CN109796437B

CN109796437B - 具有ar和hdac双重抑制作用的乙内酰脲类和乙内酰硫脲类化合物及用途

Info

Publication number: CN109796437B
Application number: CN201910142230.4A
Authority: CN
Inventors: 孟祥国; 毕思举; 周兆丽; 黄钢; 徐一新; 林快乐; 周伟澄; 徐晨钦; 田佩川; 李熙
Original assignee: Shanghai University of Medicine and Health Sciences
Current assignee: Shanghai University of Medicine and Health Sciences
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2039-02-26
Also published as: CN109796437A

Abstract

本发明公开了一种具有AR和HDAC双重抑制作用的乙内酰脲类和乙内酰硫脲类化合物，其结构式如下所示：

Description

具有AR和HDAC双重抑制作用的乙内酰脲类和乙内酰硫脲类化合物及用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种具有AR和HDAC双重抑制作用的乙内酰脲类和乙内酰硫脲类化合物及用途。

背景技术

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤之一，据美国2017年肿瘤数据年报统计，PCa是美国男性第一高发恶性肿瘤，占到美国男性新发肿瘤的19％，死亡率也高居第二。在国内，随着生活节奏的加快和生活水平的提高，PCa发病率也不容乐观，且死亡率亦呈逐年上升的趋势。另外，由于我国PCa筛查工作相对滞后，大多数初诊患者已为晚期。此癌是进展比较迅速的恶性肿瘤，得不到早起诊治，从发现症状开始，平均生存期只有3-5年。早期的PCa可以通过手术或化疗得到有效的控制。但对于晚期的PCa，只能通过基于雄激素及其受体的抗雄激素疗法，即手术去势治疗或抗雄激素药物治疗。但是经此治疗之后，绝大多数患者会进展为难治的去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。

PCa发生的根本原因是AR信号通路的异常激活，AR信号通路再次激活公认的基本分子机制是AR的突变和过度表达，所以AR依然是治疗前列腺癌的关键靶标。

以服用抗雄激素药物治疗前列腺癌的方法将更加侧重于选择性和较低的副作用，据该理论发现的化合物已多篇文献报道。然而，目前临床上使用的药物，例如以比卡鲁胺为代表的第一代AR拮抗剂，只对雄激素敏感的前列腺癌有治疗效果，对于CRPC并没有作用。而且第一代AR拮抗剂肝毒性大，且具有拮抗剂撤除综合症(antiandrogen withdrawalsyndrome,AWS)，更为棘手的是AWS可使原先的拮抗剂变成激动剂，使AR信号通路再次激活，促使病情恶化转为CRPC。大多数抗雄激素对难治性前列腺癌的活性缺乏部分是由于当AR过度表达时，它们的拮抗活性较弱且激动剂活性较强。第二代AR拮抗剂仅有恩杂鲁胺(enzalutamide)和阿帕鲁按(apalutamide)由FDA批准上市用于治疗转移性CRPC 患者，其中enzalutamide具有较大的癫痫副作用，较后上市的apalutamide相比enzalutamide虽然具有更好的抑制活性，以及降低了癫痫副作用的发生概率，但是对于突变型AR导致的CRPC患者，依然达不到预期的效果。因此，结构新颖的AR拮抗剂仍需不断开发与完善，特别是针对突变型的AR从发生机制和应对策略上的研究。

HDAC在染色质重构、基因表达调控、细胞代谢、癌症以及衰老等多种生命过程中发挥着重要作用.目前人们已经针对HDAC的功能、活性调控以及结构指导下的药物设计展开了广泛的研究，并取得了一定的成果。两个蛋白家族参与控制乙酰化程度，组蛋白乙酰转移酶(HATs)将乙酰基转移到组蛋白的赖氨酸上，组蛋白去乙酰化酶(HDACs)去除它。Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅳ类中共有11种已知的HDAC同工酶，其与活性部位结合催化Zn2+。在许多癌症中，包括前列腺癌，已经观察到存在异常的转录沉默，这是HDAC酶异常高丰度的结果。HDAC活性的上调与关键的癌抑制蛋白的下调有关。

近年来，HDAC抑制已被证实为临床上可行的癌症疗法。目前已开发的 HDAC抑制剂具有高效性和低细胞毒性等特点，已有多种抑制剂开始了临床试验阶段，并且已经有三种HDAC抑制剂类药物被FDA批准用于治疗不同类型的淋巴瘤.然而目前的HDAC抑制剂大部分是广谱抑制剂，它们缺乏同种型，组织和细胞类型选择性，导致毒性和低效力。选择性地将HDAC抑制剂靶向患病细胞的方法可以改善许多这些缺点。因此开发更为有效的、具有细胞选择性以及HDAC亚型特异性的抑制剂是面临的挑战之一。

当前，针对非甾体AR拮抗剂的研发多为现有药物基础上的结构修饰，以提高化合物的抑制活性、选择性、改善化合物的药代动力学性质等，例如乙内酰硫脲衍生物主要针对恩杂鲁胺的芳环取代基、芳环种类和硫脲环取代基进行改造，但对AR抑制活性的提高十分有限。Gryder BE等报道组蛋白去乙酰基酶抑制剂 (HDACi)结构改造的文章中，报道在HDACi中引入氰基尼鲁米特结构片段使化合物对AR和HDAC的抑制活性均有明显的提高(ACS Chem.Biol.2013,8, 2550-2560)，提示AR拮抗剂和HDAC抑制剂在抗实体肿瘤方面具有一定的协同作用。考虑到第一代AR拮抗剂具有较大的肝毒性，采用二代AR拮抗剂具有降低肝毒性的作用，其次，apalutamide与enzalutamide相比，具有更好的抑制活性，且其在中枢神经系统中的浓度比恩杂鲁胺低4倍，降低了癫痫副作用的发生概率。因此我们设计以二代AR拮抗剂apalutamide为母环，然后利用电子等排原理，通过药效团迁移引入HDAC抑制剂的药效团，进行双靶点的药物设计。

