg ca 432

<210> 2

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggattctc aagtgcagat tttcagcttc cttctaatca gtgccttagt cataatgtcc 60

agaggacaga ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120

gtcaccatga cctgcagggc cagctcaagt gtaagttcca gttacttgca ctggtaccag 180

cagaagccag gatcttcccc caaactctgg atttatagca catccaacct ggcttcagga 240

gtcccagctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcagt 300

gtggaggctg aggatgctgc cacttattac tgccagcagt atgatagttc cccatcgctc 360

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgg 396

Claims (7)

1.一种EV71病毒的单克隆抗体，其特征在于，所述EV71病毒的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO:2所示。

2.一种根据权利要求1所述的EV71病毒的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用CPE计数法或者细胞活性检测法测定EV71病毒的滴度；

培养、扩增和纯化EV71全病毒；

以纯化的所述EV71全病毒颗粒作为抗原免疫小鼠；

取免疫成功的小鼠的脾细胞与对数生长期的NS-1细胞融合并获得融合成功的杂交瘤细胞；

以有限倍数稀释法结合ELISA检测法筛选单株阳性杂交瘤细胞；以及

采用杂交瘤细胞诱生小鼠腹水发获得所述EV71病毒的单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的EV71病毒的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG₁型抗体，并且所述单克隆抗体的重链为Kappa型。

4.一种用于检测EV71病毒的试剂盒、试纸条或者试剂，其特征在于，所述试剂盒、试纸条或者试剂包含权利要求1所述的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的试剂盒、试纸条或者试剂，其特征在于，所述单克隆抗体是通过胶体金标记的。

6.根据权利要求4所述的试剂盒、试纸条或者试剂，其特征在于，所述试纸条包括加样垫、金标垫、NC膜反应垫和吸水垫。

7.根据权利要求4所述的试剂盒、试纸条或者试剂，其特征在于，所述试剂盒包括加样区、手执区、检测区、质控区和干燥区。