CN109791156A - 鉴别表位的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法。本发明的方法通常包括蛋白质的限制性或约束性蛋白水解步骤以及蛋白质上被所用蛋白酶切割的位点的鉴别。本发明还涉及与已通过本发明方法鉴别的表位结合的抗体。

Description

鉴别表位的方法
技术领域
本发明涉及某些选择靶蛋白的表位的新方法，该方法用于但不限于抗体(例如功能性抗体)产生。因此，本发明在一些方面中涉及用于产生抗体的方法。此类方法典型地包括鉴别抗原表位和培育针对该抗原表位的抗体。本发明还涉及抗原表位和结合此类抗原表位的抗体。
背景技术
由于用例如若干种单克隆抗体(mAb)疗法(包括阿达木单抗(Humira)、贝伐单抗(Avastin)、赫赛汀(Herceptin))所见的临床成功，和例如靶向PCSK9的新型胆固醇下降mAb治疗(阿利库单抗(Alirocumab)和依伏库单抗(Evolocumab))的希望，抗体治疗的发展非常迅速。然而，目前市场上的所有抗体以及所有在晚期临床发展中的抗体通常是针对细胞外靶标，并且这些抗体通常是使用聚焦于亲和力或结合强度的筛选平台进行发现和开发。细胞内作用的抗体的开发和针对“困难靶标(即其中传统抗体发现方法失败的靶标)”的抗体的开发是一项艰巨的挑战，需要新的技术进步来发现和开发有效的抗体。对于细胞内作用的抗体，还需要用于将抗体内化至正确的靶器官中的细胞的新工具。此外，目前的抗体发现和开发平台通常缺乏(例如在医学症状中)可以预测具体抗体在给定生物系统中的工作的功能相关性、药理学相关性和作用机制相关性。
今天，针对开发和发现成功抗体治疗的策略不限于完整大小的单克隆抗体。由于蛋白质工程的进步，在过去二十年中已经衍生出多种多样的工程化的抗体片段，这些片段包括Fab片段、ScFv片段、双抗体、四抗体，用蛋白质轭合物功能化的抗体片段、连同与两种抗原结合的双特异性片段。当尝试开发具有高特异性和亲和力、深层组织渗透性、高稳定性和低毒性的抗体和抗体衍生生物制剂时，这些新构建体提供了远远更大的工具箱。然而，抗体疗法的主要障碍之一仍然存在，并且该障碍是其对细胞外靶标的一般限制。抗体太大、太极性而不能通过细胞膜进入。此外，抗体通常在细胞溶质的还原环境中是不稳定的。已经开发了若干种技术来接近细胞内靶标，这些技术包括使用不同的转运载体(例如转染试剂和蛋白质转导结构域(PTD))跨细胞膜运输抗体，连同包括直接在靶细胞内表达抗体(所谓的胞内抗体)。尽管对抗体的应用不如小分子和遗传物质广泛，但是电穿孔技术也还是得到了应用。可以通过融合胞内抗体的遗传序列和细胞内运输信号来构建胞内抗体以靶向不同的细胞区室。对于有效递送载体的需要仍然是胞内抗体疗法中的关键步骤，因为仍然需要将编码胞内抗体的遗传物质递送至靶细胞。
通过杂交瘤技术生产单克隆抗体首先在1975年开发出来。简言之，给哺乳动物注射感兴趣的抗原，这触发了哺乳动物的免疫应答。然后从动物脾取出脾细胞，并且稍后与永生骨髓瘤细胞进行融合。将细胞稀释至单个细胞并分离至多孔板中。由于一个细胞产生每个分离的群落，所以在单个孔中产生的抗体将是单克隆的。下一步是筛选所有不同的孔，以获得与抗原结合的最佳候选物。
与完整大小的抗体相比，具有更小抗体片段的巨大优点是它们可以在不同的表达系统(例如，大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞)中生产，并且不再局限于用杂交瘤技术生产。这使得能够以更低的成本进行大规模生产，并且实现遗传调节抗体特性的许多可能性。抗体片段可以显示在丝状噬菌体的表面上，即所谓的噬菌体展示，丝状噬菌体可用于产生大的抗体文库，针对所需抗原对这些抗体文库进行筛选。筛选程序评估与抗原结合的抗体候选物。由于第一周期中的非特异性结合，筛选程序经常在若干个周期内重复。可以改变筛选周期期间的条件，以便在某些环境中找到最适合的候选物，例如可以通过使用恶劣环境来选择更稳定的抗体。选择具有非常高亲和力的抗体的另一种方法是用非常低浓度的抗原进行筛选，使得只保留那些能够在这种条件下结合的抗体。几家公司已经开发了他们自己的筛选技术，并且这几家公司通常具有大的抗体文库，例如再生元公司(Regeneron(regeneron.com))或Alligator生物技术公司(Alligator bioscience(alligatorscience.se))。
发明内容
在一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：
(i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的抗原表位：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉，并且基于所述表面暴露的肽产生抗原表位；和
(ii)培育针对该抗原表位的抗体。
在另一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：
(i)通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和
(ii)通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于该蛋白质的区域中，导致当该肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从该蛋白质上切割掉或除去时，该蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变；或
基于该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择该蛋白质内的至少一个靶区域，并通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于所述至少一个靶区域中；和
(iii)培育针对该抗原表位的抗体。
在另一个方面，本发明提供鉴别抗原表位的方法，所述方法包括：
(i)通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和
(ii)通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于该蛋白质的区域中，导致当该肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从该蛋白质上切割掉或除去时，该蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变；或
基于该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择该蛋白质内的至少一个靶区域，并通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于所述至少一个靶区域中。
本发明涉及检测和鉴别蛋白质中氨基酸序列的方法，其中所述氨基酸序列具有良好的暴露性并在功能上相关的，至少这些氨基酸序列是被很好地暴露的。因此，我们称之为“热点”的这些氨基酸序列可以用作引导抗体靶向、发现和开发的抗原表位。此外，这些氨基酸序列可以基于蛋白水解消化后的它们的出现、和基于来自已知的生物信息学数据或来自功能/药理学测试的功能相关性来进行排序。因此，从蛋白水解消化产生的若干个氨基酸序列的列表中，可以挑选最适合的氨基酸序列(基于功能和结构参数)用于抗原表位发现和开发。在限制性条件下进行蛋白水解消化，即蛋白酶或若干种蛋白酶的活性非常低，使得一次只有一个或几个表面暴露的肽从靶蛋白上切割掉。因此，蛋白酶用作针对结合靶蛋白的抗体的成药性探针。
在一个实施例中，这些抗体是药理学活性的。在另一个实施例中，这些抗体是药理学活性的并且被开发用于治疗用途。更确切地，此类方法包括用于揭示靶蛋白的热点表位的蛋白质组学工具。
在本发明的一个方面，蛋白质通过蛋白酶作用被消化、解构和/或截短，并且所有良好暴露的氨基酸序列用于抗原表位产生，并且尝试对基于所述抗原表位开发的抗体进行效力、功效、药理学分析和其他测试(按照制药工业中使用的抗体发现的惯例)。
在本发明的一个方面，蛋白质通过蛋白酶作用被消化、解构和/或截短，并且并行地通过在消化的、解构的和/或截短的蛋白质上进行功能测定来探测蛋白质，以描绘蛋白质的功能重要区域。相关蛋白质在此有时表示靶蛋白。
在一个实施例中，并行地通过功能测定来进行靶蛋白的消化、解构和/或截短，以描绘靶蛋白的功能重要区域以引导针对抗体产生的表位选择。
在一个实施例中，消化、解构和/或截短，以及消化的、解构的和/或截短的蛋白质和天然靶蛋白的功能测定，与其他关于蛋白质功能的生物信息学事实和其他已知的事实相结合，以描绘靶蛋白的功能重要区域以引导针对抗体产生的表位选择。
在一个实施例中，可以使用单个蛋白酶来消化、解构和/或截短靶蛋白。在另一个实施例中，可以使用多种蛋白酶来按顺序一次一个地或并行地消化、解构和/或截短靶蛋白。此类蛋白酶的示例为、但不限于：Arg-C蛋白酶、Asp-N肽链内切酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰肽链内切酶、Lys-C、Lys-N、胰蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶。易于被若干种蛋白酶消化的区域应该位于蛋白质的暴露区域中，并且仅被单个蛋白酶消化的区域可能位于更隐藏的区域中。可替代地，蛋白酶具有独特的切割特异性或/和物理化学特性或/和结构特征，使得其可以鉴别其他蛋白酶不能鉴别的在靶蛋白上的表面暴露的肽。因此，优选使用多种蛋白酶，并且每种不同的蛋白酶可以产生关于表面暴露的肽作为抗原表位的适合性的互补或独特的信息。
这些实施例使得能够实现用于快速和精确地开发可用于药理学研究的药理学活性抗体的新方法/技术，例如，这些实施例可以用作(例如在细胞测定或体外测定中)用于检测生物化合物的工具。更重要的是，所述抗体可用于治疗人和动物的医学症状。这些实施例可以应用于所有蛋白质，包括可溶性蛋白质或膜结合蛋白质、细胞外的蛋白质或细胞内的蛋白质。此外可以利用这些实施例来产生对蛋白质功能的新的基本理解。
本发明还提供通过本发明的方法产生的抗体。
本发明还提供通过本发明的方法鉴别的抗原表位。
本发明还提供针对本发明的抗原表位的抗体。
本发明的其他特征和优点从以下详细说明将是清楚的。
附图说明
通过参考以下结合附图的描述，可以最好地理解实施例及其进一步的目的和优点，其中：
图1
在室温下，在5μg/ml胰蛋白酶的限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽，n＝6。A：在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。在0.5分钟(品红色)、5分钟(橙色)和15分钟(蓝色)后检测到的肽。B：在TRPV1的示意图中显示的检测到的肽的位置。在0.5分钟(品红色)、5分钟(橙色)和15分钟(蓝色)后检测到的肽。C：在5μg/ml胰蛋白酶的限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的消化的肽的条形图，显示在哪个时间点对它们进行了确认。
图2
暴露于5μg/ml、20μg/ml或40μg/ml胰蛋白酶(Tr)5min后从TRPV1消化的肽，以及除去这些肽后电流响应的变化。A-C：来自TRPV1的消化的肽的位置，显示在流动细胞(青色)内消化的肽，以及在流动细胞内消化并随后完全消化过夜的肽(黄色)。D：TRPV1的内面向外记录的代表性轨迹(用1μM辣椒素(Cap)激活、然后进行5分钟暴露于缓冲液抑或胰蛋白酶并且另外用辣椒素激活时)。从上到下分别为：暴露于缓冲液5min、暴露于5μg/ml胰蛋白酶5min、暴露于20μg/ml胰蛋白酶5min、和暴露于40μg/ml胰蛋白酶5min。轨迹已经以100 Hz进行数字滤波，仅供图形显示目的。
图3
TRPV1功能的电生理膜片钳记录显示用辣椒素进行第二次激活的电流轨迹时间间隔，计算为以(在用缓冲液n＝11抑或抗体n＝6处理后)用辣椒素进行第一次激活的间隔的百分比。数据呈现为平均值±SEM。
图4
OTV1，肽aa96-117的抗原决定簇(红色)的位置，在hTRPV1的表面模型中可视化。A：TRPV1的侧视图，其中每个单体以交替的蓝色和紫色着色。B：TRPV1的顶视图，其中每个单体以交替的蓝色和紫色着色。
图5
OTV2，肽aa785-799的抗原决定簇(红色)的位置，在hTRPV1的表面模型中可视化。A：TRPV1的侧视图，其中由于观察目的而省略了两种单体。B：TRPV1的底视图，其中每个单体以交替的蓝色和紫色着色。
图6
在有TRPV1表达(A)和无TRPV1表达(B)的固定细胞中，OTV1(左)的位置和OTV2(右)的位置。使用山羊抗兔Alexa488第二抗体来可视化OTV1和OTV2。在每个图像下方给出沿着横穿细胞的线段(黑色)的强度值。OTV1和OTV2使用不同的激光设置，不应进行抗体之间的比较。
图7
用抗体处理后TRPV1功能的电生理膜片钳记录。A：用辣椒素进行第二次激活的电流轨迹时间间隔，计算为以(在用缓冲液(n＝11)抑或OTV1(n＝6)处理后)用辣椒素进行第一次激活的间隔的百分比。B：在钙调素(CaM)和OTV2存在下，用辣椒素进行第二次激活的电流轨迹时间间隔，计算为以(在仅用钙调素(n＝11)、抑或钙调素和OTV2处理后)用辣椒素进行第一次激活的间隔的百分比。使用OTV2进行的处理可以分为：在尖端超声处理(n＝4)15分钟内进行测量，和在尖端超声处理(n＝7)30分钟内进行测量。数据呈现为平均值±SEM。
图8
A：在无钙PBS中，在用OTV1电穿孔后，TRPV1介导的YO-PRO摄取。顶部：OTV1(n＝11)和对照(n＝11)的荧光强度。底部：OTV1和对照的相应荧光强度率。B：在50μM的Ca2+存在下，在用OTV2电穿孔后，TRPV1介导的YO-PRO摄取。顶部：OTV2(n＝9)和对照(n＝7)的荧光强度。底部：OTV2(绿色)和对照(红色)的相应荧光强度率。数据呈现为平均值±SEM。
图9
通过电穿孔，用荧光验证抗体的内化。将细胞电穿孔、固定、透化、并用山羊抗兔Alexa488第二抗体进行孵育。荧光强度用共焦显微镜测量。在经受OTV1抑或OTV2的电穿孔细胞和非电穿孔细胞、连同只经受第二抗体的细胞之间进行强度比较。在OTV1和OTV2之间使用了不同的激光设置，并且不应进行强度值的比较。数据呈现为平均值±SEM。
图10
在用胰蛋白酶限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽。在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。实验细节在实施例3中给出。首先消化的肽显示为黑色。后面消化的肽显示为灰色。
图11
在用Asp-N限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽。在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。实验细节在实施例3中给出。首先消化的肽显示为黑色。后面消化的肽显示为灰色。
图12
在用糜蛋白酶限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽。在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。实验细节在实施例3中给出。首先消化的肽显示为黑色。后面消化的肽显示为灰色。
图13
在用胃蛋白酶限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽。在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。实验细节在实施例3中给出。首先消化的肽显示为黑色。后面消化的肽显示为灰色。
图14
在用蛋白酶K限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽。在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。实验细节在实施例3中给出。首先消化的肽显示为黑色。后面消化的肽显示为灰色。
图15
这张图显示了蛋白酶和抗体Fab区域的相似的总体尺寸。上图：HMM5 Fab晶体结构的一部分，其中包括互补位的区域用红色突出，R(PDB:5I8O)。下图：牛胰蛋白酶晶体结构，其中包括活性口袋的区域用红色突出，R(PDB:1MCT)。
图16
该图显示了鉴别蛋白酶可接近的/切割(protease-accessible/cut)的示例性工作流程图，但是该蛋白酶不释放基于计算机模拟(in-silico)建模、Fab-蛋白酶同源结合和微流体多蛋白酶消化/MS-MS检测的表位。(a)将计算机模拟消化与蛋白质同源建模和Fab-蛋白酶对接相结合以预测天然蛋白质结构上的蛋白酶切割位点。(b)通过微流体平台使用一套蛋白酶将包含天然蛋白质的脂蛋白体固定并消化，得到的肽通过LC-MS/MS鉴别。这允许绘制蛋白酶可接近的切割位点。蛋白酶1肽被标记为红色(R)，蛋白酶2肽被标记为蓝色(B)，蛋白酶3肽被标记为绿色(G)。(c)将实验确定的切割位点和计算机模拟预测的位点进行比较以确定意料之外的缺少的分裂。(d)为了研究缺少的切割位点，针对含有缺少的切割位点的7-8个氨基酸长序列生产抗体，使用移码方法以覆盖合适的区域(例如切割位点周围的-20至+20个氨基酸)。为了寻找最佳的结合位点将抗体进行筛选。(e)最佳结合抗体用于探测天然和部分消化的蛋白质以获得结构信息。例如，如果抗体与天然蛋白质上的缺少的切割位点结合，则这可能表明蛋白酶结合但由于某种原因不会切割。抗体也可用于探测由例如蛋白酶作用引起的肽断裂、截断或结构域中局部结构的丢失。检测因配体-蛋白质或者蛋白质-蛋白质相互作用引起的结构重排也是合理的。
图17