因此，本发明的一个目的是提供芳基乙内酰脲衍生的AR和HDAC的双重抑制剂，其具有改善的前列腺恶性肿瘤选择性。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种具有AR和HDAC双重抑制作用的乙内酰脲类和乙内酰硫脲类化合物及用途，所述的这种具有AR和 HDAC双重抑制作用的乙内酰脲类和乙内酰硫脲类化合物及用途要解决现有技术中对由AR的过度表达和AR的基因突变导致的去势抵抗性前列腺癌低效力的问题。

本发明提供了一种具有AR和HDAC双重抑制作用的乙内酰脲类和乙内酰硫脲类化合物，其结构式如下所示：

其中：

Ar为未取代或取代的C6-10芳基或C3-10杂芳基；所述取代是指被选自下组的一种或多种取代基所取代：羟基、卤素、-C1-6烷基或-O-C1-6烷基；

A为连接Ar和B的连接基团；

B为烷基间隔基团；

ZBG为锌离子结合基团；

R1和R2独立地选自包含8或少于8个碳原子且选自下列的基团：烷基、包括卤代烷基的取代的烷基，以及与它们相连的碳原子一起为环烷基或取代的环烷基；

W选自O或S；

X选自氰基或硝基；

Y选自三氟甲基或碘。

进一步的，Ar选自：

符号

表明可选择连接乙内酰脲基团的氮原子和A。

进一步的，A选自：

进一步的，B为C1至C8的直链烷基。

进一步的，ZBG为异羟肟酸、N-甲酰基羟基胺、羧酸盐、硫醇、二硫醇、三硫代碳酸盐、苯甲酰胺类、三氟甲基酮、环氧化物、环氧酮或2-酮酰胺。

进一步的，R1和R3独立地为C1到C8的烷基；或共同组成C3-C8的环烷基。

进一步的，所述化合物的结构式为：

本发明还提供了上述的化合物或中间体的药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、异构体或前药。

本发明还提供了一种药物组合物，包含上述的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、异构体或前药，和药学上可接受的赋形剂。

进一步的，所述药物组合物的形式为水性分散剂、液体、啫喱、糖浆、西也剂、药浆、悬浮液、气雾剂、控释剂、速溶剂、泡腾剂、冻干剂、片剂、粉末、药丸、糖衣丸、胶囊、延迟释放剂、延长释放剂、脉冲控释剂、多微粒剂或立即释放剂。

本发明还提供了上述的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、异构体或前药作为雄激素受体和组蛋白去乙酰化酶的双重抑制剂的用途。

本发明还提供了上述的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、异构体或前药在制备用于治疗与雄激素受体和组蛋白去乙酰化酶有关的肿瘤的药物中的用途。

在另一优选例中，Ar为

在另一优选例中，A为

在另一优选例中，R1和R2与它们相连的碳原子一起共同为环丁基，W为S， X为氰基，Y为三氟甲基。

本发明提供了一系列的芳基乙内酰脲类和乙内酰硫脲类化合物及包含此类化合物的药物组合物。

本发明还提供上述化合物及其药物组合物在制备用于预防和治疗与雄激素受体与HDAC有关的肿瘤的药物中的用途。

本发明所述化合物通过竞争性地与AR结合，拮抗雄激素，达到抑制AR的效果，进而对前列腺癌有效；另一方面，HDAC的活性与肿瘤的发展密切相关，本发明化合物首先与AR结合，选择性累积，然后释放结合第二靶标HDAC，增强化合物的抗肿瘤活性。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明公开了乙内酰脲和乙内酰硫脲类化合物和中间体。采用上述的中间体制备的药物具有抗前列腺癌的效果，为抗前列腺癌药物的研究提供了一个新方向，对开发抗前列腺癌药物具有重要意义。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不一一赘述。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现一系列新的乙内酰脲类和乙内酰硫脲类化合物且这些化合物对雄激素受体和组蛋白去乙酰化酶具有很好的双重抑制活性。在此基础上完成了本发明。

以上说明的式(I)化合物可使用标准的合成技术或公知的技术与文中结合的方法来合成。此外，在此提到的溶剂，温度和其它反应条件可以改变。

用于式(I)化合物的合成的起始物料可以由合成或从商业来源上获得。本文所述的化合物和其它具有不同取代基的有关化合物可使用公知的技术和原料来合成。化合物制备的一般方法可通过使用适当的试剂和在此提供的分子式中引入不同基团的条件来改变。

本文所述的式(I)化合物以如下方案所示的合成路线合成，在一些实施方案中，可通过下述方法制备本文所述的化合物。以下方法和实施例是为了说明这些方法。这些流程和实施例不应以任何方式被解释为对本发明的限制。也可使用本领域技术人员已知的标准合成技术合成本文所述化合物，或者组合使用本领域已知方法和本文所述方法。

化合物(I)的合成方法可包括如下步骤：

实施例1化合物Ⅰ-3的制备

步骤A中间体A3-1的合成

氮气保护下，控温-10～-5℃，投入中间体5(2g，4.3mmol)、HATU(3.27g，8.6mmol)、DMF(20ml)和DIPEA(1.39g，10.7mmol)，搅拌20min。投入4-氨基丁酸甲酯盐酸盐(0.70g，4.3mmol)，搅拌1.5h。后加入水，二氯甲烷提取，水洗，饱和食盐水洗，干燥，浓缩，柱层析得2.18g，收率90.1％。MS：564.16(M+1) ⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ9.22(s，1H)，8.76(s，1H)，8.58(t， J＝8Hz，1H)，7.82(t，J＝8Hz，1H)，7.47(d，J＝8Hz，1H)，7.39(d， J＝8Hz，1H)，3.61(s，1H)，3.31(m，1H)，2.61-2.69(m，2H)，2.50(m， 2H)，2.36-2.44(m，2H)，1.91-2.05(m，1H)，1.75-1.96(m，2H)，1.52-1.66 (m，1H)

