CN109811038B - 一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器。包括荧光检测仪、试剂存储区、移液枪存储盒、耗材存储盒、电池盒，上述五部分放置于手提箱中；试剂存储区由试剂存储盒和试剂存储盒盖连接组成，所述试剂存储盒中开有多个离心管孔，试剂存储盒顶端开有试剂存储盒注水口，侧壁开有试剂存储盒水位限位孔，以水作为冷冻介质；荧光检测仪包括仪器外壳和样品架模块、控制电路模块、荧光检测模块、加热模块和上位机模块。本发明针对基于核酸等温扩增技术的荧光分析方法实时定量检测生化样品，实现了扩增及检测一体化与高通量，所需待测样品少、整个系统体积小便于携带，测量精度高，检测速度快，适用于食品安全的现场快速检测使用。

Description

一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器

技术领域

本发明涉及食品安全中生化样品检测仪器领域，特别是涉及了一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器，将核酸等温扩增技术结合机械电子控制形成一套自动化检测装置系统。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)作为最常用的分子生物学技术之一，能将微量的目标DNA扩增上百万倍，具有特异性强、灵敏度高、简便等优点，因此广泛应用于食品安全检测领域。但是常规PCR技术存在以下不足：仪器昂贵、体积大不易携带，不适用于现场检测，易引起非特异性扩增等。

近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在食品安全现场快速检测中显示了其良好的应用前景。常见的等温扩增技术有：环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)、依赖核酸序列扩增(Nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)、滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)、依赖解旋酶扩增技术(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等。等温扩增技术其反应过程始终维持在恒定的温度，与PCR技术相比，其对仪器要求大大简化，时间大大缩短，更适用于研发便携式仪器用于现场快速检测。

核酸扩增完成后，需要经过严格检测才能确定是否真正得到预期的特定扩增产物，常见的方法为凝胶电泳法(包括琼脂糖凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法)，但是该方法需要开盖检测易造成气溶胶污染、对人体有一定危害。众多学者探索了新方法如：微孔板夹心杂交法、荧光分析法、分支DNA等，其中荧光分析法相较于其他方法具有灵敏度高、特异性好以及检测快速等优点而备受研究人员青睐。

荧光是一种光致发光的现象。当光源照射某些物质即荧光素时，荧光素会发出不同波长的光；当撤去光源后，荧光素发出的光也会随之消失。基于核酸扩增的荧光分析法中的荧光素主要有荧光染料、荧光探针：(1)荧光染料如SYBR系列染料、DAPI荧光染料、SYTOX系列染料、EvaGreen、FAM等；(2)荧光探针如Taqman技术、分子信标技术、复合探针法等。

现有的荧光检测仪常用氙灯、氘灯、汞灯、发光二极管(LED)、激光二极管等作为激发光源，其中氙灯、氘灯、汞灯光谱带宽、能量高，但体积庞大、价格昂贵，而LED、激光二极管虽然体积小易集成，但发光波段单一难以满足多种荧光物质激发要求，且目前基于LED的荧光检测仪发光功率固定无法调节，难以满足不同浓度待测物的激发。同时，大部分检测仪的激发光源位于样本容器的顶部，照射至样本容器底部试剂上的光强由于光程大、容器的散射等原因而大大降低。荧光检测仪的接收器常采用光电倍增管(Photomultiplier，PMT)，常规PMT具有检测灵敏、响应快等优点，但其体积较大，不适用于多通道、便携式检测，目前虽然有小型化PMT，但是价格昂贵，大大提高了仪器成本。此外，目前大部分的多通道荧光检测仪采用同一的基准消除不同通道的噪声，但是不同通道由于检测仪器灵敏度、检测位置、信号处理电路等不同，其噪声会有些许差异，同一基准不利于多通道检测的一致性。

发明内容

本发明的目的，在于针对现有技术的不足，提供一种基于核酸等温扩增技术、结合荧光染料或荧光探针作为标记物的荧光分析方法，结合机械电子与计算机软件控制技术，实现对一种或多种样品进行快速检测的装置系统，具有便携、低成本、操作简单的特点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案主要包含：

本发明包括荧光检测仪、试剂存储区、移液枪存储盒、耗材存储盒、电池盒，上述五部分放置于手提箱中；其中所述试剂存储区由试剂存储盒和试剂存储盒盖连接组成，试剂存储盒和试剂存储盒盖通过两侧安装的磁铁片吸附；所述试剂存储盒中开有多个离心管孔，离心管孔用于放置盛放低温存储试剂的离心管，所述试剂存储盒顶端开有试剂存储盒注水口，侧壁开有试剂存储盒水位限位孔，以水作为冷冻介质。