该图显示了用于鉴别表位候选物的示例性多蛋白酶消化平台。(a)从细胞中提取包含靶标的脂蛋白体，并通过几种蛋白酶平行地进行有限的蛋白水解。使用不同的反应参数(持续时间，酶浓度)。使用LC-MS/MS洗脱并鉴别来自每个反应的消化的肽。(b)表面可接近性根据反应参数排序，例如比率，其中使用最慢动力学消化的肽位于表面暴露区域中并且因此给予高等级排位。(c)根据所需的效果类型(激动，拮抗或简单结合)，使用生物信息学和实验数据，通过功能相关性对肽进行额外排序。适于抗体开发的表位具有良好的可接近性和相关功能。(d)表位被优化并在计算机中验证，例如，通过将Fab-片段的模拟与表位对接。最后，表位用作动物抗体产生的免疫原。
发明详述
现在将关于本文提供的描述和方法，更详细地描述本发明的前述和其他方面。应当理解，本发明可以按不同的形式实施，并且本发明不应被解释为限于本文所阐述的实施例。相反，提供这些实施例是为了使得本披露将是全面和完整的，并且将对本领域技术人员充分传达本发明的范围。
除非另外定义，在此所使用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在本说明书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。虽然类似或等同于在此所述的那些的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但以下描述了适合的方法和材料。在此提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用结合。本文引用的参考文献不被承认是要求保护的发明的现有技术。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法、以及实例仅是说明性的，并且不旨在进行限制。
用于本发明的描述中的术语仅用于描述具体实施例的目的，而不旨在限制本发明。如在本发明的实施例的描述中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该”旨在同样包括复数形式，除非上下文另外明确指明。并且，如在此使用的，“和/或”涵盖相关列出项目中的一个或多个的任何和所有可能的组合。此外，如在此使用的术语“约”当指代可测量的值如化合物的量、剂量、时间、温度等时意在涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％、或甚至0.1％的变化。当采用范围(例如从x到y的范围)时，是指可测量的值是从约x到约y的范围、或者其中的任何范围，例如约x1到约y1等。应进一步理解，术语“包括”和/或“包含”当用于本说明书中时指示所陈述的特征、整数、步骤、操作、元件、和/或部件的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、部件、和/或它们的群组的存在或添加。除非另外限定，否则在本说明书中使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有如本发明所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同含义。
在一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：
(i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的抗原表位：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉，并且基于所述表面暴露的肽产生抗原表位；和
(ii)培育针对该抗原表位的抗体。
在另一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：
(i)通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和
(ii)通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于该蛋白质的区域中，导致当该肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从该蛋白质上切割掉或除去时，该蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变；或
基于该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择该蛋白质内的至少一个靶区域，并通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于所述至少一个靶区域中；和
(iii)培育针对该抗原表位的抗体。
可替代地观察到，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：
(i)通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从蛋白质上切割掉；和
(ii)通过鉴别被切割掉的表面暴露的肽来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽具有对所述蛋白质有或预测有功能重要性的氨基酸序列，并且基于所述表面暴露的肽产生抗原表位；和
(iii)培育针对所述抗原表位的抗体。
在另一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：
(i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的表面暴露的肽：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和
(ii)基于所述至少一种表面暴露的肽构建线性抗原表位或构象抗原表位；和
(iii)培育针对该抗原表位的抗体。
在另一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：
(i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的表面暴露的肽：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和
(ii)当表面暴露的肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从该蛋白质上切割掉或除去，导致所述蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变时，对该表面暴露的肽进行鉴别；或
在以下情况下选择至少一种鉴别的表面暴露的肽：(i)基于所述表面暴露的肽与该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据的相关性；和
(iii)基于所述至少一种表面暴露的肽构建线性抗原表位或构象抗原表位；和
(iv)培育针对该抗原表位的抗体。
在另一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：
(i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的抗原表位：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和
(ii)培育针对该抗原表位的抗体。
在另一方面，根据本发明的产生抗体的方法可以可替代地视为用于生产特异性结合蛋白质的抗体的方法。产生本文所述抗体的方法的示例性和优选实施例细节上作必要的修改将同样适用于用于生产特异性结合蛋白质的抗体的方法。
在另一个方面，本发明提供鉴别抗原表位的方法，所述方法包括：
(i)通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和
(ii)通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于该蛋白质的区域中，导致当该肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从该蛋白质上切割掉或除去时，该蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变；或
基于该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择该蛋白质内的至少一个靶区域，并通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于所述至少一个靶区域中。
任选地，这种方法进一步包括培育针对所述抗原表位的抗体的步骤。
可替代地观察到，本发明提供鉴别抗原表位的方法，所述方法包括：
(i)通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和
(ii)通过鉴别被切割掉的表面暴露的肽来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽具有对所述蛋白质有或预测有功能重要性的氨基酸序列，并且基于所述表面暴露的肽产生抗原表位。
任选地，这种方法进一步包括培育针对所述抗原表位的抗体的步骤。
关于蛋白质内表面暴露的功能活性表位的详细知识可以帮助开发有效的抗体，并帮助通过降低抗体候选物的量而减少对精细筛选程序的需要。评估蛋白质表面形态的可能方法是通过进行限制性和受控的蛋白水解来约束蛋白酶的活性，以消化蛋白质中最灵活的和表面暴露的部分。这个想法是减缓蛋白酶活性的动力学，使得肽被一次一个的切割掉或肽被一次至多几个地切割掉。然后可以基于蛋白酶攻击后的出现顺序对切割掉的肽进行排序。首先从蛋白质上切割掉的肽很好地被蛋白质暴露，并且可以容易地被蛋白酶所接近。我们给这些肽定位高等级，并且我们假设由蛋白酶容易切割掉的肽也容易被抗体识别。我们给这些后面切割掉的肽定为低等级，并且使两者之间的所有肽基于蛋白酶攻击后随时间的出现从高到低得分。因此，该方法是基于氨基酸序列的，并且因为我们知道我们特别知道抗体将结合到所述靶蛋白处的序列。在第二步骤中，因为我们知道蛋白质中靶向的特定氨基酸序列，我们可以从截短的蛋白质的公布的数据或其他已知的生物信息学数据或从其药理学研究中调查所述氨基酸序列的功能意义。如果氨基酸序列与具有功能重要性的已知氨基酸序列(例如结合位点，调节位点，结构重要位点，通道区等)一致或接触或重叠，则所述肽被给予高分，并且被判断为用于抗原表位和随后的抗体开发的良好候选物。确切地，这可以通过使用例如低温、低浓度和/或短消化时间来控制蛋白酶的活性来实现。当对具有已知结构的蛋白进行限制性蛋白水解时，主要有三种结构决定簇已经被认为对蛋白水解活性发生处具有影响。这些包括灵活性、表面暴露和局部相互作用的数量。为了使肽链进入蛋白酶内的活性位点，需要灵活性和蛋白质局部展开的能力。表面暴露使得切割位点更可能发生蛋白水解，因为事实是表面上的区域倾向于更容易展开连同施加更少的位阻。就氢键和二硫桥而言，局部相互作用的量也很重要。更较少的局部相互作用有利于蛋白水解这些结构决定簇中的所有三种通常在蛋白质内相关。因此，鉴于蛋白质链可以在局部展开，限制性的蛋白水解将主要切割表面暴露的区域。已被用作用来确定具有未知详细结构的蛋白质中的表面暴露区域的方法。
基于脂质的蛋白质固定(LPI)技术使得能够对膜蛋白质进行灵活的化学过程。通过从细胞中衍生蛋白脂质体并将其固定在流动细胞内，产生膜蛋白质的固定相，该固定相可以经受若干轮溶液和不同类型的化学调节(例如通过酶)。已经开发了用于蛋白质组学表征的顺序胰蛋白酶消化方案，其中通过使用串联质谱(LC-MS/MS)的液相色谱法分析由蛋白脂质体的逐步酶消化产生的肽[1-3]。
在本发明方法的一些实施例中，蛋白质是存在于蛋白脂质体(例如衍生自细胞(例如人类细胞)的蛋白脂质体)中(例如，在蛋白脂质体的脂质双层中)的蛋白质(例如膜蛋白质)。因此，在一些实施例中，对蛋白脂质体进行限制性的蛋白水解。蛋白脂质体是包含蛋白质的脂质囊泡。蛋白质脂质体可以从纯化的膜蛋白质和脂质中重构，或者可以直接从细胞膜衍生(例如通过起泡)，或通过细胞的裂解。优选地，蛋白脂质体衍生自(制备自)裂解的细胞的细胞膜。蛋白脂质体可以从感兴趣的任何细胞类型获得。方便的细胞类型是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
制备蛋白脂质体的方法是本领域已知的，并且可以使用这些中的任何一种(例如，Jansson等人，Anal.Chem.[分析化学]，2012,84:5582-5588中描述的方法)。在本文的实例中描述了用于制备蛋白脂质体的示例性的和优选的方法。典型地，优选具有直径约50nm至约150nm的蛋白脂质体。
优选使用衍生自(制备自)裂解的细胞的细胞膜的蛋白脂质体，因为以这种方式(例如使用实例中提到的方法)制备的蛋白脂质体可以在蛋白脂质体外部上存在膜蛋白质的细胞内部分(或结构域)，因此可用于蛋白水解切割蛋白质的一些部分(以及因此的抗原表位鉴别)，否则这些蛋白质的一些部分不可接近蛋白酶。
在一个方面，我们已经通过利用LPI微流体平台[1,4]开发出靶向抗体技术来产生潜在的表位候选物。这是一种机制，而不是基于筛选的方法。简言之，LPI技术使得能够在膜蛋白质上进行灵活的化学过程(例如限制性的蛋白水解)。通过从细胞中衍生蛋白脂质体并将其固定在流动细胞内，产生膜蛋白质的固定相。已经开发了用于蛋白质组学表征的顺序消化方案，其中通过LC-MS/MS分析由蛋白脂质体的逐步酶消化产生的肽。由LPI流动细胞内的动力学控制的消化产生的此类肽阐明靶蛋白内的暴露的和可接近的区域，这些区域是具有可接近抗体结合潜力的区域。这些潜在表位与已知的功能数据进一步相关，以便找到将产生具有优异结合特征和生物功效两者的抗体的表位。最后，所选择的表位/肽可以用于免疫宿主动物以产生抗体。应当提及，进行限制性蛋白水解消化的其他方法和技术是本领域已知的，并且可以用于例如可溶性蛋白质。
在本发明的一些实施例中，蛋白质(例如膜蛋白质)在限制性或约束的蛋白质水解之前(例如在固体支持物上)被固定以产生蛋白质的固定相。因此，在一些实施例中，蛋白质是表面结合的。
在一些实施例中，蛋白质(例如膜蛋白质)存在于蛋白脂质体(例如衍生自细胞的蛋白脂质体)中(或之上)，并且所述蛋白质脂质体在限制性或约束的蛋白质水解之前(例如在固体支持物上)被固定以产生蛋白质的固定相。
在本发明的方法的一些实施例中，蛋白质是存在于衍生自细胞的蛋白脂质体中的膜蛋白质，其中所述蛋白脂质体固定在流动细胞中以产生膜蛋白质的固定相。适合的流动细胞在本领域中是已知的，例如，Jansson等人(Anal.Chem.[分析化学]2012,84:5582-5588)描述的流动细胞。
在一些实施例中，蛋白质(例如膜蛋白质)存在于蛋白脂质体(例如衍生自细胞的蛋白脂质体)中(或之上)，并且所述蛋白脂质体处于悬浮液中(例如悬浮在溶液中)。
在一些实施例中，所述蛋白质是在包含(或存在于)蛋白质的脂质囊泡中，该囊胞是表面结合的或在悬浮液中(例如悬浮于溶液中)。
在一些实施例中，所述蛋白质可以是任何适当实体的一部分或存在于任何适当实体上，使得所述蛋白质的功能或天然构象被保留，例如，所述蛋白质是脂质双层或膜的一部分或在支架或颗粒上。
在一些实施例中，所述蛋白质是在颗粒，例如纳米颗粒，或表面结合的或悬浮液中(例如悬浮在溶液中)的任何其他胶体颗粒中(或存在于其上)。
在一些实施例中，所述蛋白质是在支架或其他化学实体(例如笼状化合物)中(或存在于其上)，该支架或其他化学实体是表面结合的或在悬浮液中(例如悬浮在溶液中)。
在一些实施例中，所述蛋白质是在完整细胞(生物细胞，例如人类细胞)中(或存在于其上)，该细胞是表面结合的或在悬浮液中(例如悬浮在溶液中)。
在蛋白脂质体中的蛋白质的上下文中的，包含蛋白质的囊泡或完整细胞包括：延伸至(并因此暴露于)蛋白脂质体、包含蛋白质的脂质囊泡或细胞的外部的蛋白质。
在一些实施例中，所述蛋白质在溶液中。该溶液可以是纯化的蛋白质的溶液，或者可以包含蛋白质的混合物。
在一些实施例中，细胞(例如CHO细胞)例如经由可调节的(例如四环素可调节的)表达系统来过表达蛋白质。在一些实施例中，使用从这种细胞衍生的蛋白脂质体。
我们检查了由瞬态受体电位香草素1(TRPV1)离子通道的限制性蛋白水解产生的肽，目的是找到用于开发生物活性抗体的潜在表位，这些抗体具有调节这一离子通道的功能的能力。使TRPV1经受两种不同的蛋白酶的限制性蛋白水解，并且消化的肽与功能数据相关。使用这一信息，我们已经开发了两种多克隆抗体OTV1和OTV2，作用于人类TRPV1(hTRPV1)离子通道的细胞内侧。两种抗体均具有药理学活性，并且基于两种抗体的易于消化(或表面暴露(限制性蛋白水解后的高等级的肽))连同功能重要性，选择这两种抗体的靶向表位区域。当用激动剂辣椒素刺激时，OTV1显示对蛋白质的强抑制作用。OTV2干扰TRPV1的钙调素/Ca2+依赖性脱敏，这是通过TRPV1引起的钙流入触发的过程。使用内面向外膜片钳研究了OTV1和OTV2两者的功效，其中TRPV1的细胞内侧可以暴露于抗体溶液中，并且在抗体在活细胞内电穿孔之后使用TRPV1介导的荧光摄取测定。
先前已经描述了使用LPI流动细胞与开放体积的微流体流动细胞组合用于快速溶液交换(适合于膜片钳实验)的方法。这样做的好处就是细胞膜可以转入内部，并且离子通道的细胞内区域可以被直接询问。在这种方法中，人员可以使用限制性和受控的蛋白水解获得相关的结构和功能数据。TRPV1是一种阳离子通道，并且在伤害性初级感觉神经元中表达。详细的晶体结构不能用于全长蛋白质，但N-末端的锚蛋白重复结构域(ARD)已经成功地用于大鼠TRPV1结晶。在TRPV1上进行限制性蛋白水解时，在短时间内消化的肽已经与已知的功能活性区域进行了比较。三分之一的检测到的肽包含已经被提出在功能重要的残基。
通过将包含TRPV1的蛋白脂质体固定在流动细胞内，并且进一步将其暴露于限制性的胰蛋白酶蛋白水解，进行如现场调查(survey of the field)中描述的TRPV1表面形态的筛选[1,4]。通过在室温下使用不同的消化时间来控制胰蛋白酶的活性。使用累积孵育时间的顺序方案，并用LC-MS/MS检测消化的肽。随着时间的推移检测到越来越多的肽，突出了可接近和容易消化的蛋白质的区域连同更刚性的区域。这在图1中示出。在LPI流动细胞中TRPV1的限制性蛋白水解之后切割掉肽时，用LC-MS/MS观察到的若干个区域与钙调素、ATP和PIP2的已知相互作用位点相关。
