CN109867726B - 一种融合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于追踪催产素的分子探针，其结构包括催产素‑连接环‑荧光蛋白1‑酶切位点‑垂体后叶运载蛋白‑荧光蛋白2。本发明的分子探针可以分别追踪到催产素与垂体后叶运载蛋白的分子探针，并且该分子探针还可以探究催产素与垂体后叶运载蛋白的分子结构关系。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白及其应用。
背景技术
催产素是一种神经肽，它不仅可以在女性生产时促进子宫收缩以及随后哺乳期乳汁分泌，而且一系列研究还发现催产素对消化系统、心血管系统甚至是学习记忆、性行为等都有着重要影响。最新研究还表明催产素可以在不同的物种内促进母性行为和社交行为，增强人与人之间的感情，催进人与人之间的交流和信任；催产素还对许多精神疾病如自闭症、社交焦虑症，精神分裂症等起到一定的治疗功能。在当今社会中，人类每时每刻都面临这诸多压力，所以这些病症在当代社会的发病率越来越高，但是目前仍然缺乏有效的治疗手段。由于催产素在社会行为和精神疾病的治疗方面发挥的重要作用，使其有望为这类精神疾病提供新的治疗手段，目前，实验证明将催产素通过对自闭症儿童采用鼻腔给药的方式能够明显的缓解他们的自闭症状，这给许多家庭带来了福音，我们迫切的希望了解催产素的作用机制使其能够更好的为人类服务。
在分子结构上，催产素是由九个氨基酸构成的一个环形肽，如此简单的催产素是怎样发挥着一些了广泛的作用的呢。这与其合成，释放，分泌机制密切相关，在中枢神经系统中，催产素主要是由位于下丘脑室上核和室旁核神经元所合成的，但是在合成之初，催产素并不是只有简单的九个氨基酸，而是通过3个氨基酸的短序列---甘氨酸-赖氨酸-精氨酸（GKR）与95个氨基酸的辅助蛋白--垂体后叶运载蛋白相连，垂体后叶运载蛋白可能对催产素的正确折叠，运输，储存以及释放等方面有密切的关系（这3个短的氨基酸序列一般认为是酶的作用位点，使催产素与辅助蛋白分开）。更重要的是，研究表明，催产素在中枢神经系统中有两种不同的分泌方式：一种经典的是胞体——轴突释放方式；另外一种是少见的胞体——树突释放方式。胞体--轴突释放发生在垂体后叶的轴突末梢，释放的催产素可以直接进入外周循环系统，发挥多种作用，然而目前尚不清楚外周循环系统的催产素含量是否直接与中枢神经系统中催产素的分泌直接相关，因为在外周系统中某些器官如：子宫，乳腺，肾，肝，心脏等也会合成催产素，但是其含量远远低于中枢神经系统中催产素的含量。而胞体-树突的释放是一种神经元自调节活性的过程，可以影响我们脑内诸多不同脑区神经元的活性和可塑性，所以通过胞体-树突释放的催产素更多的是影响我们社交行为和心理等方面。在催产素合成释放过程中，关于催产素-神经垂体后叶运载蛋白这个辅助蛋白的分子结构关系，目前有两种推测，一种是在转运的过程中，经过酶的作用，复合前体裂解为催产素和神经垂体后叶运载蛋白，并且分别在突触末梢内形成各自的分泌颗粒并储存起来，另一种是在转运过程中不经过酶的作用，复合前体直接以整个分泌颗粒储存，当神经元受到刺激时，分泌颗粒从分泌泡中释放出来，在释放的过程中经过酶的作用，复合前体裂解为催产素和神经垂体后叶运载蛋白。那么整个合成，运输，释放方式过程中催产素与辅助蛋白的关系究竟是怎样的以及这两种不同的释放过程中催产素与辅助蛋白是否存在不同的作用方式，都需要我们进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合蛋白及其在研究催产素合成释放机制中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种融合蛋白，其结构包括催产素-连接环-荧光蛋白1-酶切位点-垂体后叶运载蛋白-荧光蛋白2。
进一步地，连接环为3～8氨基酸的多肽。
进一步地，连接环的氨基酸序列为GGGGGV（SEQ ID No.1）。
进一步地，荧光蛋白1和荧光蛋白2在相距5～10nm时可产生荧光共振能量转移。
进一步地，荧光蛋白1和荧光蛋白2分别为黄色荧光蛋白和蓝绿色荧光蛋白中的一个。
进一步地，酶切位点的序列为GKR。
进一步地，催产素上游还包括信号肽，更进一步地，信号肽为15~25个氨基酸的多肽，更进一步地，编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
表达上述融合蛋白的质粒、微生物或细胞。
上述的融合蛋白在研究催产素合成释放机制中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的分子探针可以分别追踪到催产素与垂体后叶运载蛋白的分子探针，并且该分子探针还可以探究催产素与垂体后叶运载蛋白的分子结构关系。
附图说明
图1是蛋白整体结构示意图；
图2是酶切后的蛋白结构示意图；
图3是蛋白的表达结果；
图4是分子探针在神经元中的表达情况。
具体实施方式
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
1、分子探针的设计
设计可以分别追踪到催产素与垂体后叶运载蛋白的分子探针，并且该分子探针还可以探究催产素与垂体后叶运载蛋白的分子结构关系