所述荧光检测仪包括仪器外壳和安装于仪器外壳内的样品架模块、控制电路模块、荧光检测模块、加热模块和上位机模块，仪器外壳顶面开有缺口槽，缺口槽处安装样品架模块，样品架模块上端处于缺口槽，缺口槽上设置外壳遮光盖封盖，样品架模块连接荧光检测模块，荧光检测模块、加热模块均与控制电路模块电气相连。

所述样品架模块包括铝制样品池和样品容器；铝制样品池固定于缺口槽处下方，铝制样品池顶面设有多个沿直线间隔排布的样品口，每个样品口用于放置样品容器，样品容器上端开口，样品容器内盛有待检测样品；每个样品口为从上到下直径缩小的锥形孔，铝制样品池底部侧面开有多个沿直线间隔排布的导光光纤孔，各个导光光纤孔分别和各个样品口对应连接相通，导光光纤孔水平深入导通到自身对应的样品口底部内。

所述的加热模块包括加热元件固定座、加热元件和温度传感器，加热元件固定座内置加热元件，加热元件几何中心与加热元件固定座几何中心重合，加热元件固定座与铝制样品池开有导光光纤孔相对的侧面通过紧固件连接；铝制样品池上还设有温度传感器定位孔，温度传感器定位孔处安装温度传感器，温度传感器检测铝制样品池的温度进而控制加热元件加热调整样品口的样品容器温度。

所述的荧光检测模块包括荧光激发光源、荧光发射滤光片、导光光纤和荧光检测器；荧光激发光源固定盘通过紧固件固定于铝制样品池底部，荧光激发光源固定盘底面安装有多个沿直线间隔排布的荧光激发光源，各个荧光激发光源分别和各个样品口对应，荧光激发光源朝上并位于自身对应的样品口正下方，通过铝制样品池内部通道照射到样品口内；每个导光光纤孔处通过第一光纤检测头安装座连接一根导光光纤的一端，各个导光光纤孔处的第一光纤检测头安装座均被第一导光光纤固定盘固定于铝制样品池侧面，同时导光光纤孔内安装荧光发射滤光片，发射滤光片中心波长值根据荧光分析方法选择；仪器外壳底部内固定安装控制电路板，各个导光光纤另一端和控制电路板上的第二导光光纤固定盘连接，第二导光光纤固定盘内的控制电路板上安装荧光检测器，导光光纤端部通过内嵌于第二导光光纤固定盘的第二光纤检测头安装座固定并对准荧光检测器感光面。

现有的核酸等温扩增检测通常采用光电倍增管，而本发明采用光电二极管激发荧光发射荧光光源进行探测，荧光检测器位于控制电路板上。

本发明的荧光激发光源固定盘及其上的荧光激发光源位于样品容器底部，减少光程、样品容器散射的影响，有利于提高检测灵敏度，同时不需常规PCR仪上为了防止检测结果受到加热产生气泡的影响而设计的热盖。

所述的铝制样品池上还设有两个螺纹孔，紧固件通过两个螺纹孔将所述铝制样品池固定于缺口槽；所述的荧光激发光源固定盘上还设有荧光激发光源固定盘定位螺纹孔，荧光激发光源固定盘定位螺纹孔用于荧光激发光源固定盘与所述的铝制样品池固定用。

所述的铝制样品池底部侧面开设第一导光光纤固定盘定位凹槽，第一导光光纤固定盘通过两侧开设的第一导光光纤固定盘定位螺纹孔及螺栓嵌装固定于第一导光光纤固定盘定位凹槽中。

所述的荧光激发光源固定盘安装有多个沿直线间隔排布的荧光激发光源定位圆孔，每个荧光激发光源定位圆孔处安装荧光激发光源，所述的荧光激发光源峰值波长根据荧光分析方法选择，其功率大小可由操作人员根据被测物浓度通过选择驱动电流进行适当调节。

所述的仪器外壳包括上外壳和下外壳，上外壳和下外壳之间通过壳固定紧固件连接固定呈一体。

所述荧光检测器采用光电二极管，各个荧光检测器分别检测对应所述铝制样品池中的各个样品口通道，不同样品口通道根据检测荧光波长选择不同的荧光检测器，或者选择宽检测波段的荧光检测器。

