CN109890381A - 酮改善神经再生 - Google Patents

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奇拉·阿里·道阿戈斯蒂诺
多米尼克·保罗·道阿戈斯蒂诺
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Abstract

本文公开了治疗受试者中的神经系统损伤的组合物和方法。

Description

酮改善神经再生
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月12日提交的美国临时申请No.62/393,233的优先权，该临时申请通过引用全部并入本文。
技术领域
本发明涉及治疗神经系统损伤的方法。具体地，本发明描述了使用生酮组合物治疗神经系统损伤的方法。
背景技术
神经系统损伤每年都会影响相当多的人并导致神经组织受损，进而能够导致损伤和/或丧失某些运动功能、大脑功能等。当神经组织伴随着潜在的神经元、胶质细胞、轴突、髓鞘和突触受损时，给大脑功能提供燃料的葡萄糖的可用性受限。因此，神经组织必须经历再生或修复才能恢复正常的功能。
神经系统损伤有两种类型：周围神经系统(PNS)损伤和中枢神经系统(CNS)损伤。周围神经系统具有固有的自我修复能力，但中枢神经系统无法进行这样的修复。目前，还没有已知的修复和再生中枢神经系统组织及其潜在的组件的方法。因此，需要一种在CNS损伤后修复和再生神经元细胞以改善患者结果的方法。
发明内容
本文公开了治疗受试者中的神经系统损伤的方法。神经系统损伤可以是CNS损伤。CNS损伤可以是脑损伤或脊髓损伤。神经系统损伤可以是周围神经系统损伤。该方法可包括向受试者施用生酮组合物。生酮组合物可包含一种或多种生酮化合物，其选自酮酯、酮盐、酮体前体和它们的组合。酮酯可以是1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯。酮盐可以是R,S-3-羟基丁酸钠。该组合物可以增强神经系统损伤后的神经再生。
附图说明
图1A描绘了对照组在0小时时的划痕测定。
图1B描绘了对照组在24小时时的划痕测定。
图2A描绘了处理组在0小时时的划痕测定。
图2B描绘了对照组在24小时时的划痕测定。
图3描绘了24小时的划痕测定，显示对照组与治疗组相比的DAPI细胞核染色。
图4是比较处理组和对照组的图解说明，特别是关于在10x和20x放大率下24小时后划痕空间区域中的细胞核数目。
图5是比较治疗组和对照组的图解说明，特别是关于每24小时细胞覆盖率的增加。
图6A描绘了对照组中10x的细胞核、β微管蛋白和突触蛋白的荧光成像。
图6B描绘了处理组中10x的细胞核、β微管蛋白和突触蛋白的荧光成像。
图7A描绘了对照组中20x的细胞核、β微管蛋白和突触蛋白的荧光成像。
图7B描绘了处理组中20x的细胞核、β微管蛋白和突触蛋白的荧光成像。
图8A描绘了对照组中20x的细胞核、β微管蛋白和突触蛋白的荧光成像。
图8B描绘了处理组中20x的细胞核、β微管蛋白和突触蛋白的荧光成像。
图9A描绘了对照组中60x的细胞核、β微管蛋白和突触蛋白的荧光成像。
图9B描绘了处理组中60x的细胞核、β微管蛋白和突触蛋白的荧光成像。
具体实施方式
本公开描述了治疗受试者中的神经系统损伤的方法，包括向受试者施用包含一种或多种生酮化合物的组合物。
1.定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。如有冲突，将以本文件(包括定义)为准。下面描述了优选的方法和材料，但是与本文描述的那些类似或等同的方法和材料能够用于实践或测试本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的而非限制性的。
对于本文中数字范围的叙述，明确考虑了其间具有相同精度的每个中间数。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外还考虑数字7和8，对于范围6.0-7.0，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一个(a)”和“一种(an)”和“该”和“至少一个”以及类似的指示物应被解释为涵盖单数和复数。除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾，否则使用术语“至少一个”后跟一个或多个项目的列表(例如，“A和B中的至少一个”)应被解释为表示从列出的项目中选择的一个项目(A或B))或所列项目(A和B)中的两个或更多个的任何组合。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