步骤B中间体A3-2的合成

室温，投入A3-1(2.1g，3.7mmol)，3：1的甲醇：水溶液(125ml)，滴入15％的KOH溶液(5.6ml)，40℃搅拌反应3h。后自然降至室温，加入水，乙酸，白色固体析出，抽滤得1.87g，收率91.2％。MS：550.18(M+1)⁺，¹H-NMR(400 MHz，DMSO-d₆)，δ9.22(d，J＝0Hz，1H)，8.76(d，J＝4Hz，1H)，8.65(t， J＝8Hz，1H)，7.82(t，J＝8Hz，1H)，7.46(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，7.38 (dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，3.25-3.34(m，2H)，2.60-2.72(m，2H)，2.50(m， 2H)，2.28(t，J＝8Hz，2H)，1.92-2.04(m，1H)，1.71-1.82(m，2H)，1.55-1.67 (m，1H)

步骤C化合物Ⅰ-3的合成

氮气保护下，控温-10℃，投入A3-2(1g，1.82mmol)、HATU(0.83g，2.18mmol)、 DMF(20ml)和DIPEA(0.71g，5.46mmol)，搅拌15min，投入盐酸羟胺(0.19g， 2.73mmol)，搅拌1h。后加入水，乙酸乙酯提取，水洗，饱和食盐水洗，干燥，浓缩，柱层析得化合物240mg，收率23.3％。MS：565.09(M+1)⁺，¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)，δ10.40(s，1H)，9.23(d，J＝4Hz，1H)，8.76(d， J＝4Hz，1H)，8.71(s，1H)，8.58(t，J＝8Hz，1H)，7.83(t，J＝8Hz，1H)， 7.47(dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，7.39(dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，3.23-3.30(m， 2H)，2.61-2.72(m，2H)，2.50(m，2H)，1.92-2.10(m，3H)，1.70-1.83(m， 2H)，1.57-1.57(m，1H)

实施例2化合物Ⅰ-1的合成

化合物Ⅰ-1的合成通过类似于实施例1中所述步骤合成，不同点在于用2- 氨基乙酸甲酯盐酸盐替换4-氨基丁酸甲酯盐酸盐。MS:551.10(M+1)⁺，¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)，δ10.35(s，1H)，9.23(d，J＝0Hz，1H)，8.75(d， J＝4Hz，1H)，8.67(d，J＝4Hz，1H)，8.55(t，J＝8Hz，1H)，7.81(t，J ＝8Hz，1H)，7.46(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，7.38(dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，4.09(s，2H)，2.60-2.72(m，2H)，2.50(m，2H)，1.93-2.06(m，1H)，1.44-1.66 (m，1H)

实施例3化合物Ⅰ-2的合成

化合物Ⅰ-2的合成通过类似于实施例1中所述步骤合成，不同点在于用3- 氨基丙酸甲酯盐酸盐替换4-氨基丁酸甲酯盐酸盐。MS:565.13(M+1)⁺，¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)，δ10.35(s，1H)，9.23(d，J＝0Hz，1H)，8.75(d， J＝4Hz，1H)，8.67(d，J＝4Hz，1H)，8.55(t，J＝8Hz，1H)，7.81(t，J ＝8Hz，1H)，7.46(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，7.38(dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，3.68(t，J＝8Hz，2H)，2.60-2.72(m，4H)，2.50(m，2H)，1.93-2.06(m， 1H)，1.44-1.66(m，1H)

实施例4化合物Ⅰ-4的合成

化合物Ⅰ-4的合成通过类似于实施例1中所述步骤合成，不同点在于用5- 氨基戊酸甲酯盐酸盐替换4-氨基丁酸甲酯盐酸盐。MS:579.15(M+1)⁺，¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)，δ10.35(s，1H)，9.23(d，J＝0Hz，1H)，8.75(d， J＝4Hz，1H)，8.67(d，J＝4Hz，1H)，8.55(t，J＝8Hz，1H)，7.81(t，J ＝8Hz，1H)，7.46(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，7.38(dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，3.21-3.30(m，2H)，2.60-2.72(m，2H)，2.50(m，2H)，1.93-2.06(m，3H)， 1.44-1.66(m，2H)

实施例5化合物Ⅰ-5的合成

化合物Ⅰ-5的合成通过类似于实施例1中所述步骤合成，不同点在于用6- 氨基己酸甲酯盐酸盐替换4-氨基丁酸甲酯盐酸盐。MS：593.22(M+1)⁺，¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)，δ10.35(s，1H)，9.23(d，J＝4Hz，1H)，8.76(d， J＝4Hz，1H)，8.67(d，J＝4Hz，1H)，8.53(t，J＝4Hz，1H)，7.81(t，J ＝8Hz，1H)，7.46(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，7.38(dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，3.21-3.29(m，2H)，3.61-3.72(m，2H)，2.50(m，2H)，1.92-2.05(m，3H)， 1.46-1..55(m，5H)，1.27-1.39(m，2H)

实施例6化合物Ⅰ-6的合成

化合物Ⅰ-6的合成通过类似于实施例1中所述步骤合成，不同点在于用7- 氨基庚酸甲酯盐酸盐替换4-氨基丁酸甲酯盐酸盐。MS：607.24(M+1)⁺，¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)，δ10.33(s，1H)，9.22(d，J＝0Hz，1H)，8.75(d，J＝0Hz，1H)，8.52(t，J＝8Hz，1H)，7.80(t，J＝8Hz，1H)，7.45(dd， J＝4Hz，12Hz，1H)，7.38(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，3.22-3.30(m，2H)，2.60-2.71 (m，2H)，2.50(m，2H)，1.90-2.02(m，3H)，1.44-1.67(m，5H)，1.21-1.39 (m，4H)