所述温度传感器可为热敏电阻、铂电阻、热电偶等；所述加热元件可以为陶瓷加热片、电热膜、电热丝、功率电阻、纳米铟锡金属氧化物(Indium Tin Oxides，ITO)等。

所述控制电路模块包括电源模块、主控模块、荧光激发光源驱动模块、荧光强度信号调理模块、温度控制模块、过热保护模块和通讯模块；电源模块与主控模块、荧光激发光源驱动模块、荧光强度信号调理模块、温度控制模块、过热保护模块和通讯模块电气连接进行供电，主控模块分别与荧光激发光源驱动模块、荧光强度信号调理模块、温度控制模块、过热保护模块、通讯模块电连接，荧光激发光源驱动模块电连接荧光激发光源，荧光强度信号调理模块电连接荧光检测器，温度控制模块电连接温度传感器和加热元件，过热保护模块安装于加热元件，通讯模块与上位机模块连接。

所述主控模块还包括仪器运行状态指示灯，仪器运行状态指示灯安装于仪器外壳外表面，用于显示工作状态。

本发明具有的有益效果是：

1、本发明实现了基于核酸等温扩增技术的荧光分析法中扩增和检测流程的一体化，将荧光检测仪与所需辅助工具集成在一个手提箱中，实时现场检测、操作简单便捷。

2、本发明采用的荧光分析法较为简单，而且检测耗时较短；检测完成后可以对扩增产物进行溶解曲线分析，避免了生化检测中开盖进行产物验证导致的气溶胶污染，且所述PCR八连管一次性使用，提高了检测的准确度。

3、本发明采用LED作为激发光源，体积小、功耗低、工作寿命长，同时激发光源功率可调，适用于不同浓度梯度的待测物；选用光电二极管代替PMT作为荧光检测器件，大大降低成本、缩小仪器体积，适用于现场快速检测。

4、激发光源位于样品容器底部，无需热盖，减少仪器功耗；同时激发模块与接收模块组成正交的光路系统，提高仪器信噪比。

5、本发明荧光检测模块中滤光片、激发光源、检测器可根据荧光分析法进行选择更改，可以实现多种样品同时检测，提高检测效率。

6、本发明上位机模块不仅仅局限于PC机，也可使用手机、带触摸屏的单片机等设备，拓宽本发明的使用范围。

综合上述，本发明针对基于核酸等温扩增技术的荧光分析方法实时定量检测生化样品，实现了扩增及检测一体化与高通量，所需待测样品少、整个系统体积小便于携带，测量精度高，检测速度快，适用于食品安全的现场快速检测使用。

附图说明

图1是本发明荧光检测仪的机械结构模块的示意图。

图2是本发明荧光检测仪的荧光激发光源固定板俯视图。

图3是本发明荧光检测仪的铝制样品池的结构主视图。

图4是本发明荧光检测仪的主视图。

图5是本发明荧光检测仪的框架结构图。

图6是本发明荧光检测仪中控制板模块的框架结构图。

图7是本发明试剂存储区的机械结构示意图。

图7(a)是试剂存储区的试剂存储盒三维结构图。

图7(b)是试剂存储区的试剂存储盒盖三维结构图。

图8是本发明的手提箱内部组成示意图。

图9是本发明的检测流程图。

图10是本发明的实施例实时扩增荧光强度信号曲线图。

图中：控制电路板1，第二导光光纤固定盘2，第二光纤检测头安装座3，仪器运行状态指示灯4，导光光纤5，仪器外壳6，外壳遮光盖7，样品容器8，加热元件固定座9，第一光纤检测头安装座10，第一导光光纤固定盘11，荧光激发光源固定盘12，荧光激发光源13，铝制样品池14，上下外壳固定紧固件15，温度传感器定位孔16，荧光激发光源固定盘定位螺纹孔17，荧光激发光源定位圆孔18，第一导光光纤固定盘定位螺纹孔19，第一导光光纤固定凹槽20，荧光发射滤光片21，试剂存储盒22，磁铁片23，离心管孔24，试剂存储盒注水口25，试剂存储盒水位限位孔26，试剂存储盒盖27，手提箱28，移液枪存储盒29，耗材存储盒30，电池盒31，荧光检测仪32。