结合数量使用的修饰语“约”包括所述值并具有上下文所规定的含义(例如，它至少包括与特定数量的测量相关的误差程度)。修饰语“约”也应被视为公开由两个端点的绝对值定义的范围。例如，表述“从大约2到大约4”也公开了“从2到4”的范围。术语“约”可以指所指示的数字的正负10％。例如，“约10％”可表示9％至11％的范围，“约1”可表示0.9-1.1。从上下文中可以明显看出“约”的其他含义，例如四舍五入，因此，例如“约1”也可以表示0.5至1.4。
在整个说明书中使用术语“施用”(“administration”或“administering”)来描述可以将所公开的生酮组合物递送至受试者的过程。施用通常取决于给药的组合物的量、剂量的数量和治疗的持续时间。可以施用多剂量的组合物。组合物的施用频率和持续时间可以根据多种因素中的任何一种而变化，包括患者反应等。生酮组合物可以通过任何合适的途径施用于受试者。组合物可以口服、肠胃外、(包括静脉内、皮下、局部、透皮、皮内、透粘膜、腹膜内、肌肉内、囊内、眶内、心内、经气管内、皮下、皮内、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内和硬膜外注射)通过输注、通过电穿孔施用或共同施用作为待插入(暂时或永久)到受试者体内的任何医疗装置或物体的组件。
施用的组合物的量可以根据诸如个体的易感性程度、个体的年龄、性别和体重、个体的特异反应、剂量测定等因素而变化。可检测的有效量的生酮组合物也能够根据仪器和膜相关因素而变化。除非另有说明，否则这些因素的优化完全在本领域技术水平内。
术语“脂族基团”定义为包括如上定义的烷基、烯基、炔基、卤代烷基和环烷基。“低级脂族基团”是含有1至10个碳原子的脂族基团。
术语“烷氧基”由式-OR表示，其中R能够为烷基，包括任选被烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、卤代烷基或杂环烷基取代的低级烷基，如定义如下。
术语“烯基”定义为2至24个碳原子的烃基和含有至少一个碳-碳双键的结构式。
术语“烷基”定义为1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。“低级烷基”基团是具有1至10个碳原子的饱和支链或非支链烃。
术语“炔基”定义为2至24个碳原子的烃基和含有至少一个碳-碳三键的结构式。
术语“芳烷基”定义为具有与芳基连接的如上定义的烷基的芳基。芳烷基的实例是苄基。
术语“芳基”定义为任何基于碳的芳族基团，包括但不限于苯、萘等。术语“芳族”还包括“杂芳基”，其定义为具有至少一个并入芳族基团环内的杂原子的芳族基团。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、硫和磷。芳基能够被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于烷基、炔基、烯基、芳基、卤化物、硝基、氨基、酯、酮、醛、羟基、羧酸或烷氧基，或能够为未取代的芳基。
如本文所用，本文可互换使用的“β-羟基丁酸酯”、“βHB”或“BHB”是指具有通式CH3CH2OHCH2COOH的羧酸。BHB是酮体，其可在低葡萄糖水平的情况下被身体用作燃料源。
本文可互换使用的术语“CNS损伤”或“中枢神经系统损伤”是指对中枢神经系统的任何损伤。CNS损伤可以是脑损伤。脑损伤可以是对脑的任何损伤。CNS损伤可以是脊髓损伤(SCI)。脊髓损伤可以是对脊髓的任何损伤。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有(having)”、“具有(has)”、“能够”，“含有”及其变体旨在是开放式的过渡性短语、术语或词语，不排除其他行为或结构的可能性。除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用。本公开还考虑了其他实施方案“包含”、“由......组成”和“基本上由......组成”本文提供的实施方案或要素，无论是否明确阐述。
