CN109844113B - 序列和长度确定的dna单链分子的可扩展性的生物技术生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于重组生产DNA单链分子的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供假基因核酸；(2)将所述假基因核酸整合到载体中，用所述载体转化细菌细胞并在细菌培养条件下从所述载体生产前体ssDNA；(3)从所述细菌培养物分离所述前体ssDNA；(4)在自切割DNA序列变得有活性的反应条件下消化所述前体ssDNA；以及(5)分离并获得所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸。本发明的方法适用于DNA单链分子的大规模生产。本发明还涉及所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸的用途，特别是在DNA纳米技术中或作为研究工具。

Description

序列和长度确定的DNA单链分子的可扩展性的生物技术生产
技术领域
本发明涉及一种用于重组生产DNA单链分子的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供假基因核酸；(2)将所述假基因核酸整合到载体中，用所述载体转化细菌细胞并在细菌培养条件下从所述载体生产前体ssDNA；(3)从所述细菌培养物分离所述前体ssDNA；(4)在自切割DNA序列变得有活性的反应条件下消化所述前体ssDNA；以及(5)分离并获得所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸。本发明的方法适用于DNA单链分子的大规模生产。本发明还涉及所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸的用途，特别是在DNA纳米技术中或作为研究工具。
背景技术
在生命科学和医学中，各种不同的应用都需要DNA寡核苷酸。例如，为了分别进行聚合酶链反应(PCR)或实时PCR(RT-PCR)或定量PCR(Q-PCR)，需要寡核苷酸作为引物。此外，为了合成新的基因，需要寡核苷酸作为起始材料。对DNA寡核苷酸的越来越多的需求产生了主要专注于以最小的量快速生产具有任何所需序列的DNA寡核苷酸的产业。通常，DNA寡核苷酸在循环化学合成过程中在固相上逐个碱基生产。这个过程可以在微珠上或在喷墨方法中在芯片表面上进行。由于碱基添加反应不以100％的效率进行，因此不可能生产任何长度的DNA单链。得率随着靶DNA寡核苷酸的所需长度以指数方式降低。通常，通过合理的努力可以生产长达100个碱基的分子。一些公司提供长度高达200个碱基的DNA寡核苷酸的(高成本)合成。此外，DNA寡核苷酸的合成通常限于毫克规模，这对于迄今为止的大多数应用来说是足够的。
目前，开发了需要大量(＞克级规模)和/或更大长度(＞200个碱基的长度)的具有用户定义的序列的单链DNA寡核苷酸的新技术。现有的用于合成DNA寡核苷酸的方法不能满足这种需求。特别是在DNA纳米技术中，需要大量具有用户定义的序列的单链DNA寡核苷酸作为“构建材料”。DNA纳米技术对于新的药物递送介质和具有潜在医学或甚至物理/化学重要性的其他纳米粒子的产生，具有特别的潜力(Jones等，2015)。然而，所需的起始材料(即DNA寡核苷酸)在目前不能以大规模方式获得。此外，有催化活性的DNA序列(DNA酶)和DNA适体在用作诊断剂、用于疗法和传感方面获得了越来越多的兴趣(Krug等，2015；Keefe等，2010；Ng等，2006；Torabi等，2015)。对于这些应用来说，DNA寡核苷酸的大规模生产具有极大意义。
发明内容
根据本发明，这一目的通过一种用于重组生产DNA单链分子的方法得以解决，
所述方法包括以下步骤：
(1)提供假基因核酸，
其中所述假基因核酸是包含至少一个靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列和位于每个靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列侧翼的两个自切割DNA序列的核酸；
(2)将所述假基因核酸整合到载体中，用所述载体转化细菌细胞并在细菌培养条件下从所述载体生产前体ssDNA，
其中所述前体ssDNA包含所述假基因核酸；
(3)从所述细菌培养物分离所述前体ssDNA；
(4)在所述自切割DNA序列变得有活性的反应条件下消化所述前体ssDNA；