具体实施方式

下面结合说明书附图，对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。

如图8所示，本发明具体实施包括荧光检测仪32、试剂存储区、移液枪存储盒29、耗材存储盒30、电池盒31，以上五部分放置于手提箱28中；如图7(a)和图7(b)所示，其中试剂存储区由试剂存储盒22和试剂存储盒盖27组成，两者通过磁铁片23吸附。试剂存储盒22中开有多个离心管孔24，图7中以三个孔为例，用于放置离心管，离心管内盛放需要低温存储的试剂，孔尺寸可根据离心管的规格进行调整；试剂存储盒22顶端开有试剂存储盒注水口25，侧壁开有试剂存储盒水位限位孔26，超过最大注水量时水从试剂存储盒水位限位孔26流出，以水作为冷冻介质，方便无污染且可反复使用，制冷效果可持续5-7小时。

如图6所示，本发明荧光检测仪32具体实施包括仪器外壳6和安装于仪器外壳6内的样品架模块、控制电路模块、荧光检测模块、加热模块和上位机模块，样品架模块、荧光检测模块、加热模块和控制电路模块组成检测台装置，仪器外壳6顶面开有缺口槽，缺口槽处安装样品架模块，样品架模块上端处于缺口槽，缺口槽上设置外壳遮光盖7封盖，样品架模块连接荧光检测模块，荧光检测模块、加热模块均与控制电路模块电气相连；上位机模块采用PC机或者工控一体机，但不限于此。

如图1和图2所示，样品架模块包括铝制样品池14和样品容器8；铝制样品池14固定于缺口槽处下方，铝制样品池14通过紧固件固定于外壳6上，铝制样品池14顶面设有多个沿直线间隔排布的样品口，每个样品口用于放置样品容器8，样品容器8上端开口，样品容器8内盛有待检测样品，铝制样品池14对样品容器8(PCR八连管)进行保温及遮光；每个样品口为从上到下直径缩小的喇叭形的锥形孔，铝制样品池14底部侧面开有多个沿直线间隔排布的导光光纤孔，导光光纤孔数量和样品口数量相同，各个导光光纤孔分别和各个样品口对应连接相通，导光光纤孔水平深入导通到自身对应的样品口底部内。

如图1所示，加热模块包括加热元件固定座9、加热元件和温度传感器，加热元件固定座9内置加热元件，加热元件几何中心与加热元件固定座9几何中心重合，加热元件固定座9与铝制样品池14开有导光光纤孔相对的侧面通过紧固件连接；铝制样品池14上还设有温度传感器定位孔16，温度传感器定位孔16处安装温度传感器，温度传感器检测铝制样品池14的温度进而控制加热元件加热调整样品口的样品容器8温度。

如图1、图3、图4所示，荧光检测模块包括荧光激发光源13、荧光发射滤光片、导光光纤5和荧光检测器；荧光激发光源固定盘12通过紧固件固定于铝制样品池14底部，荧光激发光源固定盘12底面安装有多个沿直线间隔排布的荧光激发光源13，荧光激发光源13数量和样品口数量相同，各个荧光激发光源13分别和各个样品口对应，荧光激发光源13朝上并位于自身对应的样品口正下方，通过铝制样品池14内部通道照射到样品口内；每个导光光纤孔处通过第一光纤检测头安装座10连接一根导光光纤5的一端，各个导光光纤孔处的第一光纤检测头安装座10均被第一导光光纤固定盘11固定于铝制样品池14侧面，同时导光光纤孔内安装荧光发射滤光片21，发射滤光片中心波长值根据荧光分析方法选择；仪器外壳6底部内固定安装控制电路板1，各个导光光纤5另一端和控制电路板1上的第二导光光纤固定盘2连接，导光光纤5经第二光纤检测头安装座3连接到第二导光光纤固定盘2，第二导光光纤固定盘2内的控制电路板1上安装荧光检测器，导光光纤5端部通过内嵌于第二导光光纤固定盘2的第二光纤检测头安装座3固定并对准荧光检测器感光面。

当外壳遮光盖7盖设在或者未设在缺口槽处时均可以为：荧光激发光源固定盘12上的荧光激发光源13朝上正对铝制样品池14中的样品口，具体实施设置八个样品口用于放置PCR八连管。

铝制样品池14上还设有两个螺纹孔，紧固件通过两个螺纹孔将铝制样品池14固定于缺口槽；荧光激发光源固定盘12上还设有荧光激发光源固定盘定位螺纹孔17，荧光激发光源固定盘定位螺纹孔17用于荧光激发光源固定盘与铝制样品池14固定用。

铝制样品池14底部侧面开设第一导光光纤固定盘定位凹槽20，第一导光光纤固定盘11通过两侧开设的第一导光光纤固定盘定位螺纹孔19及螺栓嵌装固定于第一导光光纤固定盘定位凹槽20中。