术语“环烷基”定义为由至少三个碳原子组成的非芳族碳基环。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
“衍生物”是指化合物或化合物的一部分，其衍生自或理论上可衍生自母体化合物。
本文所用的术语“酯”由式-OC(O)R表示，其中R可以是烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、卤代烷基或杂环烷基。
“酯化”是指醇与羧酸或羧酸衍生物反应得到酯。
术语“卤代烷基”定义为如上定义的烷基，其中存在于这些基团上的一个或多个氢原子被卤素(F、Cl、Br、I)取代。
术语“杂环烷基”是如上定义的环烷基，其中环的至少一个碳原子被杂原子取代，所述杂原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。
术语“羟基”由式-OH表示。
如本文所用的“生酮组合物”是指包含一种或多种生酮化合物的组合物。
“生酮化合物”是指能够提高受试者体内酮体浓度的化合物。生酮化合物可包括酮体前体、酮酯、酮盐或其组合。
如本文中可互换使用的“酮”或“酮体”是指β-羟基丁酸酯(βHB)、乙酰乙酸酯、丙酮或其组合的化合物或物质。酮体可以衍生自酮体前体，即，作为酮体前体的化合物或物质，其可以在受试者体内转化或代谢成酮体。
如本文所用的“酮体酯”或“酮酯”是指酮体、酮体前体或其衍生物的酯。可以使用本领域已知的任何合适的酮酯。例如，酮酯可以是1,3-丁二醇乙酰乙酸二酯。
“酮体盐”或“酮盐”是指酮体、酮体前体或其衍生物的盐。酮盐可以与一价阳离子、二价阳离子或碱性氨基酸组合。可以使用本领域已知的任何合适的酮盐。例如，酮盐可以是BHB盐。酮盐可以是BHB无机盐。例如，BHB无机盐可以是βHB钾、βHB钠、βHB钙、βHB镁、BHB锂，或任何其他可行的βHB无毒无机盐。酮盐可以是BHB有机盐。BHB的有机盐包括有机碱的盐，例如精氨酸βHB、赖氨酸βHB、组氨酸BHB、鸟氨酸βHB、肌酸βHB、胍丁胺βHB和瓜氨酸βHB。酮盐可以是任何BHB盐的组合。例如，酮盐可以是β-羟基丁酸钠和精氨酸β-羟基丁酸酯，或β-羟基丁酸钠盐和β-羟基丁酸钾盐。
如本文所用，“神经系统损伤”是指对神经系统的任何损伤。神经系统损伤可以是中枢神经系统损伤。神经系统损伤可以是周围神经系统损伤。
本文可互换使用的“周围神经系统损伤”、“周围神经损伤”或“PNS损伤”是指对周围神经系统的任何损伤。
本文所用的“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的载体”、“载体”或“药学上可接受的佐剂”是指可用于制备药物组合物的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂，所述药物组合物通常是安全的、无毒的，既不是生物学上也不是其他方面不合需要的，并且包括兽医用和/或人类药物用途可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂，例如美国食品和药物管理局颁布的那些。
如本文所用的术语“样品”是指包括来自细胞、组织或包括活组织检查样品的器官的细胞或细胞提取物的任何物理样品。样品能够来自生物来源，例如受试者或动物，或其部分，或能够来自细胞培养物。来自生物来源的样品能够来自正常或异常生物，例如已知患有病症或疾病状态的生物，或其任何部分。样品也能够来自任何液体、组织或器官，包括正常和异常(患病或肿瘤)液体、组织或器官。来自受试者或动物的样品能够用于本发明，由受试者或动物获得并加工或培养，使得来自样品的细胞可以作为原代或连续细胞培养物或细胞系在体外维持。
本文所用的“受试者”和“患者”可互换地指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人类灵长类动物(例如，猴，例如食蟹猴或恒河猴，黑猩猩等)和人类。受试者可以是人或非人。受试者或患者可能正在接受其他形式的治疗。
本文所用的术语“治疗”(“treatment”、“treat”、“treating”)或其任何语法变体包括但不限于改善或减轻疾病或病症的症状，减轻、预防、阻抑、抑制、减少或影响不希望的生理变化或疾病状况的进展和/或严重程度。例如，治疗可包括预防神经系统损伤后的神经变性。治疗可包括在神经系统损伤后增强或促进神经元的再生。治疗可包括在神经系统损伤后增强或促进神经元的存活。治疗可包括在神经系统损伤后减小伤口大小。治疗可包括在神经系统损伤后完全消除伤口。
