CN109792973B

CN109792973B - 家蚕多肽功能研究方法及其应用

Info

Publication number: CN109792973B
Application number: CN201910078381.8A
Authority: CN
Inventors: 赵巧玲; 王平阳; 何小柏; 裘智勇; 夏定国; 沈兴家
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2039-01-28
Also published as: CN109792973A

Abstract

本发明公开了家蚕多肽功能研究方法及其应用，所述方法通过先敲出体内编码多肽的基因，然后利用多肽通过体液运输的特性，通过活体注射补充多肽来回复因基因敲出而出现的表型变化，从而筛选出起作用的多肽，过程中也明确了该多肽的功能，该方法尤其对蛋白前体能切割形成多种多肽的多肽功能研究有很好的效果。

Description

家蚕多肽功能研究方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种多肽功能研究方法，具体为采用向相应基因缺失型突变体体腔注射多肽溶液的手段研究家蚕多肽功能，及该方法在其他昆虫多肽功能研究中的应用。

背景技术

由两个及两个以上α氨基酸通过肽键连接形成的化合物称之为多肽。在所有细胞中均能合成多肽，发现的多肽种类也有数万种，是生命活动不可或缺的重要组分，涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个生理过程，多肽功能也是多方面的，如：营养平衡作用、抗溃疡、抗风湿、类胰岛素作用、降血脂、调节血压、提高免疫、抗菌、抗病毒、抗衰老等方面作用。所以多肽具有作用领域广、活性高、分子量小、含量低等特点。在众多多肽中，有些是通过高效液相色谱、质谱和化学手段等分离纯化得到，有些是通过生物信息学方法预测得到，有些是利用高通量测序技术获得，因此很多多肽并不知道其在生理过程中发挥何种作用，这就需要对多肽进行功能探索。此外，多肽通常由蛋白质前体切割而来，释放到血液循环系统，输送到目标组织发挥作用。

多肽一般通过分离纯化或合成获得后再进行功能研究，常用分离纯化方法有盐析法、超滤法、电泳法、离子交换色谱法、亲和层析法、毛细管区带电泳法、超速离心法等，而化学合成主要有液相化学合成法和固相化学合成法。进行功能研究时有多种方式：1、将组织用多肽溶液处理，观察和记录其生理反应，从而判断其功能；2、从基因层面着手，通过研究编码多肽的基因研究其功能；3、通过生物信息学比对，以明晰功能的多肽来判断同源肽的功能；4、活体注射多肽，观察相关生理变化，该方法主要用于哺乳动物的研究，尤其作为代替人的模式动物鼠的多肽功能研究。在多肽的研究中，多采用离体器官研究法和同源性比对法研究多肽功能，如用合成的滞育激素保育卵巢，用合成的FMRFamide溶液孵育离体心脏，研究其对心脏的影响等。当很多物种基因组测序完成以后，开始在基因组层面进行多肽挖掘，其中存在同源多肽且在其他物种中功能已知的多肽，则可以对其功能进行预测。在基因水平研究多肽功能主要通过RNAi或者基因组变异来敲出编码多肽的基因，通过表型研究多肽功能。

上述方法在多肽功能研究中具有重要作用，却存在很多缺陷，首先得到的结果并不准确(离体器官研究法和同源性比对法)，其次操作过程对多肽种类有限制，有些多肽可能没法在离体器官中研究其功能，最后是在进行基因功能研究时，若基因编码的蛋白前体能切割形成多种多肽时，无法判断具体是哪种多肽在生理过程中起作用。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明提供了家蚕多肽功能研究方法及其应用，通过先敲出体内编码多肽的基因，然后利用多肽通过体液运输的特性，通过活体注射补充多肽来回复因基因敲出而出现的表型变化，从而筛选出起作用的多肽，过程中也明确了该多肽的功能，该方法尤其对蛋白前体能切割形成多种多肽的多肽功能研究有很好的效果。