荧光激发光源固定盘12安装有多个沿直线间隔排布的荧光激发光源定位圆孔18，每个荧光激发光源定位圆孔18处安装荧光激发光源13；荧光激发光源13峰值波长根据荧光分析方法选择，其功率大小可由操作人员根据被测物浓度通过选择驱动电流进行适当调节。

仪器外壳6包括上外壳和下外壳，上外壳和下外壳之间通过壳固定紧固件15连接固定呈一体。壳固定紧固件15可以为内凸耳及其内凸耳之间的连接螺栓。

荧光检测器采用光电二极管，各个荧光检测器分别检测对应铝制样品池14中的各个样品口通道，即单个通道有单独的检测器，不同样品口通道可根据检测荧光波长选择不同的荧光检测器，或者选择宽检测波段的荧光检测器。

如图5和图6所示，控制电路模块包括电源模块、主控模块、荧光激发光源驱动模块、荧光强度信号调理模块、温度控制模块、过热保护模块和通讯模块；电源模块与主控模块、荧光激发光源驱动模块、荧光强度信号调理模块、温度控制模块、过热保护模块和通讯模块电气连接进行供电，主控模块分别与荧光激发光源驱动模块、荧光强度信号调理模块、温度控制模块、过热保护模块、通讯模块电连接，荧光激发光源驱动模块电连接荧光激发光源13，荧光强度信号调理模块电连接荧光检测器，温度控制模块电连接温度传感器和加热元件，过热保护模块安装于加热元件，通讯模块与上位机模块通过蓝牙模块、USB、UART等方式连接。

主控模块中的温度控制模块通过控制算法如PID控制、大林算法、Smith预估控制等输出PWM脉冲至加热元件进而控制加热元件的加热状态，用以调节铝制样品池14温度。

过热保护模块由自恢复保险丝和若干电子元器件组成，压装于加热元件与样品池14背面，保证检测装置不会由于温度过高而存在安全问题。

荧光强度信号调理模块包括依次连接的信号采集单元、信号滤波单元、信号放大单元、数据A/D转换单元。

主控模块还包括仪器运行状态指示灯4，仪器运行状态指示灯4安装于仪器外壳6外表面，用于显示工作状态。当装置通电而未运行时仪器运行状态指示灯4显示橙色，当装置通电且运行时仪器运行状态指示灯4显示绿色，当装置通电而未按上位机命令运行或发生故障时仪器运行状态指示灯4显示红色。

上位机模块作为整个检测系统的主要软件组成部分，通过蓝牙模块、USB、UART等方式与控制电路模块进行通讯，进而控制检测装置的运行，并实时接收检测所得到的荧光强度信号。

上位机模块通过控制主控模块中的温度控制模块实现加热模块温度的调控，上位机模块同时控制荧光检测模块，包括荧光激发光源驱动通道选择、荧光激发光源驱动电流选择、采集荧光强度信号，然后接收所得数据并进行滤波、归一化等分析处理，得出检测结果实时显示并生成检测结果输出。其中归一分析即消除噪声，不同通道噪声的消除采用统一标准即实时采集得到的信号减掉无样本时检测所得背景信号，但不同通道不使用同一数值消除。

本发明上位机模块还可通过控制加热模块实现以下两种功能：

1)实现部分样品在高温下核酸的提取，例如大肠杆菌DNA，有利于现场快速检测；

2)通过逐渐提高温度实时监测荧光信号生成溶解曲线，用以确定不同的反应产物，包括非特异性产物，提高检测准确性。

具体实施时，可将部分需低温存储的试剂放置于试剂存储区，将用于试剂移取的移液枪放置于移液枪存储盒29内、将检测所需耗材(移液枪头、离心管、样品容器8，但不限于此)置于耗材存储盒30中，将供能设备电池(锂电池，但不限于此)置于电池区31，以及荧光检测仪32放置于手提箱28中，用于现场快速检测。