以及
(5)分离所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸并获得所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸。
根据本发明，这一目的通过将在本发明的方法中获得的靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸用于下述应用得以解决：
-用于DNA纳米技术中、
-用作研究工具、
-用作诊断的探针、
-用于基因合成中、
-用于基因疗法中、
-用于分子传感方面/用作分子传感器。
本发明优选实施方式的描述
在下文中更详细地描述本发明之前，应该理解，本发明不限于本文中描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应该理解，本文中使用的术语仅仅是出于描述特定实施方式的目的，并且不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅受随附的权利要求书限制。除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的意义。出于本发明的目的，本文中引用的所有参考文献整体提供参考并入本文。
浓度、量和其他数值数据在本文中可能以范围的格式表述或呈现。应该理解，这种范围格式仅仅出于方便和简洁而使用，因此应该被灵活地解释为不仅包括作为所述范围的限度而明确列举的数值，而且包括涵盖在该范围之内的所有个体数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确列举。例如，“50至3,000个核苷酸”的数值范围荧光被解释为不仅包括明确列举的50至3,000的值，而且包括所指示的范围之内的各个值和子范围。因此，在该数值范围内包括各个值例如50、51、52……2,998、2,999、3,000和子范围例如50至150、100至250、200至500、500至2,500等。同样的原则适用于叙述了仅仅一个数值的范围，例如“至少一个”。此外，不论所述范围的宽度或所描述的特征如何，这种解释都将适用。
生产ssDNA的方法
本发明提供了一种用于重组生产DNA单链分子、特别是单链DNA寡核苷酸和多肽的方法。
所述方法包括以下步骤：
(1)提供假基因核酸，
其中所述假基因核酸是包含至少一个靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列和位于每个靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列侧翼的两个自切割DNA序列的核酸；
(2)将所述假基因核酸整合到载体中，用所述载体转化细菌细胞并在细菌培养条件下从所述载体生产前体ssDNA，
其中所述前体ssDNA包含所述假基因核酸；
(3)从所述细菌培养物分离所述前体ssDNA；
(4)在所述自切割DNA序列变得有活性的反应条件下消化所述前体ssDNA；
以及
(5)分离并获得所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸。
(1)假基因核酸的设计和提供
所述“假基因核酸”是包含至少一个靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列和位于每个靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列侧翼的两个自切割DNA序列的核酸。
优选地，所述假基因核酸包含一个以上靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列，例如2、3、4或超过约50个靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列。
所述靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列在它们的序列以及它们的长度上可以是一致的或不同的。
优选地，靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列具有约20个核苷酸至约几千个核苷酸范围内的长度，覆盖并超出了可以获得的化学合成的寡核苷酸的范围。
优选地，在所述假基因核酸中在每个所述靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列侧翼的自切割DNA序列是自切割脱氧核酶或DNA酶，
