CN109797172A - 一种与外源性核酸原位合成三维结构的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米金属单质或纳米金属合金与外源性核酸原位合成三维结构的方法。具体是将一定浓度的纳米金属单质或纳米金属合金与某一核酸溶液，依次添加到含完全培养基的细胞悬液中。将混合液移入培养瓶孵育，经过活细胞的原位合成之后破碎细胞，提取细胞质产物，即可得到一种基于纳米金属单质或纳米金属合金与外源性核酸原位合成的三维结构。该方法可实现外源性DNA片段、长链非编码RNA、微小RNA、环状RNA片段等核酸片段与纳米金属单质或纳米合金单质的三维自组装。其组装产物“核酸‑金属纳米材料”可用于靶向肿瘤细胞，实时高分辨追踪成像与精准定位。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA等核酸与纳米金属材料的体内自组装方法,具体涉及一种基于纳米金属单质或纳米金属合金与外源性核酸原位合成三维结构的方法。
背景技术
DNA等核酸作为遗传密码的载体，因其精确的碱基互补配对，可作为很好的自组装材料。目前的DNA体外自组装已经实现了对不同图案的描绘，同时也实现了不同维度的组装。利用范德华力，共价键，静电作用力，电荷转移作用等分子之间的作用力也能够完成DNA与不同纳米材料的体外自组装。然而，对于DNA与其他物质自组装后的纳米颗粒并无太多实质性的应用，同时这些合成方式的条件都较为苛刻，比如需要保持高温、较窄的酸碱范围、复杂的编程。本发明改进了合成工艺，在常温，宽酸碱范围的条件下，可以大量原位合成基于纳米金属单质或纳米金属合金与外源性核酸合成三维结构。所述三维结构可靶向肿瘤细胞，在肿瘤成像与靶向治疗中有巨大的潜在应用价值。
发明内容
技术问题：本发明利用一种基于纳米金属单质或纳米金属合金与外源性核酸原位合成三维结构的方法，合成了以金属单质或合金纳米颗粒—核酸片段的三维结构。本发明合成的纳米结构，可以直接追踪外源性的DNA片段、长链非编码RNA、微小RNA、环状RNA等核酸片段。同时利用所添加核酸片段的特征，增强了纳米材料抑制肿瘤细胞增殖和侵袭转移的作用。
技术方案：本发明基于纳米金属单质或纳米金属合金与外源性核酸原位合成三维结构，该方法以肿瘤细胞作为载体，依次添加纳米金属单质或纳米金属合金与外源性核酸，具体进行如下操作：
步骤1.将纳米金属单质或纳米金属合金与去离子水的混合体系的pH值调至6.8-8.0，并灭菌，得到无菌混合体系；
步骤2.用细胞完全培养基将步骤1中无菌混合体系调至终浓度，同时加入用去离子水稀释的核酸片段，使形成的混合液终浓度达到要求；
步骤3.用步骤2中的混合液悬浮细胞，等待细胞贴壁后，继续培养12h-96h,期间步骤2中的混合液正常换液；
步骤4.将细胞破碎，提取细胞质中生成好的产物，即可得到一种基于纳米金属单质或纳米金属合金与外源性核酸原位合成的三维结构。
所述核酸片段包括DNA片段、RNA片段或几种核酸片段的组合；
所述肿瘤细胞来源于动物但不限于体内，体外。
所述的混合液，其特征在于所述的纳米金属单质或纳米金属合金的去离子水混合体系与核酸片段的添加顺序可以调换。
所述的步骤2用细胞完全培养基将步骤1中无菌混合体系调至终浓度为1μmol/L-1000μmol/L。
所述形成的混合液终浓度为10nmol/L-30mmol/L。
有益效果：本发明合成的纳米结构，可以直接追踪外源性的DNA片段、长链非编码RNA、微小RNA、环状RNA等核酸片段。同时利用所添加核酸片段的特征，增强了纳米材料抑制肿瘤细胞增殖和侵袭转移的作用。此外，使用本发明所述方法合成的纳米三维结构，集肿瘤成像与靶向治疗于一体，为基因药物的体内运送提供了新方法。
具体实施方式
实施例1：利用金纳米簇和长链非编码RNA—Pvt1oncogene(PVT1)原位合成三维结构的自组装方法：
将去离子水溶解的PVT1片段添加到宫颈癌细胞悬液中(所用细胞为Hela)，使得PVT1的终浓度是10nmol/L；接着继续在Hela细胞悬液中添加现配的pH＝6.8的金纳米簇溶液，使得金纳米簇的终浓度为1000μmol/L。将细胞悬液放入培养瓶中(37℃，5％CO2)孵育72h，期间每隔24h用含有10nmol/L的PVT1，1000μmol/L的金纳米簇溶液的完全培养基给细胞换液。将细胞质破碎后，用原子力显微镜等实验工具可以观察到金纳米簇和PVT1原位生成的纳米三维结构，同时用共聚焦显微镜可以追踪三维纳米结构在细胞或体内的定位。
实施例2：利用金银合金纳米簇和鲱鱼精DNA原位合成三维结构的自组装方法：