实施例7化合物Ⅰ-7的合成

化合物Ⅰ-7的合成通过类似于实施例1中所述步骤合成，不同点在于用8- 氨基辛酸甲酯盐酸盐替换4-氨基丁酸甲酯盐酸盐。MS：621.26(M+1)⁺，¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)，δ10.33(s，1H)，9.22(d，J＝0Hz，1H)，8.75(d， J＝0Hz，1H)，8.52(t，J＝8Hz，1H)，7.80(t，J＝8Hz，1H)，7.45(dd， J＝4Hz，12Hz，1H)，7.38(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，3.22-3.30(m，2H)，2.60-2.71 (m，2H)，2.50(m，2H)，1.90-2.02(m，3H)，1.44-1.67(m，5H)，1.19-1.42 (m，6H)

实施例8化合物Ⅰ-8的合成

化合物Ⅰ-7的合成通过类似于实施例1中所述步骤合成，不同点在于用9- 氨基壬酸甲酯盐酸盐替换4-氨基丁酸甲酯盐酸盐。MS：635.30(M+1)⁺，¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)，δ10.33(s，1H)，9.22(d，J＝0Hz，1H)，8.75(d， J＝0Hz，1H)，8.52(t，J＝8Hz，1H)，7.80(t，J＝8Hz，1H)，7.45(dd， J＝4Hz，12Hz，1H)，7.38(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，3.22-3.30(m，2H)，2.60-2.71 (m，2H)，2.50(m，2H)，1.90-2.02(m，3H)，1.44-1.67(m，5H)，1.08-1.39 (m，8H)

实施例9化合物Ⅱ-3的合成

步骤A中间体2的合成

氮气保护下，控温0℃，依次投入原料1(5g，10.8mmol)、DMF(50ml)、 HOBt(2.2g，16.1mmol)，分批投入EDCI(3.1g，16.1mmol)，搅拌45min，投入炔丙胺(0.89g，16.1mmol)，室温搅拌1h。后加入水，二氯甲烷提取，依次用水和饱和食盐水洗，干燥，浓缩，柱层析得白色固体4.57g，收率84.5％。MS：502.1 (M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ9.23(d，J＝4Hz，1H)，9.00 (t，J＝4Hz，1H)，8.76(d，J＝4Hz，1H)，7.85(t，J＝12Hz，1H)，7.49 (dd，J＝4Hz，12Hz，1H)，7.41(dd，J＝4Hz，12Hz，1H)，4.05-4.13(m，2H)， 3.16(t，J＝4Hz，1H)，2.60-2.72(m，2H)，2.50(m，2H)，1.92-2.07(m， 1H)，1.54-1.66(m，1H)

步骤B中间体B3-2的合成

室温，氮气保护，投入中间体2(1g，2mmol)，原料B3-1(0.93g，2.4mmol)， DMSO(15ml)，DIPEA(0.52g，4mmol)，CuI(0.19g，1mmol)。搅拌1h。后加入150ml DCM，用1:4的氨水：饱和氯化铵水溶液洗，饱和食盐水洗，干燥，浓缩，柱层析得白色固体。MS：910.32(M+23)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.34(s，1H)，9.23(d，J＝4Hz，1H)，9.04(t，J＝8Hz，1H)，8.76(d， J＝0Hz，1H)，7.84-7.91(m，1H)，7.49(dd，J＝0Hz，12Hz，1H)，7.41(dd， J＝4Hz，8Hz，1H)，7.22-7.38(m，15H)，4.54(d，J＝4Hz，2H)，4.07(t， J＝8Hz，2H)，2.60-2.72(m，2H)，2.50(m，2H)，1.91-2.04(m，1H)，1.79-1.89 (m，2H)，1.68-1.79(m，2H)，1.52-1.63(m，1H)

步骤C化合物Ⅱ-3的合成

控0℃，投入中间体B3-2(1g，1.1mmol)，二氯甲烷45ml，三异丙基硅烷 (1ml)，加入三氟乙酸(1ml)，加入三异丙基硅烷(4ml)，搅拌30min。后加入 50ml水，用饱和碳酸氢钠溶液调PH为6，用30:1的二氯甲烷：甲醇混合溶液提取，饱和食盐水洗，干燥，浓缩，柱层析得342mg类白色固体，收率46.6％。 MS：646.42(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ10.40(s，1H)， 9.22(d，J＝4Hz，1H)，9.04(t，J＝8Hz，1H)，8.75(d，J＝0Hz，1H)，8.72 (s，1H)，8.01(s，1H)，7.87(t，J＝8Hz，1H)，7.48(dd，J＝0Hz，12Hz， 1H)，7.40(d，8Hz，1H)，4.55(d，J＝4Hz，2H)，4.36(t，J＝8Hz，2H)， 2.59-2.75(m，2H)，2.50(m，2H)，1.90-2.10(m，5H)，1.51-1.66(m，1H)

实施例10化合物Ⅱ-1的合成

化合物Ⅱ-1的合成通过类似于实施例9中所述步骤合成，不同点在于用原料 B1-1代替原料B3-1。MS：618.40(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.37(s，1H)，9.22(d，J＝4Hz，1H)，9.05(t，J＝8Hz，1H)，8.76(d， J＝4Hz，1H)，8.68(s，1H)，7.99(s，1H)，7.87(t，J＝8Hz，1H)，7.48(dd， J＝0Hz，8Hz，1H)，7.40(dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，5.60(s，2H)，4.55(d， J＝4Hz，2H)，2.60-2.73(m，2H)，2.50(m，2H)，1.91-2.06(m，1H)，1.53-1.66 (m，1H)

