CN109844542B - 用于复用的旋转成像生物测定的装置和方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于执行复用旋转成像生物测定的装置。该生物测定装置可以利用高速自转运动，其自然地以常规相机或激光扫描技术无法达到的速率而以超快速成像模式提供即时细胞成像。更重要的是源自盘状基底的功能化固体基底可以与粘附细胞培养及生物化学特异性细胞捕获相容，其现在可以用超快速成像模式以>10MHz的超高速线扫描率测定。因此，大幅面自转高通量成像测定可以成为用于在例如药物发现和稀少的癌细胞筛选之类的许多应用中所要求的扩增测定通量以及含量/复用性这两者的有效工具。

Description

用于复用的旋转成像生物测定的装置和方法

技术领域

本发明涉及加速生物测定和增加采集的信息量的装置和方法。

背景技术

目前的生物测定技术通常可以根据目标标本的类型分为三类：（1）生物分子（亲和力）测定（例如DNA/蛋白质微阵列，ELISA/EIA），（2）基于细胞的测定（例如流式细胞计数法，成像细胞计数法）和（3）基于组织的测定（例如组织微阵列（TMA）和整体切片成像（WSI））。典型的测定策略包括：（a）悬浮液测定和（b）固体基底测定。这些技术通常在测量通量（即效率）和测量含量（即精度/准确度）之间具有基本的权衡。调和这种权衡的尝试可以通过在流式细胞计数法中增加成像能力的新兴兴趣（细胞测定的黄金标准）来证明。

虽然访问关于单个细胞的附加空间信息，但是这些成像流式细胞仪只能实现约1000个细胞/秒的成像通量，比非成像流式细胞仪（100,000个细胞/秒）慢许多数量级。与其中生物标本悬浮在流体中的流式细胞计数法相反，成像细胞计数法是对隔离的单细胞或大块组织基质执行高含量测量的另一种广泛的方法，其中标本大多附着在固体基底上。成像细胞计数法能够实时提供高含量的定量高分辨率图像分析（诸如用于细胞周期研究的时移测量、药物筛选实验等）。然而，测量通量限于少量细胞（每单拍视场为100-1000个细胞）。通过机械扫描整个标本可以实现测量（成像）区域的扩大。这不仅是在成像细胞计数法中而且也是在WSI和TMA中采用的常见策略，WSI和TMA是数字病理学和药物筛选的新兴技术。制药行业的高通量筛选已经扩展到TMA（来自单个组织块的大于1000多个核），其可以用于广泛的技术，包括组织化学、免疫组织化学和免疫荧光染色，或者用于DNA或mRNA的原位杂交。

WSI和TMA技术与基于组织的测定相关。此类测定在常规病理诊断中迅速获得普及，因为它们能够进行自动化的组织切片扫描和数字化，减轻临床实验室和医院中大量组织切片的手工检查的巨大负担。然而，此类技术的通量受到样本级的通用光栅扫描速度的限制，这也与所使用的相机技术的最高可实现帧速率紧密相关。为了保持高达约1μm的图像空间分辨率，WSI或TMA中的典型扫描处于在大于1分钟的时间内二维（2D）区域<10mm²的数量级。同样，这是目前测定技术中存在的通量对比含量权衡的一个明显示例。当成像的组织为三维（3D）时，例如，通过组织清除技术制备的3D组织块/支架或3D组织，因为需要额外的轴向图像扫描，通量进一步严重降低。

此外，绝大多数目前的生物测定技术依赖于使用分子特异性生物标志物/对比剂来增强测量特异性和准确性。示例是用于流式细胞计数法和图像细胞计数法的免疫荧光标记；以及用于肿瘤的组织病理学检查的免疫组织化学染色（例如苏木紫和曙红（H＆E）染色）。这些分子特异性生物标志物/对比剂一直是生命科学研究和生物医学诊断的主力。它们已被证明是揭示生物组织、细胞、细菌和病毒的形态和功能（基因型和表型）的有用工具，具有极高的化学特异性。尽管其流行，鉴于通过荧光的细胞毒性和光漂白引入的并发症，这些分子特异性对比剂并不总是理想的，更不用说与染色和标记相关联的费力和昂贵的样本制备过程。

相比之下，例如生物标本的光学（例如光散射率、折射率）、物理（例如尺寸、形态）和机械（例如质量密度、刚度或变形能力、细胞牵引力和粘附力）性质的内源（内在）参数现在已被认为是表型信息的新维度，这在生物测定中对于备受赞誉的分子特异性信息的补充有价值。然而，这些内在参数长期以来特别是在高通量生物测定的背景下一直保持未知。因此，如果能够将这些内在参数与黄金标准分子生物标志物一起揭示，那么它将成为一种变革性的生物测定技术，为高通量和高含量的生物医学分析创造新的信息/数据空间。

存在一类广泛命名为“离心微流体”的微流体技术，其中在自转/旋转期间利用离心推进机构用于主动流体控制，从而用于片上样本处理，例如，流体采样、混合和阀门调节、以及与外部泵对接。例如，离心微流体在亲和力免疫测定中增强了与抗体涂覆表面的抗原结合（亲和力）。离心力也促进细胞分离和分类，这已经在循环肿瘤细胞筛选中得到应用。离心微流体技术已被商业化以用于包括血液参数分析、免疫测定和核酸分析的应用。然而，（由于缺乏高速相机/激光扫描技术），现有技术缺乏在旋转/自转操作期间提供超快速高分辨率成像以用于实时高通量监测的能力。它们还缺乏提取生物标本的生物物理和生物化学特征的组合以用于高含量分析的能力，特别是在基于细胞和基于组织的测定的背景下（因为它们压倒性地依赖于慢荧光成像，这有助于仅提取生物化学信息）。

为了克服传统成像方法中存在的技术和基本限制，以及实现高通量和高分辨率成像生物测定的能力的阻碍，基于全光学激光扫描成像概念的类似两种新技术已被开发。 一种被称为“时间拉伸成像”，其通过在空间和时间域中使用光的色散性质而建立在时间上拉伸的宽带脉冲上。它以每秒1-100百万帧的超高速帧速率实现连续的图像采集。参见Lei等人，“Optical time-stretch imaging：Principles and applications（光学时间拉伸成像：原理及应用）”，Appl. Phys.，Rev. 3，011102（2016）；http://dx.doi.org/10.1063/1.4941050，其全部内容通过引用并入本文。另一种技术被称为“自由空间角啁啾增强延迟（FACED）成像”，其基于使用具有高反射率（>99％）的一对准平行平面镜将激光脉冲束变换为用于激光扫描的时空编码子束阵列而操作。 FACED不仅可以实现与时间拉伸成像相似的高达10 MHz的线扫描速率，而且可以实现在时间拉伸成像情况下不可能的扩展成像模式，举几例，如亮场彩色成像荧光成像，多光子成像。 参见Jianglai Wu 等人的“UltrafastLaser-Scanning Time-Stretch Imaging at VisibleWavelengths（可见波长的超快激光扫描时间拉伸成像）” Light：Science＆Applications 6，e16196（2017）。

