CN109820032A

CN109820032A - Ube2抑制剂作为食物低温保鲜剂的用途

Info

Publication number: CN109820032A
Application number: CN201910241065.8A
Authority: CN
Inventors: 龚明; 汪滢; 鲍大鹏; 李正鹏; 茅文俊; 万佳宁; 李燕; 王莹; 周陈力
Original assignee: SHANGHAI GUOSEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI GUOSEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2039-03-28
Also published as: CN109820032B

Abstract

本发明提供了泛素缀合E2酶（Ubiquitin‑conjugating E2 enzyme,UBE2）的抑制剂作为食物低温保鲜剂的用途。本发明还提供了一种草菇的低温保鲜方法，将草菇放置于UBE2抑制剂的溶液中浸泡，然后沥干水分，进行冷藏，能够明显延缓低温对草菇的冻伤。本发明将UBE2抑制剂配比成溶液，进行草菇子实体浸泡实验，发现该抑制剂能够明显延缓低温对草菇的冻伤，可以作为草菇等食品的低温保鲜剂。

Description

UBE2抑制剂作为食物低温保鲜剂的用途

技术领域

本发明属于食品领域，涉及一种食品保藏技术，具体来说UBE2抑制剂作为食物低温保鲜剂的用途。

背景技术

草菇（Volvariella volvacea）被称为“中国菇”，是一种重要的食用菌。草菇不仅味道鲜美，而且具有重要的医疗保健作用，如抗氧化、调节免疫、抗肿瘤等。草菇工厂化栽培大都以稻草、废棉为主要基质，是降解秸秆的主要品种之一。我国农作物秸秆年产约8 亿吨。草菇降解秸秆所具有的巨大经济效益将助力资源节约型、环境友好型现代化新农业的发展。草菇肉质鲜美且生长周期短(大约10天左右)，本应成为经济效益很高的食用菌。然而，草菇菌丝的生长和结实要求比较高的温度(28–35°C)，尤其是其菌丝和子实体不耐低温，即使在常规低温4℃下，菌丝和子实体在短时间内便会软化、液化甚至腐烂，即通常所说的“低温自溶”。

草菇“低温自溶”的独特性提出了保鲜难题。所以，一直以来草菇的货架期明显短于其它菇类，使其栽培和普及受到极大地限制，也间接影响了降解秸秆经济效益的发挥。

目前草菇的保鲜研究：局限于借鉴广谱性物理和化学的果蔬保鲜技术，例如自发气调法、紫外杀菌、辐照杀菌、臭氧等物理方法，以及1-甲基环丙烯、氯化钠、抗坏血酸、柠檬酸、海藻糖等。这些方法存在针对性差、效果不明显、成本高不实用等的问题。可以说，目前还未能研发出对草菇适用的低温保鲜技术。该问题的症结在于没有从草菇低温自溶的生理代谢分子机理出发，在此基础上研发保鲜技术。

UBE2是泛素缀合E2酶, 它的主要作用是特异的选择靶蛋白上的Lys位点与泛素分子共价结合，并且决定了泛素链的特异性连接方式及长度，从而影响靶蛋白的命运。UBE2在泛素转移通路中发挥核心作用, 负责泛素细胞信号的多样性。

发明内容

本发明的目的在于提供UBE2抑制剂作为食物低温保鲜剂的用途，所述的这种用途要解决现有技术中对于草菇的低温保鲜针对性差、效果不明显、成本高、不实用的技术问题。

本发明提供了UBE2抑制剂作为食物低温保鲜剂的用途。

进一步的，所述的UBE2抑制剂为NSC697923。

进一步的，所述的食物为草菇。

本发明还提供了一种草菇的低温保鲜方法，将草菇放置于UBE2抑制剂的溶液中浸泡，然后沥干水分，进行冷藏。

优选的，冷藏温度为0~8℃。

优选的，浸泡时间30分钟。

进一步的，所述的UBE2抑制剂为NSC697923。

进一步的，所述的UBE2抑制剂溶液的浓度为100~500µM。

优选的，UBE2抑制剂溶液的浓度为300µM。

本发明发现UBEV2介导的泛素化导致草菇“低温自溶”，基于UBEV2是一种类型的UBE2，本发明利用UBE2的抑制剂抑制泛素化过程从而间接削弱草菇低温自溶的原理，进而研发草菇耐低温保鲜技术。