除非另外定义，否则本文中可互换使用的“治疗有效量”或“有效剂量”或“有效量”是指有效达到所需时间的药物剂量，以达到所需的治疗结果。
根据本发明，合适的单剂量大小是当在合适的时间段内施用一次或多次时能够预防或减轻受试者症状的剂量。有效剂量可以由本领域技术人员确定，并且可以根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重等因素以及药物在个体中引发所需反应的能力而变化。本领域普通技术人员能够容易地确定所公开组合物的治疗有效量。
治疗有效量可以在一次或多次施用中施用(例如，生酮组合物可以作为预防性治疗施用或在神经系统损伤的任何阶段(在症状之前或之后等)治疗施用)，应用或剂量，并且是并非旨在限于特定的制剂、组合或施用途径。在本公开的范围内，所公开的生酮组合物可以在受试者的治疗过程中的不同时间施用。施用时间和剂量将取决于若干因素，例如疾病状态、年龄、性别和个体体重，以及组合物在个体中引发所需反应的能力。可以根据施用或监督本发明中使用的化合物给药的人的个人需要和专业判断来调整施用。
“酯交换”是指酯与醇反应以形成新的酯化合物。
2.生酮组合物
本公开提供了包含一种或多种生酮化合物的组合物。生酮化合物可以是能够提高受试者体内酮体浓度的任何化合物。例如，生酮化合物可在施用于受试者后提高BHB的表达。生酮化合物可以是酮体前体、酮酯、酮盐或其组合。例如，生酮化合物可以是酮体前体或其衍生物。可以使用任何合适的酮体前体，其在施用于受试者后将代谢成酮体。例如，生酮化合物可以是1,3-丁二醇乙酰乙酸酯或BHB部分或其衍生物，包括其酯和盐。例如，生酮化合物可以是1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯。生酮化合物可以是3-羟基丁酸钠。生酮化合物可以是R,S-3-羟基丁酸钠。
生酮化合物可以是酮酯。任何合适的酮酯可用于所公开的生酮组合物中。可以使用任何合适的生理学相容的醇制备酮酯。适用于制备这种酯的多元醇的实例包括碳水化合物和碳水化合物衍生物，例如碳水化合物醇。碳水化合物的实例包括但不限于阿卓糖、阿拉伯糖、右旋糖、赤藓糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、古古糖、艾杜糖、乳糖、来苏糖、甘露糖、核糖、蔗糖、塔罗糖、苏糖、木糖等。酮酯可以是单酯。酮酯可以是二酯，酮酯可以是聚酯。例如，酮酯可以是1,3-丁二醇-乙酰乙酸酯单酯。酮酯可以是1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯。
生酮化合物可以是酮盐。酮盐可以与一价阳离子、二价阳离子或碱性氨基酸组合。可以使用任何合适的酮盐。例如，酮盐可以是BHB盐。酮盐可以是BHB无机盐。例如，BHB无机盐可以是βHB钾、βHB钠、βHB钙、βHB镁、BHB锂，或任何其他可行的βHB无毒无机盐。例如，酮盐可以是3-羟基丁酸钠。酮盐可以是R,S-3-羟基丁酸钠。酮盐可以是BHB有机盐。BHB的有机盐包括有机碱的盐，例如精氨酸βHB、赖氨酸βHB、组氨酸BHB、鸟氨酸βHB、肌酸βHB、胍丁胺βHB和瓜氨酸βHB。酮盐可以是BHB盐的组合。例如，酮盐可以是钠/钾BHB无机盐。
可以将酮盐混合成溶液。例如，可以将βHB无机盐混合成溶液。βHB无机盐可以是溶液的1至99％。例如，βHB无机盐可以是溶液的5-95％、10-90％、20-80％、30-70％、40-60％、或约50％。
生酮组合物可进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。这种载体可以是无菌液体，例如水和油。例如，载体可以是石油，例如矿物油；植物油，如花生油、豆油或芝麻油；动物油；或合成来源的油。合适的载体还包括乙醇、二甲基亚砜、甘油、二氧化硅、氧化铝、淀粉、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、D-木糖、甘露醇、粉状纤维素、微晶纤维素、滑石、胶体二氧化硅、碳酸钙、碳酸镁、磷酸钙、硅酸铝钙、氢氧化铝、淀粉磷酸钠、卵磷脂和等效的载体和稀释剂。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也能够用作液体载体。合适的载体包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。生酮组合物可含有少量润湿剂或乳化剂。生酮组合物可含有pH缓冲剂。