发明内容

本发明提供了用于2D或3D形式的生物分子、微生物和细胞到组织/支架部分范围的高通量复用旋转/自转多尺度生物测定的有利的系统和方法。

本发明的实施例还涉及用于在超快速旋转运动中执行高通量和高含量2D和3D成像生物测定的技术。本发明的许多实施例具有与通用大幅面生物测定平台相集成的超快速、宽视场（FOV）、高分辨率光学激光扫描成像技术的特征，其支持2D或3D形式的从生物分子、微生物和细胞中的生物标本、到整个组织切片/支架的超宽范围的广泛定量测量。基于全光学激光扫描成像（例如时间拉伸或FACED成像）以超高速帧速率运行，本发明的许多实施例通过生物测定平台或成像照射的超快速旋转扫描运动以目前标准相机/激光扫描技术无法实现的速度和FOV实现高通量测量（读出），以用于捕获没有运动模糊及牺牲图像分辨率的微观图像。通过不仅提取（例如由生物化学特异性生物标志物辅助的）生物分子和生物化学信息，而且还提取（特别是在高通量系统中的）其它生物测定平台中通常缺失的定量参数的分类，来实现高含量测量（读出）。这些包括生物标本的光学（例如光散射、折射率）、物理（例如尺寸、形态、质量、密度）和机械（例如硬度或变形能力、细胞牵引力和粘附力）性质。这是一种测定通量和含量的前所未有的组合，其由于超快速运动连同超快速定量高分辨率成像技术。

本发明的实施例独特地提供大容量和高复杂度的生物医学数据，引发了医学科学研究和临床诊断中的范式转变，这是从基于假设到数据驱动的生物医学的目前转变。此类转变的基本原理在于大规模数据不仅能够做出更明智的决策，而且还会导致发现新的见解。例如，疾病的生物学和分子发病机理中的一个巨大挑战是在巨大和异质的群体内识别稀少的干细胞/祖细胞。它们的特性签名（从细胞水平到分子水平）的知识是必不可少的，但在再生医学中是有限的。此外，各应用还可以扩展到在不同分化阶段检测细胞的临床环境，或者可以在早期疾病过程期间特别是对于稀少的癌细胞筛选来量化稀少的异常细胞。另一个示例是药物开发过程，其中迫切需要高度复用的成像生物测定（涉及基于细胞或基于组织的测定），以用于针对数十至数十万种化合物的高通量表型药物筛选。因此，迫切需要一种变革性技术，其可以为异质群体内的多个个体细胞和组织收集（形态学、表型和分子的）高含量数据，以便对其进行高速、非常详细地分析。

与常规生物测定技术相比，本发明的实施例涉及基于与高速旋转测定基底或旋转照射集成的超快速激光扫描成像的高通量复用生物测定平台。此外，本发明的成像测定平台中实现的速度和FOV不能通过任何现有相机和激光扫描/样本扫描技术来实现，并且仅可能通过本发明实现。在本发明的许多实施例中，在高速基底/照射旋转期间的单向轴向扫描允许实时地进行3D成像。此外，根据期望的应用，可以灵活地设计成像FOV的数量以及甚至跨整个平台上的各个FOV的形状，而不会危害成像速度和通量。再次注意，本发明显示了与生物化学特异性分子结合测定、细胞捕获测定、细胞培养测定和组织切片/支架测定相容的通用生物测定平台。本发明的实施例提供了能够同时提取生物物理学（光学、机械性质）和生物化学性质的高含量定量成像测定，其还能够与主动离心微流体技术集成以用于采样测定平台上的全自动样本处理、成像和分析。

用于实现本发明的装置利用来自单个或多个脉冲激光器或强度调制连续波（CW）激光器的激光脉冲。可以实现两种不同成像模式中的任何一种，即，（1）其中涉及图像的频谱编码的时间拉伸成像，或（2）其中不涉及频谱编码的FACED成像。这些脉冲首先在介质（例如用于时间拉伸成像的色散光纤或用于FACED成像的准平行镜对）内拉伸以形成时间波形，然后由分束器将其引导到成像系统。在时间拉伸成像中，全息衍射光栅连同中继透镜和物镜被用来将波长扫描光束转换成一维频谱编码的线扫描光束，其被投影到改进的自转盘状基底上。在FACED成像中，线扫描光束直接投影到自转盘状基底上。与盘状基底上的标本接触会导致光束被用样本或标本的图像编码。通过在后物镜的入射光瞳处放置反射镜，沿着相同的路径返回用样本图像编码的线扫描光束，从而形成双通道配置。当被重新组合成高斯光束轮廓时，被图像编码的光束最终由高速光接收器检测并由高速实时数字化仪和电子信号处理器记录。值得注意的是，图像编码的线扫描光束也可以通过后物镜之后的透镜系统重新耦合，其如双通道配置中那样形成高斯光束轮廓。重新组合的图像编码光束还可以最终由高速光检测器检测。这种单通传输配置与FACED成像特别相关，这是因为其在光耦合和光投射方面的简单性而无需如在时间拉伸成像中那样使用衍射光栅。

本发明中使用的改进的自转盘（例如DVD）测定平台可以具有四个测定孔/位点，尽管它们可以是任何整数。标本的样本位于每个位点中。在本发明的多个实施例中，包含测定站点的基底由两个光学透明层组成（例如从两个单独的DVD获得的聚碳酸酯层），它们与UV固化的粘合剂结合在一起。这产生了由间隔件限定的高度约3-1000μm的测定室，其也被仔细对准以稳定快速自转运动。

附图说明

当结合以下详细描述和附图考虑时，本发明的前述和其它目的和优点将变得更加明显，其中类似的标称在各视图中表示相同的元件，并且其中：

图1是本发明的操作方法的流程图；

图2是根据本发明的通用生物测定平台的流程图，其与分子、细胞和组织切片/支架相容，并且其利用改进的盘状基底以用于特异性捕获、细胞培养和组织安装；

图3A示出了对于本发明有用的具有静态线扫描的旋转/自转平台的总体布置；

图3B示出了可以与本发明一起使用的具有静态平台的旋转/自转线扫描的总体布置；

图3C示出了根据本发明的实现具有与旋转载体集成的小型化光学组件的旋转线扫描照射的示例；

图3D示出了根据本发明的实现具有与旋转载体集成的小型化的基于反射镜的光学组件的旋转线扫描照射的示例；

图4A示出了根据本发明的系统的任意视场成像能力的示例；

图4B示出使用螺旋扫描方法实现全盘成像的示例；

图4C示出了使用环形扫描方法实现全盘成像的示例；

图4D示出了根据本发明实现的具有可重新配置区域的分段视场阵列的示例。

图5A示出了实现3D组织结构成像的图示，该3D组织结构成像是通过将3D组织块安装到自转盘状基底上来实现。因此，该自转样品沿着轴向通过全光学激光扫描成像进行光学切片，然后将2D光学切片图像数字地堆叠，拼接并重建为3D体积组织块结构。

图5B示出了实现3D组织结构成像的图示，该3D组织结构成像是通过将3D组织块安装到静态盘状基底上来实现。因此，该静态样品沿轴向通过旋转全光学激光扫描成像进行光学切片，然后将2D光学切片图像数字地堆叠，拼接并重构成3D体积组织块结构。