实施例11化合物Ⅱ-2的合成

化合物Ⅱ-2的合成通过类似于实施例9中所述步骤合成，不同点在于用原料 B2-1代替原料B3-1。MS：632.43(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.37(s，1H)，9.22(d，J＝4Hz，1H)，9.05(t，J＝8Hz，1H)，8.76(d， J＝4Hz，1H)，8.68(s，1H)，7.99(s，1H)，7.87(t，J＝8Hz，1H)，7.48(dd， J＝0Hz，8Hz，1H)，7.40(dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，4.01(t，J＝8Hz，2H)，2.78(d，J＝8Hz，2H)，2.60-2.73(m，2H)，2.50(m，2H)，1.91-2.06(m，1H)， 1.53-1.66(m，1H)

实施例12化合物Ⅱ-4的合成

化合物Ⅱ-4的合成通过类似于实施例9中所述步骤合成，不同点在于用原料 B4-1代替原料B3-1。MS：660.21(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.37(s，1H)，9.22(d，J＝4Hz，1H)，9.05(t，J＝8Hz，1H)，8.76(d，J＝4Hz，1H)，8.68(s，1H)，7.99(s，1H)，7.87(t，J＝8Hz，1H)，7.48(dd， J＝0Hz，8Hz，1H)，7.40(dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，4.55(d，J＝4Hz，2H)4.35(t，J＝8Hz，2H)，2.60-2.73(m，2H)，2.50(m，2H)，1.91-2.06(m，3H)， 1.72-1.88(m，2H)，1.53-1.66(m，1H)，1.40-1.53(m，2H)

实施例13化合物Ⅱ-5的合成

化合物Ⅱ-5的合成通过类似于实施例9中所述步骤合成，不同点在于用原料 B5-1代替原料B3-1。MS：674.43(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.33(s，1H)，9.23(d，J＝4Hz，1H)，8.04(t，J＝8Hz，1H)，8.76(d， J＝4Hz，1H)，8.66(s，1H)，，8.00(s，1H)，7.87(t，J＝8Hz，1H)，7.48 (dd，J＝4Hz，12Hz，1H)，7.40(dd，J＝0Hz，8Hz，1H)，4.55(d，J＝4Hz， 2H)，4.34(t，J＝8Hz，1H)，2.60-2.73(m，2H)，2.51-2.59(m，2H)，1.89-2.04 (m，3H)，1.75-1.87(m，2H)，1.46-1.66(m，3H)，1.17-1.31(m，2H)

实施例14化合物Ⅱ-6的合成

化合物Ⅱ-6的合成通过类似于实施例9中所述步骤合成，不同点在于用原料 B6-1代替原料B3-1。MS：688.20(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.32(s，1H)，9.1(s，1H)，9.04(s，1H)，8.75(s，1H)，8.65(s，1H)， 7.99(s，1H)，7.86(t，J＝8Hz，1H)，7.47(d，J＝8Hz，1H)，7.39(d，J＝8 Hz，1H)，4.57(d，J＝4Hz，1H)，4.33(t，J＝8Hz，2H)，2.60-2.73(m，2H)，2.50(m，2H)，1.85-2.04(m，3H)，1.71-1.85(m，2H),1.53-1.66(m，1H),1.39-1.52 (m，2H)，1.14-1.33(m，2H)

实施例15化合物Ⅱ-7的合成

化合物Ⅱ-7的合成通过类似于实施例9中所述步骤合成，不同点在于用原料 B7-1代替原料B3-1。MS：702.29(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.32(s，1H)，9.1(s，1H)，9.04(s，1H)，8.75(s，1H)，8.65(s，1H)， 7.99(s，1H)，7.86(t，J＝8Hz，1H)，7.47(d，J＝8Hz，1H)，7.39(d，J＝8 Hz，1H)，4.56(d，J＝4Hz，1H)，4.33(t，J＝8Hz，2H)，2.60-2.73(m，2H)，2.50(m，2H)，1.85-2.04(m，3H)，1.71-1.85(m，2H),1.53-1.66(m，1H),1.39-1.52 (m，2H)，1.10-1.33(m，4H)

实施例16化合物Ⅱ-8的合成

化合物Ⅱ-8的合成通过类似于实施例9中所述步骤合成，不同点在于用原料 B8-1代替原料B3-1。MS：716.37(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.32(s，1H)，9.1(s，1H)，9.04(s，1H)，8.75(s，1H)，8.65(s，1H)， 7.99(s，1H)，7.86(t，J＝8Hz，1H)，7.47(d，J＝8Hz，1H)，7.39(d，J＝8 Hz，1H)，4.56(d，J＝4Hz，1H)，4.33(t，J＝8Hz，2H)，2.60-2.73(m，2H)，2.50(m，2H)，1.85-2.04(m，3H)，1.71-1.85(m，2H),1.53-1.66(m，1H),1.39-1.52 (m，2H)，1.09-1.35(m，6H)

实施例17中间体5的合成

步骤A中间体4的合成

室温，氮气保护，投入中间体3(7g，24.6mmol)，4-溴-2-氟-1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙炔基]-苯(8.0g，29.6mmol)，DMF(42ml)，水(0.5ml)，碳酸钾(8.5g， 61.6mmol)，CuCl(0.98g，9.85mmol)，2-乙酰基环己酮(0.69g，4.93mmol)， 100℃搅拌9h。后自然降温，加入乙酸乙酯(500ml)，用1:4的氨水：饱和氯化铵水溶液洗，饱和食盐水洗，干燥，浓缩，柱层析，重结晶得2.31g，收率23.3％。 MS：403.40(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ10.67(s，1H)， 9.27(d，J＝0Hz，1H)，8.75(d，J＝4Hz，1H)，7.25(t，J＝8Hz，1H)，7.14 (s，1H)，6.17-6.28(m，2H)，4.12(s，1H)，2.66-2.80(m，2H)，2.12-2.25 (m，2H)，1.96-2.06(m，2H)