通过碱基合成分别带有不同报告基因的催产素与神经垂体后叶运载蛋白片段，其中催产素通过一个连接环(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸)与报告基因黄色荧光基团相连，这个连接环富含甘氨酸因为其分子结构简单，灵活性较大，可以减少含238个氨基酸的黄色荧光基团对只有9个氨基酸的催产素在空间结构上产生的干扰；神经垂体后叶运载蛋白报告基因是蓝绿色荧光基团，中间无连接环，因为神经垂体后叶运载蛋白含有109个氨基酸，分子结构比较大，可以不用连接环来减少荧光蛋白的空间阻力，而且为了最大化的模拟体内的结构，我们设计的荧光分子探针也保留了该蛋白早期合成时带有的19个氨基酸序列的信号肽。蛋白整体结构如图1。如果在甘氨酸-赖氨酸-精氨酸（GKR）位点经过酶切以后就会产生分子量为28KD和38KD两个不同的蛋白片段图2。最终，通过观察不同的荧光基团的位置变化可以清楚的追踪到催产素与神经垂体后叶运载蛋白，此外，我们选择这两个荧光基团作为报告基因还涉及到通过荧光共振能量转移原理（FRET）来研究催产素与神经垂体后叶运载蛋白，其原理是在运输过程中当催产素与神经垂体后叶运载蛋白发生相互作用，距离在5-10纳米时就会产生荧光共振能量转移，即在只用433-445nm的激发波长激发蓝绿色荧光蛋白的情况下，该蛋白会产生475-503nm的发射波长，而这个发射波长就会激发黄色荧光蛋白，从而我们可以通过显微镜最终观察到有黄色的荧光产生，蓝绿色荧光减弱甚至消失。反之，则无黄色荧光产生。最终采用实时成像手段和FRET来研究催产素与神经垂体后叶运载蛋白在神经元中的合成，运输，储存以及释放这一完整过程。
新合成的序列OT-YFP-NP-CFP基因序列如SEQ ID No.3所示。
2、合成的分子探针构建到质粒表达载体中
首先采用酶切的方法（KpnI与HindIII酶均购买于NEB）使分子探针和表达载体pcDNA3.1zeo带上相同的粘性末端。酶切体系如下：
将配置好的体系分别至于37°C反应1小时，通过电泳胶分离后，回收目的片段，分别测出载体与目的片段的DNA浓度，用T4 DNA连接酶在16°C的条件下将这两个片段连接12小时，连接体系如下；
12小时后将连接的质粒转入感受态细胞，进行转化实验，通过平板涂布法将菌液涂板，置于细菌培养箱37°C培养12小时，然后通过基因测序的方法挑选阳性克隆产物，作为我们的实验质粒。
3、采用与步骤2中相同的酶切连接方式将合成的分子探针构建到腺相关病毒载体中，并以Hek293T细胞为载体包装腺相关病毒。
将Hek293T细胞扩大培养至10cm直径的培养盘15盘，细胞生长至80%时即可进行转染，每盘细胞质粒的用量为2.5μg目的质粒，7.5μg Helper辅助质粒，5.5μg AAV9血清型质粒，将以上质粒分别加入到opti-MEM中，混匀后加入PEI(1mg/ml)，每盘细胞PEI的用量为64μL，室温静置20分钟，将混合液缓慢滴加到细胞培养基中，6小时后更换培养基，置于37°C培养箱继续培养。60-72小时后将弃上清将细胞收集于15ml离心管，通过5次反复冻融循环（置于液氮中5分钟，然后置于55°C水浴锅中10分钟）以破碎细胞，1000g离心后保留上清液弃细胞碎片，将细胞上清液通过碘克沙醇超高速（48000rpm）离心的方式获取纯化的腺相关病毒，最后用病毒浸染原代培养的神经元，使神经元带上荧光从而来检测催产素与神经垂体后叶运载蛋白的相互关系。
实验结果
1.Western Blot 检测该质粒载体的催产素与神经垂体后叶运载蛋白表达情况，结果证明在Hek293T这个细胞系中可以正常表达，以及可以分开形成单独的催产素与神经垂体后叶运载蛋白片段，结果如图3（1代表阴性对照绿色荧光蛋白（28KD）样品；2代表绝对阴性对照即没有转染质粒的Hek293T细胞；3代表我们的目的质粒样品即在我们构建的载体在细胞中存在图1，图2所示的三种不同的蛋白；4代表标准蛋白marker）。Western Blot 采用的是绿色荧光蛋白抗体，因为我们的报告基因黄色荧光蛋白和蓝绿色的荧光蛋白都是通过原始的绿色荧光蛋白突变了某些关键氨基酸而来的，绝大部分氨基酸是相同的所以可以使用绿色荧光蛋白的抗体。
2.目前我们已经成功的将病毒在原代培养的神经元中表达，并且检测到了两种荧光的表达以及囊泡在神经元里的运动方式如图4，下一步需要我们做的就是利用双光子显微镜通过实时成像手段来研究在整个合成，运输，释放方式过程中催产素与辅助蛋白的关系；以及利用FRET原理来研究这两种不同的释放过程中催产素与辅助蛋白是否存在不同的作用方式。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南师范大学
<120> 一种融合蛋白及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Gly Val
1 5
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atggccggcc ccagcctcgc ttgctgtctg ctcggcctcc tggcgctgac ctccgcc 57
<210> 3
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atggccggcc ccagcctcgc ttgctgtctg ctcggcctcc tggcgctgac ctccgcctgc 60
tacatccaga actgccccct gggaggaggt ggaggtggag ctgtgagcaa gggcgaggag 120
ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 180
ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 240
atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cttcggctac 300