本发明利用UBE2抑制剂配比成溶液，进行草菇子实体浸泡实验，发现该抑制剂能够明显延缓低温对草菇的冻伤，具有成为草菇低温保鲜剂的潜力。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。采用基于UBE2抑制剂进行草菇耐低温保鲜的方法，本发明具有以下优点：

(1) 经本发明方法处理过的草菇，在低温抗冻实验下能够有效延缓菇体腐烂、流水、凹陷，子实体比较硬实，维持较好的商品外观；

(2) 采用UBE2抑制剂浸泡处理的方法操作简单，处理成本较低，能使草菇的低温保鲜至少延长到2天。

附图说明

图1显示冷处理诱导了UBEV2的上调表达，进而UBEV2介导的泛素化促进草菇低温自溶。其中，（A）泛素化组学分析显示冷处理影响了蛋白翻译；（B）Western blot 分析显示冷处理下草菇V23的UBEV2蛋白表达含量上升；（C）RT-PCR分析显示冷处理下草菇VH3（VH3菌株是由V23复合诱变获得，其菌丝体相比于V23有较好的耐低温性）的UBEV2的mRNA表达量含量下降；（D）蛋白组学分析显示冷处理下V23的蛋白表达下降；（E）蛋白组学分析显示冷处理下VH3的蛋白表达下降；(F) 使用SDS-PAGE和银染色方法显示存在与UBEV2相结合的互作蛋白的GST-pulldown实验结果。（G）UBEV2互作蛋白网络分析显示了核糖体富集和泛素化作用。 (H) CO-IP实验分析证实了UBEV2与泛素化的核糖体分子伴侣蛋白SSB2相结合。 (I)UBEV2介导泛素化促进低温自溶的模型。该模型强调了UBEV2通过泛素化作用核糖体分子伴侣蛋白SSB2促进其降解，进而间接抑制蛋白翻译的作用。

图2中，e2i代表UBE2抑制剂浸泡处理后的草菇子实体照片；H₂O代表水浸泡处理后的草菇子实体照片。

图3显示了草菇V23和VH3分别进行冷处理后的草菇子实体对比照片。

具体实施方式

实施例1

冷处理下的草菇泛素化组分析

通过对草菇V23菌丝分别进行冷处理0和4小时，提取样品中总蛋白，取出一部分做蛋白浓度测定及SDS-PAGE检测，另取部分进行胰蛋白酶酶解及基于抗体的泛素化修饰的肽段富集，然后经液相色谱-质谱联用鉴定及数据分析，获得显著差异的泛素化相关表达蛋白（P<0.05 和倍数 ≥1.5），对这些泛素蛋白进行富集分析，结果显示冷处理影响了蛋白翻译（图1A）。

② 冷处理下的草菇UBEV2 的Western blot分析

通过对草菇V23菌丝分别进行冷处理0和4小时，提取样品中总蛋白，使用Western blot技术对UBEV2进行蛋白表达分析，结果显示冷处理下UBEV2蛋白表达含量上升（图1B）。

③ 冷处理下的草菇UBEV2的RT-PCR分析

通过对草菇V23菌丝分别进行冷处理0和4小时，提取样品中总mRNA, 使用荧光定量PCR表达技术对VH3中的UBEV2进行表达分析，

UBEV2的引物设计为,

UBEV2-F: CTCTCCCAAGGTCGCCACTC;

UBEV2-R: GCGTGATTTCCGGGTTTGGG。

图1C显示RT-PCR分析结果。RT-PCR分析显示冷处理下草菇VH3的UBEV2的mRNA表达量含量下降；

冷处理下的草菇蛋白组分析

通过对草菇V23和VH3菌丝分别进行冷处理0和4小时，提取总蛋白进行iTRAQ定量蛋白质组学实验，提取样品中总蛋白，取出一部分做蛋白浓度测定及SDS-PAGE检测，另取部分进行胰蛋白酶酶解及标记，然后取等量的各标记样品混合后进行色谱分离，最后对样品进行LC-MS/MS鉴定及数据分析，获得显著差异的蛋白表达(P< 0.05 和倍数 ≥1.5)。对这些差异蛋白进行热图分析，结果显示冷处理下V23的蛋白表达下降，而冷处理下VH3的蛋白表达下降（图 1D和1E）。