我们还测试了通过胰蛋白酶消化，除去不同结构区段后，TRPV1的功能性[4]。使用内面向外膜片钳记录和流动细胞消化测试TRPV1离子通道的活性，然后进行蛋白质组学分析评估化学截短的结构效应。我们已经使用内面向外膜片钳记录构型，允许TRPV1的细胞内部分暴露于胰蛋白酶，并确定电流响应随着胰蛋白酶浓度的增加而降低(图2)。
我们证明离子通道TRPV1可以在相同的实验条件下在两个不同的微流体流动细胞中暴露于限制性和受控的胰蛋白酶蛋白水解。在一个实例中，针对药理学研究进行了膜片钳记录，获得了关于开放体积微流体装置中的通道功能动力学的信息。这种设计允许膜片钳移液管和细胞膜片可以进入过熔通道。在另一个实例中，使用封闭体积的当量流动细胞来消化掉来自离子通道的肽而不引起样品的稀释。用LC-MS/MS鉴别切割掉的肽。然后比较来自两个实验的数据，并且可以评估结构-功能关系。使用这种方法对策，我们已经鉴别了TRPV1的高度灵活的区域连同影响功能通道特性的关键区域(在其激动剂辣椒素激活期间)。
这种类型的方法也可以用于其他蛋白质(即非TRPV1蛋白质)。
hTRPV1的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:1)。
MKKWSSTDLGAAADPLQKDTCPDPLDGDPNSRPPPAKPQLSTAKSRTRLFGKGDSEEAFPVDCPHEEGELDSCPTITVSPVITIQRPGDGPTGARLLSQDSVAASTEKTLRLYDRRSIFEAVAQNNCQDLESLLLFLQKSKKHLTDNEFKDPETGKTCLLKAMLNLHDGQNTTIPLLLEIARQTDSLKELVNASYTDSYYKGQTALHIAIERRNMALVTLLVENGADVQAAAHGDFFKKTKGRPGFYFGELPLSLAACTNQLGIVKFLLQNSWQTADISARDSVGNTVLHALVEVADNTADNTKFVTSMYNEILMLGAKLHPTLKLEELTNKKGMTPLALAAGTGKIGVLAYILQREIQEPECRHLSRKFTEWAYGPVHSSLYDLSCIDTCEKNSVLEVIAYSSSETPNRHDMLLVEPLNRLLQDKWDRFVKRIFYFNFLVYCLYMIIFTMAAYYRPVDGLPPFKMEKTGDYFRVTGEILSVLGGVYFFFRGIQYFLQRRPSMKTLFVDSYSEMLFFLQSLFMLATVVLYFSHLKEYVASMVFSLALGWTNMLYYTRGFQQMGIYAVMIEKMILRDLCRFMFVYIVFLFGFSTAVVTLIEDGKNDSLPSESTSHRWRGPACRPPDSSYNSLYSTCLELFKFTIGMGDLEFTENYDFKAVFIILLLAYVILTYILLLNMLIALMGETVNKIAQESKNIWKLQRAITILDTEKSFLKCMRKAFRSGKLLQVGYTPDGKDDYRWCFRVDEVNWTTWNTNVGIINEDPGNCEGVKRTLSFSLRSSRVSGRHWKNFALVPLLREASARDRQSAQPEEVYLRQFSGSLKPEDAEVFKSPAASGEK
因此，对于存在于其天然脂质环境中的靶膜蛋白质，本发明使得能够针对新颖抗体，进行特异性表位的功能研究或推定结合位点的评估。
根据本发明，抗原表位典型地基于表面暴露的肽，该表面暴露的肽在限制性或约束的蛋白质水解期间已经从蛋白质上切割掉。可替代地观察到，典型地表面暴露的肽用于产生抗原表位。
在这方面，抗原表位可以包括表面暴露的肽的氨基酸序列或与其基本同源的序列。抗原表位可以由表面暴露的肽的氨基酸序列或与其基本同源的序列组成。抗原表位可以与表面暴露的肽的氨基酸序列或与其基本同源的序列重叠。
与表面暴露的肽“基本同源”的氨基酸序列包括：与给定的表面暴露的肽的氨基酸序列相比，具有1、2或3个(优选1或2个，更优选1个)氨基酸取代的序列，或包含具有1、2或3个(优选1或2个，更优选1个)氨基酸取代的序列的序列。
与表面暴露的肽“基本同源”的氨基酸序列包括：包括表面暴露的肽的至少5个或至少6个连续氨基酸(或由其组成)的序列(或包括表面暴露的肽的至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少15个、至少20个或至少25个连续氨基酸(或由其组成)的序列)。六个氨基酸是被抗体识别或结合的肽/蛋白质序列的典型长度。
与表面暴露的肽“基本同源”的氨基酸序列包括：与给定的表面暴露的肽序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列一致性的序列，或包括与给定的表面暴露的肽序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列一致性的序列的序列。至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列一致性是优选的。
抗原表位可以包括：表面暴露的肽的延长版本(或由其组成)，或者与表面暴露的肽基本同源的氨基酸序列的延长版本(或由其组成)。例如，一个或多个另外的氨基酸(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个、至少10个、至少15个或至少20个氨基酸)可以存在于表面暴露的肽序列(或与其基本同源的序列)的一端或两端。在一些实施例中，最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多15个或最多20个氨基酸可能存在于表面暴露的肽序列(或与其基本上同源的序列)的一端或两端。
抗原表位可以包括表面暴露的肽的截短版本(或由其组成)，或者与表面暴露的肽基本同源的氨基酸序列的截短版本(或由其组成)。例如，一个或多个氨基酸(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或9个、至少10个氨基酸)可以不存在于表面暴露的肽序列(或与其基本同源的序列)的一端或两端。在一些实施例中，最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多15个或最多20个氨基酸可能存在于表面暴露的肽序列(或与其基本上同源的序列)的一端或两端。
抗原表位可以是环肽，例如与一种或若干种表面暴露的肽基本同源的环肽，其中该表面暴露的肽在空间中定位为彼此靠近。
抗原表位的长度可以是至少5个、或至少6个或至少7个氨基酸，例如长度是6至10、6至12、6至15、6至20、6至25、6至30、6至40、6至50、6至60或6至75个氨基酸。抗原表位的长度可以是，例如，最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多15个、最多20个、最多25个或最多30个氨基酸。抗原表位的长度可以是，例如5至30、6至30、7至30、5至25、6至25或7至25个氨基酸。抗原表位的长度可以是，例如5至7或5至8或5至9(例如7至9个氨基酸)。为避免疑问，更长的蛋白质或多肽，例如，长度大于100个氨基酸的那些，不认为是本发明中涉及的表位。
可以通过任何方便的方法来评估同源性(例如序列一致性)。然而，为了确定序列之间的同源性的程度(例如一致性)，进行序列的多重比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W(Thompson，Higgins，Gibson，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，22:4673-4680,1994)。如果需要，Clustal W算法可以与BLOSUM62评分矩阵(Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，89:10915-10919,1992)一起使用，并且间隙开放罚分为10和间隙延伸罚分为0.1，使得在两个序列之间获得最高阶匹配，其中序列之一的总长度的至少50％参与比对。可以用于比对序列的其他方法是Needleman和Wunsch的比对方(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.[分子生物杂志]，48:443,1970)，该方法由Smith和Waterman进行了修改(Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.[应用数学进展]，2:482,1981)，使得在两个序列之间获得最高阶匹配，并且在两个序列之间确定相同氨基酸的数量。计算两个氨基酸序列之间的百分比一致性的其他方法通常是本领域公认的，并且包括例如Carillo和Lipton(Carillo和Lipton，SIAM J.Applied Math.[SIAM应用数学杂志]，48:1073,1988)所描述的那些，以及Computational Molecular Biology[计算分子生物学]，Lesk编辑，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，1988，Biocomputing:Informatics and Genomics Projects[生物计算：信息学和基因组学项目]所描述的那些。
一般来说，计算机程序将用于这种计算。比较和比对序列对的程序，如ALIGN(Myers和Miller，CABIOS[计算机在生物学中的应用]，4:11-17,1988)、FASTA(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，85:2444-2448,1988；Pearson，Methods in Enzymology[酶学方法]，183:63-98,1990)和间隙BLAST(Altschul等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，25:3389-3402,1997)、BLASTP、BLASTN或GCG(Devereux，Haeberli，Smithies，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，12:387,1984)也可用于此目的。此外，欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics institute)的Dali服务器(Daliserver)提供基于结构的蛋白质序列比对(Holm，Trends in Biochemical Sciences[生物化学趋势]，20:478-480,1995；Holm，J.Mol.Biol.[分子生物杂志]，233:123-38,1993；Holm，Nucleic Acid Res.[核酸研究]，26:316-9,1998)。
根据本发明的抗原表位可以是线性表位或构象表位。
在一些实施例中，根据本发明的抗原表位可以是环化表位。
用于制备用于免疫的线性抗原表位的常用技术是Fmoc SPPS(固相肽合成)。在SPPS中，小的多孔珠可以用功能性接头进行处理，其上可以使用重复的洗涤-偶联-洗涤循环来构建肽链。然后使用化学切割将合成的肽从珠中释放出来。为了合成环肽，通常的方法是利用环化，该环化是通过形成二硫桥(其中桥由两个半胱氨酸形成桥)或通过形成“头对尾(head-to-tail)”桥(其中桥由典型的肽键组成)进行的。环肽可以在固体支持物上形成。通常使用整个蛋白质或蛋白质的更大部分来培育针对构象表位的抗体。
限制性或约束的蛋白水解包括不完成的蛋白质的蛋白水解消化。因此，经由限制性或约束的蛋白质水解，给定的蛋白质可能仅部分消化(或部分解构或部分截短)。限制性或约束的蛋白水解可以被认为是部分蛋白水解。如果给定的蛋白质对于给定的蛋白酶具有某一数量的潜在的切割点(即可通过给定的蛋白酶识别用于切割的位点)，则在限制性或约束的蛋白质水解下，蛋白酶只能在这些切割位点的一个子集上进行切割。
限制性或约束的蛋白质水解还包括在限制条件下进行的蛋白水解，由此使蛋白酶活性的动力学减慢到以下程度：一次一个或一次至多几个肽从蛋白质上切割掉。在一些实施例中，至少一种蛋白酶的动力学活性被减慢，使得所述表面暴露的肽一次一个或一次至多一次几个被切割掉，例如，一次至多8(1、2、3、4、5、6、7或8)个肽被切割掉(例如样品中至多8个肽或8个独特的肽被切割掉，例如如本文别处所述)，或一次至多7(1、2、3、4、5、6或7)个肽被切割掉(例如样品中至多7个肽或7个独特的肽被切割掉，例如如本文别处所述)(例如，至多7个肽或样品中至多7个独特的肽，例如本文别处所述)，或一次至多5(1、2、3、4或5)个肽被切割掉(例如样品中至多5个肽或5个独特的肽被切割掉，例如如本文别处所述)。在一些此类实施例中，蛋白水解反应可以完成，使得蛋白质耗尽可被给定蛋白酶切割掉的肽。
如在本文的其他地方描述的，典型地，限制性或约束的蛋白质水解仅导致蛋白质的最灵活的和/或表面暴露的部分被蛋白酶切割掉。
在本发明的一些实施例中，所述至少一种蛋白酶在以下条件下使用：导致通过所述蛋白酶的作用，至多8个表面暴露的肽(例如1、2、3、4、5、6、7或8个表面暴露的肽)从蛋白质上切割掉(例如样品中至多8个肽或至多8个独特的肽被切割掉，例如如本文别处所述)。
在一个优选的实施例中，所述至少一种蛋白酶在以下条件下使用：导致通过所述蛋白酶的作用，至多7个表面暴露的肽(例如1、2、3、4、5、6或7个表面暴露的肽)或至多5个表面暴露的肽(例如1、2、3、4或5个表面暴露的肽)从蛋白质上切割掉(例如样品中至多7个或至多5个肽、或至多7个或至多5个独特的肽被切割掉，例如如本文别处所述)。
典型地，可以通过降低蛋白酶活性来实现根据本发明的限制性或约束的蛋白质水解，例如通过将蛋白酶活性的动力学减慢到到以下程度：一次一个或一次至多几个肽从蛋白质上切割掉。在一些实施例中，所述至少一种蛋白酶的动力学活性被减慢，使得所述表面暴露的肽一次一个或一次至多几个被切割掉，例如，一次至多8(1、2、3、4、5、6、7或8)个肽被切割掉、或一次至多7(1、2、3、4、5、6或7)个肽被切割掉、或一次至多5(1、2、3、4或5)个肽被切割掉，例如，如上所述。
任何适合的条件可用于限制性或约束的蛋白质水解，以便仅导致蛋白质中最灵活的和/或表面暴露的蛋白质部分被蛋白酶切割掉，例如导致至多8个表面暴露的肽、或至多7个表面暴露的肽、或至多5个表面暴露的肽被蛋白酶切割掉。可以通过改变消化反应的温度和/或蛋白酶的浓度和/或消化反应的持续时间和/或缓冲条件来确定导致限制性或约束的蛋白质水解的条件。在具体条件下从肽切割掉的肽的数目可以由本领域技术人员确定(例如通过质谱法或蛋白质化学或生物化学)。为限制性或约束的蛋白水解建立适当的条件的适合方式也在本文其他地方描述。可以为不同的蛋白质、或不同的蛋白酶、或所使用的蛋白质和蛋白酶的具体组合建立适当的限制性或约束的蛋白质水解条件。用于限制性或约束的蛋白质水解的特别优选的条件在本文的实例中描述。典型地，用于限制性或约束的蛋白质水解的条件不会改变(或不显著改变)蛋白质的天然构型(天然形式)。蛋白质的辅酶因子可能是但不一定存在于限制性或约束的蛋白水解过程中。
用于限制性或约束的蛋白质水解的适当条件可以取决于蛋白酶和/或蛋白质而不同，但是通常是对于所讨论的蛋白酶是次优的条件，例如使得蛋白酶活性的动力学显著减慢或降低的条件。
通常使用赋予(或提供)蛋白酶的低蛋白水解活性(例如更低或显著低于最优蛋白水解活性)的条件。这些条件包括但不限于使用低浓度的蛋白酶、和/或对所讨论的蛋白酶来说次优的工作温度、和/或对所讨论的蛋白酶来说非标准或次优缓冲液、和/或蛋白酶与蛋白质的短接触(孵育)时间。
在一些实施例中，在室温(例如约20℃或17℃-23℃)下进行限制性或约束的蛋白质水解(例如在最优工作温度(例如37℃或更高)下使用胰蛋白酶或例如使用蛋白酶)。
在一些实施例中，限制性或约束性蛋白水解在高于或低于，或显著高于或低于，(优选低于)使用的蛋白酶的最优工作温度至少2℃、至少5℃、至少10℃、或至少20℃的温度下进行。在一些实施例中，限制性或约束性蛋白水解是在高于或低于(优选低于)使用的蛋白酶的最优工作温度2℃至5℃、2℃至10℃、2℃至20℃、2℃至30℃、5℃至10℃、5℃至20℃、5℃至30℃、10℃至20℃、10℃至30℃、20℃至30℃的温度下进行。
在一些实施例中，高达5μg/ml蛋白酶(例如胰蛋白酶)的浓度用于限制性或约束性蛋白水解。在一些实施例中，浓度高达0.5μg/ml、高达1μg/ml、高达2μg/ml、高达10μg/ml或高达20μg/ml的蛋白酶用于限制性或约束性蛋白水解。在一些实施例中，允许限制性蛋白水解反应进行高达或少于5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、一小时或五小时，通常优选更短的孵育时间。例如，在一些实施例中，允许限制性蛋白水解反应进行至多或少于5分钟、10分钟、15分钟或30分钟。在一些此类实施例中，限制性蛋白水解在室温下进行。因此，在一些实施例中，在室温下以高达5μg/ml蛋白酶(例如约5μg/ml蛋白酶)的浓度进行至多约5分钟(例如约5分钟)的限制性蛋白水解。
在一些实施例中，可以使用甲酸或氨水停止蛋白水解消化反应。例如，可以使用甲酸停止胰蛋白酶、Asp-N、蛋白酶K和糜蛋白酶，并且可以使用氨水停止胃蛋白酶。
在本发明的一些实施例中，基于与所述至少一种蛋白酶接触后的出现顺序对切割掉的表面暴露的肽进行排序，其中首先(或早期)被切割掉并且在第一(或早期)取样点检测到的表面暴露的肽被定为高等级，并且之后被切割掉并且在随后取样点检测到的表面暴露的肽被定为低等级。快速脱离靶蛋白的、也具有功能意义的高等级肽，典型地可以用于表位开发、免疫和随后的抗体产生。
在本发明的一些实施例中，如在本文所述的低(更不苛刻的)蛋白水解活性条件下(例如蛋白酶的浓度(更)低、孵育的温度(更)低和/或孵育的时间(更)短，通常容易消化的肽)切割掉的表面暴露的肽被定为高等级，并且如在本文所述的高(更苛刻的)蛋白水解活性条件下(例如蛋白酶的浓度(更)高、孵育的温度(更)高和/或孵育的温度(更)长，通常不容易消化的肽)切割掉的表面暴露的肽被定为低等级。
在一些实施例中，可以在限制性或约束的蛋白质水解反应期间(例如，顺序地))取蛋白水解消化物质的多个样品(或来自蛋白水解消化反应的洗脱液)，和/或多个样品(例如多个限制性或约束的蛋白质水解反应)可以分开处理(或运行)(例如并行地处理或运行)。