ggcctgatgt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 360
gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 420
aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 480
ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 540
agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 600
atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 660
cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta ccagtccgcc 720
ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 780
gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggca agagggccgc gccggacctc 840
gacgtgcgca agtgcctccc ctgcggcccc gggggcaaag gccgctgctt cgggcccaat 900
atctgctgcg cggaagagct gggctgcttc gtgggcaccg ccgaagcgct gcgctgccag 960
gaggagaact acctgccgtc gccctgccag tccggccaga aggcgtgcgg gagcgggggc 1020
cgctgcgcgg tcttgggcct ctgctgcagc ccggacggct gccacgccga ccctgcctgc 1080
gacgcggaag ccaccttctc ccagcgcgga ggtggaggtg gagctgtgag caagggcgag 1140
gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 1200
aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 1260
ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 1320
tggggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 1380
tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 1440
tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 1500
aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 1560
atcagccaca acgtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa ggccaacttc 1620
aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 1680
acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 1740
gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 1800
gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt ga 1842
Claims (10)
1.一种融合蛋白，其结构包括催产素-连接环-荧光蛋白1-酶切位点-垂体后叶运载蛋白-荧光蛋白2；催产素上游还包括信号肽；连接环为3～8氨基酸的多肽。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：连接环的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：荧光蛋白1和荧光蛋白2在相距5～10nm时可产生荧光共振能量转移。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：荧光蛋白1和荧光蛋白2分别为黄色荧光蛋白和蓝绿色荧光蛋白中的一个。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：酶切位点的序列为GKR。
6.根据权利要求1～5任一项所述的融合蛋白，其特征在于：信号肽为15～25个氨基酸的多肽。
7. 根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于：编码信号肽的核苷酸序列为SEQ IDNo .2。
8. 编码权利要求1～7任一项所述的融合蛋白的核酸，其特征在于：所述核酸的序列为SEQ ID No .3。
9.表达权利要求1～7任一项所述的融合蛋白的质粒或细胞。
10.权利要求1～7任一项所述的融合蛋白在研究催产素合成释放机制中的应用。
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