步骤B中间体5的合成

氮气保护，20℃下，投入中间体4(3.6g，9.0mmol)，DMAP(5.48g，45mmol)，硫光气(3.6g，31.4mmol)溶于无水四氢呋喃(3ml)中，缓慢滴入，搅拌1h。后加入50ml水，用6N HCl调PH为6，乙酸乙酯提取，水洗，饱和食盐水洗，干燥，浓缩，柱层析得3.35g，收率84％。MS：445.23(M+1)⁺，¹H-NMR(400 MHz，DMSO-d₆)，δ9.26(d，J＝0Hz，1H)，8.80(d，J＝4Hz，1H)，7.88(t， J＝8Hz，1H)，7.55(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，7.40(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)， 4.76(s，1H)，2.64-2.75(m，2H)，2.50(m，2H)，1.97-2.09(m，1H)，1.61-1.72 (m，1H)

实施例18化合物Ⅲ-3的合成

步骤A中间体C3-1的合成

室温，氮气保护，投入中间体5(0.6g，1.35mmol)，原料B3-1(0.63g，1.62mmol)，DMSO(9ml)，DIPEA(0.36g，2.70mmol)，CuI(0.13g，0.68mmol)，搅拌反应2h。后加入DCM100ml，用1:4的氨水：饱和氯化铵水溶液洗，水洗，饱和食盐水洗，干燥，浓缩，柱层析得0.77g，收率69％。MS：631.06(M-1)⁺，¹H-NMR(400 MHz，DMSO-d₆)，δ10.34(s，1H)，9.24(d，J＝0Hz，1H)，8.78(d，J＝4Hz， 1H)，8.43(d，J＝4Hz，1H)，8.36(t，J＝8Hz，1H)，7.53(dd，J＝4Hz，12Hz， 1H)，7.44(d，J＝8Hz，1H)，7.17-7.40(m，15H)，4.23(t，J＝8Hz，2H)， 2.62-2.73(m，2H)，2.52-2.61(m，2H)，1.93-2.05(m，1H)，1.67-1.90(m， 4H)，1.45-1.64(m，1H)

步骤B化合物Ⅲ-1的合成

控0℃，投入中间体C3-1(0.77g，0.93mmol)，二氯甲烷45ml，三异丙基硅烷(1ml)，加入三氟乙酸(1ml)，加入三异丙基硅烷(4ml)，搅拌30min。后加入50ml水，用饱和碳酸氢钠溶液调PH为6，用30:1的二氯甲烷:甲醇混合溶液提取，饱和食盐水洗，干燥，浓缩，柱层析得270mg，收率54.5％。MS：589.47 (M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ10.43(s，1H)，9.24(d，J＝0 Hz，1H)，8.78(d，J＝4Hz，1H)，8.61(d，J＝4Hz，1H)，8.37(t，J＝8Hz，1 H)，7.53(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，7.44(dd，J＝0Hz，8Hz)，4.51(t，J＝8Hz， 2H)，2.63-2.73(m，2H)，2.53-2.62(m，2H)，2.09-2.18(m，2H)，1.95-2.05 (m，3H)，1.57-1.69(m，1H)

实施例19化合物Ⅲ-1的合成

化合物Ⅲ-1的合成通过类似于实施例18中所述步骤合成，不同点在于用中间体B1-1替换原料B3-1。MS：561.32(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.43(s，1H)，9.24(d，J＝0Hz，1H)，8.78(d，J＝4Hz，1H)，8.61(d，J＝4 Hz，1H)，8.37(t，J＝8Hz，1H)，7.53(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，7.44(dd， J＝0Hz，8Hz)，5.60(s，2H)，2.63-2.73(m，2H)，2.53-2.62(m，2H)，1.95-2.05 (m，1H)，1.57-1.69(m，1H)

实施例20化合物Ⅲ-2的合成

化合物Ⅲ-2的合成通过类似于实施例18中所述步骤合成，不同点在于用中间体B2-1替换原料B3-1。MS：575.43(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.43(s，1H)，9.24(d，J＝0Hz，1H)，8.78(d，J＝4Hz，1H)，8.61(d，J＝4 Hz，1H)，8.37(t，J＝8Hz，1H)，7.53(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，7.44(dd， J＝0Hz，8Hz)，4.01(t，J＝8Hz，2H)，2.63-2.73(m，4H)，2.53-2.62(m， 2H)，1.95-2.05(m，1H)，1.57-1.69(m，1H)

实施例21化合物Ⅲ-4的合成

化合物Ⅲ-4的合成通过类似于实施例18中所述步骤合成，不同点在于用原料B4-1替换原料B3-1。MS：603.54(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.38(s，1H)，9.23(d，J＝0Hz，1H)，8.77((d，J＝4Hz，1H)，8.69(s， 1H)，8.58(d，J＝4Hz，1H)，8.36(t，J＝8Hz，1H)，7.52(dd，J＝4Hz，8Hz， 1H)，7.43(dd，J＝4Hz，8Hz)，4.49(t，J＝8Hz，2H)，2.62-2.73(m，2H)， 2.52-2.61(m，2H),1.92-2.09(m，5H)，1.45-1.59(m，3H)