图5C示出了实现3D组织结构成像的图示，该3D组织结构成像通过将3D组织块切片成多个组织切片来实现。然后将组织切片安装在自转盘状基底上，并且由此通过全光学激光扫描成像进行成像，然后将2D组织图像数字地堆叠，拼接并重构成3D体积组织块结构。

图5D示出了实现3D组织结构成像的图示，该3D组织结构成像是通过将3D组织块切片成多个组织切片来实现。然后将组织切片安装到静态盘状基底上，并且由此通过旋转的全光学激光扫描成像进行成像，然后将2D组织图像数字地堆叠，拼接并重构成3D体积组织块结构。

图6A示出了基于时间拉伸激光扫描成像的本发明的基于DVD成像细胞的测定系统的示意图；

图6B示出了本发明的由从用UV固化的粘合剂结合在一起的两个DVD获得的两个聚碳酸酯层组成的基底的示意图；

图6C示出了根据本发明的图像拼接算法；

图6D示出了本发明的基底的示意图，该基底由从DVD获得的一个聚碳酸酯层和具有组织切片的玻璃基底组成，其用氟凝胶结合在一起。

图7A示出了在盘上培养的420μm×34mm MCF-7拼接图像（以900rpm（线速度约4m/s）成像））；

图7B示出了图7A中用虚线所示的区域的放大视图；

图7C示出了图7B中MCF-7拼接图像的图7B中用虚线所示的上部区域的放大视图；

图7D示出了图7B中MCF-7拼接图像的图7B中用虚线所示的中间区域的放大视图；

图7E示出了图7B中MCF-7拼接图像的图7B中用虚线所示的底部区域的放大截面图；

图7F示出了由商用光学显微镜拍摄的图7C中MCF-7的相同区域的相位对比静态图像；

图7G示出了由商用光学显微镜拍摄的图7D中MCF-7的相同区域的相位对比静态图像；

图7H示出了由商用光学显微镜拍摄的图7E中MCF-7的相同区域的相位对比静态图像；

图8A示出了特异性捕获的生物素化聚苯乙烯微粒的时间拉伸成像的改进的DVD测定设计；

图8B示出了在3000rpm（速度为14m/s）的自转速度下拍摄的在孔T（顶部）和C（底部）中的捕获的微粒的时间拉伸图像；

图8C示出了由普通光学显微镜拍摄的孔T（顶部）和C（底部）的静态图像；

图8D示出了根据时间拉伸图像分析的捕获的4657个微粒的统计尺寸分布；

图9A示出了用于特异性捕获的MCF-7的时间拉伸成像的改进的DVD测定设计；

图9B示出了自转DVD（自转速度为2400rpm，并且线速度为11m/s）上的目标孔中的抗体捕获的MCF-7细胞的时间拉伸图像；

图9C示出了图9B中MCF-7的大区域拼接图像的放大截面；

图9D示出了图9B中MCF-7的大区域拼接图像的放大截面；

图9E示出了图9B中MCF-7的大区域拼接图像的放大截面；

图9F示出了在具有仅要控制的涂覆链酶亲和素的区域中特异性捕获的MCF-7细胞的图像；

图9G示出实验中细胞捕获的特异性分析；

图9H示出了在2分钟自转之后拍摄的在DVD基底上用活体染色（碘化丙啶）处理的捕获细胞的静态图像（相位对比（左）和荧光（右））；

图9I示出了在32分钟自转之后拍摄的在DVD基底上用活体染色（碘化丙啶）处理的捕获细胞的静态图像（相位对比（左）和荧光（右））；

图10A示出了与用于抗体捕获的人血沉棕黄层（75％）混合并因此富集MCF-7的MCF-7的标本（25％）;

图10B示出了在900rpm（线速度为4m/s）的自转速度下拍摄的对照孔（controlwell）中和目标孔中的富集MCF-7（具有抗-EpCAM抗体）的时间拉伸图像；以及

图10C示出了用绿色荧光染料进一步染色的富集MCF-7的静态图像（顶部：相位对比；底部：荧光）。

图11A示出了人骨组织的拼接时间拉伸亮场图像。

图11B示出了人骨组织的拼接时间拉伸相位图像。

图11C示出了针对相位图像拼接实现的拼接算法。

具体实施方式

本发明涉及用于高通量通用多尺度自转/旋转成像生物测定的系统和方法。更具体地，本发明体现在如图1到图11C所图示的装置、方法和结果中。应当理解，该装置可以关于配置和部件的细节而变化，并且该方法不脱离本文所公开的基本概念的情况下可以关于具体步骤和顺序而变化。

本发明可以以具有超快自转/旋转运动的测定形式来体现。图1图示出了测定读出是基于任何超快速激光扫描成像策略（例如时间拉伸成像和FACED成像），其可以超过传统激光扫描技术的速度限制（例如检流计镜、自转多面镜、声光偏转仪）。

用于实施本发明的一般方法包括将标本的样本安装在可旋转盘状驱动器上的第一步骤101，如图1所示。在步骤102，发送驱动器的起始位置，并且在步骤103，设置用于盘状驱动器的期望的自转速率。接下来在步骤104开始对盘上的样本进行成像，其产生串行输出数据流。在步骤105重构和分析该串行图像数据以提供生物测定。

如图2所示，该基本方法可以用特别为诸如捕获来自特异性对象、细胞培养和组织安装的数据之类的特定任务准备的盘或基底来实现。对于这些技术中的任何一种，第一步骤201是要创建在其上安装样本的基底。在利用DVD的许多个实施例中，这通过首先将DVD盘分成两半并仅保留透明的一半来完成。在步骤202，用70％至100％的乙醇清洁该透明盘状基底。

如果基底被用于捕获特异性对象（标记为228），则在步骤203将盘用链酶亲和素涂覆。接下来，在步骤204施加生物素化二级抗体涂覆，然后在步骤205进行一级抗体涂覆。待测定对象被置于盘上的孔中，并在步骤206中培育一段时间。培育后，在步骤207将盘冲洗以减少非特异性结合。这去除不在结合位点的材料。最后（步骤208），将基底输送到用于成像的光学系统以便形成生物测定。

在步骤209，当用于细胞培养时，例如用70％的乙醇和紫外光对来自步骤202的清洁盘进行消毒。在步骤210，将培养介质和细胞的混合物沉积在基底上。然后在步骤211将基底保存在培育箱中，直到所需细胞群体存在于基底上。最后，在步骤212将基底输送到用于成像的光学系统，从而可执行生物测定。

如果希望将组织安装在基底上（标记为230），则在步骤213首先使组织样本脱水。然后在步骤214，使组织达到最佳温度用于将其与最佳切割温度（OCT）化合物包埋。在步骤215，具有包埋的OCT的组织在低温恒温箱中冷冻至低于-20℃。而在步骤216，在低温恒温箱中将组织切成切片。在接下来的步骤217，将基底置于低温恒温箱中，并将组织切片安装在其上。然后在步骤218，使具有冷却组织的基底过夜达到室温。在步骤219，冲洗具有安装的组织的基底，并且在步骤220，将其输送到成像的光学系统。