检测前，将样品容器8(PCR八连管，但不限于此)放入铝制样品池14中，确保样品容器8底部中心与荧光激发光源定位圆孔18的中心重合，检测过程中需将外壳遮光盖7完全合上以减少外界环境光对检测结果的影响。根据实际所采用的荧光分析法选择合适波长的荧光发射滤光片与荧光激发光源13，例如荧光发射滤光片可以选择欧风光学公司的中心波长为520nm、半波宽为20nm的滤光片，荧光激发光源13可以使用峰值波长为470nm的LED，但不限于此；将发射滤光圆片与荧光发射滤光片固定孔21同轴固定，荧光激发光源13通过荧光激发光源固定盘12上的定位螺纹孔17固定于铝制样品池14的底面。根据实际安装满足要求的加热模块中温度传感器及加热元件，温度传感器放置于所述样品架模块中的样品池14底部固定温度传感器定位孔16内，通过检测铝制样品池14的温度进而控制反应样本的温度，使得样品温度满足核酸等温扩增技术的温度要求，加热元件可采用江苏星河电子公司的加热元件(220V、30W)，但不限于此。

检测时，上位机模块作为整个检测系统的软件部分，作为实验员对整个检测系统的流程控制和结果分析的人机交互，与控制电路板相连，从而控制加热模块和荧光检测模块，硬件部分在软件部分的控制下完成整个检测流程，并实时接收检测所得到的荧光强度信号。当控制电路板中的通讯模块与PC机通过蓝牙模块、USB、UART等方式连接后，接收上位机发送的命令，主控模块中的温度控制单元输出PWM脉冲至加热元件开关管进而控制加热元件的加热状态，通过PID算法调节得到设定温度，同时根据温度传感器实时反馈样品池14实际温度，进而调节样品池14温度。过热保护单元由自恢复保险丝和若干电子元器件组成，压装于加热元件与所述样品池14背面，保证检测装置不会由于温度过高而存在安全问题。开始检测后，样品发出的荧光通过导光光纤5被荧光检测器件接收，通过荧光强度信号调理模块处理后发送给上位机模块，以曲线的形式实时显示；荧光强度信号调理模块包括信号采集单元、信号滤波单元、信号放大单元、数据A/D转换单元。主控模块包括仪器运行状态指示灯4，当装置通电而未运行时仪器运行状态指示灯4显示橙色，当装置通电且运行时仪器运行状态指示灯4显示绿色，当装置通电而未按上位机命令运行或发生故障时仪器运行状态指示灯4显示红色。

具体实施中，上位机模块采用计算机，提供对整个系统在检测时的控制分析功能，通过USB或者UART等接口方式控制电路板进行通信。同时作为一个人机交互接口，使实验员可以直接控制检测系统硬件部分的运作，最终完成整个检测流程。开始时，需要对仪器通讯、荧光激发光源驱动通道的选择、反应温度、检测时间进行初始设置。上位机模块中对所得原始荧光强度信号数据进行滤波、归一化等分析处理，得出检测结果实时显示并生成检测结果输出。对所得原始荧光强度信号值、处理后荧光强度信号值、样品池14实时温度测量值以及最后检测结果的实时显示，并可以保存在整个检测过程中涉及到的所有设置参数、当前检测环境和检测结果。上位机模块还可通过控制加热模块进而控制检测装置对样本扩增产物进行溶解曲线分析。

如图9所示，以荧光分析法中荧光物质采用荧光染料SYTO9，采用核酸等温扩增技术中的环介导等温扩增技术(LAMP)检测柑橘黄龙病为例，本发明的具体实施工作过程如下：

1)待测液准备：从试剂存储区取出所需试剂，溶化摇匀后按照常规核酸扩增检测方法，借助移液枪移取所需试剂配置待测液。

①配置待测物溶液；

②配置合适浓度的荧光染料SYTO9溶液(本实施例中以4μM为例)，在保证检测灵敏度和准确性的前提下尽量减少荧光染料对核酸扩增的抑制作用；

③根据检测要求取适量待测液与合适SYTO9溶液混合并使之反应结合；

2)根据检测需求，荧光检测仪32安装合适的发射滤光片和荧光激发光源13(本实施例中荧光发射滤光片选择中心波长为520nm、半波宽为20nm的滤光片，荧光激发光源13使用峰值波长为470nm的LED)，样品容器8选择合适的PCR八连管，放入铝制样品池14中，八连管上标号1对应上位机中的通道1，安放好样品容器8后，合上外壳遮光盖7，确定没有漏光后，连接好电池区31的电池与荧光检测仪32，打开硬件部分的电源开关，使荧光激发光源等部件进入工作状态，仪器运行状态指示灯4显示橙色；

3)系统初始化：在上位机模块中设置完成荧光激发光源驱动通道的选择、反应温度、检测时间、LED驱动电流等检测条件参数，确认参数后使硬件部分回复到初始状态(本实施例中选择通道4、反应温度设置为65℃、检测时间为45min、LED驱动电流设置为20mA)；