实施例22化合物Ⅲ-5的合成

化合物Ⅲ-5的合成通过类似于实施例18中所述步骤合成，不同点在于用原料B5-1替换原料B3-1。MS：639.14(M+23)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.35(S，1H)，9.24(d，J＝0Hz，1H)，8.78(d，J＝4Hz，1H)，8.69(d，J＝4 Hz，1H)，8.60(d，J＝4Hz，1H)，8.37(t，J＝8Hz，1H)，7.53(dd，J＝0Hz， 12Hz，1H)，7.44(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，4.48(t，J＝8Hz，2H)，2.62-2.72 (m，2H)，2.52-2.61(m，2H)，1.95-2.05(m，5H)，1.49-1.64(m，3H)，1.21-1.30 (m，2H)

实施例23化合物Ⅲ-6的合成

化合物Ⅲ-6的合成通过类似于实施例18中所述步骤合成，不同点在于用原料B6-1替换原料B3-1。MS：631.06(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.35(S，1H)，9.24(d，J＝0Hz，1H)，8.78(d，J＝4Hz，1H)，8.67(S，1H)， 8.60(d，J＝4Hz，1H)，8.37(t，J＝8Hz，1H)，7.53(dd，J＝0Hz，12Hz，1H)， 7.43(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，4.48(t，J＝8Hz，2H)，2.67(m，2H)，2.57(m，2H)，1.83-2.05(m，5H)，1.56-1.69(m，1H)，1.44-1.55((m，2H)，1.20-1.34 (m，4H)

实施例24化合物Ⅲ-7的合成

化合物Ⅲ-7的合成通过类似于实施例18中所述步骤合成，不同点在于用原料B7-1替换原料B3-1。MS：645.29(M+1)⁺，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)， δ10.35(S，1H)，9.24(d，J＝0Hz，1H)，8.78(d，J＝4Hz，1H)，8.67(S，1H)， 8.60(d，J＝4Hz，1H)，8.37(t，J＝8Hz，1H)，7.53(dd，J＝0Hz，12Hz， 1H)，7.43(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，4.48(t，J＝8Hz，2H)，2.67(m，2H)，2.57(m，2H)，1.83-2.05(m，5H)，1.56-1.69(m，1H)，1.44-1.55((m，2H)， 1.13-1.37(m，6H)

实施例25化合物Ⅲ-8的合成

化合物Ⅲ-7的合成通过类似于实施例18中所述步骤合成，不同点在于用原料B8-1替换原料B3-1。化合物Ⅲ-7的合成通过类似于实施例18中所述步骤合成，不同点在于用原料B7-1替换原料B3-1。MS：659.37(M+1)⁺，¹H-NMR(400 MHz，DMSO-d₆)，δ10.35(S，1H)，9.24(d，J＝0Hz，1H)，8.78(d，J＝4Hz， 1H)，8.67(S，1H)，8.60(d，J＝4Hz，1H)，8.37(t，J＝8Hz，1H)，7.53(dd， J＝0Hz，12Hz，1H)，7.43(dd，J＝4Hz，8Hz，1H)，4.48(t，J＝8Hz，2H)， 2.67(m，2H)，2.57(m，2H)，1.83-2.05(m，5H)，1.56-1.69(m，1H)， 1.44-1.55((m，2H)，1.03-1.35(m，8H)

实施例26：使用SAHA作为两种靶标的阳性对照，使用荧光测定法测量目标化合物对HDAC1和HDAC6的IC50。

实验材料：

HDAC1和HDAC6购自Active Motif，SAHA购自Selleck，GL-peptide购自GLBiochem，DMSO购自Sigma，OptiPlate-384F购自PerkinElmer。

实验方法

1)准备1x分析缓冲液。

2)用DMSO进行化合物稀释。对于测试化合物和SAHA，制备100倍溶液，进行3倍连续稀释，共10个浓度的100x溶液。试验化合物的最终起始浓度为 10μM，SAHA的最终起始浓度为3μM。

3)使用自动液体处理器根据平板图将250nL化合物转移至384孔板。对于对照孔，转移250nL DMSO。

4)用1x测定缓冲液将HDAC酶稀释至1.67x终浓度。

5)将15μL2x酶溶液加入384孔板中，并在室温下与化合物预孵育15分钟。对于阴性对照，添加15μL1x测定缓冲液代替酶溶液。

6)用1x测定缓冲液以2.5x终浓度制备肽和胰蛋白酶混合溶液。

7)将10μL底物溶液加入384孔板中以初始反应。

8)用EnSpire动力学读取荧光，激发波长355nm，发射波长460nm。

数据分析

剂量响应曲线用GraphPad Prism5拟合，IC50由“log[inhibitor]vs.response-variable slope”程序计算。

实验结果：

阳性药物的活性

阳性药物	IC50(nM)on HDAC1	IC50(nM)on HDAC6
			SAHA	20	19

Summary of Compound IC50(nM)on HDAC

化合物体外对HDAC1和HDAC6的抑制作用：

体外实验结果表明，化合物Ⅰ-5、Ⅰ-6、Ⅰ-7、Ⅱ-5、Ⅱ-6、Ⅱ-7、Ⅲ-5、Ⅲ -6、Ⅲ-7和Ⅲ-8对HDAC1表现出相当或优于阳性对照药物SAHA的抑制活性，其中Ⅲ-6对HDAC的抑制活性比SAHA提高了一倍；化合物Ⅰ-4、Ⅰ-5、Ⅰ-6、Ⅰ-7、 Ⅱ-3、Ⅱ-5、Ⅱ-6、Ⅱ-7、Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-5、Ⅲ-6、Ⅲ-7和Ⅲ-8对HDAC6表现出相当或优于阳性对照药物SAHA的抑制活性，其中Ⅲ-5和Ⅲ-6对HDAC6的抑制活性比SAHA提高了4-5倍。