如果希望将组织安装在具有较薄厚度的基底上（标记为230），则在步骤213，首先使组织样本脱水。然后在步骤221将组织包埋到熔融石蜡中。在步骤222，具有包埋的石蜡的组织冷却至室温。 而在步骤223的低温恒温器中，在切片机中将组织切成切片。在下一步骤224，将玻璃基底带入切片机并且将组织切片安装在其上。然后在步骤225用二甲苯冲洗具有冷冻组织的玻璃基底。在步骤226，将具有安装的组织的玻璃基底粘附在[0064]段中提到的清洁的基底上，并且在步骤227将其输送到成像的光学系统。

图3A示出了在自转平台或基底302上一维（1D）线扫描301照射阵列元件303。对于1D线扫描的速度要求必须超过1MHz，以便适应测定的高速运动（例如自转轨迹）。标本的2D高分辨率图像（例如组织、细胞或分子微阵列的微观图像）通过具有单向旋转运动的测定样本平台的照射来捕获，即，如图3A中所示的旋转测定平台（其由静态线扫描312照射成像），或者如图3B中所示的，使静态测定平台上的线扫描照射旋转/自转。当如图3B中所示基底304是静态或静止时，来自光纤306的照射由载体305旋转。注意，这种单向旋转运动减轻了前后扫描或锯齿形路径扫描的常规策略带来的机械不稳定性和后冲问题。旋转/自转照射通过但不限于以下方法（图3C）来实现：线扫描光束可以被引导到安装在旋转载体305上的集成小型化光学组件（由渐变折射率（GRIN）透镜308、小型中继（迷你光栅）透镜309和物镜310组成）。这些元件安装在外壳307中。照射由光纤306提供，光纤306借助于可旋转接头附接到旋转载体305的外边缘。接头在载体旋转时防止光纤扭转。以这种方式，组件可充当将线扫描光束投射到静态测定平台上的作用。注意，依赖于超快速线扫描技术，线扫描光束可以通过光纤306或通过体光学器件在自由空间中被引导到组件（图4A）。注意，在自转期间，照射元件301,306,311也可以沿径向致动，以便接近更宽的2D FOV。

成像生物测定系统的FOV可以被任意设计。例如，它可以是覆盖整个自转盘401的连续FOV，或者具有由用户定义的不同尺寸的离散FOV阵列，或者甚至具有任意形状402的FOV，包括但不限于如图4A的线扫描区域。这可以通过自转403/旋转404照射或生物测定盘之间的相对运动来控制。对于整个盘的扫描可以采用包括但不限于如图4B和4C所示的方案。FOV还可以是如图4D所示具有可重构区域（具有标签405的蓝色的段）的分段视场阵列。

值得注意的是，由于系统的自转速率可以从500转到25,000转/分钟（rpm）灵活地调节，这意味着视频帧速率，即>10 Hz的超大FOV成像（通常沿圆周方向）。再次，有效的FOV可以被设计为沿圆周方向的多个分立的区域。所有这些区域可以大规模（>cm²）同时成像，并以视频速率进行成像。这种独特的能力有助于对例如细胞增殖，细胞牵引的感兴趣领域的实时视频速率蜂窝动态监测。

除了对2D生物测定提供独特的监测之外，本发明还可以以超快速率扩展到3D组织结构成像。图5示出了如何可以通过目前发明安装和成像3D组织结构的图示。与之前关于2D成像的图示类似，这可以在自转/静态盘基底上进行。此外，3D组织结构可以被处理和成像以用于不同形式的样品类型，例如，组织块/组织切片。图5A-5B描述了如何可以将3D组织块503与轴向扫描一起光学地切片以实现3D组织成像。图5A示出了实现3D组织结构成像的图示，这是通过将3D组织块503安装到自转盘状基底501上来实现。因此，该自转样品沿着轴向通过全光学激光扫描成像502进行光学切片504，然后将2D光学切片图像505数字地堆叠，拼接并重建为3D体积组织块结构506。图5B示出了实现3D组织结构成像的图示，这是通过将3D组织块503安装到静态盘状基底上来实现。因此，该静态样本507沿轴向通过旋转的全光学激光扫描成像508-509进行光学切片504，然后将2D光学切片图像505数字地堆叠，拼接并重构成3D体积组织块结构506。

另一方面，图5C-5D描述了如何可以首先将3D组织块机械地切片，并且然后将其安装到盘状基底上以实现3D组织成像。图5C示出了实现3D组织结构成像的图示，其是通过将3D组织块510切片成多个组织切片511来实现。然后将组织切片安装在自转盘状基底501上，并且由此通过全光学激光扫描成像502进行成像，然后将2D组织图像512数字地堆叠，拼接并重构成3D体积组织块结构506。图5D示出了实现3D组织结构成像的图示，这是通过将3D组织块510切片成多个组织切片511来实现。然后将组织切片安装到静态盘状基底501上，并且由此通过旋转的全光学激光扫描成像508-509进行成像，然后将2D组织图像512数字地堆叠，拼接并重构成3D体积组织块结构506。

图6A描绘了本发明的装置，其中来自光纤603（来自光纤锁模激光器601）的激光脉冲首先在色散光纤602内被时间拉伸，并且从而形成波长扫掠波形，然后由分束器604（BS）将其引导到成像系统。全息衍射光栅605与中继透镜606、607（L1和L2）和物镜608（Obj1）一起被用于将波长扫掠光束转换成1D光谱编码的线扫描光束612，其被投射到改进的自转DVD基底609上。通过在后物镜610（Obj2）的入射光瞳处放置反射镜611，沿着相同的路径返回图像编码的线扫描光束，形成双通道配置。当被重新组合回高斯光束轮廓时，图像编码光束最终被分束器引导并且然后由高速光接收器613（12GHz带宽）检测并由高速实时示波器614（16GHz带宽、采样率为80GSa/s）记录。

商业DVD的基底通常由聚碳酸酯制成，其是生物医学应用中材料的普遍选择，因为其生物相容性和其优异的机械强度。然而，DVD上的反射涂层通常妨碍本工作采用的传输成像、成像配置（图6B）。为此，在一个示例性实施例中，本发明的测定平台设计基于从两个分离的DVD获得的双层聚碳酸酯基底。具体地说，每个DVD被分成两半，每个具有相同的盘形，但是减小了厚度，从而可以去除原来夹入的反射层。只有DVD盘的透明半部（约0.6毫米）被用于进一步的表面功能化。

图6B示出了在本发明的一个实施例中采用的改进的DVD测定平台615的设计示意图（这里描绘了四个测定孔/位点616-619，其可以是整数数目）。参考图6B中的截面视图，上层透明聚碳酸酯层620通过间隔件624、625与下层621分离。基底的各盘通过UV固化胶或粘合剂622保持在一起。因此，在细胞培养或特异性细胞捕获过程之后，UV固化的粘合剂沉积在细胞标本位点623的周围，使得被测细胞在固化它们之前不与UV固化的粘合剂622接触。间隔件624、625由任何固体材料（例如但不限于玻璃）制成，并且具有3-1000μm的高度。它们被小心地定位在基底621上的各个位置（如图6B所示），使得重量均匀地分布在基底上，以便确保稳定的自转操作。

基底620与基底621相同，但是没有被功能化。如所指示的那样，它用间隔件堆叠并胶合在功能化基底621的顶部上。进一步按压顶部基底620，以确保与所有间隔件624、625的完全接触。此时，双层盘626厚度约为1.3mm，并且包含N个预定的测定隔室（图6B中示出四个）。将双层盘组件暴露于空间受限的UV光（Thorlabs CS2010）至少30秒以进一步固化。空间受限的UV照射避免UV暴露，并且从而避免隔室内细胞标本的光毒性。