生酮组合物可以是各种形式。例如，生酮组合物可以是固体形式、半固体形式或液体剂型。生酮组合物可以是片剂、丸剂、粉末、液体溶液或悬浮液、栓剂和可注射或可输注溶液的形式。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。
3.治疗神经系统损伤的方法
本发明公开了一种治疗受试者神经系统损伤的方法。治疗受试者的神经系统损伤的方法可包括将生酮组合物施用于受试者。
受试者可被诊断为神经系统损伤。神经系统损伤可以是中枢神经系统损伤。CNS损伤可以是脑损伤。脑损伤可以是对脑的任何损伤。脑损伤可以是由头部外力引起的创伤性脑损伤。例如，创伤性脑损伤可以是弥漫性轴索损伤、脑震荡、挫伤、coup-countrecoup损伤、复发性创伤性脑损伤(有时称为第二次撞击综合征)、头部开放性损伤、闭合性颅脑损伤、穿透性损伤、摇晃婴儿综合症、锁定综合症等。脑损伤可以是由完全中断向大脑供氧造成的缺氧性脑损伤。脑损伤可以是由向大脑供氧不足造成的低氧性脑损伤。缺氧和缺氧脑损伤的实例包括但不限于缺氧缺血性脑病、弥漫性脑缺氧、局灶性脑缺血、全脑缺血和脑梗塞。CNS损伤可以是脊髓损伤(SCI)。脊髓损伤可以是对脊髓的任何损伤。SCI可由直接创伤引起。SCI可以是由骨碎片、血肿或椎间盘物质压迫引起的。SCI可位于颈椎、胸椎、腰椎或骶椎中的一个或多个。SCI可以是颈脊髓、胸髓、腰骶椎、圆锥、枕骨中的一个或多个或马尾的一个或多个神经。
神经系统损伤可以是周围神经系统损伤。PNS损伤可以是周围神经系统任何组成部分的损伤。PNS损伤可以是感觉-躯体神经系统的损伤。PNS损伤可以是自主神经系统的损伤。PNS损伤可以是一个或多个颅神经的损伤。例如，PNS损伤可以是对嗅神经、视神经、动眼神经、滑车神经、三叉神经、外展神经、面神经、前庭神经、舌咽神经、迷走神经、副神经或舌下神经中的任何一个或多个的损伤。PNS损伤可以是一个或多个脊神经的损伤。PNS损伤可以是创伤性周围神经损伤。PNS损伤可以是先天性周围神经损伤。PNS损伤可以是炎症性周围神经损伤。PNS损伤可以是毒性周围神经损伤。PNS损伤可以是肿瘤周围神经损伤。
生酮组合物可以通过任何合适的途径施用于受试者。生酮组合物可以口服、肠胃外、(包括静脉内、皮下、局部、透皮、皮内、透粘膜、腹膜内、肌肉内、囊内、眶内、心内、经气管内、皮下、皮内、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内和硬膜外注射)通过输注、通过电穿孔施用或共同施用作为待插入(暂时或永久)到受试者体内的任何医疗装置或物体的组件。
生酮组合物可以与其他疗法组合施用以治疗神经系统损伤。其他疗法可能包括紧急治疗，例如清除大脑凝结的血液，修复颅骨骨折，以及缓解颅骨压力。其他疗法可包括治疗神经系统损伤症状的药物。其他疗法可包括减少与神经系统损伤有关的其他风险的药物。例如，生酮组合物可以与抗焦虑药物、抗凝血剂、抗惊厥药、抗抑郁药、利尿剂、肌肉松弛剂、兴奋剂等组合施用。其他疗法可包括康复疗法、包括物理疗法、职业疗法、言语疗法、认知疗法等。
生酮组合物的施用可以为单剂量，或在一段时间内多剂量。生酮组合物可以以达到所需治疗效果所需的任何频率施用于患者。例如，生酮组合物可以每月、每两周、每周或每天施用一次至数次。可以重复施用生酮组合物直至达到所需的治疗效果。例如，生酮组合物可以在1天、3天、5天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间的过程中施用一次至数次。
待施用的生酮组合物的量可取决于多种因素，例如施用途径和病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。生酮组合物可以以适合于治疗受试者的神经系统损伤的任何量施用。有效量的生酮组合物可引起神经系统损伤引起的部分改善或完全消除症状。治疗可包括促进神经系统损伤后神经元的再生。治疗可包括在神经系统损伤后增强神经元的存活。治疗可包括在神经系统损伤后减小伤口大小。治疗可包括在神经系统损伤后完全消除伤口。