将鲱鱼精DNA片段添加到肺癌细胞系细胞悬液中(所用细胞为A549)，使得鲱鱼精DNA的终浓度是30mmol/L；接着继续在A549细胞悬液中添加pH＝7.2的金银合金纳米簇溶液，使得金银合金纳米簇的终浓度为1μmol/L。将细胞悬液放入培养瓶中(37℃，5％CO2)孵育36h，期间每隔24h用含有30m mol/L的鲱鱼精DNA片段，1μmol/L的金银合金纳米簇溶液的完全培养基给细胞正常换液。借助于原子力显微镜等实验工具可以观察金银合金纳米簇和鲱鱼精DNA原位生成的三维结构，同时用共聚焦显微镜可以追踪三维纳米结构在细胞或体内的定位。
实施例3：运用原位合成金纳米簇和鲱鱼精DNA原位合成三维结构进行肿瘤细胞靶向：
将鲱鱼精DNA片段分别添加到乳腺癌细胞悬液(所用癌细胞为MDA-MB-231)和正常细胞悬液(所用细胞为LO2)中，使得鲱鱼精DNA的终浓度均为10nmol/L；接着继续在上述两种细胞悬液中添加pH＝7.2的氯金酸溶液，使得氯金酸在这一溶液中的终浓度为1000μmol/L。将两种细胞悬液分别放入两个培养瓶中(37℃，5％CO2)孵育48h，期间每隔24h用含有10nmol/L的鲱鱼精DNA片段溶液，1000μmol/L的氯金酸溶液的完全培养基给细胞换液。在共聚焦显微镜488nm光源处，可以观察到MDA-MB-231细胞内有绿色荧光，而LO2细胞无绿色荧光；将细胞质破碎后，用原子力显微镜可以观察到MDA-MB-231细胞内有原位合成的金纳米簇和鲱鱼精DNA的自组装纳米三维结构，而LO2细胞无此结构。说明原位合成金纳米簇和鲱鱼精DNA原位合成的三维结构可靶向肿瘤细胞。
实施例4：运用原位合成银纳米簇和长链非编码RNA—Pvt1oncogene(PVT1)原位合成三维结构进行肿瘤细胞靶向：
将PVT1片段分别添加到鼻咽癌细胞悬液(所用癌细胞为5-8F)和正常细胞悬液(所用细胞为AT2)中，使得PVT1片段的终浓度均为50nmol/L；接着继续在上述两种细胞悬液中添加pH＝7.6的硝酸银溶液，使得硝酸银在这一溶液中的终浓度为100μmol/L。将两种细胞悬液分别放入两个培养瓶中(37℃，5％CO2)孵育96h，期间每隔24h用含有50nmol/L的PVT1片段溶液，100μmol/L的硝酸银溶液的完全培养基给细胞换液。利用共聚焦显微镜可以观察到5-8F细胞内有荧光，而AT2细胞无荧光；将细胞质破碎后，用原子力显微镜可以观察到5-8F细胞内有原位合成的银纳米簇和PVT1片段的自组装纳米三维结构，而AT2细胞内无此结构。说明原位合成银纳米簇和PVT1片段原位合成的三维结构可靶向肿瘤细胞。
Claims (6)
1.一种与外源性核酸原位合成三维结构的方法，其特征在于该方法以肿瘤细胞作为载体，依次添加纳米金属单质或纳米金属合金与外源性核酸，具体进行如下操作：
步骤1.将纳米金属单质或纳米金属合金与去离子水的混合体系的pH值调至6.8-8.0，并灭菌，得到无菌混合体系；
步骤2.用细胞完全培养基将步骤1中无菌混合体系调至终浓度，同时加入用去离子水稀释的核酸片段，使形成的混合液终浓度达到要求；
步骤3.用步骤2中的混合液悬浮细胞，等待细胞贴壁后，继续培养12h-96h,期间步骤2中的混合液正常换液；
步骤4.将细胞破碎，提取细胞质中生成好的产物，即可得到一种基于纳米金属单质或纳米金属合金与外源性核酸原位合成的三维结构。
2.根据权利要求1所述的一种与外源性核酸原位合成三维结构的方法，其特征在于所述核酸片段包括DNA片段、RNA片段或几种核酸片段的组合。
3.根据权利要求1所述的一种与外源性核酸原位合成三维结构的方法，其特征在于所述肿瘤细胞来源于动物但不限于体内，体外。
4.根据权利要求1所述的一种与外源性核酸原位合成三维结构的方法，其特征在于所述的混合液，其特征在于所述的纳米金属单质或纳米金属合金的去离子水混合体系与核酸片段的添加顺序可以调换。
5.根据权利要求1所述的一种与外源性核酸原位合成三维结构的方法，其特征在于所述的步骤2用细胞完全培养基将步骤1中无菌混合体系调至终浓度为1μmol/L-1000μmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种与外源性核酸原位合成三维结构的方法，其特征在于所述形成的混合液终浓度为10nmol/L-30mmol/L。
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| CN111235216A (zh) * | 2020-02-26 | 2020-06-05 | 东南大学 | 一种智能生物探针的致病微生物精准检测及杀灭方法 |
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