由于电气抖动，图像不是水平或垂直地以精确的空间位置拍摄。这在图6C中所示，在本发明的一般图像拼接中，在拼接整个图像之前，从2个图像中获取少部分图像用于互相关。归一化互相关允许无限拼接迭代和更快的模式识别，因为较少的像素被取用于相关计算。通过在大规模图像拼接之前的在各个空间位置执行成像，可以对大型的任意FOV进行成像。

图6D示出针对组织切片粘附的基底设计。仅使用单层聚碳酸酯基底（620/621）。在用例如氟凝胶的安装介质636密封之前，将组织切片粘附在护罩玻璃637上。多个组织切片（631-634）可以粘附到相同的护罩玻璃上，使得可以在聚碳酸酯基底上处理数十个组织切片。对于用于组织成像的基底，仅通过图2中的步骤201-202处理基底620/621。

本发明可用于细胞培养实验。当这是这种情况时，用70％的乙醇和紫外（UV）光清洁并消毒聚碳酸酯基底。参见图2中的步骤209-212。

可以使用本发明对人乳腺癌细胞系（MCF-7）执行一种类型的细胞培养实验。在这种情况下，将细胞系在与用90％的最小必需培养介质（MEM）、10％的胎牛血清（FBS）和1％青霉素-链霉素（Pen Strep）配制的标准细胞培养介质混合之前从培养皿中胰蛋白酶化并使其离心。将这种类型的细胞在CO₂培育箱中培养，并且每周将介质更新2-3次。参见图2中的步骤209-212。

使用该细胞培养物的测试结果示于图7中。对于这些测试，将约30,000个MCF-7细胞与300μL标准细胞培养介质混合，并且然后装载在半盘状基底上的预定区域上。该混合物通过疏水性聚碳酸酯表面上的表面张力在空间上限制在该区域内。然后将该基底在与另一种非功能化聚碳酸酯半盘粘合之前培育两天。

作为本发明的概念验证实验，在线扫描区域内以900rpm的自转速度（其相当于线速度4m/s）在改进的DVD上执行这些MCF-7粘附细胞的时间拉伸成像。系统不但以11MHz的线扫描速率捕获了大型FOV（大至34mmx420μm（图7A）），而且还递送了高分辨率的细胞成像，其显示了没有运动模糊的亚细胞结构。图7B是图7A中的附图标记701指示的区域的放大图。图7C、7D和7E分别表示由附图标记702、703和704指示的区域的进一步放大。图7中的附图标记705指示的线表示50μm。

注意，通过使用干涉测量进入（access）相位对比或通过非对称检测技术进行相位梯度对比，可以进一步增强图像对比度。值得注意的是，两种成像方案可以进一步量化细胞的相位信息，从其中可以提取一组生物物理表型，例如细胞尺寸、质量和密度。

已经发现，本发明采用的自转速度方案可以确保在超快速自转作用下粘附细胞的形态没有可观察到的变化。这可以通过使用10倍物镜（Nikon Eclipse Ni-U）的常规光学显微镜拍摄的相同区域的静态图像来验证。在静态图像中可视化的细胞形态和时间拉伸自转图像总体上彼此一致（图7F、7G、7H）。图7C、7D、7E中的每个图中的箭头指示了图7F、7G、7H的时间拉伸图像和光学显微镜图像这两者中识别的关键细胞特征。在当前系统中，时间拉伸图像的FOV受到示波器提供的有限存储深度的限制。当与高通量数据获取平台（例如，图形处理单元（GPU）或现场可编程门阵列（FPGA））集成时，实时全盘成像是可行的。

对于化学特异性微粒捕获的测试，可以使用生物素化聚苯乙烯微球（Spherotech，7.79μm）。然后将20μL库存供应的微球溶液在盘的所有预定捕获（目标）孔上培育30分钟（参见图8A中所示的盘示意图）。将所有孔用1×磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤5次以防止非特异性微球捕获。用反渗透（RO）水一次性轻轻洗涤位点5秒钟可防止在干燥时PBS的结晶。

化学特异性细胞/微粒捕获实验的结果在图8A-10C中示出。如图8A所示，分别在N个（在图8A的实施例中示出4个为例子）预定区域用链酶亲和素涂覆进一步处理基底801，其稍后形成测定孔802-805。二级生物素化抗体可以在这些区域803、805中培育以便进一步的特异性捕获。参见图2的步骤203-208。图8A中的DVD上的曲线指示记录区域。

四个位点/孔对称地分布在盘状基底801上。其中的两个803、805涂覆有用于生物素化-微球结合的链酶亲和素并被标记为T，而另外两个孔802、804没有涂覆链酶亲和素，并被定义为标记为C的对照孔（图8A）。为了成像演示和简化，本实验使用单层基底设计和反射成像。这通过去除后物镜610和反射镜611来实现，使得仅采集反射和反向散射的光。选择这种布置是因为与生物细胞相反，聚苯乙烯微球给出足够高的反向散射光对比度，并且可以在成像期间暴露于空气中，而不会对微球带来任何不利影响。在用于时间拉伸成像的高速自转之前，基底801在干燥器内干燥。将具有0.384mm×140mm的大型FOV的拼接图像转换成具有180°的弧的弯曲图像（参见图8A中所示的盘上重叠图像的示意图）。与在对照位点拍摄的图像相比，特异性捕获的微球（4657个微球）在3000rpm的高旋转速度下或约14m/s的线速度下被清晰地可视化（图8B顶部），即观察不到微球（图8B底部）。注意，自转基底的时间拉伸图像与由普通光学显微镜捕获的相同区域的静态图像（图8C）高度一致。用附图标记806指示的所有比例尺表示50μm。为了进一步举例说明从该高通量成像技术得到的定量分析的能力，将个体微球在图像中数字分割并量化。尺寸的统计分布（图8D）是高斯曲线。测量的平均直径，即7.85μm（0.68μm的标准偏差），与供应商提供的规格一致。

对于化学特异性细胞捕获的测试，其结果示于图9中，四个或八个目标孔被限定在单层聚碳酸酯基底上，并用链酶亲和素涂覆（遵循BioteZ Polystreptavidin R CoatingKit提供的协议）进行处理（图9A）。将生物素化的马抗-山羊抗体（Vector Labs BA-9500,10μg/mL）在链酶亲和素涂覆的位点中培育30分钟，然后用1×PBS冲洗5次。然后，将山羊抗上皮细胞粘附分子（EpCAM）抗体（RnD AF960,10μg/mL）仅在目标孔中进一步培育30分钟，然后用1×PBS冲洗5次，使得目标孔可捕获MCF-7，其中具有EpCAM作为表面标志物。参见图2的步骤203-208。