技术方案：家蚕多肽功能研究方法，所述方法包括以下步骤：

第1步、获取家蚕编码多肽蛋白质前体的基因缺陷型突变体；

第2步、根据多肽切割规则及文献报道预测步骤(1)中多肽的种类；

第3步、对步骤(2)预测的多肽进行编号，并合成多肽，配制成多肽溶液；

第4步、家蚕发育至4龄起蚕时注射多肽溶液；

第5步、注射后饲养至5龄起蚕时，观察家蚕表型变化。

优选的，第4步中，4龄起蚕注射步骤为：

(1)将微量注射器高温高压灭菌，烘干后备用；

(2)注射前用无菌去离子水反复清洗注射器，一方面保证针头顺畅不堵，另一方面保证活塞能轻松拉动，不会出现卡塞；

(3)用吸水纸吸取注射器水分，并抽取注射液；

(4)一只手握住注射器，大拇指推动活塞，另一只手拿住家蚕，用食指和大拇指固定家蚕后部，在尾节的前一节贴着表皮注射，针深入2-3mm，缓慢匀速推动活塞；

(5)注射完成后停顿，待注射液稀释到体液后，缓慢抽走注射器，伤口有大量体液溢出，采用无生物毒性的速干胶封闭伤口；

(6)用新鲜桑叶在温度25℃，湿度65％条件下进行饲养。

优选的，注射液的浓度为5-10mmol/L。

优选的，注射剂量为2-5μL。

优选的，注射的家蚕为编码多肽蛋白质前体的基因缺陷型突变体。

优选的，微量注射器的量程为5-50μL。

以上任一所述家蚕多肽功能研究方法在昆虫多肽功能研究中的应用。

本发明所述研究多肽功能方法的原理在于：多肽在生命活动中具有非常重要的作用，参与许多生理过程。多肽由前体蛋白切割形成，通常有三种切割模式：第一种是同一个前体蛋白含有多个成熟肽拷贝，一条前体蛋白质可以切割形成多个同一种成熟肽；第二种是一个前体蛋白含有多种成熟肽序列，一条前体蛋白可以切割形成多种成熟肽，第三种是一个前体蛋白含有多种多个成熟肽序列，一条前体蛋白可以切割形成多种成熟肽，其中部分或全部成熟肽能切割形成多个拷贝。

具有重要功能的多肽，通常由调控组织合成并释放到血液循环系统，运输到达目标组织发挥作用，最常见的垂体、下丘脑等器官组织，在神经系统的控制下可以分泌调控其他组织的多肽，经循环系统到达目标组织器官，如促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促性腺激素等，因此多肽的合成部位和作用部位通常是不一样，合成部位作为调控器官，很多时候属于神经系统，作用部位是被调控组织器官，通常属于外周组织器官。在昆虫中，多肽通常亦通过开放循环系统运输多肽，然后在靶组织发挥作用。

当编码多肽前体蛋白的基因缺失时，突变体表现为缺失型表型，有时会表现出单一突变表型，有时会表现出多种突变表型，而基因编码的前体蛋白可以切割形成多种多肽时，就无法判断哪种多肽控制哪种表型，因此可以采用本申请所述的注射补充多肽的方式，根据表型变化判断何种多肽控制何种表型，作为拓展，可以几种多肽混合注射，研究是否多种多肽控制同一种表型。

本发明所述方法是先将一类多肽(同一个前体蛋白切割形成)全部移除(缺失型突变体)，获得这类多肽调控的所有表型，然后逐一供给单一多肽或多种混合肽，通过突变表型回复情况研究多肽的功能。

有益效果：本发明所述方法通过活体注射补充多肽来回复因基因敲出而出现的表型变化，从而筛选出起作用的多肽，过程中也明确了该多肽的功能，该方法尤其对蛋白前体能切割形成多种多肽的多肽功能研究有很好的效果。

附图说明

图1是家蚕紫色类鹑斑突变体表型图，其中A为q-l^p突变体，B为932VR家蚕品种；

图2是注射BmOKA_type2多肽的家蚕紫色类鹑斑突变体表型变化图，其中1-3分别表示932VR、注射BmOKA_type2多肽的家蚕紫色类鹑斑突变体和q-l^p家蚕(5龄起蚕)，4-6分别表示932VR、BmOKA_type2多肽的家蚕紫色类鹑斑突变体和q-l^p家蚕(5龄第3天)7-9分别表示932VR、BmOKA_type2多肽的家蚕紫色类鹑斑突变体和q-l^p家蚕(5龄第5天)；

图3是注射4种多肽对家蚕紫色类鹑斑突变体家蚕体重的影响图，其中，A为注射OKA_type2家蚕体重统计结果；B为注射OKA_type4、OKA_type5及OKB家蚕体重统计结果；C为注射OKA_type4、OKA_type5及OKB家蚕5龄第7天体重差异显著性分析；D为注射OKA_type4、OKA_type5及OKB家蚕5龄第8天体重差异显著性分析。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

在家蚕饲养过程中，从素斑品种932VR中发现了一种色素沉积型突变体紫色类鹑斑(purple quail-like,q-l^p)(如图1所示)，该突变体主要有两个方面的突变表型，一是出现类似鹑斑(quail,q)的斑纹表型，幼虫体色为浅粉紫色，二是幼虫食桑量少，发育缓慢，体质较弱，体型较小，茧型偏小。通过对突变体进行定位分析发现，q-l^p突变体的突变基因是一个神经多肽基因Orcokinin。在q-l^p中，BmOK基因第3外显子上出现一个碱基的缺失，该突变位点在两个剪接体BmOKA和BmOKB的共用外显子上，引起两个剪接体功能完全丧失。以上述多肽的功能研究为例，应用本发明所述方法，具体如下：