在一些实施例中，在蛋白质的限制性或约束的蛋白质水解期间，以时间间隔(例如1分钟、2.5分钟或5分钟间隔)获取(或获得)蛋白水解消化物质的多个样品(或来自蛋白水解消化反应的洗脱液)。在一些此类实施例中，蛋白酶和/或(典型地是“和”)蛋白酶浓度(和/或可能影响蛋白水解的其他条件，如本文其他地方所述)对于每个样品(或在每个样品中)可能是恒定的，其中样品基于与蛋白酶接触(或一起孵育)的时间(或持续时间)变化。在一些此类实施例中，可以顺序获得样品(顺序消化)。
在一些实施例中，对多个样品(例如多个限制性或约束的消化反应)进行分开处理(或运行)，其中对于蛋白质的限制性或约束的蛋白质水解，每个样品具有不同的蛋白水解条件或蛋白水解活性，例如，如本文其他地方所讨论，例如，可以用于不同的样品的不同的蛋白酶和/或不同的蛋白酶浓度和/或不同的温度和/或不同的孵育的时间。在一些此类实施例中，对于每种样品(或在每种样品中)，与蛋白酶接触(或一起孵育)的时间(或持续时间)是典型地(或优选地)恒定。在一些此类实施例中，样品可以并行地处理(或运行)。
在本发明方法的一些实施例中，通过所述蛋白酶的作用从所述蛋白质上切割掉的表面暴露的肽的数目由蛋白酶的恒定浓度的时间控制，并且随着时间的推移获取若干个样品，或通过所述蛋白酶的作用从蛋白质上切割掉的表面暴露的肽的数目由恒定时间的蛋白酶的浓度控制，并且可以在若干种不同浓度的蛋白酶下获取(或运行)若干个样品，或通过所述蛋白酶的作用从蛋白质上切割掉的表面暴露的肽的数目由所述蛋白酶的时间和浓度二者控制。
每个样品(或优选的样品)可以优选地包含已经从蛋白质上切割掉的一个或几个肽(例如多达8个肽或多达8个独特的肽)。因此，可以在每个样品中检测到已经从蛋白质上切割掉的一个或几个肽(例如多达8个肽或多达8个独特的肽)。独特的肽是不存在于先前样品中的肽，或不存在于具有更弱(或更不苛刻)的蛋白水解条件的样品中的肽(例如与存在于先前样品中的肽或存在于具有更弱蛋白水解条件的样品中的肽明显不同(distinct)或不同(different)的肽)。因此，包含多达8个独特的肽的样品可包含大于8种不同的肽，但是这些肽中的一种或多种可能已经在先前的样品或具有更弱蛋白水解条件的样品中检测到(并且因此这些肽中的一种或多种肽可以是非独特的肽)。
理想地，并且优选地，每个样品将仅包含单个切割掉的肽。例如，可以在第一样品(或取样点)中检测到单个切割掉的肽，并且可以在一个或多个随后样品(或取样点)中检测到单个切割掉的肽。在其他实例中，可以在第一和/或随后样品(取样点)中检测多个切割掉的肽(例如多达8个肽或多达8个独特的肽)。可以通过使用短的取样间隔、不同的蛋白酶浓度、不同的缓冲液组成、不同的温度、不同的盐浓度、或蛋白酶抑制剂(或其组合)来建立每个样品产生一个或几个切割掉的肽(例如多达8个肽或多达8个独特的肽)的条件。可以基于其中出现切割掉的肽的样品(取样点)对这些切割掉的肽进行排序。例如，导致在每个取样点仅检测到一个肽的条件下，获取的第一样品中的肽被定为最高等级、获取的第二样品中的肽被定为等级2等。使用在每个取样点仅检测到单个切割掉肽的条件，对单个肽进行排序是可能的。使用在每个取样点检测到多个切割掉肽的条件，对肽的组的排序是可能的。
在一些实施例中，更高等级的表面暴露的肽(切割掉的肽)是优选的。在一些实施例中，根据本发明的表面暴露的肽(例如高等级肽)是在(或存在于)所获取的第一样品中检测的切割掉的肽。在一些实施例中，就在蛋白质的限制性或约束的蛋白质水解过程中获取的一个或多个样品的其出现顺序而言，根据本发明的表面暴露的肽(例如高等级肽)是被切割掉的肽，这一切割掉的肽是前8位的肽(例如前8位的独特的肽)之一，或存在于包含前8位的肽(例如前7位或前5的肽)(例如前8位、前7位或前5位的独特的肽)之一样品中。此类肽可以在(或存在于)所获取的第一样品中检测到或可存在于一个或多个随后获取的样品中。
典型地，首先(或早期)从蛋白质上切割掉的肽(例如，在如上所述的获取的第一样品(第一取样点)中的肽，或是基于在如上所述的限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽)的肽)是那些被很好地暴露(例如表面暴露)并且因此被蛋白酶容易地接近的肽。这种第一(或早期)消化的肽被定为高等级(例如，第一出现的肽被定为等级1，第二出现的被定为等级2等)。典型地，之后从蛋白质上切割掉的肽(例如在比早期肽更晚的取样点)是那些暴露不太好并且因此蛋白酶不容易接近的肽。此类之后消化的肽被定为更低的等级。在本发明中，典型地优选具有高等级的肽。
在一些实施例中，具有在蛋白质表面最多暴露的氨基酸序列的切割掉的肽(表面暴露的肽)优选用于抗原表位开发。
在一些实施例中，可以基于肽对蛋白质有或预测有功能重要性来对这些肽(切割掉的肽)进行排序。典型地，具有对蛋白质有或预测有功能重要性的氨基酸序列的那些肽比具有对蛋白质无或预测无功能重要性的氨基酸序列的那些肽具有更高的等级。在一些实施例中，优选更高等级的肽。
在一些实施例中，具有对蛋白质有或预测有功能重要性(例如具有高等级的功能重要性)的氨基酸序列、并且另外具有基于表面暴露的高等级的肽(例如，如上所述的在获取的第一样品(第一取样点)的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))的那些肽优选用于抗原表位开发(或另一种方式是抗原表位所基于的优选的肽)。
在一些实施例中，具有对蛋白质有或预测有功能重要性(例如具有高等级的功能重要性)的氨基酸序列、但是另外不具有基于表面暴露的高等级的肽(例如不是如上所述的在获取的第一样品(第一取样点)的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))的那些肽可以用于抗原表位开发。
在一些实施例中，具有对蛋白质无或预测无功能重要性(例如具有低等级的功能重要性)的氨基酸序列、但是具有基于表面暴露的高等级的肽(例如如上所述的在获取的第一样品(第一取样点)的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))的那些肽可以用于抗原表位开发。
在一些实施例中，抗原表位是基于首先(或早期)从所述蛋白质上切割掉的表面暴露的肽(例如，如上所述获取的第一样品(第一取样点)中的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))的肽，而不管切割掉的肽的氨基酸序列的功能重要性或预测的功能重要性。
在一些实施例中，抗原表位是基于表面暴露的肽，该表面暴露的肽是基于在另外具有对蛋白质有或预测有功能重要性的氨基酸序列的那些肽的限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽)。这些肽不一定(但可以)与仅基于出现顺序的绝对前8个肽的集合相同(如上所述)。
在一些实施例中，鉴别或选择蛋白质上的感兴趣区域(该区域是或被预测为对于蛋白质具有功能重要性)，并且抗原表位是基于表面暴露的肽(该表面暴露的肽是基于在另外具有从所述感兴趣区域切割掉的氨基酸序列的那些肽的限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))。这些肽不一定(但可以)与仅基于出现顺序的绝对前8个肽的集合相同(如上所述)。
在一些实施例中，针对抗体产生的抗原表位是基于在限制性蛋白水解期间通过蛋白酶的作用，首先(或早期)从所述蛋白质上切割掉并因此具有高等级的肽(表面暴露的肽)(例如，如上所述获取的第一样品(第一取样点)中的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))的肽的氨基酸序列。
因此，在一些实施例中，本发明的方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽(如上所述获取的第一样品(第一取样点)中的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽)的肽)，用于抗原表位开发并培养针对所述抗原表位的抗体(所述表位基于所述表面暴露的肽(或从其开发))。
在一些实施例中，本发明的方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽(如上所述获取的第一样品(第一取样点)中的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽)的肽)，来基于所述表面暴露的肽构建抗原表位并培育针对所述抗原表位的抗体。
在一些实施例中，本发明的方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽(如上所述获取的第一样品(第一取样点)中的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽)的肽)并且将其与蛋白质的定义的生物学特性(或生物功能)相关，来基于所述表面暴露的肽构建抗原表位并培育针对所述抗原表位的抗体。典型地，优选具有与蛋白质的定义的生物学特性(或功能)相关的氨基酸序列的肽。
可以采用被用于鉴别切割掉的肽(表面暴露的肽)的任何手段。在一些实施例中，使用质谱鉴别切割掉的肽。在一些实施例中，将液相色谱与质谱组合使用。优选地，用LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱)鉴别切割掉的肽(表面暴露的肽)。示例性和优选的质谱方法在实施例中描述。串联质谱可以由MASCOT(英国伦敦的矩阵科学(Matrix Science，London，UK))针对适当的数据库进行检索，例如，如实例中所述。
本文所述的消化、解构或截短的蛋白质是已经通过蛋白酶在沿其长度上的一个或多个位点处被切割掉的蛋白质。此类蛋白水解切割导致一个或多个肽(表面暴露的肽)从蛋白质上切割掉(即从蛋白质释放出来)。因此，表面暴露的肽是已经通过蛋白酶的作用从蛋白质上切割掉的肽。典型地，在全长蛋白质(即未切割掉的蛋白质)的背景下，术语“表面暴露”反映了这样的事实，对应于切割掉(释放的)肽序列的蛋白质的部分是良好的暴露并且可接近蛋白酶。
本发明提供用于治疗性抗体发现的新方法和针对人类TRPV1蛋白的新的药理学活性抗体。
本发明涉及在良好暴露的蛋白上检测表位的方法，并且因此本发明可以用作抗体靶向的指导。
本发明的一些方法包括通过鉴别被切割掉的表面暴露的肽来鉴别抗原表位的步骤，这一切割掉的肽具有对所述蛋白质有或预测有功能重要性(例如生物重要性)的氨基酸序列，并且基于这种表面暴露的肽产生抗原表位。在一些实施例中，针对这种抗原表位培育抗体。
可以通过任何适合的手段鉴别从所述蛋白质上切割掉的表面暴露的肽是否具有氨基酸序列，该氨基酸序列对所述蛋白质有或预测有功能重要性，并且本领域技术人员将会很容易地能够做到这一点。
例如，在一些实施例中，在功能测定中测试在限制性或约束的蛋白质水解期间被消化、解构或截短的蛋白质，以评估其功能或功能活性(例如生物功能)是否已被改变。这可以通过比较消化的、解构的或截短的蛋白质的功能活性的水平与尚未进行限制性或约束的蛋白质水解的蛋白质的功能活性的水平(没有经受限制性或约束的蛋白水解的蛋白质的功能活性的水平可以视为对照水平)来完成。如果蛋白质的生物功能在限制性或约束的蛋白质水解之后(或期间)被改变，这表明一个或多个被切割掉的肽(表面暴露的肽)已从与蛋白质功能相关的蛋白质(例如具有生物重要性的蛋白质)的区域中被切割掉了。因此，切割掉的表面暴露的肽可以与功能数据相关以评估表面暴露的肽对蛋白质的功能重要性。例如，在平行实验中，可以鉴别一个或多个被切割掉的肽(例如，可以鉴别一个或多个被切割掉的肽的序列)，如本文其他地方所述(例如通过LC-MS/MS)。如果从蛋白质上切割肽(表面暴露的肽)导致蛋白质的功能活性的改变，则这表明表面暴露的肽在本发明中可以特别用于抗原表位产生。可替代地观察到，基于此类表面暴露的肽的抗原表位可能是特别有用的并且优选用于抗体产生。
在一个实施例中，蛋白质是TRPV1，并且确定切割掉的肽对TRPV1的功能重要性的测定是如本文别处所述的内面向外膜片钳测定法。
对于功能或功能活性，“改变的”或“改变”可以是任何可测量的改变，优选显著改变、更优选统计学上显著的改变“改变的”功能或功能“改变”可以是功能的增加或减少。功能的示例性改变是≥2％、≥3％、≥5％、≥10％、≥25％、≥50％、≥75％、≥100％、≥200％、≥300％、≥400％、≥500％、≥600％、≥700％、≥800％、≥900％、≥1000％、≥2000％、≥5000％，或≥10,000％的改变。典型地，与功能或功能活性的适当对照水平相比评估改变，例如与尚未进行限制性或约束的蛋白质水解的等价蛋白质的功能或功能活性相比较评估改变。
在一些实施例中，抗原表位基于表面暴露的肽的氨基酸序列，当该表面暴露的肽从蛋白质上切割掉时导致蛋白质的功能或功能活性的改变。
在一些实施例中，表面暴露的肽序列是否具有功能重要性(例如生物重要性)是通过生物信息学手段和/或通过使用已知关于蛋白质的功能重要区域的其他信息(例如在学术文献中)预测或确定的。因此，切割掉的表面暴露的肽可以与已知关于蛋白质的功能重要区域的数据相关，以预测或确定切割掉的肽对蛋白质的功能重要性。如果表面暴露的肽的氨基酸序列已知具有(或预测具有)功能重要性，则这表明该表面暴露的肽在本发明中可以特别用于抗原表位产生。可替代地观察到，基于此类表面暴露的肽的抗原表位可能是特别有用的并且优选用于抗体产生。
因此，在一些实施例中，抗原表位基于已知(或预测为)在功能上重要的表面暴露的肽的氨基酸序列，例如，基于生物信息学分析和/或基于关于蛋白质的功能重要区域已知的(例如在学术文献中的)其他信息。
在一些实施例中，抗原表位是TRPV1的抗原表位，其基于与TRPV1的钙调素结合序列或TRPV1的辣椒素结合位点相关(或与之对应)的表面暴露的肽的氨基酸序列。
在一些实施例中，除了通过生物信息学手段和/或通过使用已知关于蛋白质的功能重要区域的其他信息(例如在学术文献中)来预测或确定表面暴露的肽的功能重要性之外，还进行功能测定来确定表面暴露的肽的功能重要性。
“生物信息学手段”、“生物信息学分析”、“生物信息学数据”和“生物信息学信息”包括但不限于数据库检索(例如BLAST检索)、结构建模、或结构生物学以及由此获得的数据/信息。
功能(例如生物功能)可以包括所讨论的蛋白质的任何生物或生理相关功能。功能(例如生物功能)包括但不限于：蛋白质与靶标(例如配体或受体)或其他结合配偶体(例如辅因子)结合的能力、信号传导活性、蛋白质的酶活性和离子通道活性，转运活性，释放(例如胰岛素释放)和摄取机制等。因此，蛋白质的功能相关或功能重要的区域包括但不限于：赋予蛋白质结合靶标(例如配体或受体)或其他结合配偶体(例如辅因子)的能力的区域、赋予信号传导活性的区域、具有蛋白质的酶活性的区域、赋予离子通道活性的区域、赋予转运活性的区域、以及赋予分子(例如胰岛素)的释放和摄取的区域。
在一个实施例中，本发明的方法进一步包括：经由电脑产生一组推定肽(或全部推定肽)的步骤，这些推定肽可以通过一种或多种蛋白酶(例如通过使用计算机程序，该程序可以基于所述一种或多种蛋白酶的已知一个或多个识别序列，鉴别该蛋白质中的切割点)从蛋白质上切割掉，并任选地过滤所述经由电脑产生的推定肽的集合以除去先前已经描述的肽(例如，在序列数据库(例如BLAST检索)中或在其他文献中)，从而获得推定肽的过滤列表，将推定肽的所述过滤列表与通过蛋白质的限制性或约束的蛋白质水解鉴别的肽的列表进行比较，鉴别通过蛋白质的限制性或约束的蛋白质水解鉴别的所述过滤列表和所述肽的列表二者共有的肽，基于两个列表共有的肽鉴别(或构建)抗原表位，以及任选地培育针对所述抗原表位的抗体。
在另一个方面，本发明提供鉴别抗原表位的方法，所述方法包括：
(i)通过使第一蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该第一蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该第一蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该第一蛋白质上切割掉；
(ii)鉴别第二蛋白质的区域(或部分区域或区域部分)的氨基酸序列，该氨基酸序列与从第一蛋白质上切割掉的表面暴露的肽的氨基酸序列相同或基本同源；和
(iii)基于所述第二蛋白质的所述区域(或部分区域或区域部分)的氨基酸序列产生抗原表位，该氨基酸序列与从第一蛋白质上切割掉的表面暴露的肽的氨基酸序列相同或基本同源；并且任选地
(iv)培育针对该抗原表位的抗体。
基本同源的序列的示例性类型在本文其他地方讨论。基于对不同蛋白质(第一蛋白质)进行的限制性或约束的蛋白质水解，此类方法可以促进针对蛋白质(第二蛋白质)的抗原表位产生。当第一和第二蛋白质在相同的蛋白质家族中或以其他方式相关时(例如可以使用在TRPV1上进行的限制性或约束的蛋白质水解的数据鉴别TRPV2抗原表位时)，这可能是特别有用的。可以使用任何适合的手段(例如计算机程序)和技术人员熟悉的手段来确定(或鉴别)第二蛋白质上的基本同源的蛋白质。纯粹作为举例，由EMBL-EBI提供的EMBOSSNeedle程序是一个适合的计算机程序。EMBOSS针读取两个输入序列并写入其最优全局序列比对，使用Needleman-Wunsch比对算法进行计算，以找到沿其整个长度的两个序列的最优比对(包括间隙)。
在本发明的一些实施例中，抗原表位不是基于表面暴露的肽，该表面暴露的肽具有与另一种或多种蛋白质保守的氨基酸序列(例如，进化上保守的序列或与表面暴露的肽的氨基酸序列相同或基本同源的序列)。这可以最小化针对此类抗原表位培育的抗体的交叉反应性(或非特异性结合)。换句话说，在一些实施例中可以使用基于独特氨基酸序列(或其他蛋白质中未发现的序列)的抗原表位
本发明涉及在功能上相关的蛋白上检测表位的方法，并且因此本发明可以用作抗体靶向的指导。更确切地，此类方法包括用于揭示靶蛋白的热点表位的蛋白质组学工具。潜在地可以用作抗体的生产中的抗原的这些表位在本文中被表示为抗原表位。
在本发明的一个方面，蛋白质通过蛋白酶作用被消化、解构和/或截短，并且并行地通过在消化的、解构的和/或截短的蛋白质上进行一个或多个功能测定来探测蛋白质，以描绘蛋白质的一个或多个功能重要区域。
在一个实施例中，可以并行地通过一个或多个功能测定来进行蛋白质的消化、解构和/或截短，以描绘蛋白质的功能重要区域以引导针对抗体产生的表位选择。