接下来将1×PBS中的10μL MCF-7装载到基底上的所有孔中30分钟，其允许抗体和EpCAM之间的结合，并且从而捕获MCF-7（图9A）。这之后用1×PBS冲洗5次，以减少非特异性结合。通过标准生物化学方法分别测试和验证所有涂层。使用生物素化辣根过氧化物酶H（Vector Labs PK-6100）用3, 3’-二氨基联苯胺（DAB）染色测试链酶亲和素层，使得染色时链酶亲和素涂覆的基底显色为棕色。在基底上用额外的Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠抗体（LifeTechnologies A-11001）培育之后，通过荧光成像验证链酶亲和素层顶部上的生物素化的马抗山羊抗体（Vector Labs BA-9500）层（图9A）。对于每个层，进行对照实验以验证最小的非特异性结合。

基底采用八孔设计901：四个孔是涂覆有抗-EpCAM抗体的目标孔（标记为T）902-905，而另外四个孔是仅具有链酶亲和素涂覆的对照孔（标记为C）906-909。还示出了目标孔中抗体捕获的MCF-7的示意图。

可以使用被设计用于处理自转运动中的千兆像素的图像的算法来拼接所获取的图像。该算法与全景算法不同，不使用特征识别算法，即尺度不变特征变换算法。该算法基于归一化互相关，其在计算之前比较来自2个图像的修剪区域。在计算相关性期间，图像同时重新整形，以补偿高速自转下的图像变形。如图6C所示，记录最大相关发生的位置和变形系数，从而可以重构最终图像。这种算法还能够监视旋转速率的抖动。

在2400rpm的旋转速度（即线速度高达11m/s）下，本发明的时间拉伸成像系统能够在目标孔中获得单个捕获的MCF-7细胞的高分辨率图像（图9B）。注意，最终拼接图像具有0.55mm×70mm的FOV，覆盖对照孔和目标孔这两者（如图9A中所示的跨90°的弧）。通过在目标孔和对照孔的图像之间进行比较（图9B对比图9F），清楚地验证了DVD表面改进过程和结合特异性。底部的比例尺表示50μm。图9C-9E示出了图9B中的虚线中的区域的放大截面。

确定特异性捕获率为约95.8％，而非特异性捕获率为约1.4％（图9C）。应当注意，特异性捕获率原则上受限于可用的结合区域。这种演示的意义在于，使用该基于自转细胞的测定形式相结合的时间拉伸成像不仅可以揭示细胞的形态学信息，还可以通过生物化学特异性结合揭示细胞的生物分子特征（例如在这种情况下是MCF-7的表面标志物EpCAM），这是增强测定准确性和特异性的重要附加信息。

图9G示出了实验中细胞捕获特异性的分析。特异性和非特异性的百分数是根据剩余细胞的数量分别比对除去在抗体涂覆和链酶亲和素涂覆的孔中捕获的MCF-7数量来计算。

图9H示出了在2分钟自转之后拍摄的在DVD基底上用活体染色（碘化丙啶（PI））处理的捕获细胞的静态图像（相位对比（左）和荧光（右））。图9I示出了在32分钟自转之后拍摄的在DVD基底上用活体染色（碘化丙啶（PI））处理的捕获细胞的静态图像（相位对比（左）和荧光（右））。

还通过本发明的高速自转操作来评估待测细胞的活力。通过在基底上用PI培育捕获的细胞来执行活体染色。来自PI的橙红色荧光发射作为死亡细胞的指示符。观察到在2分钟和32分钟自转操作之后细胞活力没有显著变化（死亡细胞计数仅增加0.5％）。其验证了时间拉伸成像期间的高速自转给细胞带来的不利影响最小。此外，绝大多数捕获的细胞在32分钟的自转持续时间内在盘上的其位置保持不变（图9I）。它展示出优异的结合强度，并因此证明了该细胞捕获测定形式的鲁棒性。

代替使用纯MCF-7群体（如图9所示），用人血细胞和MCF-7的混合群体进行进一步的实验。具体地说，将MCF-7细胞与人血沉棕黄层（从人全血提取）混合（图10A），然后在自转盘上对MCF-7进行捕获和筛选。采用与图7A所示相同的基底设计。与纯MCF-7群体的实验类似（图9），将盘上八个位点中的四个位点902-905指定为目标孔，其涂覆有链酶亲和素、生物素化的马抗-山羊抗体、最后是山羊抗-EpCAM抗体。筛选/富集过程表现出高效的特异性细胞捕获，其在900rpm的自转速度下再次通过时间拉伸成像（图10B左）可视化。通过将额外的绿色荧光探针（Alexa Fluor-488）与抗-EpCAM抗体缀合并在时间拉伸自转成像操作（图10B右）之后检测相应的荧光发射，进一步验证MCF-7捕获的特异性，确认捕获的细胞不是白细胞。所有比例尺表示50μm。

对于MCF-7富集/筛选的测试，在实验前一天获得血沉棕黄层样本，并在室温下储存过夜。另一方面，将MCF-7细胞从培养皿中胰蛋白酶化，并计数，从而将600,000个MCF-7细胞与来自人血沉棕黄层（总计220μL）的3,000,000个细胞混合。然后将10μL的混合溶液在每个目标位点培育30分钟，随后多个盘冲洗（约7次），直到血块完全消除。校准后应进行1次以上的冲洗。

图10C示出了用绿色荧光染料进一步染色的富集MCF-7的静态图像（上部：相位对比；下部：荧光）。（Alexa Fluor-488抗-EpCAM（RnD FAB9601G，10μg/mL））。执行该附加染色步骤以进一步确认DVD上富集的MCF-7。

该测试与CTC富集、检测和计数的应用特别相关。在该示例中，我们利用通常在上皮细胞上表达的细胞粘附分子EpCAM作为通过免疫结合方法将MCF-7细胞与白细胞区分开的生物标志物。因此，本发明的实施例不仅可以与现有技术类似地执行基于EpCAM的CTC富集，而且由于高分辨率和高通量成像能力还允许利用单细胞精度对捕获的细胞进行现场定量图像分析。值得注意的是，与定量相位时间拉伸成像相结合，这种基于细胞的高通量自转成像测定可以允许单细胞生物物理表型，例如，细胞尺寸、质量、密度和其它细胞的机械性质。已知这些内在表型与恶性转化密切相关，并因此是癌症筛选以及药物开发的有效生物标志物。特别是关于药物开发过程，大幅面的自转盘也有利于高度复用的成像测定，并且可以潜在地用于针对数百到数万种化合物的有效（癌症）药物筛选。

图11示出了无标记的大型FOV组织切片成像（人软骨组织切片）的另一种实施方式。在这种情况下，在自转（以2,400rpm）期间捕获亮场和定量相位图像。之后，使用亮场图像进行模式识别和拼接。用于拼接的相同坐标将用于拼接相应的相位图像。这减少了用于处理亮场和定量相位图像的拼接的总体计算时间（图11A和11B）。对于相位图像拼接，使用图11C所示的方案对2个图像1101-1102之间的重叠区域进行权重平均。因为由于光学像差和低光谱功率，重建的相位值可能对图像的2个边缘具有增加的误差，所以该方法可以抵消误差的一部分。

本发明的测定形式是高度通用的。旋转的平面平台代表了针对广泛应用功能化的通用测定形式，诸如但不限于粘附细胞培养物、生物化学特异性细胞捕获、双分子亲和力测定、2D组织切片、3D组织支架，以及利用组织清除技术的3D组织标本。旋转平台的离心作用也可用于细胞的生物力学测量（例如细胞牵引力，细胞粘附力，细胞刚度），这在任何现有的测定技术中尚未得到证实。注意，长期以来已知细胞和组织的生物力学性质与遗传/表观遗传学特征密切相关，并因此代表了用于细胞生物学研究和癌症筛选的有价值的内在生物标志物，以及药物开发过程期间药物反应的评估。