生酮组合物的合适剂量范围包括约0.001mg生酮/kg体重至约100mg/kg，约0.01mg/kg至约50mg/kg，约0.1mg/kg至约25mg/kg，约0.5mg/kg至约15mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg，或约2.5mg/kg至约5mg/kg。胰岛素的合适剂量范围包括约0.001mg胰岛素/kg体重至约100mg/kg，约0.01mg/kg至约50mg/kg，约0.1mg/kg至约25mg/kg，约0.5mg/kg至约15mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg，或约2.5mg/kg至约5mg/kg。
此外，可任选地使用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。可从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。
4.实施例
实施例1-施用生酮组合物增强损伤后的神经元再生
当葡萄糖可用性有限时，酮体可作为大脑的替代燃料。在人类中，BHB在肝脏中由乙酰乙酸酯合成，其为在禁食状态下产生的第一种酮。其生物合成由β-羟基丁酸脱氢酶催化。通过使用划痕试验测试酮体对原代神经元细胞培养物中细胞再生的影响，所述划痕试验随后用CYTOSMART系统进行24小时。
如Katnic，Guerrero等人2006所述，分离和培养来自胚胎(E18)Sprague Dawley大鼠的皮层神经元。简而言之，用0.25％胰蛋白酶消化切除的脑。将分离的细胞悬浮于补充有胎牛血清(FBS，10％，热灭活)、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100mg/ml)和两性霉素B1(0.25mg/ml)(抗生素/抗真菌)的DMEM中并涂在聚-L-赖氨酸涂层的盖玻片上。培养24小时后，用补充有B-27(10ml)和0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基替换DMEM溶液。将3周龄大鼠原代神经元暴露于2mM R,S-3-羟基丁酸钠。用P100移液管尖端刮细胞单层以产生划痕。通过用培养基洗涤除去细胞碎片。通过CytoSmart系统在24小时内拍摄了100个细胞迁移/细胞再生到划痕空间的快照。
用R,S-3-羟基丁酸钠处理的细胞培养物在24小时内显示出更强烈的细胞迁移和受损区域的再生(比较图1A-1B对图2A-2B)。如图3和图4所示，在具有2mM R,S-3-羟基丁酸钠的20x(p＝0.01)和10x(p＝0.0004)放大率照片的细胞培养物的划痕空间区域中发现显著更多的DAPI染色的细胞核。治疗后细胞覆盖率增加约3.3％，而对照组则约为0.9％。参见图5。
原代神经元进行免疫荧光染色。在划痕测定中(在24小时/3周龄原代神经元之后)的荧光成像能够在图6A-6B、7A-7B、8A-8B和9A-9B中看到。为了说明的目的，图像已被变亮。这些图中的每一个包括四(4)个图像，标记为I-IV。在图像I中，细胞核被染成蓝色并被描绘；在图像II中，β微管蛋白被染成绿色并被描绘；在图像III中，突触蛋白被染成红色并被描绘；在图像IV中，描绘了图像I-III的染色的组合。作为背景，微管蛋白是作为两个相似多肽α和β的异二聚体存在于所有细胞中的蛋白质，其组装形成微管。适当组织微管对于几种细胞功能是必不可少的，例如有丝分裂、减数分裂、某些形式的细胞器运动、细胞内运输、鞭毛运动和细胞骨架功能。突触蛋白是在CNS和PNS的突触小泡的细胞质表面中发现的磷蛋白。突触蛋白I参与轴突发生和突触发生的调节，其中它作为各种蛋白激酶的底物，包括由cAMP、钙/钙调蛋白、促细胞分裂素和细胞周期蛋白激活的蛋白激酶。因此，希望通过施用生酮化合物来观察两者。
图6A-6B和7A-7B分别以10x和20x比较对照组和测试组。与对照相比，再生位点周围可见更多的细胞核，以及更高密度的突触蛋白和微管蛋白。图8A-8B和9A-9B分别以20x和60x比较对照组和测试组。与对照相比，再生位点周围和在划痕区域中可见更多的细胞核，以及更高密度的突触蛋白和微管蛋白。