例如
Zn2+依赖性DNA酶
例如I-R3和在Gu等，2013中描述的其他变体，以及源自于在Gu等，2013中描述的变体的变体。
脱氧核酶(也被称为DNA酶)是形成能够催化化学反应的结构的DNA分子(Breaker，1997)。存在催化自加工反应的DNA(Carmi等，1996)。可以利用这些脱氧核酶来产生当暴露于特定反应条件时在其固有催化活性的基础上而被修饰的DNA构建体。例如，存在使用各种不同的定向进化策略产生的利用氧化(Carmi等，1996)、脱嘌呤作用(Sheppard等，2000)或水解(参见例如Chandra等，2009)机制的工程化改造的自切割脱氧核酶。
最近，描述了两类以高的速度和序列特异性水解DNA的工程化改造的自切割脱氧核酶(Gu等，2013)。一种这样的脱氧核酶名为I-R3(参见图3)，带有小的催化核心，其由17个核苷酸构成，侧翼带有1或2个双链亚结构。这类脱氧核酶的代表当在接近中性pH和毫摩尔浓度的Zn2+存在下温育时，对DNA水解表现出～1min-1的表观速率常数(kobs)(半衰期为～40秒)。这种脱氧核酶切割ApA连键的3′氧与磷中心之间的磷酸酯键，产生具有5′磷酸酯基团的3′切割片段。
P1-TAGTTGAGCTGT-P2-P3-P2’-ACGTTGAAG-P1’
或
P2’-ACGTTGAAG-P1-P3-P1’-TAGTTGAGCTGT-P2
其中TAGTTGAGCTGT是SEQ ID NO.1，并且ACGTTGAAG是SEQ ID NO.2；
并且其中P3是任意序列的间隔区，P1和P1’是形成DNA双螺旋的两条互补序列。对于P2和P2’来说同样如此。
P1-[SEQ ID NO.1]-P2-P3-P2’-[SEQ ID NO.2]-P1’
P2’-[SEQ ID NO.2]-P1-P3-P1’-[SEQ ID NO.1]-P2
在本发明中使用的自切割DNA序列(即自切割脱氧核酶或DNA酶)只在限定的反应条件下变得有活性(并催化自切割)。
例如，Zn2+依赖性DNA酶诸如I-R3需要添加Zn离子。
所述假基因核酸可以通过常规/现有的基因合成方法来合成。
例如，它可以订购并由商业化供应商合成。
(2)在细菌培养物中生产前体ssDNA
在步骤(2)中，将所述假基因核酸整合到载体中。将所述载体通过转化引入到细菌细胞中，并在细菌培养条件下从所述载体生产前体ssDNA。
在某些实施方式中，所述载体是至少一个载体，例如2、3、4或更多个载体。
所述“前体单链DNA”或“前体ssDNA”包含单链形式的假基因核酸和载体骨架。
优选地，所述细菌选自大肠杆菌，特别是K12衍生的大肠杆菌安全菌株，例如DH5alpha，、XL-1blue或JM109。
在优选实施方式中，所述步骤(2)中的载体是噬菌粒。
在某些实施方式中，所述噬菌粒是至少一个噬菌粒，例如2、3、4或更多个噬菌粒。
所述(至少一个)噬菌粒包含质粒骨架并且可以任选地包含其他组分，
例如
-包装序列，
-确保所述噬菌粒在细胞分裂期间繁殖的组分，
-选择性标记，
通常为抗生素抗性基因。
此外，在所述实施方式中，使用辅助质粒或辅助噬菌体，其包含其他组分，例如
-编码噬菌体例如M13噬菌体的蛋白质的基因，
-确保所述辅助质粒在细胞分裂期间繁殖的组分，
-选择性标记，
通常为抗生素抗性基因。
在这个实施方式中，将所述(至少一个)噬菌粒和所述辅助质粒或辅助噬菌体两者优选地通过同时转化引入到所述细菌细胞中。
在这个实施方式中，在所述载体是噬菌粒(并且其也使用辅助质粒)的情况下，所述噬菌粒通过滚环扩增(RCA)在所述细菌细胞内部扩增。这同样适用于利用超过一个噬菌粒的实施方式。
所述滚环扩增(RCA)产生所述噬菌粒的单链形式“噬菌粒ssDNA”。在这个实施方式中，所述噬菌粒ssDNA是“前体ssDNA”。
所述噬菌粒ssDNA优选被包装在细胞表面上的噬菌体样颗粒中，所述颗粒优选地从所述细胞分泌到周围培养基中。
所述噬菌体样颗粒含有所述噬菌粒ssDNA代替正常的噬菌体基因组。
例如，在所述辅助质粒含有编码M13噬菌体的蛋白质的基因的实施方式中，形成M13噬菌体样颗粒，其不需细胞裂解从所述宿主细胞分泌。
(3)从所述细菌培养物获得所述前体ssDNA
从所述细菌培养物分离所述前体ssDNA。
所述分离或纯化可以使用本领域中已知的常规/现有的技术来进行，
例如离心、沉淀、基于溶剂的提取、层析方法或其组合。
在使用(至少一个)噬菌粒和辅助质粒的一个实施方式中，所述分离或纯化包括
-从所述细胞培养物、优选地从所述培养上清液提取所述噬菌体样颗粒，