4)扩增及检测：对当前处于检测位置的待测样进行加热，同时检测荧光信号强度，连通加热元件加热样品池14使得样品容器8中的反应液达到LAMP反应温度65℃，打开荧光激发光源13照射此溶液，激发荧光染料产生荧光，荧光接收器接收产生的荧光强度信号，获得扩增反应数据，仪器运行状态指示灯4显示绿色；

5)扩增反应数据采集与显示：加热元件从室温加热至设定反应温度时，荧光接收器按一定频率将接收的荧光强度信号通过蓝牙模块、USB、UART等方式传送给上位机(本实施例中采用蓝牙模块传输)，上位机模块将接收的原始扩增数据实时显示，如图10所示；

6)溶解曲线分析：部分检测实验为了验证扩增产物是否为目标产物，需要进行溶解曲线分析，在扩增反应完成后，在上位机模块中将反应温度设置为95℃，加热时间设置为5min，对反应液中酶进行灭火，该过程中不采集荧光强度信号，而后待仪器降温至50℃时重新升温至95℃，此阶段荧光接收器按一定频率将接收的荧光强度信号通过蓝牙模块、USB、UART等方式传送给上位机(本实施例中采用蓝牙模块传输)，上位机模块将接收的原始扩增数据实时显示；

7)数据处理与保存：上位机模块对采集得到的荧光强度信号数据进行滤波、归一化等处理，并根据相关算法计算得到检测结果，然后显示、保存：

①将接收的原始扩增数据采用算术平均滤波法进行滤波，连续取5个采样值进行算术平均运算，排除随机干扰信号；

②将滤波后的数据进行归一化处理——即将背景信号剔除，先对背景期的数据进行最小二乘法拟合，然后将预估出的背景噪声从滤波后的数据中减掉；

③根据归一化处理后的荧光强度信号达到程序设定阈值所经过的扩增时间，判断待测液中是否含有目标物；

8)检查数据，善后处理，测量结束：上位机模块执行停止信号，加热模块和荧光检测模块处于停止运行状态，仪器运行状态指示灯4显示橙色，然后打开检测台，取出样品容器8，弃去使用过的一次性PCR八连管，关闭电源。

不计待测液配置时间，整个一轮检测，以八孔为例，包括待测样本扩增及检测的总时间可控制在30分钟之内，实现了高通量以及快速的检测；同时可更换式的发射滤光片与荧光激发光源13以及可选择大小的激发光源驱动电流，适用于不同荧光分析法，检测功能丰富；而且将检测装置和所需辅助工具集成在一个手提箱中，便于现场检测，可见本发明的技术效果显著突出。

上述具体实施方式是用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改版，都落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器，其特征在于：包括荧光检测仪(32)、试剂存储区、移液枪存储盒(29)、耗材存储盒(30)、电池盒(31)，上述五部分放置于手提箱(28)中；其中所述试剂存储区由试剂存储盒(22)和试剂存储盒盖(27)连接组成，试剂存储盒(22)和试剂存储盒盖(27)通过两侧安装的磁铁片(23)吸附；所述试剂存储盒(22)中开有多个离心管孔(24)，离心管孔(24)用于放置盛放低温存储试剂的离心管，所述试剂存储盒(22)顶端开有试剂存储盒注水口(25)，侧壁开有试剂存储盒水位限位孔(26)，以水作为冷冻介质；

所述荧光检测仪(32)包括仪器外壳(6)和安装于仪器外壳(6)内的样品架模块、控制电路模块、荧光检测模块、加热模块和上位机模块，仪器外壳(6)顶面开有缺口槽，缺口槽处安装样品架模块，样品架模块上端处于缺口槽，缺口槽上设置外壳遮光盖(7)封盖，样品架模块连接荧光检测模块，荧光检测模块、加热模块均与控制电路模块电气相连；

所述样品架模块包括铝制样品池(14)和样品容器(8)；铝制样品池(14)固定于缺口槽处下方，铝制样品池(14)顶面设有多个沿直线间隔排布的样品口，每个样品口用于放置样品容器(8)，样品容器(8)上端开口，样品容器(8)内盛有待检测样品；每个样品口为从上到下直径缩小的锥形孔，铝制样品池(14)底部侧面开有多个沿直线间隔排布的导光光纤孔，各个导光光纤孔分别和各个样品口对应连接相通，导光光纤孔水平深入导通到自身对应的样品口底部内；