根据文献报道和多肽切割规律，预测并合成了6种多肽(分别命名为OKA_type1-OKA_type5和OKB)，纯度>95％，使用相应溶剂溶解多肽，配置成相应多肽溶液，浓度为5mmol/L，其中3种多肽以无菌去离子水为溶剂，1种以3％氨水为溶剂(OKA_type1)，1种以DMSO(二甲基亚砜)为溶剂(OKA_type3)，1种以1×PBS(磷酸盐缓冲液)为溶剂(OKB)。经测试，3％氨水和DMSO对家蚕有致命伤害，PBS对家蚕生长发育无显著影响，所以用OKA_type2、OKA_type4、OKA_type5和OKB这4种多肽进行试验。

BmOK基因缺陷型突变体紫色类鹑斑突变体正常条件下饲养至4龄起蚕，随机选择发育状态较好，大小一致的30头家蚕作为一组，共计6组进行试验。

其中4组分别注射OKA_type2、OKA_type4、OKA_type5和OKB这4种多肽溶液，1组注射去离子水，1组注射1×PBS。

注射之前先将20μL量程的微量注射器进行高温高压灭菌，烘干备用；然后用无菌去离子水反复清洗注射器，以活塞能顺畅推拉为宜，然后用滤纸吸掉多余水分。

抽取20μL多肽溶液，右手握住注射器，大拇指推动活塞，左手拿住蚕，用食指和大拇指固定家蚕后部，在尾节的前一节贴着表皮注射，针深入大约2-3mm，缓慢匀速推动活塞；每头蚕注射2μL，停顿大约3s左右，待注射液稀释到体液后，缓慢抽走注射器，如果伤口有大量体液溢出，需要用无生物毒性的速干胶封闭伤口，然后用新鲜桑叶在标准条件(温度25℃，湿度65％)下进行饲养。

饲养至5龄起蚕观察蚕的表型变化，期间统计各组家蚕平均体重，用以分析多肽对家蚕生长发育的影响。

家蚕发育至5龄起蚕，观察各组家蚕表型变化，同时观察野生型家蚕品种932VR 5龄起蚕的表型，结果发现，与对照组相比，注射有OKA_type2多肽溶液的实验组大部分斑纹消失，且在整个5龄阶段均表现出无斑纹表型，而注射无菌去离子水的对照组和q-l^p一样，为紫色类鹑斑表型(如图2所示)。

分别统计了注射4种多肽溶液的家蚕体重，期间部分组有部分家蚕因各种原因死亡，但死亡数量不超过20％，死亡家蚕不作统计平均体重的样本。OKA_type2做了单独比较，结果发现，注射OKA_type2和OKA_type4的实验组相比于注射去离子水的对照组，整个5龄阶段体重均高于对照组，但是差异不显著，注射OKA_type5和OKB的实验组相比于注射去离子水的对照组，整个5龄阶段体重均高于对照组，经统计学分析发现，5龄第7天和第8天，注射OKA_type5和OKB的实验组相比于注射去离子水的对照组，差异达到显著和极显著水平，表明OKA_type5和OKB对家蚕生长发育有影响(如图3所示)。

Claims

1.家蚕多肽功能研究方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

第1步、获取家蚕编码多肽蛋白质前体的基因缺陷型突变体；

第4步、家蚕发育至4龄起蚕时注射多肽溶液；

第5步、注射后饲养至5龄起蚕时，观察家蚕表型变化。

2.根据权利要求1所述的家蚕多肽功能研究方法，其特征在于，第4步中，4龄起蚕注射步骤为：

(1)将微量注射器高温高压灭菌，烘干后备用；

(3)用吸水纸吸取注射器水分，并抽取注射液；

(6)用新鲜桑叶在温度25℃，湿度65％条件下进行饲养。

3.根据权利要求2所述的家蚕多肽功能研究方法，其特征在于，注射液的浓度为5-10mmol/L。

4.根据权利要求2所述的家蚕多肽功能研究方法，其特征在于，注射剂量为2-5μL。

5.根据权利要求2所述的家蚕多肽功能研究方法，其特征在于，注射的家蚕为编码多肽蛋白质前体的基因缺陷型突变体。

6.根据权利要求2所述的家蚕多肽功能研究方法，其特征在于，微量注射器的量程为5-50μL。

7.权利要求1-6任一所述家蚕多肽功能研究方法在昆虫多肽功能研究中的应用。