在许多实施例中，细胞的生物力学测量可以在改进为与常用的牵引力显微镜配置相容的旋转或静态基底302，304（如图3A和3B所示）上实现，但是在高速自转/旋转动作的情况下。该实现可以以单细胞精度和高通量来帮助实时可视化细胞牵引、粘附力的空间分布。在这种情况下，基底302，304以最高可能的密度包括具有基准标记（例如荧光珠）的弹性层。该自转平台上的激光扫描成像被用于跟踪它们的移动并量化可以评估单细胞牵引力的位移场。

另一方面，可以通过在离心作用下由旋转或静态基底302，304上的剪切力引起的细胞变形的直接成像（例如，亮场和定量相位成像模态）来推断细胞刚度。

与遭受缓慢的扫描速率和机械后冲常规样本平台的光栅扫描或用于成像的激光束不同，本发明依赖于高速单向旋转，从而实现稳定的样本或>1000rpm的照射扫描。该高速旋转运动的这个特征要求超快速激光扫描技术，其可以实现超过10MHz的连续线扫描速率，以便确保无运动模糊的高分辨率成像。这就解释了为什么几乎没有一种基于离心平台的现有测定技术能够结合成像能力，即，因为当前相机技术的基本限制。

为了完全理解大多数（若并非全部的）细胞特征，通常结合多模成像平台。该测定平台能够递送超快速激光扫描定量相位成像（用于细胞/组织的无标记的生物物理表型；用于生物分子结合的无标记读出，用于亲和力测定，例如免疫测定）以及激光扫描荧光成像或检测（用于分子、细胞或组织的生物化学表型或读出）。利用时间拉伸成像或FACED成像使该成像能力成为可能。

为此，本发明的特征在于全光学超快速激光扫描成像（即，FACED成像或时间拉伸成像），其被认为是能够以超过10MHz的线扫描速率递送定量相位和荧光成像的唯一可用的成像技术。这种超快速、多模成像能力在统一的系统中实现，其允许实时、连续地同时进行来自生物标本的生物物理和生物化学测量。这是任何现有测定技术中通常不存在的特征。此外，利用连续旋转成像操作，可以通过扫描器装置或样本平台的连续单向轴向平移来实现细胞和组织标本的宽FOV三维（3D）成像。同样，在测定技术方面这种能力稀缺。这种单向自转和轴向平移方法解决了几乎在所有的电流计扫描镜或在经典的自动显微镜中的大块样本扫描阶段中出现的常见的后冲问题，并且从而提高了长期连续扫描操作的扫描精度。

本发明还与生物分子亲和力测定（例如ELISA/EIA）、粘附2D或3D细胞培养、生物化学特异性细胞捕获测定、WSI、TMA形式以及3D组织标本广泛地相容。基于高速旋转运动测定策略和超快速全光学激光扫描技术的集成，本发明不仅可以显著增强当前测定应用（例如，ELISA/EIA、使用细胞成像的表型药物筛选，超高通量WSI或TMA成像）中的测定通量和含量，本发明还开启了新类型的成像测定，其另外通过利用离心作用的现有测定是不可能的，例如，（在离心作用下）在单细胞精度下的细胞生物力学的超声大型FOV监测；（由离心力操纵的）高图像分辨率下的细胞/分子亲和力动力学的实时监测。

大区域自转/静态平台上的高密度测定和阵列矩阵可以容易地用现有的微细加工技术设计和制造，并且从而允许高通量的高度复用测定。

本发明还包括用于同一盘上的主动流体控制（例如，采样、混合和阀门调节）的已建立的离心微流体技术。此类测定集成在样本测定平台上允许更先进的测定功能性和完全自动化的工作流（从样本加载、处理和监测到分析）。因此，本发明的实施例代表了药物筛选开发、常规病理学评估、癌症筛选等中的高通量筛选的独特且通用的测定方法。

除了对细胞或生物分子特征的理解之外，本发明可以结合到组织切片/支架中。组织安装的过程被示出但不限于以下，并且由两个主要步骤组成：（1）在本发明中,将切片进行标准冷冻包埋并加载到基底上的过程。将新鲜的组织/支架样本在-20℃下冷冻，其准备用于将样本修整成与支持物匹配的尺寸。然后将修整好的组织块小心地放置在支持物的中心（设计用于低温恒温器），然后在室温下将OCT倒入支持物中。然后将含有内容物的支持物在-80℃下冷冻直至块完全硬化。在第二步之前，将块快速转移至低温恒温器进行切割。

为了将切片加载到本发明的基底上，制备透明/反射基底（例如DVD）并用70％的乙醇清洁。可以任选地处理DVD以显示亲水性。值得注意的是，有几种增强疏水聚碳酸酯表面亲水性能的方法，包括电晕（空气）等离子体放电、臭氧化、火焰等离子体放电和化学等离子体放电。虽然它们全都用于类似的目的，即清洁表面，但它们依赖于不同的机制，并因此具有不同的缺点。

电晕等离子体放电要求具有高电位差的真空条件以将电弧放电到样本上。其要求用于等离子体生成的特定室和仔细的手动检查。经处理的基底在短时间内（小于5分钟）显示出良好的亲水性。虽然所有其它方法也要求公众不容易获得的具体工具，但这些方法主要在工业中采用。

值得注意的是，火焰等离子体放电通常在老化时相对稳定，由于通过与火焰中的OH自由基的反应而被广泛氧化。本发明的实施例基于在强烈的蓝色火焰区域内组合和燃烧可燃气体和大气。本发明不要求复杂的仪器，而是用便携式燃烧器操作的加压液化丁烷气体生成此类强烈的蓝色火焰。由于DVD的相对低的熔点，蓝色火焰和DVD之间的接触一定不能是持续的。本发明采用重复的锯齿形扫描路径进行蓝焰接触。在DVD下方放置大区域、平坦的导热金属，以确保快速散热。扫描应进行5次。亲水性增强已显示持续数周。

在用70％的乙醇处理基底DVD之后，将切割的组织切片（至多N个连续切片）转移到DVD上。当DVD充满样本时，将其带到室温，并允许切片粘附。然后用RO水或PBS清洁DVD以清除OCT。也可以在DVD上执行可选的染色或其它光学改进。

虽然已经参考本发明的优选实施例具体示出和描述了本发明；本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

Claims (26)

1.一种用于执行复用旋转成像生物测定的装置，包括：

激光器，生成用于全光学超快速激光扫描成像的激光脉冲，其中，所述全光学超快速激光扫描成像包括时间拉伸成像以生成一维频谱编码的线扫描光束，或包括自由空间角啁啾增强延迟FACED成像以生成线扫描光束，