例如通过沉积所述细胞并从所述上清液移除/提取所述噬菌体样颗粒，例如通过沉淀(例如使用PEG)
-从所述噬菌体样颗粒提取所述噬菌粒ssDNA，
例如通过蛋白质衣壳的化学裂解和ssDNA的乙醇沉淀。
例如，ssDNA的下游加工可以包括以下步骤：宿主细胞和细胞外生产的噬菌体样颗粒的分离，PEG介导的噬菌体沉淀，噬菌体化学裂解和使用乙醇的ssDNA沉淀。
参见例如Kick等，2015。
(4)所述前体ssDNA的自催化消化
然后将所述分离的前体ssDNA以自催化方式消化，即所述自切割DNA序列将切割所述前体ssDNA。
所述消化在所述自切割DNA序列变得有活性的反应条件下进行。
在利用Zn2+依赖性DNA酶例如I-R3的一个实施方式中，所述步骤(4)的消化通过添加Zn2+离子来引发，即所述自切割DNA序列变得有活性的反应条件需要Zn2+离子的存在。
(5)获得所述靶单链DNA分子
接下来，将分离所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸，特别是与作为步骤(4)的副产物的所述自切割DNA序列分离开。
所述分离或纯化可以使用本领域中已知的常规/现有的技术来进行，
例如
沉淀，例如使用乙醇和乙酸钾，或使用聚乙二醇，
层析法，
或其组合。
最后，获得所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸。
(6)其他步骤
在一个实施方式中，本发明的方法包括下述其他步骤：
(6)所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸的进一步加工。
例如，所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸可以被自组装和/或折叠成DNA折纸结构、基于拼贴的DNA纳米结构或结晶DNA纳米材料。或者，它们可用作适体或DNA酶以结合、检测或加工其他分子。
-ssDNA分子的大规模生产
在一个实施方式中，所述细菌培养在生物反应器例如搅拌釜生物反应器中进行。
这种实施方式允许以克级规模生产靶ssDNA分子。
因此，单链DNA分子的大规模生产是可能的。
获得的ssDNA分子的用途
本发明提供了在本发明的方法中获得的靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸在DNA纳米技术中的用途。
例如，所述靶单链DNA寡核苷酸和多核苷酸可以被设计成能够自组装成DNA折纸结构，即成为支架链和几个主产物链。
DNA折纸结构可以是：
DNA纳米杆，
例如在本文的实施例1中所描述的；
DNA纳米孔，
例如在欧洲专利申请号2 695 949中所描述的；
DNA螺旋管，
例如在本文的实施例3中所描述的；
DNA指向物，
例如在本文的实施例3中或Bai等，2012中所描述的；
有治疗活性的DNA纳米结构或药物递送介质，
定位装置，
纳米传感器。
本发明提供了在本发明的方法中获得的靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸作为研究工具的用途。
本发明提供了在本发明的方法中获得的靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸作为诊断的探针的用途。
本发明提供了在本发明的方法中获得的靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸在基因疗法中的用途。
本发明提供了在本发明的方法中获得的靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸在分子传感中的/作为分子传感器的用途。
优选实施方式的进一步描述
我们提出了一种在细菌中重组生产单链DNA寡核苷酸的生物技术方法。使用所述方法，可以以任何可扩展的量生产长度高达几千个碱基的单链DNA分子。由于这种方法，基于DNA的纳米结构的大规模生产在实践上变得可能。
如图1的流程图中所示，所述方法包括7个步骤。
在步骤(1)中，设计并构建假基因，其包含采取特殊调制形式的待生产的DNA核酸序列。这种在下文中更详细描述的形式对于本发明的方法来说是必需的。
在步骤(2)中，通过当前/现有的基因合成方法产生所述假基因。
接下来，将所述假基因整合到载体或质粒中，并作为“串接的前体ssDNA”以规模可扩展的方式在液体细菌(大肠杆菌)培养物中生产(步骤(3)).
然后，纯化并分离所述串接的前体ssDNA(步骤(4)).