在一个实施例中，可以使用单个蛋白酶来消化、解构和/或截短蛋白质。在另一个实施例中，可以使用多种蛋白酶来按顺序一次一个地或并行地消化、解构和/或截短靶蛋白。此类蛋白酶的示例为、但不限于：Arg-C蛋白酶、Asp-N肽链内切酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰肽链内切酶、Lys-C、Lys-N、胰蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶。易于被若干种蛋白酶消化的区域应该位于蛋白质的暴露区域中，并且仅被单个蛋白酶消化的区域可能位于更隐藏的区域中。可替代地，蛋白酶具有独特的切割特异性或/和物理化学特性或/和结构特征，使得其可以鉴别其他蛋白酶不能鉴别的在靶蛋白上的表面暴露的肽。因此，优选使用多种蛋白酶，并且每种不同的蛋白酶可以产生关于表面暴露的肽作为抗原表位的适合性的互补或独特的信息。
多种蛋白酶的顺序使用意味着不同的蛋白酶与蛋白质一个接一个地孵育，即一个蛋白酶被孵育，随后又在之后的时间点孵育另一个蛋白酶，以及在稍后的一个或多个时间点任选地孵育一个或多个其他不同的蛋白酶。
单个蛋白酶的顺序使用意味着将相同的蛋白酶(例如相同浓度的蛋白酶)与蛋白质一起孵育若干次(例如，在若干个不同的(顺序)时间点)，或者意味着从蛋白水解消化反应中随时间取出若干个样品，并且随着时间的推移检测和跟踪在反应中产生的新的或独特的肽的出现。
并行地使用意味着进行多个单独的单蛋白酶消化反应，每个反应使用不同的蛋白酶、或者使用相同的蛋白酶但不同的蛋白水解条件(例如，如本文别处描述的，不同的蛋白酶浓度和/或温度和/或时间点)。
可以使用多种蛋白酶来鉴别重叠的、互补的或独特的表面暴露的肽。在这种情况下，“重叠”是指经由用一种蛋白酶的限制性或约束的蛋白质水解鉴别的表面暴露的肽具有以下氨基酸序列：与经由用一种或多种其他(即不同的)蛋白酶的限制性或约束的蛋白水解鉴别的表面暴露的肽的氨基酸序列(部分或完全)重叠。在这种情况下，“互补”是指经由用一种蛋白酶的限制性或约束的蛋白质水解鉴别的表面暴露的肽具有以下氨基酸序列：在整个蛋白质序列的背景中(即在限制性或约束的蛋白质水解之前的整个蛋白质序列),位于与经由用一种或多种其他(即不同的)蛋白酶的限制性或约束的蛋白质水解鉴别的表面暴露的肽的氨基酸序列紧邻或接近(或甚至部分重叠)。“独特的”表面暴露的肽是仅在用一个或几个(少数)测试的蛋白酶的限制性或约束的蛋白水解之后才被鉴别的表面暴露的肽。
不希望被理论束缚，被多于一种蛋白酶切割掉的蛋白质的区域可能在蛋白质的良好暴露(例如表面暴露)区域中，并且因此来自被多于一种蛋白酶切割掉的蛋白质的区域的表面暴露的肽可以代表特别有用的表面暴露的肽，抗原表位是基于这些表面暴露的肽的。
使用多种蛋白酶包括但不限于使用2、3、4、5种蛋白酶。
在本发明方法的一些实施例中，蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成(或包括)：胰蛋白酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N肽链内切酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰肽链内切酶、Lys-C、Lys-N、糜蛋白酶、蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、肠激酶、因子Xa、粒酶B、中性粒细胞弹性蛋白酶、脯氨酸-肽链内切酶、葡萄球菌肽酶I、和凝血酶。
在一些优选的实施例中，蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成(或包括)：胰蛋白酶、Asp-N肽链内切酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K。在优选的实施例中，蛋白酶是胰蛋白酶。
在本发明的又另一方面，在时间上间隔地以恒定或不同浓度的一种或若干种蛋白酶的单个或多个激发中，单一地一起使用若干种蛋白酶的混合物。因此，在一些实施例中，使用多种蛋白酶的单一混合物(cocktail)(混合物(mixture))。
如果使用多种蛋白酶，则可以为每个单独的蛋白酶产生排序列表。
这种方法将对得到对蛋白质功能的新的基本了解、以及可以用于治疗人和/或动物的医学症状的药理学活性抗体的快速和精确开发的新方法/技术。该方法可以推广到所有蛋白质，可溶性蛋白质或膜结合蛋白质、细胞外的蛋白质或细胞内的蛋白质。
通过所提出的方法产生的表位的列表优选地针对生物信息学数据和一个或多个功能测定进行分类。该方法优选地使用来自两个实验的输入数据和生物信息学信息。在一个实施例中，重点将在膜和膜相关蛋白质上。此类蛋白质是例示但不限于人类伤害感受器TRPV1、TRP超家族中的其他离子通道、连同一些兴奋性氨基酸受体(包括NMDA受体和G-蛋白质)。这些蛋白质(例如离子通道)具有这样的优点：可以使用例如膜片钳，以详细的方式直接研究它们。其他类型的感兴趣的蛋白质与致癌蛋白质(包括致癌小GTP酶KRAS、NRAS和HRAS)有关。KRAS是若干种转移性恶性肿瘤(包括胰腺癌、结肠癌和肺癌)中的关键蛋白质。例如，GTP酶活性可以通过以下研究：GTP的放射性同位素标记，随后测量GTP水解至GDP后的游离32P，或降低测定(pull-down assays)，随后进行蛋白质印迹。而其他有趣的蛋白质类别是涉及癌症疗法中的免疫调节的免疫调节蛋白，例如PD1、PDL1、CD40(仅作为几个实例)。
根据本发明的“蛋白质”可以是任何蛋白质。
在本发明的一些实施例中，蛋白质是膜结合蛋白质，可溶性(例如循环)蛋白质、细胞外蛋白质或细胞内蛋白质。
在一些实施例中，蛋白质是膜蛋白质或膜相关蛋白质。
在一些实施例中，蛋白质是离子通道，例如TRP超家族中的离子通道(例如TRPV1或TRPV2)。在优选的实施例中，蛋白质是TRPV1。
在一些实施例中，蛋白质是兴奋性氨基酸受体。在一些此类实施例中，蛋白质是NMDA受体或G-蛋白质。
在一些实施例中，蛋白质是致癌蛋白质。在一些此类实施例中，蛋白质是选自下组的致癌小GTP酶，该组由以下各项组成：KRAS、NRAS和HRAS。
在一些实施例中，蛋白质是免疫调节蛋白。在一些此类实施例中，蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：PD1、PDL1、CD40、OX40、VISTA、LAG-3、TIM-3、GITR和CD20。
在一些实施例中，蛋白质不是尿激酶纤溶酶原激活物受体(u-PAR)、转谷氨酰胺酶3(TGase3)、脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白质或大麻素受体(例如CB1)。
在一些实施例中，蛋白质是真核蛋白质。例如，在一些实施例中，蛋白质是哺乳动物蛋白质，优选人蛋白质。
在一些实施例中，蛋白质是人类蛋白质组的任何蛋白质。换句话说，人类蛋白质是优选的。
使用这些靶标的单个蛋白酶或多蛋白酶限制消化方案，将导致发现针对热点表位的新抗体。不同的蛋白酶会产生不同的切割掉的肽。在一个实施例中，膜蛋白质被解构，并且这种逐件截短的作用被探测以影响蛋白质功能。仅用某些蛋白酶观察到的稀少斑点也将被鉴别。然后，然后将针对策划(curated)的生物信息学数据以及也来自截短的蛋白质的功能测定来分析鉴别数据，以识别所讨论的蛋白质的功能重要区域。
实施例的一个方面涉及鉴别蛋白质中的抗原表位的方法。该方法包括通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解。在另一个实施例中，该方法还包括在测试、检查或验证蛋白质的至少一种生物功能的功能测定中探测至少一种消化的、解构的或截短的版本的蛋白质。该方法进一步包括鉴别蛋白质中的抗原表位，将其鉴别为在至少一种表面暴露的肽中的，并且存在于参与如基于功能测定确定的发挥蛋白质的生物学功能的蛋白质的区域中的一种表面暴露的肽。
在一个实施例中，将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解包括在以下条件使蛋白质与至少一种蛋白酶接触：i)至少一种蛋白酶的选择的温度或温度范围、ii)至少一种蛋白酶的选择的浓度或浓度范围(相对于蛋白质的浓度)、和/或iii)在选择的持续时间期间。这转而使得至少一种蛋白酶能够切割蛋白质的表面暴露区域，而不是蛋白质的非灵活的和/或内部的区域。
通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，这意味着蛋白质暴露于温和的蛋白水解。因此，特别是蛋白质的一个或多个表面暴露的和灵活的肽部分将通过至少一种蛋白酶的作用从氨基酸序列上切割掉。典型地，在蛋白水解中使用的温度、浓度和/或持续时间取决于具体的一种或多种蛋白酶和当前的蛋白质。因此，在一个实施例中，首先测试一组候选蛋白水解条件以选择或鉴别用于消化的适合的温度、蛋白酶的浓度和/或持续时间、以及缓冲液条件以解构或截短蛋白质并获得至少一个表面暴露的肽。例如，可以在多个(即至少两个)不同的反应温度、在多个不同的蛋白酶浓度(相对于蛋白质的浓度)、和/或在多个不同的反应持续时间(包括不同的缓冲液条件)下进行蛋白水解，如图1所示，以鉴别蛋白质和一种或多种蛋白酶的当前组合的最适当的蛋白水解条件。
例如，适合的蛋白酶条件是导致蛋白质消化、解构或截短为一个或最多N个表面暴露的肽的温度、浓度和/或持续时间。参数N的典型值为7、优选为6或5、更优选为4或3、甚至更优选为2或1。
在一个实施例中，功能测定测试、检查或验证蛋白质的至少一种生物功能。这种生物功能的非限制性实例包括蛋白质结合靶标(如配体或受体)的能力；蛋白质的酶活性；离子通道活性；等。
在一个实施例中，将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解包括：通过使蛋白质与多种蛋白酶接触以形成多个消化、解构或截短版本的蛋白质和多种表面暴露的肽来将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解。在一个具体实施例中，蛋白质连续(即一个接一个)地与多种蛋白酶接触。在另一个具体实施例中，蛋白质与多种蛋白酶并行地接触。
在一个实施例中，鉴别抗原表位包括鉴别至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位，该表面暴露的肽存在于区域中，导致当在限制性或约束的蛋白质水解期间该区域从该蛋白质上切割掉或除去时，蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变。
在一个实施例中，该方法还包括基于蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择蛋白质内的至少一个靶区域。在这种情况下，鉴别抗原表位包括鉴别至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的肽，该表面暴露的肽存在于至少一个靶区域中的蛋白质的区域中。
在该实施例中，使用生物信息学和/或生物功能的其他已知数据来指导抗原表位选择。这意味着在鉴别或选择抗原表位时，只有存在于所选一个或多个靶区域之一中的表面暴露的肽才被用作候选物。因此，可以通过去除或省略存在于已知缺乏任何生物功能和/或已知不参与发挥蛋白质的生物功能的的区域中的表面暴露的肽来减少候选物的数目。
实施例的另一方面涉及根据鉴别蛋白质中的抗原表位的上述方法鉴别的抗原表位。
在一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：
LLSQDSVAASTEK(SEQ ID NO:2)；
LLSQDSVAASTEKTLR(SEQ ID NO:3)；和
QFSGSLKPEDAEVFKSPAASGEK(SEQ ID NO:4)，
或与其基本同源的序列。
在另一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：
LLSQDSVAASTEKTLRLYDRRS(SEQ ID NO:5)；和
GRHWKNFALVPLLRE(SEQ ID NO:6)。
在一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括LVENGADVQAAAHGDF(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列或与其基本同源的序列(或由其组成)。
在另一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：
DGPTGARLLSQ(SEQ ID NO:8)；和
DAEVFKSPAASGEK(SEQ ID NO:9)，
或与其基本同源的序列。
在另一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：
SQDSVAASTEKTL(SEQ ID NO:10)；和
SGSLKPEDAEVF(SEQ ID NO:11)，
或与其基本同源的序列。
在一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：
VSPVITIQRPGD(SEQ ID NO:12)；
VSPVITIQRPGDGPTGA(SEQ ID NO:13)；
LNLHDGQNTTIPLLL(SEQ ID NO:14)；
YTDSYYKGQ(SEQ ID NO:15)
SLPSESTSH(SEQ ID NO:16)
EDPGNCEGVKR(SEQ ID NO:17)
DRQSAQPEEVYLR(SEQ ID NO:18)；和
QSAQPEEVYLR(SEQ ID NO:19)，
或与其基本同源的序列。
在一些实施例中，本发明提供了TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括如在本文实例3中表2、3、4、5和6中的每一个中的第二标题(标有双星号(**)的标题)下列出的氨基酸序列或与其基本同源的序列。使用更高的蛋白水解活性(或更严格或更强的蛋白水解条件)消化的此类肽通常不如使用更低的蛋白水解活性(或更不苛刻或更弱的蛋白水解条件)(例如更短的时间和/或更低浓度)消化的肽优选，例如，如在第一个标题(列于表2、3、4、5和6中的每一个中标有单个星号(*)的标题)下列出，但如果它们对蛋白质有或预测有功能重要性，则可能是特别有意义的。在表2、3、4、5和6(**)中的第二个标题下列出的肽可以被认为是之后消化的肽，并且在表2、3、4、5和6(*)中的第一个标题下列出肽可以被认为是首先被消化的肽。
在上述TRPV1的抗原表位的上下文中，与给定的氨基酸相比，所述基本同源的序列可以是包含1、2、3、4、5或6(优选1、2或3)个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定氨基酸序列具有至少70％序列一致性的序列，或是具有给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。关于与表面暴露的肽“基本同源”的氨基酸序列，“基本同源”序列的其他实例在本文中别处描述，并且“基本同源的”序列的这些实例也适用于上述特定的肽序列。上述特定的肽序列是表面暴露的肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了抗原表位，该抗原表位包括上述肽序列(或与其基本同源的序列)的延长、截短或环状版本(或由其组成)。在延长、截短和环状版本的表面暴露的肽的上下文中，本文在其他地方讨论了延长、截短的和环状版本的肽，并且该讨论也适用于上述肽序列。上述特定的肽序列是表面暴露的肽序列。
在一个实施例中，本发明提供TRPV2的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：
FAPQIRVNLNYRKGTG(SEQ ID NO:20)；
ASQPDPNRFDRDR(SEQ ID NO:21)
LNLKDGVNACILPLL(SEQ ID NO:22)
CTDDYYRGH(SEQ ID NO:23)
LVENGANVHARACGRF(SEQ ID NO:24)
EDPSGAGVPR(SEQ ID NO:25)；和
GASEENYVPVQLLQS(SEQ ID NO:26)，
或与其基本同源的序列。示例性基本同源的序列在本文其他地方讨论。
实施例的另一方面涉及构造成用于产生抗体的轭合物。轭合物包括与肽载体偶联或与肽载体混合的至少一个如上定义的抗原表位。
因此，在一个方面，本发明提供了包括本发明的或由本发明鉴别(或由本发明产生)的抗原表位的轭合物。轭合物可以包括抗原表位和任何不同的实体(即与抗原表位不同的任何实体)，例如标记物或肽载体。典型地，轭合物包括抗原表位和肽载体，其中所述抗原表位与所述肽载体偶联或混合。
在一个实施例中，肽载体选自下组，该组由以下各项组成(或包括以下各项)：钥孔戚血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白。例如,偶联可以是共价偶联或二硫桥。在一个实施例中，钥孔戚血蓝蛋白是优选的肽载体。在一些实施例中，抗原表位可以在其N-末端或C-末端(优选N-末端)处提供半胱氨酸残基。此类半胱氨酸残基可以促进抗原表位与肽载体(例如KLH)的偶联。
实施例的又另一方面涉及根据上述用于产生特异性结合蛋白质的抗体的抗原表位和/或轭合物的用途。
实施例的仍另一方面涉及用于产生特异性结合蛋白质的抗体的方法。该方法包括针对根据上文的抗原表位和/或轭合物培育抗体并分离抗体。分离抗体可以包括从其生产或产生的细胞(例如宿主细胞)和/或从生长培养基/上清液来分离抗体。
在一个具体实施例中，该方法包括通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解。该方法还包括在测试、检查或验证蛋白质的至少一种生物功能的功能测定中探测至少一种消化的、解构的或截短的版本的蛋白质。该方法进一步包括鉴别蛋白质中的抗原表位，将其鉴别为在至少一种表面暴露的肽中的，并且存在于参与如基于功能测定确定的发挥蛋白质的生物学功能的蛋白质的区域中的一种表面暴露的肽。该方法还包括培育针对抗原表位的抗体并分离抗体。