如上述实验所示，当用R,S-3-羟基丁酸钠处理细胞培养物并且细胞覆盖率高于对照细胞培养物时，发现显著更多的细胞迁移到受损区域。通过荧光显微镜显示，与细胞骨架和突触蛋白相关的标记在再生位点处理的神经元培养物中更密集。上述结果说明了生酮化合物用于治疗创伤性脑损伤或其他神经系统损伤的方法的潜在应用。
出于完整性的原因，本发明的各个方面在以下编号的条款中列出：
第1条.一种治疗受试者中的神经系统损伤的方法，所述方法包括向受试者施用包含一种或多种生酮化合物的组合物。
第2条.根据第1条所述的方法，其中所述神经系统损伤是中枢神经系统损伤。
第3条.根据第2条所述的方法，其中所述中枢神经系统损伤是脑损伤。
第4条.根据第2条所述的方法，其中所述中枢神经系统损伤是脊髓损伤。
第5条.根据第1条所述的方法，其中所述神经系统损伤是周围神经系统损伤。
第6条.根据第1条所述的方法，其中所述组合物包含一种或多种生酮化合物，所述一种或多种生酮化合物选自酮酯、酮盐、酮体前体和它们的组合。
第7条.根据第6条所述的方法，其中所述一种或多种生酮化合物是酮酯。
第8条.根据第7条所述的方法，其中所述酮酯是1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯。
第9条.根据第6条所述的方法，其中所述一种或多种生酮化合物是酮盐。
第10条.根据第9条所述的方法，其中所述酮盐是β-羟基丁酸盐。
第11条.根据第9条所述的方法，其中所述酮盐是β-羟基丁酸无机盐。
第12条.根据第9条所述的方法，其中所述酮盐是β-羟基丁酸钠盐。
第13条.根据第9条所述的方法，其中所述酮盐是R,S-3-羟基丁酸钠。
第14条.根据第1条所述的方法，其中所述组合物增强神经系统损伤后的神经元再生。
第15条.根据第1条所述的方法，其中所述受试者是脊椎动物。
第16条.根据第1条所述的方法，其中所述受试者是人。

Claims (16)

1.一种治疗受试者中的神经系统损伤的方法，所述方法包括向受试者施用包含一种或多种生酮化合物的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经系统损伤是中枢神经系统损伤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述中枢神经系统损伤是脑损伤。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述中枢神经系统损伤是脊髓损伤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经系统损伤是周围神经系统损伤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含选自酮酯、酮盐、酮体前体和它们的组合中的一种或多种生酮化合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种生酮化合物是酮酯。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述酮酯是1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种生酮化合物是酮盐。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述酮盐是β-羟基丁酸盐。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述酮盐是β-羟基丁酸无机盐。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述酮盐是β-羟基丁酸钠盐。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述酮盐是R,S-3-羟基丁酸钠。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物增强神经系统损伤后的神经元再生。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是脊椎动物。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。
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