在步骤(5)中，将所述串接的前体ssDNA以自催化的方式消化，其中所述消化是本发明的方法的重要特点。
使用常规方法分离从所述消化得到的靶单链DNA寡核苷酸(步骤(6))。
然后可以将所述靶单链DNA寡核苷酸进一步加工，例如以较大规模产生DNA折纸结构(步骤(7)：下游应用)。
-串接的前体ssDNA的生物技术生产
通过同时转化将两种DNA质粒引入到大肠杆菌细胞中(图2).所述“辅助质粒”含有M13噬菌体蛋白的基因以及确保所述辅助质粒在大肠杆菌细胞分裂期间在子细胞中繁殖的其他信息(质粒骨架)。所述“噬菌粒”(＝噬菌体质粒)含有采取特殊调制形式的待生产的DNA寡核苷酸序列(“串接的前体ssDNA”)和其他信息，所述其他信息除了其他功能之外，还确保所述噬菌粒在细胞分裂期间的繁殖。
首先，所述两种质粒中的每一种需要通过克隆产生。为了产生具有所述串接的前体ssDNA的噬菌粒，需要预先进行常规的基因合成。
在所述细胞内，所述噬菌粒被扩增(通过滚环扩增)。同时产生所述M13噬菌体蛋白。
所述单链噬菌粒含有特殊的包装序列，它通过所述序列被所述噬菌体蛋白识别并包装到噬菌体粒子。结果，所述细胞分泌噬菌体样颗粒，其代替正常的噬菌体基因组，含有所述噬菌粒的单链形式以及因此所述待生产的DNA寡核苷酸序列。
所述噬菌体粒子可以在将所述细胞沉积后从上清液分离。所述噬菌体粒子中包含的DNA可以被纯化。
上面描述的生物技术过程是规模可缩放的，在细菌培养物中蛋白质的重组生产也是如此(Kick等，2015)。
-串接的前体ssDNA的进一步加工
图3示出了采取所述特别调制的形式的假基因，即“串接的前体ssDNA”。
所述待生产的DNA寡核苷酸序列在两端带有有催化活性的DNA序列(“I-R3”)，参见Gu等，(2013)。这些DNA酶具有自切割效应，即所述DNA酶在添加二价锌离子后并且在适合的反应条件下催化骨架水解(在图3的插入图中黑色尖头所示的位置处)。
因此，所述串接的前体ssDNA可以含有许多不同的DNA寡核苷酸序列。
在纯化所述前体ssDNA后，可以通过添加锌来启动所述催化(“切割”)。
由于所述切割，所述前体ssDNA被分离开或分成所需的单链DNA寡核苷酸和作为副产物的催化性DNA酶。所述DNA酶可以例如通过层析法与所述靶DNA寡核苷酸分离开。
-本发明的方法的优点
在本领域中以描述了使用辅助质粒(Marchi等，2014)或酶(Schmidt等，2015)生物技术生产单链噬菌粒DNA的方法。此外，本领域中已描述了包括在限制性内切核酸酶的帮助下在用户定义的序列处消化长的环状ssDNA的方法(Ducani等，2013)。
在Ducani等人(2013)所描述的方法中，利用了基于蛋白质的限制性核酸酶，并因此需要它们作为另外的试剂。这些酶需要购买或者在分开的生物技术过程中生产。此外，在Ducani等人所描述的方法中，所有主产物寡核苷酸使用制备型凝胶电泳来纯化，这是繁琐并且不可规模放大的。在本文描述的方法中，所述消化不需要其他成本密集型或劳动密集型试剂，因为产生所述靶DNA寡核苷酸序列所需的所有组分都已包含在辅助质粒和带有假基因的噬菌粒的组合系统中。
本发明的一个必不可少的方面是使用通过定向进化产生的有催化活性的DNA序列，即DNA酶(Gu等，2013)。所述有催化活性的DNA序列被包含在所述串接的前体ssDNA中，并与所述靶DNA寡核苷酸序列一起在所述生物技术过程中扩增。由Gu等人提出的方法生产具有不同长度但不具有任意序列的寡核苷酸。它们的前体DNA含有同一个冗余序列的几个拷贝。本文描述的方法能够生产DNA折纸的生产所需的具有任意序列的寡核苷酸。此外，尽管Gu等人使用了相同的末端序列以及因此相同的DNA酶，但本发明的方法使用不同的DNA酶序列来生产不同的靶寡核苷酸序列。
下面的实施例和附图说明了本发明但不限制本发明。
附图简述
图1：示出了串接的前体单链DNA的生物技术生产的流程图。
图2：辅助噬菌粒单链DNA的辅助质粒协助的生产的示意说明。
图3：含有5个靶序列(粗线)和用于提取所述靶分子的(5+1)x2个侧翼催化性DNA酶序列(发夹结构)的噬菌粒的示意说明。
图4：使用生物技术生产的单链起始材料生产DNA折纸纳米杆。
A，噬菌粒(左侧)和DNA纳米杆的内部链拓扑结构的示意图。
B，琼脂糖凝胶的视图，在其上将使用通过化学固相合成生产的主产物寡核苷酸的10-螺旋束的自组装产物(左侧)与使用通过本发明的方法生产的主产物寡核苷酸的样品(右侧)进行比较。两种样品显示出可比的迁移性质，这暗示了可比的组装品质。
C，其主产物寡核苷酸通过本发明的方法生产的纳米杆的透射电子显微镜照片。