可以根据本领域已知的技术来培育针对抗原表位的抗体，这些技术包括例如本文前面所述的杂交瘤技术、噬菌体展示技术等。
实施例的另一方面涉及针对根据上文的抗原表位和/或轭合物的抗体。抗体特异性结合蛋白质。
因此，在一个方面，本发明提供由本发明的方法产生(或生产)的抗体。
在另一个方面，本发明提供了针对本发明抗原表位的抗体。可替代地观察到，本发明提供了结合本发明的抗原表位的抗体。可替代地观察到，本发明提供了与本发明的抗原表位特异性结合的抗体。
作为实例，本发明提供了针对抗原表位的抗体，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：LLSQDSVAASTEKTLRLYDRRS(SEQ ID NO:5)和GRHWKNFALVPLLRE(SEQ ID NO:6)。在一个实施例中，针对包含氨基酸序列LLSQDSVAASTEKTLRLYDRRS(SEQ ID NO:5)(或由其组成)的抗体是针对TRPV1的拮抗性(抑制性)抗体，优选具有抗体OTV1的实例部分中描述的一种或多种功能特性。该表位对应于位于TRPV1的N-末端细胞内结构域中的氨基酸序列。在一个实施例中，针对包含氨基酸序列GRHWKNFALVPLLRE(SEQ ID NO:6)(或由其组成)的抗体是针对TRPV1的激动性抗体，优选具有抗体OTV2的实例部分中描述的一种或多种功能特性。该表位对应于位于TRPV1的C-末端细胞内结构域中的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体可以针对细胞内TRPV1表位(或结构域)。在一些此类实施例中，抗体可以是针对细胞内TRPV1表位(或结构域)的拮抗性(抑制性)抗体。在其他此类实施例中，抗体可以是针对细胞内TRPV1表位(或结构域)的激动性抗体。
在一个实施例中，抗体与蛋白质的结合导致蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变。
因此，抗体可以是功能性抗体，例如激动性抗体或拮抗性抗体(例如针对TRPV1或TRPV2的拮抗性或激动性抗体)。拮抗性抗体能够结合蛋白质并抑制或降低蛋白质的功能。激动性抗体能够结合蛋白质并增强或增加蛋白质的功能。在TRPV1或TRPV2(或任何其他离子通道)的情况下，所涉及的功能可以是离子传输活性。例如，可以评估抗体阻断(降低)或增强(增加)辣椒素或钙调素结合的能力。具有此类能力的抗体形成本发明的优选实施例。
实施例的相关方面定义了根据上述用作药物的抗体。
针对抗原表位和/或轭合物的抗体可以通过用根据实施例的一种或多种抗原表位和/或一种或多种轭合物免疫动物来获得。免疫的动物可以选自下组，该组包括人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、非人灵长类动物、山羊、马和家禽。
根据实施例的抗体也可以通过使用根据实施例的一种或多种抗原表位和/或一种或多种轭合物的体外免疫方法获得。
根据本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
抗体可以是配体、抗体的一个或多个片段(例如Fab(片段抗原结合)片段、F(ab)'2片段(包含两个Fab的片段)、ScFv片段(单链可变片段)、双抗体、四抗体、或完整抗体。
典型地，本发明的抗体能够与其所针对的蛋白质的全长版本，例如其天然形式的蛋白质的全长版本(例如在细胞中或细胞上)结合(例如特异性结合)。
在一些实施例中，抗体是针对本文别处描述的蛋白质(或蛋白质类型)的抗体。
抗体和抗原表位可以被分离或纯化。在本文的上下文中，使用的术语“分离的”或“纯化的”是指当此类分子从其天然环境中分离、纯化或天然环境中基本不含此类分子时(例如，从生物体分离或纯化(如果确实天然存在))，或者是指此类分子通过技术方法产生时，即包括重组和合成产生的分子。因此，术语“分离的”或“纯化的”典型地是指基本上不含细胞材料的或衍生自其来源的其他蛋白质的抗体或抗原表位。在一些实施例中，当化学合成时，当通过重组技术或化学前体或其它化学品生产时，此类分离的或纯化的分子基本上不含培养基。
可以评估由本发明产生的抗体对其靶蛋白的功能效应，并且本领域技术人员将容易地能够确定(例如基于靶蛋白的性质)使用的适合的测定法。例如，如果抗体是针对TRPV1(或任何其他离子通道)的抗体，则可以例如使用本文实例2中描述的电生理学和/或YO-PRO摄取测定法来评估抗体的功能效应。
本发明的方法可以用于产生抗体，然后可以将该抗体分离、生产或制造用于不同下游用途。因此，本发明的另一方面提供了生产或制造和/或分离抗体的方法。
当已经使用本发明的方法产生、生产、选择、鉴别、分离和/或纯化一种或多种抗体时，可以制造，以及如果需要，与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂来配制这些抗体或其组分、片段、变体、或衍生物。这样制造的分子或其组分、片段、变体或衍生物也涵盖在本发明中。可替代地，这些分子可以采用编码所述抗体的核酸的形式，这些核酸转而可以并入适当的表达载体和/或包含在适合的宿主细胞中。因此，编码所述抗体的核酸分子或包含所述核酸分子的表达载体形成本发明的其他方面。
一旦根据本发明已经产生或产生具体抗体或其组分、片段、变体或衍生物，编码抗体的表达载体可以容易地用于(或适于使用)通过在适当的宿主细胞或系统中表达，并且酌情从宿主细胞或系统或其生长培养基或上清液中分离抗体来产生足够量的分子。对于多克隆抗体，这些抗体可以从免疫的动物的血清中被分离或纯化。
因此，本发明的仍另一方面提供了一种生产或制造抗体的方法，该方法包括以下步骤：根据如上所述的本发明的方法产生或生产抗体，制造或产生所述抗体或其组分、片段、变体或衍生物，并任选地用至少一种药学上可接受的载体或赋形剂配制所述制造的抗体。
抗体的所述变体或衍生物包括类肽等同物，具有非肽合成骨架的分子、和与原始鉴别的多肽相关或衍生自原始鉴别的多肽的多肽，其中氨基酸序列已经通过单个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失进行修饰，这些取代、添加和/或修饰可替代地或另外地包括已经例如通过去糖基化或糖基化的化学修饰的氨基酸的取代或添加。方便地，此类衍生物或变体可与其衍生的原始多肽具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列一致性。
由于本发明涉及抗体的产生，所述变体或衍生物进一步包括将一种形式的抗体分子转化为另一种形式(例如从Fab转化为scFv、或反之亦然，或在本文别处描述的任何形式的抗体分子之间的转化，例如转化为如本文所述的任何其他类型的抗体片段)，或将抗体分子转化为具体类别的抗体分子(例如，抗体分子转化为IgG或其亚类(例如IgG1或IgG3)，这些IgG特别适用于治疗性抗体)或人源化或任何抗体的嵌合版本的形成。
所述变体或衍生物还包括抗体与另外的功能组分的联合，例如其可用于所述抗体的下游应用。例如，抗体可以与将其靶向体内具体位点的组分相关，或者与可用于例如成像或其他诊断应用的可检测的部分相关或与负荷(payload)如放射性同位素、毒素或化学治疗剂(免疫轭合物形式)相关。
清楚地，这些组分、片段、变体或衍生物结合配偶体分子或靶实体的主要要求是它们在结合能力方面保持其原始功能活性或具有改善的功能活性。
使用本发明的方法产生或生产或制造的抗体分子可以用于需要对靶实体特异的抗体(例如对具体抗原特异的抗体)的任何方法。因此，抗体可以用作分子工具，并且本发明的另一方面提供了包括如本文所定义的此类抗体的试剂。此外，此类分子可用于体内治疗或预防应用、体内或体外诊断或成像应用或体外测定。
本发明的一些特定实施例如下：
1.一种产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：
(i)通过将蛋白质暴露于限制性或约束性蛋白水解来鉴别所述蛋白质中的抗原表位，所述限制性或约束性蛋白水解通过将所述蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化的、解构的或截短的蛋白质版本和至少一种表面暴露的肽，所述表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从蛋白质切割掉，且生成基于所述表面暴露的肽的抗原表位；和
(ii)培育针该抗原表位的抗体。
2.一种产生针对蛋白质的抗体的方法，包括以下步骤：
(i)将蛋白质暴露于限制性或约束性蛋白水解，所述限制性或约束性蛋白水解通过将所述蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化的、解构的或截短的蛋白质版本和至少一种表面暴露的肽，所述表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从蛋白质切割掉；和；
(ii)通过鉴别存在于蛋白质区域中的至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，所述表位暴露的肽导致在限制性或约束性蛋白水解过程中，肽从蛋白质切割掉或去除时，蛋白质的生物学功能缺乏或发生显著改变；或
基于生物信息学和/或蛋白质的生物功能的已知数据选择蛋白质内的至少一个目标区域，并通过鉴别存在于所述至少一个目标区域内的至少一个表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位；和
(iii)培育针该抗原表位的抗体。
3.实施例1或者实施例2中的方法，其中在导致至多8个或至多7个或至多5个表面暴露的肽，或至多8个或至多7个或至多5个独特表面暴露的肽的条件下使用所述至少一种蛋白酶，表面暴露的肽通过在蛋白水解消化的材料样品中所述蛋白酶的作用从蛋白质切割掉，并且任选地，多个样品依次或平行地处理或运行，任选地在不同的时间段和/或在所述蛋白酶的不同浓度下。
4.实施例1-3中任意一项的方法，其中所述至少一种蛋白酶在通过所述蛋白酶的作用导致至多8个或至多7个或至多5个表面暴露的肽从蛋白质切割掉的条件下使用。
5.实施例1-4中任意一项的方法，其中所述至少一种蛋白酶的动力学活性快速降低使得所述表面暴露的肽一次一个或最多一次几个切割掉，例如在样品中一次最多8个或最多7个或最多5个，并且任选地，多个样品可以依次或平行地处理或运行。
6.实施例1-5中任意一项的方法，其中所述切割掉表面暴露的肽基于与所述至少一种蛋白酶接触后出现的顺序排序，其中首先或在所述蛋白酶的最低浓度下切割掉的表面暴露的肽被给予高等级，并且后期或在所述蛋白酶的最高浓度下切割掉的表面暴露的肽被给予低等级，并且任选地在其间切割掉的表面暴露的肽以它们出现的顺序排序。
7.实施例6的方法，其中所述方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽用于抗原表位发育和培育针对所述抗原表位的抗体。
8.实施例6的方法，其中所述方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽，基于所述表面暴露的肽构建抗原表位并培育针对所述抗原表位的抗体。
9.实施例6的方法，其中所述方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽，将所述表面暴露的肽与蛋白质的限定的生物学特性相关联，基于所述表面暴露的肽构建抗原表位并培育针对所述抗原表位的抗体。
10.实施例1-9中任意一项的方法，其中使用单一蛋白酶消化、解构和/或截短所述蛋白质。
11.实施例1-9中任意一项的方法，其中使用多种蛋白酶来消化、解构和/或截短所述蛋白质。
12.实施例11的方法，其中所述多种蛋白酶一次一个地按顺序使用，并行使用，或者在多种蛋白酶的单一混合物中使用。
13.实施例11或实施例12的方法，其中所述多种蛋白酶用于鉴别重叠、互补或独特的表面暴露的肽。
14.实施例1-13中任意一项的方法，其中所述蛋白酶选自：胰蛋白酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰内肽酶、Lys-C、Lys-N、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、肠激酶、因子Xa、颗粒酶B、中性白细胞弹性蛋白酶、脯氨酸-内肽酶、葡萄球菌肽酶I和凝血酶。
15.实施例1-14中任意一项的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
16.实施例1-15中任意一项的方法，其中所述蛋白质是存在于衍生自细胞的蛋白脂质体中的膜蛋白。
17.实施例1-16中任意一项的方法，其中所述蛋白脂质体固定在流动池中以产生膜蛋白的固定相。
18.实施例1-15中任意一项的方法，其中所述蛋白质在含蛋白质的脂质囊泡中，所述脂质囊泡表面结合或悬浮在溶液中。
19.实施例1-15中任意一项的方法，其中所述蛋白质在表面结合或悬浮在溶液中的完整细胞中。
20.实施例1-15中任意一项的方法，其中所述蛋白质在溶液中。
21.实施例1-20中任一项的方法，其中所述蛋白质是人蛋白质组的任何蛋白质。
22.实施例1-21中任一项的方法，其中所述蛋白质是膜结合蛋白、可溶性蛋白、细胞外蛋白或细胞内蛋白。
23.实施例1-22中任一项的方法，其中所述蛋白质是膜蛋白或与膜相关蛋白。
24.实施例1-23中任一项的方法，其中所述蛋白质是TRP超家族中的离子通道。
25.实施例24的方法，其中所述蛋白质是TRPV1或TRPV2。
26.实施例1-23中任一项的方法，其中所述蛋白质是兴奋性氨基酸受体。
27.实施例26的方法，其中所述蛋白质是NMDA受体或G蛋白。
28.实施例1-23中任一项的方法，其中所述蛋白质是致癌蛋白质。
29.实施例28的方法，其中所述蛋白质是选自KRAS、NRAS和HRAS的致癌小GTP酶。
30.实施例1-23中任一项的方法，其中所述蛋白质是免疫调节蛋白。
31.实施例30的方法，其中所述蛋白质选自PD1、PDL1、CD40、OX40、VISTA、LAG-3、TIM-3、GITR和CD20。
32.实施例1-31中任一项的方法，其中所述切割掉的肽采用质谱法鉴别。
33.实施例24的方法，其中用LC-MS/MS鉴别所述切割掉的肽。
34.实施例2-33中任一项的方法，其中所述生物学功能选自所述蛋白质结合靶标例如配体或受体的能力、所述蛋白质的酶活性、离子通道活性、转运蛋白活性、和释放，例如胰岛素释放和摄取机制。
35.实施例1-34中任一项的方法，其中通过杂交瘤技术、噬菌体展示技术或通过用所述抗原表位免疫动物来进行针对抗原表位的抗体的培育。
36.根据实施例1-35中任一项的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
37.通过实施例1-36中任一项的方法产生的抗体。
38.TRPV1的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸序列：
LLSQDSVAASTEK(SEQ ID NO:2)；
LLSQDSVAASTEKTLR(SEQ ID NO:3)和
QFSGSLKPEDAEVFKSPAASGEK(SEQ ID NO:4)；
或与其基本同源的序列；
其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。
39.TRPV1的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸序列：
LLSQDSVAASTEKTLRLYDRRS(SEQ ID NO：5)；和
GRHWKNFALVPLLRE(SEQ ID NO：6)。
40.TRPV1的抗原表位，其包括LVENGADVQAAAHGDF(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列，或者与其基本同源的序列；
其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。
41.TRPV1的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸序列：
DGPTGARLLSQ(SEQ ID NO：8)；和
DAEVFKSPAASGEK(SEQ ID NO：9)
或与其基本同源的序列；
其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。
42.TRPV1的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸：
SQDSVAASTEKTL(SEQ ID NO：10)；和
SGSLKPEDAEVF(SEQ ID NO：11)
或与其基本同源的序列；
其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。
43.TRPV1的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸：
VSPVITIQRPGD(SEQ ID NO:12)；
VSPVITIQRPGDGPTGA(SEQ ID NO:13)；
LNLHDGQNTTIPLLL(SEQ ID NO:14)；
YTDSYYKGQ(SEQ ID NO:15)；
SLPSESTSH(SEQ ID NO:16)；
EDPGNCEGVKR(SEQ ID NO:17)；
DRQSAQPEEVYLR(SEQ ID NO:18)；和
QSAQPEEVYLR(SEQ ID NO:19)；
或与其基本同源的序列；
其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。
44.TRPV2的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸：
FAPQIRVNLNYRKGTG(SEQ ID NO:20)；
ASQPDPNRFDRDR(SEQ ID NO:21)；
LNLKDGVNACILPLL(SEQ ID NO:22)；
CTDDYYRGH(SEQ ID NO:23)；
LVENGANVHARACGRF(SEQ ID NO:24)；