其中所述时间拉伸成像包括：色散光纤，其中所述激光脉冲首先被时间拉伸，以形成波长扫描波形；将所述波长扫描波形引导到成像系统的分束器；形成所述成像系统的全息衍射光栅以及中继透镜和物镜，所述成像系统将所述波长扫描波形转换成一维频谱编码的线扫描光束，以及其中所述FACED成像包括：具有高反射率的平面镜对，其中所述激光脉冲被转换成时空编码子束的阵列；分束器，其将子束引导到包括中继透镜和物镜的成像系统，所述成像系统将子束变换成一维线扫描光束；

改进的自转盘状基底，其上投射有所述线扫描光束，所述基底具有位于其上的至少一个测定孔，所述测定孔包含标本样本；

后物镜，用于从所述盘状基底接收所述线扫描光束，所述线扫描光束已经用来自所述样本的信息编码，以形成图像编码光束；

图像耦合模块，用于将所述图像编码光束引导至具有重组光束轮廓的分束器上；

高速光电检测器，从所述分束器接收返回的图像编码光束；以及

高速实时数据记录仪，记录所述光电检测器的输出。

2.一种用于执行复用旋转成像生物测定的装置，包括：

激光器，生成用于全光学超快速激光扫描成像的激光脉冲，所述全光学超快速激光扫描成像包括自由空间角啁啾增强延迟FACED成像，以生成线扫描光束，其中所述FACED成像包括：具有高反射率的平面镜对，其中所述激光脉冲被转换成时空编码子束的阵列；以及分束器，其将子束引导到包括中继透镜和物镜的成像系统，所述成像系统将子束变换成一维线扫描光束；

改进的静态盘状基底，自转的所述线扫描光束投射在其上，所述基底具有位于其上的至少一个测定孔，所述测定孔包含标本样本；

后物镜，用于从所述盘状基底接收所述光束，所述光束已经用来自所述样本的信息编码，以形成图像编码光束；

图像耦合模块，用于将所述图像编码光束引导至具有重组光束轮廓的分束器上；

高速光电检测器，从所述分束器接收返回所述图像编码光束；以及

高速实时数据记录仪，记录所述光电检测器的输出。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述盘状基底由从两个独立的盘状基片获得的两个透明聚碳酸酯层组成，所述两个独立的盘状基片用UV固化的粘合剂结合在一起。

4.根据权利要求3所述的装置，其中所述盘状基底还包括确定所述聚碳酸酯层之间的间隔的高度以形成测定室的间隔件，所述间隔件被基本上对准以稳定快速自转运动。

5.根据权利要求4所述的装置，其中所述测定室具有由所述间隔件限定的3-1000μm的高度。

6.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述盘状基底具有至少四个测定孔。

7.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述图像耦合模块具有包括时间拉伸成像或FACED成像的成像配置，所述成像配置包括后物镜的入射光瞳处的反射镜，所述反射镜反射所述图像编码光束使得它们沿着相同的路径通过所述盘状基底和所述成像系统返回，以便形成双通道配置。

8.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述图像耦合模块具有包括FACED成像的成像配置，所述成像配置包括在所述后物镜之后的透镜系统，所述透镜系统将编码光束引导到检测光路上，以形成单通配置。

9.根据权利要求1所述的装置，其中所述改进的自转盘状基底包括与粘附细胞培养相容的测定孔。

10.根据权利要求1所述的装置，其中所述改进的自转盘状基底包括与生物化学特异性细胞捕获相容的测定孔。

11.根据权利要求1所述的装置，其中所述改进的自转盘状基底包括与包括2D和3D组织结构的组织样本相容的测定孔。

12.根据权利要求1所述的装置，其中，可以通过全光学超快速激光扫描成像来旋转和成像所述改进的自转盘状基底以产生

任意形状的视场；

螺旋扫描视场；或

环形扫描视场；或

具有可重新配置区域的分段视场阵列。

13.根据权利要求11所述的装置，其中，用于安装3D组织标本的改进的自转盘状基底包括：

作为盘状基底的一个聚碳酸酯层，其可以是DVD；以及

具有组织切片的玻璃基板，其与安装介质结合在一起。

14.根据权利要求11所述的装置，其中，用于安装2D或切片的3D组织结构的改进的自转盘状基底包括：

两个透明聚碳酸酯层作为两个独立的盘状基片，所述两个独立的盘状基片用UV固化的粘合剂结合在一起；

确定所述聚碳酸酯层之间的间隔的高度以形成测定室的间隔件，所述间隔件基本上对准以稳定快速自转运动；

所述室包括用安装介质结合在一起的组织切片。

15.根据权利要求13或14所述的装置，其中所述安装介质可以是氟凝胶。

16.根据权利要求13所述的装置，其中所述3D组织结构能够与自转的2D视场一起自转，同时沿着光束传播的方向进行顺序的轴向扫描，然后能够以3D形式堆叠并重构图像，以形成体积组织块结构。

17.根据权利要求14所述的装置，其中所述3D组织结构能够仅用自转2D视场来旋转，然后能够以3D形式将图像拼接，形成体积组织块结构。

18.根据权利要求12所述的装置，其中能够以由自转速率支配的至少10Hz的2D帧速率来观察改进的自转盘状基底的成像视场，其大规模地促进了实时视频速率动态监测。

19.根据权利要求1或2所述的装置，其中，通过以下步骤制备基底用于捕获特异性对象：

提供用70％至100％的乙醇清洁的透明盘状基底；

用链霉亲和素涂覆所述盘；

在链霉亲和素的顶部施加生物素化二级抗体涂层；

施加一级抗体的涂层；

将要测定的所述对象放置在所述盘上的孔中；

培育所述盘一段时间；以及

冲洗所述盘，以减少非特异性结合。

20.根据权利要求1或2所述的装置，其中，通过以下步骤制备所述基底以用于细胞培养：

提供用70％至100％的乙醇清洁的透明盘状基底；

用乙醇和紫外光对所述盘进行消毒；

将培养介质和细胞的混合物沉积到所述基底上；以及

将所述基底保持在培育箱中，直到所需细胞群体存在于基底上。

21.根据权利要求2所述的装置，其中，自转照射光束投射在改进的静态盘状基底上，自转照射光束发生器包括旋转载体以承载来自光纤的照射，以避免前后扫描或曲折路径扫描的传统策略引起的机械不稳定性和后冲的问题，所述旋转/自转照射通过以下步骤实现：

将线扫描光束引导到安装在旋转载体上的集成小型化光学组件上，所述光学组件包括渐变折射率GRIN透镜，小型中继或迷你光栅透镜，和物镜；

所述组件安装在外壳中；

所述照射由光纤提供，所述光纤通过可旋转接头附接到所述旋转载体的外边缘；

所述接头在载体旋转时保持纤维不发生扭曲。

22.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述高速实时数据记录仪是示波器或高通量数据采集平台。

23.根据权利要求22所述的装置，其中所述高通量数据采集平台是图形处理单元（GPU）以及现场可编程门控阵列（FPGA）。

24.根据权利要求1或2所述的装置，其中从生物测定图像检索的内源或内在参数可以是以下至少之一：生物标本的光学、物理和机械性质。

25.根据权利要求24所述的装置，其中所述生物标本的光学性质可以是光散射率或折射率中的至少一种，所述生物标本的物理性质可以是尺寸或形态中的至少一种，生物标本的机械性质可以是质量密度、刚度或变形能力、牵引力和粘附力中的至少一种。

26.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述标本包括标准分子生物标志物。