图5：通过包含的DNA酶序列将串接的前体ssDNA自催化消化成所需靶DNA寡核苷酸的图解。
示出了琼脂糖凝胶上的视图，在其上将不同温浴时间下所述串接的前体ssDNA的消化反应的产物进行电泳分离。
图6：DNA酶序列的优化。
A，左侧：DNA酶(I-R3型)的示意图。必需碱基对(在我们的实验中所鉴定的)被显示为字母，可交换的碱基对用线指示。三角形指示切割位置。右侧：相差1个碱基对的DNA酶的两种变体的反应动力学的凝胶电泳分析。较慢的迁移条带对应于未切割的寡核苷酸，较快的迁移条带对应于反应产物。τ被定义为产物条带的强度超过未切割的DNA酶的强度的第一个时间点。上方凝胶示出了在Gu等，2013中所描述的原始序列的切割，而下方凝胶示出了其中G-C碱基对被A-T碱基对代替的变体的切割。这种交换造成了DNA酶的催化活性的显著降低，尽管该碱基对在Gu等人的原始文献中被分类为可交换。
B，左侧：含有通过DNA酶分离开的用于纳米杆的主产物的两种噬菌粒的示意图。右侧：所述两种噬菌粒的消化动力学的凝胶电泳分析。下方的变体在来自于Gu等人的原始文献的必需碱基分类的基础上设计，而上方的变体在我们自己的关于必需碱基的发现的基础上设计。尽管上方的优化变体显示出快速且完全的切割(在40分钟后基本上所有的DNA都在对应于所需产物的条带中)，但下方的变体即使在温浴24小时后仍显示出不完全的消化。
图7：从使用本发明的基于DNA酶的方法生产的DNA寡核苷酸组装的纳米结构。
A，左上：从3200个碱基长的支架和都包含在一个噬菌粒中的31个主产物寡核苷酸组装的48-螺旋管的示意图。左下：琼脂糖凝胶的图像，在其中将未消化的噬菌粒(左侧)、消化的噬菌粒(中央)和折叠的48-螺旋管(右侧)进行电泳。右侧：48-螺旋管的负染色透射电子显微照片(下方)和类型平均值(上方)。
B，左上：从7249个碱基长的M13支架和161个主产物寡核苷酸组装的指向物的示意图。左下：琼脂糖凝胶的图像，在其中将支架(左侧)和使用化学合成(中央)或生物技术生产(右侧)的主产物组装的结构进行电泳。右侧：所述指向物的负染色透射电子显微照片和类型平均值(插入图)。
实施例
实施例1基于DNA的纳米杆的产生
作为原型，从专门通过本发明的方法生产的DNA材料产生了基于DNA的纳米杆。所述基于DNA的纳米杆使用DNA折纸设计方法设计和开发(参见Rothemund，2006；也参见美国专利申请2007/117109 A1和2012/251583 A1；美国专利号7,842,793 B2和8,501,923 B2)，并由在蜂窝晶格中平行排列并通过链连接交联的10个DNA双螺旋构成(参见图4A)。对于所述纳米杆来说，需要2500个碱基长的单链DNA骨架分子(“支架链”)以及21个长度各为约100个碱基的DNA寡核苷酸(“主产物链”)。所有需要的构建元件都源自于为此特别构建的噬菌粒。
1.1材料和方法
-序列：
DNA酶：
P1-[SEQ ID NO.1]-P2-P3-P2’-[SEQ ID NO.2]-P1’
P2’-[SEQ ID NO.2]-P1-P3-P1’-[SEQ ID NO.1]-P2
其中SEQ ID NO.1＝TAGTTGAGCTGT，SEQ ID NO.2＝ACGTTGAAG；
并且其中P3是任意序列的间隔区，其中P1和P1’是形成DNA双螺旋的两个互补序列。对于P2和P2’来说同样如此。
21个寡核苷酸，各自具有约100个碱基的长度：
作为支架的噬菌粒骨架：SEQ ID NO.24
全长的噬菌粒ssDNA序列(＝前体ssDNA)：SEQ ID NO.25：
2.大肠杆菌培养条件
在本实施例中，噬菌粒单链DNA在大肠杆菌液体培养物中生产并从其中纯化。为此目的，将化学感受态DH5alpha细胞用所述噬菌粒和辅助质粒共转化。将由此获得的菌株在含有50mg/L卡那霉素和100mg/L羧苄青霉素的2xYT培养基中生长。在37℃温浴过夜后，将所述培养物以4000rcf离心30分钟。向上清液添加固体PEG 8000和NaCl至终浓度各为3％(m/v)。然后通过以4000rcf离心30分钟来沉淀噬菌体样颗粒。如Kick等，2015中所述从这些粒子提取ssDNA。
3.靶结构的消化和组装
然后将所述噬菌粒单链DNA在反应缓冲液(50mM Hepes pH7，100mM NaCl，2mMZnCl2)中，在37℃温浴3小时。在温浴后，所述DNA被完全消化成所需的区段，参见图5。随后，将所述DNA用乙醇和乙酸钾沉淀，并在折纸折叠缓冲液(10mM Tris，5mM NaCl，1mM EDTA，20mM MgCl2)中溶解。将所述DNA溶液加热15分钟至65℃，然后从60℃缓慢冷却至40℃(每1℃3小时)。凝胶电泳分析(参见图4B)和透射电子显微术(参见图4C)确认了所述靶结构的成功组装。