EDPSGAGVPR(SEQ ID NO:25)；和
GASEENYVPVQLLQS(SEQ ID NO:26)
或与其基本同源的序列；
其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。
45.针对实施例38-44中任一项的抗原表位的抗体。
如上所述，我们开发了一种鉴别表面暴露的抗原表位的方法，该方法使用动力学控制的蛋白水解产生药理学活性抗体。理想地，蛋白水解步骤进行得足够缓慢以使得蛋白酶在此时脱落(tear off)单个或几个肽。首先出现的肽是表面暴露的并且容易接近抗体，因此通常优于晚期出现的肽。这些肽的基于序列的功能性意义然后可以使用策划的生物信息学数据以及对截短的蛋白质进行的功能测定进行交叉相关联。
然而，本发明还提供了对上述方法进行改进的方法，其允许进一步优化表位设计和/或鉴别其他(另外的)表位。这种改进的方法称为方法A和B。
至于本文所述的其他方法，这些改进的方法可以并行使用几种蛋白酶，以最大化所获得的表位的数量。已经在离子通道TRPV1上测试了5种蛋白酶，并且可以扩展有用蛋白酶的范围，其中指定的蛋白酶具有不同的裂解特异性以从天然和最低消化的蛋白质产生更多数量的独特肽。
总之，这些改进的方法应该改善抗体开发并产生新的治疗和药理学活性抗体以对抗疾病。可以使用本文描述的方法生产细胞内和细胞外作用的药理学活性抗体。
在与用于发现新抗体的许多已知技术不同的本发明的方法中，可以从一开始就设计抗体以结合特定位点并任选地执行特定功能，而不是盲目地完成，其中最初的焦点是通常根据亲和力而非功能性，随后测试显示出良好结合特征的抗体子集的药理学和生物学效应。
方法A
因此，一方面，本发明提供了鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：
(i)在所述蛋白质暴露于一种或多种蛋白酶的限制性或约束性蛋白水解后，鉴别一种或多种蛋白酶切割所述蛋白质的位点；和
(ii)探测所述蛋白质上的多个表位，所述表位位于切割位点之间，与切割位点重叠，或位于侧接具有针对所述表位的抗体的切割位点的区域中，从而鉴别一个或多个可以被抗体结合的表位。
可以使用任何合适的蛋白酶，并且可以在这种方法中使用的合适的蛋白酶在本文其他地方描述。因此，可以使用单个或多个蛋白酶，如本文其他地方所述。如果使用多种蛋白酶，则在一些实施例中，它们可以如本文其他地方所述并行使用。本文其他地方也描述了限制性或约束性蛋白水解。本文所述的任何限制性或限制性蛋白水解条件可根据该方面使用(方法A)。
在上述方法的部分(i)中鉴别的位点可以称为切割位点(蛋白酶在该处已切割或将预测切割和切割掉表面暴露的肽的位点)。可以使用任何合适的方法/技术来鉴别一种或多种蛋白酶在该处已切割(或将切割)所述蛋白质的位点(切割位点)。一种合适的技术是质谱法。通过限制性或约束性蛋白水解(例如通过质谱法鉴别)从蛋白质释放(或切割掉)的肽序列的知识是切割位点的信息。在这方面，释放的肽末端的残基(切割掉的肽)提供了蛋白质中(例如天然或全长蛋白质中)切割位点的信息。
为避免疑义，上述方法(方法A)的步骤(ii)中的“切割位点”可以被认为是蛋白质的氨基酸序列中(例如，天然蛋白质或全长蛋白质或野生型蛋白质中)的位点(或位置)，其对应于根据步骤(i)已经(或将要)切割(或裂解)的位点(对应于步骤(i)中鉴别的位点)。因此，方法A的步骤(ii)通常涉及探测天然蛋白质(或全长蛋白质或野生型蛋白质)上的多个表位，所述表位位于切割位点之间，与切割位点重叠，或者位于侧接具有针对所述表位的抗体的切割位点的区域中，从而鉴别可以被抗体结合的一个或多个表位。
为避免疑义，优选地，“切割位置之间”意指相邻切割位点之间。因此，优选地，“切割位点之间”意指在蛋白质的氨基酸序列中(例如在天然蛋白质或全长蛋白质或野生型蛋白质中)的给定切割位点和下一个(或之前的)切割位点之间。因此，优选地，“切割位点之间”指在一级氨基酸序列中彼此相邻的切割位点之间。
在一些实施例中，该方法可以进一步包括产生(或合成)多个(例如2个或更多个、3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个)分离的表位的步骤(在步骤(ii)之前)，所述分离的表位具有与所述蛋白质上的表位(或序列)相对应的序列，所述蛋白质位于切割位点之间、与切割位点重叠、或位于侧接切割位点的区域中，并生成(产生)针对(结合)所述分离的表位的抗体。然后可以将这些抗体用于上述方法的步骤(ii)中，用于探测所述蛋白质上(例如天然或全长蛋白质中)的多个表位，所述多个表位位于切割位点之间，与切割位点重叠，或者位于侧接切割位置的区域中。可以使用用于产生分离的表位或用于产生抗体的任何合适的方法/技术(例如，如本文其他地方所述)，并且技术人员将熟悉这些。
在一些实施例中，表位具有不同的长度和/或序列。因此，在多个(或一组)表位内，可存在彼此具有不同长度和/或序列的表位。在其他实施例中，表位具有相同(或相似)的长度并且通常具有不同的序列。因此，在一些实施例中，在多个(或一组)表位内，表位具有相同(或相似)的长度。
表位可以具有任何合适的长度。在一些实施例中，分离的表位长度为7-8个氨基酸或具有如本文其他地方所述的长度。
在优选的实施例中，表位与切割位点重叠(或包含或包围切割位点)。
通常，表位(或任何给定表位的至少一部分)将在切割位点的50个氨基酸内，即相对于切割位点的+50至-50个氨基酸。优选地，表位(或任何给定表位的至少一部分)将在切割位点的20个氨基酸内，即相对于切割位点的+20至-20个氨基酸，或将在切割的10个氨基酸内，即相对于切割位点的+10至-10个氨基酸，或者在切割位点的5个氨基酸内，即相对于切割位点的+5至-5个氨基酸。
在一些实施例中，多个表位是一组(set)(或一组(group))表位，其中所述组中每个表位的序列从所述组中的另一个表位偏移一个或几个(例如,1、2或3个)，优选一个，氨基酸。换句话说，在一些实施例中，在一组(多个)表位中，每个表位序列被一个或几个(例如1、2或3个)，优选一个，氨基酸移位到该组中的另一个表位序列。因此，多个表位可以是嵌套的表位组，例如，如图16d所示。通常，这种嵌套的表位组将相对于(或围绕)切割位点在任一方向(或两个方向)上覆盖蛋白质序列的多达约50个氨基酸。优选地，这种嵌套的表位组将相对于(或围绕)切割位点在任一方向(或两个方向)上覆盖蛋白质序列的多达约20或10或5个氨基酸。
当使用嵌套的表位组时，在优选的实施例中，显著数目的表位将包含切割位点，优选地，嵌套组中基本上所有的表位将包含切割位点，更优选地，嵌套组中所有的表位将包含切割位点。
在一些实施例中，完成了主动进行限制性或约束性蛋白水解的步骤。在其他实施例中，没有完成进行限制性或约束性蛋白水解的主动步骤，而是完成基于来自先前进行的限制性或约束性蛋白水解实验的数据(例如，存档数据，例如，质谱数据，包含从先前限制性或约束性蛋白水解实验中的蛋白质释放的肽序列)对一种或多种蛋白酶切割所述蛋白质的位点的鉴别。再者，用于进行限制性或约束性蛋白水解的优选的和合适的方法在本文其他地方描述。
探测多个表位意指多个(例如2个或更多个、3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个，或多于一个但最多4个、5个、10个、20个或50个)蛋白质(例如天然或全长蛋白质)上的表位(或潜在表位)被分析(或评估)它们被抗体结合的能力，所述抗体已经针对(或结合)对应于蛋白质上表位(或潜在表位)的分离表位产生。
如上所述，探测切割位点之间，与切割位点重叠，或者位于侧接切割位点的区域中的蛋白质上的多个表位，可以用针对所述表位的抗体(即抗体充当探针)完成。实际上，用抗体(例如Fab片段或其他抗体片段)进行探测是优选的。然而，备选地，其他结合实体可以用作探针(例如，可以使用其他亲和探针)。亲和体是可以使用的亲和探针的一个实例。
优选的蛋白质在本文别处描述。
在一个方面，本发明提供了通过鉴别蛋白质上的表位的方法鉴别的表位(或抗原表位)，所述蛋白质可以被上文描述的抗体结合(方法A)。一方面，本发明提供了与蛋白质上的这种表位结合的抗体。在一些实施例中，在如本文所述的切割位点附近(例如，在切割位点的5、10、20或50个氨基酸以内)结合的抗体是优选的。本领域技术人员熟悉用于产生针对给定表位的抗体的方法或技术，并且可以使用任何合适的方法(例如，如本文其他地方所述)。优选类型的抗体也在本文其他地方描述。
在一些实施例中，该方法(方法A)还包括产生(或培育或生产)针对(或结合)由方法A(在步骤(ii)中鉴别)鉴别的表位的抗体的步骤。任选地，可以进行用至少一种药学上可接受的载体或赋形剂配制抗体的进一步的步骤。
因此，在一个方面，本发明提供了产生或制造抗体的方法，所述抗体结合由方法A(在步骤(ii)中鉴别)鉴别的表位。任选地，进可以进行用至少一种药学上可接受的载体或赋形剂配制所述生产或制造的抗体的进一步的步骤。产生或制造抗体的方法在本文其他地方描述，并且适用于(加上有必要的变更)本发明的这个方面。
在一个方面，本发明提供缀合物，其包含通过方法A鉴别的至少一个表位，其与肽载体偶联或混合。缀合物在本文其他地方描述，并且该讨论适用于(加上有必要的变更)本发明的这个方面。
结合由方法A鉴别的表位的抗体(或由方法A鉴别的表位或包含此类表位的缀合物)可用于治疗。
可以测试靶向蛋白质上的多个表位的抗体(例如一个或多个，或抗体的组或阵列，或大量抗体)结合蛋白质的能力，例如以评估它们对蛋白质的结合亲和力或其他的功能作用(例如，如本文其他地方所述)。因此，可以筛选抗体以鉴别最佳结合物。因此，可以鉴别特别有用的表位(例如用于抗体靶向)，例如，如此表位：其特别适合被高亲和力抗体靶向或其靶向导致对靶蛋白的显着或可测量的功能效应(例如拮抗或激动作用)。因此，可以鉴别最佳表位(例如用于抗体靶向，例如用于治疗用途)。因此，作为另外一种选择，本发明提供了一种优化表位设计或选择最佳表位的方法(例如用于针对或靶向其的抗体)。该方法可以允许确定表位相对于切割位点的最佳长度和位置。
当使用限制性蛋白水解作为验证抗体结合的可接近区域的工具时，它依赖于从蛋白质释放肽，即蛋白酶在围绕正确大小的序列的两个可接近位点处切割以用于例如通过质谱法检测。从这样的实验获得的信息是验证被消化并导致肽释放的两个切割位点的可接近性。然而，切割位置周围的可接近区域的大小和位置可能是未知的。方法A使用抗体(或其他结合蛋白)来验证切割位点周围区域的可接近性。例如，通过开发靶向切割位点周围的表位的抗体并随后测试它们的结合亲和力和/或功能，可以确定相对于切割位点的最佳表位长度和位置。该方法可包括开发一组(一种以上)或大量抗体，靶向相对于切割位点的不同长度和不同序列位置的表位。通常，每个表位相对于彼此移位一个氨基酸并覆盖切割位点周围的-20至+20个氨基酸。可以并行使用不同的蛋白酶以使用限制性蛋白水解实验验证可接近的切割位点。最佳表位设计可以在已经由不同蛋白酶验证的切割位点之间变化，因为不同的蛋白酶可能需要更大或更小的可接近区域以便能够结合和消化切割位点。因此，通过上述方法(方法A)探测每个经验证的切割位点，可以确定每种类型蛋白酶的最佳表位设计。
本文所述的其他方法的优选特征可以适用于(加上有必要的变更)本发明的这个方面(方法A)。
如上所述，我们已经开发了额外的和改进的方法，因为使用先前的方法，可能遗漏几个潜在的Ab结合位点，因为一些肽未被释放。例如，如果蛋白酶仅裂解某个氨基酸序列周围的两个切割位点之一，则可能发生这种情况。在下面描述的改进方法(方法B)中，通过开发基于计算机模拟、Fab-蛋白酶同源结合和多蛋白酶消化数据集的新搜索算法，可以发现特异且新颖的抗体结合位点，此外，我们还为天然和部分消化的蛋白质提供了新的结构数据。该技术(与上述方法A一起)因此可以为探测蛋白质结构和功能提供综合工具。
方法B
另一方面，本发明提供了鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：
(i)用一种或多种蛋白酶执行所述蛋白质的计算机模拟蛋白酶消化，以鉴别蛋白质上的位点，所述位点被预测由所述一种或多种蛋白酶切割，并任选地进行蛋白质同源性建模以预测哪些计算机模拟预测的蛋白酶切割位点可能暴露，和/或任选地进行抗体片段或蛋白酶的计算机模拟对接，以预测哪些计算机模拟预测的切割位点可能在体外被切割；
(ii)用一种或多种蛋白酶进行所述蛋白质的体外蛋白酶消化；
(iii)通过步骤(ii)的体外蛋白酶消化鉴别从所述蛋白质释放的肽，从而鉴别切割位点；
(iv)将步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的切割位点与步骤(iii)中鉴别的切割位点进行比较；
(v)探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域包含或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，但不是步骤(iii)中用一种或者多种抗体鉴别的切割位点；和
(vi)鉴别所述一种或多种抗体是否与所述一种或多种表位结合，从而鉴别可被抗体结合的蛋白质上的表位。
在上述方法(方法B)中进行计算机模拟蛋白酶消化步骤。然而，可替代地，可以使用用于预测蛋白质的蛋白酶消化的任何其他方法或技术。例如，可以通过眼睛检查蛋白质的氨基酸序列，并且基于给定蛋白酶的特异性和规则的知识鉴别预测的切割位点(即，预测由蛋白酶切割的位点)。可以使用基于对给定蛋白酶的特异性和规则的知识来预测蛋白质的蛋白酶消化的任何方法或技术。因此，在该方法的一些实施例中，尽管基于计算机的方法是优选的，但不需要基于计算机的预测。
可以使用任何合适的蛋白酶，且合适的蛋白酶在本文其他地方描述。因此，可以使用单个或多个蛋白酶，如本文其他地方所述。
该方法任选地涉及建模(例如计算机模拟建模)，例如蛋白质建模，例如蛋白质同源建模，以预测哪些计算机模拟预测的蛋白酶切割位点可能被暴露(例如溶剂暴露或表面暴露)。
该方法任选地涉及进行计算机模拟对接(或结合)抗体片段(例如Fab片段或本文其他地方描述的其他抗体片段)或蛋白酶，以预测哪些计算机模拟预测的切割位点可能在体外切割。本领域技术人员将能够容易地执行这种计算机模拟对接分析或建模。
可以使用任何合适的手段来执行建模(例如同源建模)，例如MOE软件中的同源建模引擎(Molecular Operating Environment(MOE)2015.10.Chemical Computing GroupInc.,1010 Sherbrooke St.West,Suite#910,Montreal,QC,Canada,H3A 2R7.2016)。
诸如MOE软件之类的软件可用于构建和建模蛋白质模型和/或进行蛋白质-蛋白质对接建模(计算机模拟对接)。该软件允许预测蛋白质-蛋白质结合配置并且可以产生对接的蛋白质结构。因此，可以产生与抗体(或抗体片段)对接(或结合)或与蛋白酶对接(或结合)的蛋白质模型。
在优选的实施例中，用一种或多种蛋白酶对蛋白质进行体外蛋白酶消化是限制性或约束性蛋白水解。本文其他地方描述了限制性或约束性蛋白水解。
在使用多种蛋白酶的情况下，优选地，蛋白酶单独使用(例如平行使用)。
通过上述方法(方法B)的步骤的体外蛋白酶消化鉴别从所述蛋白质释放的肽(肽序列)，可以通过任何合适的方法或技术进行，例如通过质谱法(例如LC-MS/MS)。鉴别了从所述蛋白质释放的肽(肽序列)后，一种或多种蛋白酶切割所述蛋白质的位点(切割位点)很容易被鉴别为通过限制性或约束性蛋白水解(例如通过质谱法鉴别)从蛋白质释放的肽序列的知识是切割位点的信息。在这方面，释放的肽末端的残基(切割掉的肽)提供了蛋白质中(例如天然或全长蛋白质中)切割位点的信息。
方法B的步骤(v)是指探测含有或侧接切割位点的蛋白质区域中的一个或多个表位，所述切割位点是在步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，但不是步骤(iii)用一种或多种抗体鉴别的切割位点。从本文其他地方可以明显看出，并且为了避免疑问，切割位点(其一个或多个表位重叠或侧接)可以被认为是蛋白质的氨基酸序列中(例如，天然蛋白质或全长蛋白质或野生型蛋白质中)的位点(或位置)，其对应于预测在步骤(i)中被切割(鉴别)但在步骤(iii)中未鉴别的位点。
探测一个或多个(例如多个)表位是指蛋白质(例如天然或全长蛋白质)上的一个或多个表位(或潜在表位)被分析(或评估)它们被抗体结合的能力，所述抗体已经产生针对(或结合)与蛋白质上的表位(或潜在表位)相对应的分离的表位生成。在优选的实施例中，探测多个表位(或表位阵列)。
因此，方法B的步骤(v)通常涉及探测包含或侧接切割位点的天然(或全长或野生型)蛋白质区域中的一个或多个表位，所述切割位点是步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，但这不是步骤(iii)中用一种或多种抗体鉴别的切割位点。或者，方法B的步骤(v)通常涉及探测在所述蛋白质的区域中的天然(或全长或野生型)蛋白质，所述蛋白质含有或侧接切割位点，所述切割位点是在步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，但这不是步骤(iii)中用一种或多种抗体鉴别的切割位点。
在一些实施例中，该方法可以进一步包括产生(或合成)一种或多种(例如多种，例如2种或更多种、3种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种，例如最多3种、最多4种、最多5种、最多10种、最多20种或最多50种)分离的表位的步骤(步骤(v)之前)，所述分离的表位具有对应于所述蛋白质上的一个或多个表位(或序列)的序列，所述一个或多个表位(或序列)位于包含或侧接切割位点的蛋白质区域中(切割位点是步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，但不是步骤(iii)中鉴别的切割位点)，并产生(引发)针对(结合)所述分离的表位的抗体(例如多克隆抗体)。在优选的实施例中，产生多个表位(或表位阵列)并产生多个抗体(或抗体阵列)。然后可将这些抗体用于上述方法的步骤(v)中，以探测所述蛋白质上(例如天然或全长蛋白质中)的一个或多个表位。可以使用用于产生分离的表位或用于产生抗体的任何合适的方法或技术(例如，如本文其他地方所述)，并且技术人员将熟悉这些。