UBEV2的GST-PULLDOWN实验

利用MaxCodonTM Optimization Program (V13)对UBEV2序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点BamHI 和XhoI将GST-UBEV2 融合基因插入到表达载体pGEX-4T-1中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到Top10 克隆菌株和BL21(DE3)表达菌株中，之后通过亲和层析（Glutathione 树脂）纯化。对草菇V23菌丝进行4℃冷处理4小时，提取总蛋白与纯化好的GST-UBEV2蛋白孵育，通过层析柱时与此固相复合物混合时就可被吸附而分离，分离结果采用SDS-PAGE、银染进行检测（图1F）。对回收复合物进行液相质谱鉴定及数据分析，获得UBEV2的互作蛋白，进而对这些互作蛋白进行STRING网络富集分析（图1G）。

UBEV2的免疫共沉淀（Co-IP）实验

采用全基因合成UBEV2、SSB2 (VVO_07431) 并插入真核载体构建表达质粒，并分别转化到DH5α克隆菌株中，通过质粒大抽试剂盒提取转染级质粒，之后将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞HEK293 中表达。收集4℃冷处理4小时下的草菇V23菌丝体，采用细胞裂解液裂解细胞，加入Flag 单抗进行Co-IP，通过SDS-PAGE 与Western blot分析实验结果（图1H）。

由上述实验可知， UBEV2介导的泛素化导致草菇“低温自溶”。图I模型展现了冷处理诱导UBEV2的上调表达，进而UBEV2介导的泛素化促进草菇“低温自溶”的机理。

实施例2

一种基于UBE2抑制剂进行草菇耐低温保鲜的方法，包括以下步骤：

(1) 将同一批次采收的草菇V23，挑选大小相似、无开伞、无明显损伤的草菇；

(2) NSC697923是一种细胞选择透过性UBE2抑制剂，配比300ml浓度为300µM的UBE2抑制剂溶液 (DMSO助溶)；

(3) 将草菇在UBE2抑制剂溶液中浸泡30分钟，然后沥干水分；

(4) 将处理后的草菇直接放入4℃进行0, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48小时冷藏试验；

(5) 对UBE2抑制剂浸润的草菇子实体在冷处理下的形态、色泽和硬度进行评价。

由图2可知，经UBE2抑制剂浸润后的草菇子实体在冷处理下（2~48小时）的形态饱满、色泽鲜亮和硬度硬实，各方面都显著优于对照处理的状态。具有较好的感官评价效果，草菇抗冻性显著提高。经处理后草菇至少可以保藏2天。

对比例1

(1) 将与实施例1同一批次采收的草菇V23，挑选大小相似、无开伞、无明显损伤的草菇；

(2) 使用300ml的对照水溶液（加入等量DMSO）

(3) 将草菇在对照水溶液浸泡30分钟，然后沥干水分；

(5) 对草菇子实体在冷处理下的形态、色泽和硬度进行评价。

对比例 2

(1) 将同一批次采收的草菇V23和VH3，挑选大小相似、无开伞、无明显损伤的草菇；

(2) 将采收后的草菇直接放入4℃进行0, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48小时冷藏试验；

(3) 对草菇子实体在冷处理下的形态、色泽和硬度进行评价。

结果显示，经实施例2方法处理下UBE2抑制剂浸润后的草菇子实体在冷处理下的形态更饱满、色泽更鲜亮和硬度硬实，各方面都显著优于对比例1处理的状态（图2）。图3结果显示对比例2处理的VH3子实体在冷处理下（2~48小时）依然保持一定的鲜亮，鲜亮程度与经实施例2方法处理下UBE2抑制剂浸润后的草菇子实体的状态相当，均显著优于对比例2处理的V23子实体状态。鉴于VH3具有较好的耐低温性，图3的结果也进一步证实UBE2抑制剂能够显著提高草菇抗冻性。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.UBE2抑制剂作为食物低温保鲜剂的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的UBE2抑制剂为NSC697923。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的食物为草菇。

4.一种草菇的低温保鲜方法，其特征在于：将草菇放置于UBE2抑制剂的溶液中浸泡，然后沥干水分，进行冷藏。

5.根据权利要求4所述的一种草菇的低温保鲜方法，其特征在于: 所述的UBE2抑制剂为NSC697923。

6.根据权利要求4所述的一种草菇的低温保鲜方法，其特征在于: 所述的UBE2抑制剂的溶液的浓度为100~500µM。

7.根据权利要求4所述的一种草菇的低温保鲜方法，其特征在于: 所述的UBE2抑制剂的溶液的浓度为300µM。