实施例2 DNA酶序列的优化
为了构建我们的噬菌粒，我们没有简单地以与插入限制性酶结合位点相同的方式将恒定的DNA酶序列放置在靶寡核苷酸之间。所述DNA酶的序列取决于待生产的寡核苷酸的末端序列。尽管Gu等人(Biotechniques 2013)简单地使用了相同的末端序列以及因此相同的DNA酶，但我们的方法使用不同的DNA酶序列来生产不同的靶寡核苷酸序列。
为了鉴定所述DNA酶序列中的必需碱基，我们筛选了约40个作为寡核苷酸的各个DNA酶的不同变体(两个实例参见图6A)和5个版本的全长噬菌粒(两个实例参见图6B)。我们发现了在DNA酶的原始文献(Gu等，JACS 2013)中没有被分类为必需的一些碱基。这允许我们构建在可接受的时间内完全切割成所需产物的噬菌粒(参见图6B)。
DNA酶寡核苷酸(如图6A中所示)：
G-C(上方)：SEQ ID NO.26
A-T(下方)：SEQ ID NO.27
噬菌粒(如图6B中所示)：
优化的版本(上方)：SEQ ID NO.28
未优化的版本(下方)：SEQ ID NO.29
实施例3从使用本发明的基于DNA酶的方法生产的DNA寡核苷酸组装的其他纳米结构
除了纳米杆之外，我们设计了从3200个碱基长的支架和31种主产物寡核苷酸组装的48-螺旋管(参见图7A)。与纳米杆相同，用于该48-螺旋管的所有主产物编码在一个噬菌粒上，并且所述噬菌粒的骨架充当支架。与纳米杆相同，由于固有的精确的1∶1化学计量比，该物体高效地组装成所需形状，没有使用超过支架的量的主产物。
为了证实我们的方法对现有的全尺寸DNA折纸物体的组装的适用性，我们生产了编码以前在冷冻电子显微术研究(Bai等，2012)中使用的指向物的组装所需的所有161种主产物寡核苷酸的噬菌粒(参见图7B)。与纳米杆和48-螺旋束相反，所述用于指向物的主产物分布在4个单独噬菌粒上，并使用单独的支架(M13mp18，7249个碱基长，与在Bai等人的原始研究中使用的序列相同)。为了补偿相对浓度的不确定性，我们使用了与支架相比略微过量的主产物(1.25比1)。作为比较，使用化学合成的主产物的组装需要大于2.5比1的过量。
噬菌粒序列
48螺旋管(图7A)：SEQ ID NO.30_
指向物部分1(图7B)：SEQ ID NO.31
指向物部分2(图7B)：SEQ ID NO.32
指向物部分3(图7B)：SEQ ID NO.33
指向物部分4(图7B)：SEQ ID NO.34
在上面的描述、权利要求书和/或附图中公开的特点可以单独地和以任何组合的方式作为材料，用于以多种多样的形式实现本发明。
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Claims (24)

1.一种用于重组大规模生产DNA单链分子的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提供假基因核酸，
其中所述假基因核酸是包含(i)至少一个靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列和(ii)位于每个靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列侧翼的自切割DNA序列的两个切割组的核酸，其中每个切割组包含两个自切割DNA序列，
其中所述假基因核酸包含每一个靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列的两个切割组，并且在每个切割组中两个自切割DNA序列以反向顺序相互连接以形成一个切割组；
(2)将所述假基因核酸整合到载体中，用所述载体转化细菌细胞并在细菌培养条件下从所述载体生产前体ssDNA，
其中所述前体ssDNA包含所述假基因核酸；
(3)从所述细菌培养物分离所述前体ssDNA；
(4)在所述自切割DNA序列变得有活性的反应条件下消化所述前体ssDNA，从而切断所述两个切割组；
以及
(5)分离所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸并获得所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸，