实施例27：本发明的化合物对人前列腺癌LNCaP细胞雄激素受体转录活性的抑制作用

以下药效学评价实施例中，受试样品由本发明化学合成实施例提供；以先导化合物MDV-3100和SAHA为阳性对照。全部测试样品，按照10^-2M的母液浓度，由二甲基亚砜溶解配制后分装，冻存于-20℃冰箱备用。

方法：Real-time RT-PCR法

1)细胞样品制备与核酸提取

人前列腺癌LNCaP细胞，用含10％雄激素碳吸附剥夺胎牛血清的RPMI1640 培养基(Gibco，美国)培养，培养条件为37℃、5％CO2。取对数增长期细胞，更换培养条件为含5％雄激素碳吸附剥夺胎牛血清的RPMI 1640培养基，以2x105 个细胞/孔的密度种入24孔板，贴壁过夜后加入1nM浓度的二氢睾酮 (Dihydrotestosterone，DHT)，以及0.1μM，0.5μM，1μM，10μM的待测化合物，作用8h后，弃去培养基，PBS清洗两次后，收集细胞，使用组织RNA小量提取试剂盒提取核酸。

2)RNA反转录成cDNA

使用超微量分光光度计测定核酸浓度，并调整核酸浓度均一。使用gDNA 去除反转录试剂盒(Code No.RR047A，TaKaRa)将抽提得到的核酸反转录成 cDNA。反转录体系如表所示

1.去除基因组DNA反应

反应条件：室温5min

2.反转录反应

试剂名称	体积(μL)
		步骤1的反应液	10.0
PrimeScript RT Enzyme Mix	1.0
		RT Prime Mix	1.0
5×PrimeScript Buffer2(for Real Time)	4.0
		RNase Free dH<sub>2</sub>O	4.0
Total	20μL

反应条件：37℃15min，85℃5sec(酶失活)

3)荧光定量PCR

使用上述反转录得到的cDNA为Real-time PCR反应模板，每个样本设置三个复孔。检测的目的基因为AR调控靶基因PSA和TMPRSS2，以及内参基因 GAPDH。对应各目的基因扩增反应所使用的引物序列如表1所示。

使用Vazyme试剂盒进行Real-time PCR反应；反应体系如表2所示。

qPCR反应条件：95℃预变性30sec，40个循环：95℃变性10sec，60℃延伸30sec。

4)基于PCR结果AR转录活性抑制率的计算

分析各个样品目标基因扩增情况，导出各域值循环数(cycle at threshold，即Ct)值。以GAPDH为内对照基因，校正cDNA模板的细胞拷贝数。取三复孔的 Ct平均值进行计算。计算不同样品间目标基因的相对量采用2-ΔΔCt法。Δ CT＝Ct PSA-Ct GAPDH或者ΔCT＝Ct TMPRSS2-Ct GAPDH，ΔCT值越小说明该目的基因表达量越高，反之亦然。2-ΔCT表示目的基因相对于内参基因的表达量；本实验用2-ΔCT来表示样本中PSA的表达量

按照下列公式计算AR活性的抑制率：抑制率＝(OD值对照孔-OD值给药孔)/OD值对照孔x100％。

结果判定标准：无效：抑制率@10μM<50％；有效：抑制率@10μM≥50％；强效：抑制率@1μM≥50％。

结果：

本次筛选体系中，体外化合物对人前列腺癌LNCaP细胞AR转录活性的抑制作用评价显示，阳性药MDV3100可以强效抑制AR转录活性，阳性药SAHA 在高浓度(10μM，1μM)也表现出一定的抑制AR转录活性的作用。本发明化合物中，包括Ⅱ-3，Ⅱ-4，Ⅱ-5，Ⅱ-6，对AR的抑制活性较弱，在1μM浓度下抑制率小于50％。Ⅰ-6，Ⅲ-4，Ⅲ-5，Ⅲ-6，Ⅲ-7对AR抑制活性较好，超过阳性药物ARN-509，0.5μM浓度下抑制率大于50％。进一步降低化合物作用浓度，显示在0.1μM浓度下抑制率略弱于阳性药MDV-3100。

表3.化合物对LNCaP细胞DHT刺激下AR靶基因转录激活的抑制作用(抑制率％)

实施例28.本发明化合物对体外培养的人前列腺癌LNCaP细胞非雄激素依赖生长的抑制作用

方法：Cell counting kit-8法(CCK-8)

人前列腺癌LNCaP细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco，美国)培养，培养条件为37℃、5％CO₂。肿瘤细胞按照每孔1x10⁴个/100ul培养基接种于96-孔板，细胞过夜贴壁后，加入PBS稀释的各化合物，按照100μM、 10μM，1μM，0.1μM，0.01μM的作用浓度，加至96孔板对细胞进行药物处理。作用72小时后，每孔加入10ul的CCK-8溶液，反应1小时后，使用酶标仪在 450nm波长下测定光密度(optical density，OD)值。

按照下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率＝(OD值_对照孔-OD值_给药孔)/OD 值_对照孔x100％。

结果：

本次筛选体系中，体外化合物对人前列腺癌LNCaP细胞非雄激素依赖生长的拮抗作用评价显示，阳性药SAHA可以有效抑制细胞生长，而AR靶向性抑制药物MDV-3100则无效，符合两个阳性药的药物作用特点。本发明有9个化合物，包括Ⅰ-4、Ⅰ-5、Ⅰ-6、Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-5、Ⅲ-6、Ⅲ-7和Ⅲ-8，体外呈剂量依赖性地抑制非雄激素依赖性人前列腺癌LNCaP细胞生长，表现出体外抗肿瘤作用，其中化合物Ⅰ-6表现出强效的抗肿瘤作用，与阳性药SAHA活性相当。具体结果见表1，取4次独立实验的数值计算均值、标准差后制作表格。

表4.化合物对LNCaP细胞非雄激素依赖生长的抑制作用(抑制率％，均值 ±标准差)