所述的加热模块包括加热元件固定座(9)、加热元件和温度传感器，加热元件固定座(9)内置加热元件，加热元件几何中心与加热元件固定座(9)几何中心重合，加热元件固定座(9)与铝制样品池(14)开有导光光纤孔相对的侧面通过紧固件连接；铝制样品池(14)上还设有温度传感器定位孔(16)，温度传感器定位孔(16)处安装温度传感器，温度传感器检测铝制样品池(14)的温度进而控制加热元件加热调整样品口的样品容器(8)温度；

所述的荧光检测模块包括荧光激发光源(13)、荧光发射滤光片(21)、导光光纤(5)和荧光检测器；荧光激发光源固定盘(12)通过紧固件固定于铝制样品池(14)底部，荧光激发光源固定盘(12)底面安装有多个沿直线间隔排布的荧光激发光源(13)，各个荧光激发光源(13)分别和各个样品口对应，荧光激发光源(13)朝上并位于自身对应的样品口正下方，通过铝制样品池(14)内部通道照射到样品口内；每个导光光纤孔处通过第一光纤检测头安装座(10)连接一根导光光纤(5)的一端，各个导光光纤孔处的第一光纤检测头安装座(10)均被第一导光光纤固定盘(11)固定于铝制样品池(14)侧面，同时导光光纤孔内安装荧光发射滤光片(21)，发射滤光片中心波长值根据荧光分析方法选择；仪器外壳(6)底部内固定安装控制电路板(1)，各个导光光纤(5)另一端和控制电路板(1)上的第二导光光纤固定盘(2)连接，第二导光光纤固定盘(2)内的控制电路板(1)上安装荧光检测器，导光光纤(5)端部通过内嵌于第二导光光纤固定盘(2)的第二光纤检测头安装座(3)固定并对准荧光检测器感光面；

所述的荧光激发光源(13)采用功率可调的LED；

所述荧光检测器采用光电二极管，各个荧光检测器分别检测对应所述铝制样品池(14)中的各个样品口通道，不同样品口通道根据检测荧光波长选择不同的荧光检测器，或者选择宽检测波段的荧光检测器。

2.根据权利要求1所述的一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器，其特征在于：所述的铝制样品池(14)上还设有两个螺纹孔，紧固件通过两个螺纹孔将所述铝制样品池(14)固定于缺口槽；所述的荧光激发光源固定盘(12)上还设有荧光激发光源固定盘定位螺纹孔(17)，荧光激发光源固定盘定位螺纹孔(17)用于荧光激发光源固定盘与所述的铝制样品池(14)固定用。

3.根据权利要求1所述的一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器，其特征在于：所述的铝制样品池(14)底部侧面开设第一导光光纤固定盘定位凹槽(20)，第一导光光纤固定盘(11)通过两侧开设的第一导光光纤固定盘定位螺纹孔(19)及螺栓嵌装固定于第一导光光纤固定盘定位凹槽(20)中。

4.根据权利要求1所述的一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器，其特征在于：所述的荧光激发光源固定盘(12)安装有多个沿直线间隔排布的荧光激发光源定位圆孔(18)，每个荧光激发光源定位圆孔(18)处安装荧光激发光源(13)。

5.根据权利要求1所述的一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器，其特征在于：所述的仪器外壳(6)包括上外壳和下外壳，上外壳和下外壳之间通过壳固定紧固件(15)连接固定呈一体。

6.根据权利要求1所述的一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器，其特征在于：所述控制电路模块包括电源模块、主控模块、荧光激发光源驱动模块、荧光强度信号调理模块、温度控制模块、过热保护模块和通讯模块；电源模块与主控模块、荧光激发光源驱动模块、荧光强度信号调理模块、温度控制模块、过热保护模块和通讯模块电气连接进行供电，主控模块分别与荧光激发光源驱动模块、荧光强度信号调理模块、温度控制模块、过热保护模块、通讯模块电连接，荧光激发光源驱动模块电连接荧光激发光源(13)，荧光强度信号调理模块电连接荧光检测器，温度控制模块电连接温度传感器和加热元件，过热保护模块安装于加热元件，通讯模块与上位机模块连接。

7.根据权利要求6所述的一种底照式核酸等温扩增检测便携仪器，其特征在于：所述主控模块还包括仪器运行状态指示灯(4)，仪器运行状态指示灯(4)安装于仪器外壳(6)外表面，用于显示工作状态。

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