其中所述大规模生产允许以克级规模生产靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述自切割DNA序列是自切割脱氧核酶。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述自切割DNA序列是Zn2+依赖性DNA酶。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述自切割DNA序列是I-R3。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述假基因核酸中的靶DNA寡核苷酸序列是2、3、4或超过50个。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中靶DNA寡核苷酸或多核苷酸序列具有20个核苷酸至几千个核苷酸范围内的长度。
7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细菌选自大肠杆菌。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述细菌选自K12衍生的大肠杆菌安全菌株。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述细菌是DH5alpha、XL-1blue或JM109。
10.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述步骤(2)中的载体是至少一个噬菌粒，其任选地包含选自以下一种或多种的其他组分，
-包装序列，
-确保所述噬菌粒在细胞分裂期间繁殖的组分，
-选择性标记。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述选择性标记是抗生素抗性基因。
12.如权利要求10所述的方法，其中还使用辅助质粒或辅助噬菌体，其包含选自以下一种或多种的其他组分，
-编码噬菌体的蛋白质的基因，
-确保所述辅助质粒在细胞分裂期间繁殖的组分，
-选择性标记。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述辅助质粒或所述辅助噬菌体包含抗生素抗性基因。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述噬菌体是M13噬菌体。
15.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述步骤(2)中的载体是至少一种噬菌粒，并通过滚环扩增(RCA)在所述细菌细胞内扩增，产生噬菌粒ssDNA。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述噬菌粒ssDNA被包装在噬菌体样颗粒中，所述颗粒优选地从所述细胞中分泌。
17.如权利要求10所述的方法，其中步骤(3)包括从所述细胞培养物提取所述噬菌体样颗粒，并从所述噬菌体样颗粒提取所述噬菌粒ssDNA。
18.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述步骤(4)的消化通过添加Zn2+离子触发。
19.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(5)中分离所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸包括
从以反向顺序相互连接的两个自切割DNA序列的切割组中分离。
20.如权利要求19所述的方法，其中从以反向顺序相互连接的两个自切割DNA序列的切割组中分离通过层析法进行。
21.如权利要求1至4中任一项所述的方法，包括进一步的步骤(6)进一步处理所述靶单链DNA寡核苷酸或多核苷酸。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述步骤(6)包含：自组装和/或折叠成DNA折纸结构、基于拼贴的DNA纳米结构或结晶DNA纳米材料。
23.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细菌培养在生物反应器中进行。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述生物反应器是搅拌釜生物反应器。
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