在一些实施例中，表位具有不同的长度和/或序列。因此，在多个(或一组)表位内，可存在彼此具有不同长度和/或序列的表位。在其他实施例中，表位具有相同(或相似)的长度并且通常具有不同的序列。因此，在一些实施例中，在多个(或一组)表位内，表位具有相同(或相似)的长度。
表位可以具有任何合适的长度。在一些实施例中，分离的表位长度为7-8个氨基酸或具有如本文其他地方所述的长度。
在优选的实施例中，表位包含切割位点(或与切割位点重叠或包围切割位点)。
通常，表位(或任何给定表位的至少一部分)将在切割位点(所述切割位点是在步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点但不是步骤(iii)中鉴别的切割位点)的50个氨基酸内，即相对于切割位点的+50至-50个氨基酸。优选地，表位(或任何给定表位的至少一部分)将在切割位点(切割位点是在步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点但不是步骤(iii)中鉴别的切割位点)的20个氨基酸内，即相对于切割位点的+20至-20个氨基酸，或切割位点的10个氨基酸内，即相对于切割位点的+10至-10个氨基酸，或在切割位点的5个氨基酸内，即相对于切割位点的+5至-5个氨基酸。
在一些实施例中，多个表位是一组表位，其中该组中每个表位的序列从该组中的另一个表位偏移一个或几个(例如1、2或3个)氨基酸，优选一个。换句话说，在一些实施例中，在一组(多个)表位中，每个表位序列被一个或几个(例如1、2或3个)氨基酸(优选一个)移位到该组中的另一个表位序列。因此，多个表位可以是嵌套的表位组，例如，如图16d所示。通常，这种嵌套的表位组将相对于(或围绕)切割位点(切割位点是在步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点但不是步骤(iii)中鉴别的切割位点)在任一方向(或两个方向)上覆盖蛋白质序列的多达约50个氨基酸。优选地，这种嵌套的表位组将相对于(或围绕)切割位点(切割位点是在步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点但不是步骤(iii)中鉴别的切割位点)在任一方向(或两个方向)上覆盖蛋白质序列的多达约20个氨基酸。在一些实施例中，这种嵌套的表位组将相对于(或围绕)切割位点(切割位点是在步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点但不是步骤(iii)中鉴别的切割位点)在任一方向(或在两个方向上，优选在两个方向上)覆盖蛋白质序列的多达约6个氨基酸。。
当使用嵌套的表位组时，在优选的实施例中，显著数量的表位将包含切割位点，优选地，嵌套组中的基本上所有表位将包含切割位点，更优选地，嵌套组中的所有表位将包含切割位点。
如上所述，可以利用针对所述表位的抗体(即抗体充当探针)来探测蛋白质上的表位，所述表位在切割位点之间、与切割位点重叠或位于侧接切割位点的区域中。实际上，用抗体(例如Fab片段或其他抗体片段)进行探测是优选的。然而，备选地，其他结合实体可以用作探针(例如可以使用其他亲和探针)。亲和体是可以使用的亲和探针的一个实例。
优选蛋白质在文中其他地方描述。
另一方面，作为在方法B的步骤(ii)中主动进行体外蛋白酶消化的替代方案，没有进行蛋白质消化的主动步骤(没有体外步骤)，而是鉴别从蛋白质释放的肽并因此鉴别切割步骤(iii)中的位点基于来自先前进行的蛋白水解实验的数据(例如，存档数据，例如质谱数据，包含从来自先前蛋白水解实验的蛋白质释放的肽序列)完成。然而，在优选的方法中，进行了主动进行体外蛋白酶消化(优选地限制性或约束性蛋白水解)的步骤。
在一个方面，本发明提供表位(或抗原表位)，例如，分离的表位，其通过鉴别蛋白质上可被如上所述的抗体结合的表位的方法鉴别(方法B)。一方面，本发明提供了与蛋白质上的这种表位结合的抗体。在一些实施例中，在如本文所述的切割位点附近，例如，切割位点的5、10、20或50个氨基酸内结合的抗体是优选的。本领域技术人员熟悉用于产生表位(例如分离的表位)和针对给定表位的抗体的方法或技术，并且可以使用任何合适的方法(例如，如本文其他地方所述)。优选类型的抗体也在本文其他地方描述。
在一个方面，本发明提供了与蛋白质上的表位结合的抗体，所述蛋白质含有或侧接(优选含有)切割位点，所述切割位点是计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，但不是通过体外蛋白水解(例如限制性或约束性蛋白水解)鉴别的切割位点。
可以测试蛋白质上靶向表位(优选多个表位)的抗体(例如一组抗体或抗体阵列或大量抗体)结合蛋白质的能力，例如评估它们对蛋白质的结合亲和力或其他功能效应(例如，如本文其他地方所述)。因此，可以筛选抗体以鉴别最佳结合物。因此，可以鉴别特别有用的表位(例如用于抗体靶向)，例如，这样的表位：其特别适合被高亲和力抗体靶向或其靶向导致对靶蛋白的显着或可测量的功能效应(例如拮抗或激动作用)。因此，可以鉴别最佳表位(例如用于抗体靶向)。因此，作为另外一种选择，本发明提供了一种优化表位设计或选择最佳表位的方法(例如用于针对其培育或靶向其的抗体)。该方法可以允许确定表位相对于切割位点的最佳长度和最佳位置。
在一些实施例中，该方法(方法B)还包括产生(或培育或生产)针对(或结合)由方法B(在步骤(vi)中鉴别)鉴别的表位的抗体的步骤。任选地，可以进行用至少一种药学上可接受的载体或赋形剂配制抗体的进一步的步骤。
因此，在一个方面，本发明提供了产生或制造抗体的方法，所述抗体结合由方法B(在步骤(vi)中鉴别)鉴别的表位。任选地，可以进行用至少一种药学上可接受的载体或赋形剂配制所述生产或制造的抗体的进一步的步骤。生产或制造抗体的方法在本文其他地方描述，并且适用于(加上有必要的变更)本发明的这个方面。
在一个方面，本发明提供缀合物，其包含通过方法B鉴别的至少一个表位，其与肽载体偶联或混合。缀合物在本文其他地方描述，并且该讨论适用于(加上有必要的变更)本发明的这个方面。
结合由方法B鉴别的表位的抗体(或由方法B鉴别的表位或包含此类表位的缀合物)可用于治疗。
方法B可用于鉴别蛋白质表面上蛋白酶可接近/切割但未释放的表位。该方法可以使用基于计算机模拟的蛋白酶消化的搜索算法，以及同源建模(例如，与靶蛋白结合的Fab-蛋白酶同源性)，以预测蛋白质表面上的蛋白酶切割位点。该方法使用体外蛋白酶消化，任选使用几种蛋白酶(例如平行)。该方法可以使用微流体平台进行消化。质谱(MS)，优选LS-MS/MS，可用于鉴别由来自靶蛋白的蛋白酶释放的肽。从例如，由MS获得的肽图谱中阐明实验确定的切割位点。可以将蛋白质表面上的计算机模拟预测的切割位点与实验观察到的切割位点进行比较。可以使用针对包含切割位点的序列的抗体(例如切割位点周围的-20至+20个氨基酸)探测未通过实验观察到的计算机模拟预测的切割位点。抗体可以通过结合强度(例如亲和力)和/或活性(例如对靶蛋白的拮抗或激动作用)来排序。可以测试抗体与天然蛋白质和消化蛋白质的结合。如果对于天然蛋白质和消化的蛋白质实现抗体与切割位点的结合，我们可以得出结论，蛋白酶不会在那里切割。相反，如果抗体结合天然蛋白而不是消化蛋白，我们可以得出结论，该位点实际上是通过蛋白酶在体外消化，但我们无法检测到肽释放。这假设当切割时抗体不能与所讨论的序列结合。
该方法的目的是使用新方法和算法鉴别抗体结合位点和/或阐明蛋白质结构，其中抗体用于鉴别蛋白酶可接近/切割但未释放的表位。该方法基于计算机模拟消化和任选地蛋白质结构建模、和/或抗体片段(例如Fab片段)和/或蛋白酶与靶蛋白的模拟对接。可以使用具有MS-MS检测的微流体多蛋白酶消化(例如，如本文其他地方所述并行使用的多种蛋白酶)。该程序将能够发现特异和新颖的抗体结合位点，并且可以产生天然的以及部分消化的蛋白质的新结构数据。
使用质谱法评估蛋白水解依赖于从蛋白质释放肽，即蛋白酶在围绕正确大小的序列的两个位点切割以通过质谱法检测。然而，蛋白质中的一些感兴趣区域可能不满足这些标准。蛋白酶可能只切割单个位点，产生缺口但不释放肽。肽的释放需要两次切割。因为没有释放肽，因此我们没有基于MS的结合事件或蛋白水解活性的证据。单一切割还未检测。未检测的其他原因可包括肽上的糖基化，或肽通过离子键或共价键保持与蛋白质结合。解决该问题的一种方法是产生针对这种切割位点居留在其中的序列的抗体。鉴于抗体Fab区和蛋白酶之间的高度相似的尺寸(图1)，蛋白酶可用于探测表面的抗体结合位点，反之亦然。
如果确认天然蛋白质中的抗体结合的位点，那么我们就会知道，基于大小相似性，蛋白酶也应该在那里结合。如果对消化的蛋白质进行相同的抗体结合试验，则蛋白水解后缺乏与位点的结合将表明靶序列实际上被切割，因为抗体识别的特定表位被蛋白酶破坏。
图16中概述了用于识别沉默的、未检测到的切割位点的工作流程。
我们使用一种或多种不同的蛋白酶对蛋白质序列进行计算机模拟消化。这考虑了蛋白酶特异性和规则，例如，胰蛋白酶将只能在精氨酸或赖氨酸的C末端位置切割。参见例如肽切割器(Peptidecutter)(Expasy，SIB Swiss Institute of Bioinformatics)，对大多数蛋白酶给出了消化的规则和例外。因此，诸如肽切割器的计算机程序可用于进行计算机模拟蛋白酶消化。任选地，使用建模(例如蛋白质同源建模)，我们此时可以估计哪些切割位点可能暴露于溶剂，并且通过将该步骤与沿着表面的抗体片段(例如Fab片段)或蛋白酶的计算机模拟对接相结合，我们可以预测哪些切割位点可能在体外被消化(图16a)。可以用MOE软件(Molecular Operating Environment(MOE)2015.10.Chemical Computing GroupInc.,1010 Sherbrooke St.West,Suite#910,Montreal,QC,Canada,H3A 2R7.2016)中的高灵活的和透明的(transparent)同源建模引擎生成同源模型。例如，可以使用大鼠TRPV1的冷冻EM结构(缺失突变体，PDB条目3J5P29和5IRZ30)构建人TRPV1的同源模型。基于这些结构，用于方法开发，我们使用MOE构建了人TRPV1同源模型。
在预测蛋白酶消化位点，例如表面蛋白酶消化位点之后，进行体外蛋白水解实验。对于膜相关蛋白，含有天然蛋白的蛋白脂质体可以在微流体流动池(LPI，NanoxisConsulting AB)内消化。流动池技术能够对固定相中包含的膜蛋白进行灵活的化学反应，例如有限的蛋白水解(Jansson ET，Trkulja CL，Olofsson J等，Microfluidic flow cellfor sequential digestion of immobilized proteoliposomes.Anal Chem.2012；84(13)：5582-5588，其可以经历几轮溶液和不同类型的化学调制，例如通过酶)。细胞膜可以从里向外翻转，并且跨膜蛋白的细胞内和细胞外结构域都可以直接查询。使用标准的溶液内技术可以对可溶性蛋白质进行有限的蛋白水解。
在平行反应中可以使用具有不同特异性的多种蛋白酶，以便覆盖尽可能多的序列。已经建立的限制条件，例如2-5μg/mL范围内的蛋白酶浓度和5分钟消化，可用于限制蛋白质表面的蛋白水解(图16b)。其他限制条件(限制性或约束性蛋白水解条件)在本文其他地方讨论，并且可以根据该方面使用任何这些(方法B)。释放的肽可以通过质谱法(例如通过LC-MS/MS)鉴别，优选的，通过使用高分辨率质谱仪(例如Q Exactive，Thermo Fisher)和Mascot肽/蛋白质鉴别。通过手头的肽图，我们此时可以确定哪些切割位点可被蛋白酶物理接近。
为了查明蛋白酶可接近/切割但不释放的位点，我们将实验验证的切割位点与预测位点列表进行比较，并选择MS数据中缺少的那些预测位点(图16c)。可以合成含有这些位点的肽序列，优选7-8个氨基酸长，并用于产生多克隆抗体(pAb)。长度选择的原因是为了通过最小化靶序列来最小化pAb的多克隆性，但不能太短以至于序列变得免疫原性差。
单个氨基酸框架移位可用于选择该长度在切割位点每侧上的设定距离内的线性序列(例如6个氨基酸)。然后可以使用这些创建一系列序列靶向pAb，随后可以使用例如ELISA筛选所述序列靶向pAb与天然完整蛋白质的结合。
确认的结合事件表示抗体可接近该位点，因此蛋白酶也应当可接近，反之亦然。这表明蛋白酶应在该位点切割，但肽不会被释放。可以通过对消化的蛋白质使用相同的抗体阵列来实现验证，其中与切割位点结合的减少证实发生了蛋白水解(图16e)。这假设抗体不与破坏的序列结合，但通常抗体对用作表位的氨基酸构型具有高度特异性。
该方法具有不仅被用于确定蛋白酶切割，而且被用作检测局部结构域结构的截短或切除和丢失的工具的潜力。当不能使用质谱法评估截短时，例如，因为释放的序列对于MS检测来说太短或太长，或者如果肽含有糖基化或者通过一个或多个离子键或共价键保持与蛋白质结合，验证截短将是有用的。我们已将肽的切除与TRPV1的功能测定相关联。此外，可以使用这些抗体探测由配体结合或蛋白质-蛋白质相互作用引起的局部结构改变。通过该方法产生的抗体也可以用作序列靶向功能性抗体，以用于治疗用途。
为避免疑义，在本发明的方法中使用搜索算法不是必要的，但可以使用这样的算法。例如，可以使用分析(或处理)一种或多种计算机模拟数据集的算法(例如，计算机模拟蛋白酶消化数据和/或蛋白质同源建模数据和/或蛋白质结构和功能数据，其中结构或功能数据包含在计算机模拟模型中(或由计算机模拟模型预测)，一种或多种Fab-蛋白酶同源结合数据集(例如由计算机模拟蛋白质-蛋白质对接产生)，一种或多种其他计算机模拟蛋白质-蛋白质对接模型(如蛋白质-抗体对接模型，蛋白质-抗体片段对接模型和/或蛋白质-蛋白酶对接模型)，和/或一种或多种蛋白酶消化(例如多蛋白酶消化)数据集(例如质谱数据)。搜索算法可以组合和处理来自各种数据集中的一个或多个的输入，以便找到(或预测)蛋白质结构的区域，所述区域在功能上可被抗体接近，并且在蛋白质功能方面功能上相关(例如，该区域的扰动会改变蛋白质的功能)。
本文所述的其他方法的优选特征可以适用于(加上必要的变更)本发明的这个方面(方法B)。
在使用多种蛋白酶的实施例中，适当的实例描述于本文其他地方。在一些实施例中，优选的蛋白酶是选自(或包含)胰蛋白酶、Asp-N、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、Lys-C、Arg-C、梭菌蛋白酶、谷氨酰内肽酶、Lys-N和嗜热菌蛋白酶中的一种或多种。
本发明的其他特征和优点从以下实例变得明显。所提供的实例说明在实施本发明中有用的不同组分和方法。所述实例不限制要求保护的发明。基于本披露，本领域技术人员可以识别和使用对实施本发明有用的其他组分和方法。
实例
实例1
在这个实例中，我们描述了一种成功的方法，其中我们已经发现并开发了基于所提出的发明并包括方法在人类TRPV1离子通道的细胞内侧作用的多克隆抗体OTV1。该抗体具有药理学活性，并且当用激动剂辣椒素刺激时，对蛋白质显示出强烈的抑制作用。据我们所知，这是第一次发现靶向TRPV1细胞内结构域的抑制性抗体。这表明该概念具有高的工作概率，并且如果起源于远远更丰富的多蛋白酶数据集的表位的起始矩阵将可用，则可以鉴别甚至更好的和优化的抗体。从限制性的蛋白水解和生物信息学分析的多个匹配中选择抗体。抗体是第一选择的，并且它显示出功效的强证据。这是一个显著的进步，并且与目前的抗体鉴别努力相辅相成，因为不需要筛选步骤，因为它直接导致可以被药理学活性抗体靶向的独特表位。
基于在LPI微流体平台中使用优化方案的靶蛋白的限制性消化来选择靶向表位区域，并进一步优化。通过用半胱氨酸残基修饰靶肽表位并将其连接到钥孔戚血蓝蛋白(KLH)来产生多克隆抗体。通过在注射具有联合特异性肽的KLH后免疫特异性无病原体(SPF)兔来进行特异性抗体的产生。纯化抗体，并根据标准方案使这些抗体经受ELISA试验。用ELISA进行针对线性表位的抗体滴度，得到0.25μg/ml的浓度。使用内面向外膜片钳研究抗体对天然TRPV1的功效，其中TRPV1的细胞内侧可以暴露于抗体溶液。使用用于膜片钳记录的微流体装置(Dynaflow公司，Cellectricon AB，瑞典哥德堡(Sweden))进行内面向外记录。通过将包含若干个离子通道的膜片暴露于具有和不具有抗体的辣椒素来测量电流幅度。将对照物暴露于1μM辣椒素30s，然后暴露于缓冲液70s，然后再暴露于1μM辣椒素30s。将抗体处理的膜片暴露于1μM辣椒素30s，然后用0.14mg/ml抗体暴露70s，并且然后将1μM辣椒素与0.14mg/ml抗体一起暴露30s。对于所有测量，将抗体活性与仅暴露于缓冲液后的活性进行比较，以排除脱敏或增强的任何影响。计算电流-时间积分面积，并计算第二和第一电流的积分面积之间的比率，并在处理间进行比较。与仅用缓冲液相比，用抗体处理的细胞观察到电流响应减少50％(图3)。用学生t检验来计算统计学显著性(p>0.05)。
实例2
治疗性mAb市场正在快速增长，预计2020年将达到值约1250亿美元。新颖mAb不断达到监管机构的认可，目前，免疫原性mAb如PD1抑制剂被广泛讨论，因为它们大大改善了某些类型的难转移性癌症的结果。然而，用于治疗目的的新颖抗体的发现在很大程度上依赖于筛选并且盲目地完成。重点是亲和力，并且针对生物学效应测试显示良好结合特征的抗体的一个子集。关于结合相互作用、抗原决定簇和作用机制的细节仍然未知。
我们提出了一种使用微流体方法和质谱法、基于限制性的蛋白水解动力学攻击来选择抗原表位的方法。蛋白水解步骤如此缓慢地进行，在蛋白酶攻击之后，在那时抗原将单个或几个肽撕下来。首先下来的肽对于pAb或mAb是容易接近的，并且因此对于残留在蛋白质的区域的之后下来的肽(更难接近)很有利。然后使用策划的生物信息学数据，针对基于序列的功能重要性，将这些肽按等级排序并且交叉关联。快速脱离靶蛋白的、也具有功能意义的高等级肽，用于表位开发、免疫和随后的抗体产生。此外，截短的蛋白质可用于药理学测试。该方法依赖于基于序列的信息，并且是基于药理学、作用机制来发现抗体的方法，并且可以用于细胞内靶标、循环靶标和细胞外靶标。我们已经使用这种方法开发两种抗体，一种是激活解决(addressing)钙调素结合序列的抗体，另一种是抑制解决(addressing)人类TRPV1离子通道胞内区N-末端的辣椒素结合位点的抗体。
开发治疗性抗体时的两个重要参数是结合亲和力和生物功效。抗体是大约150kDa的大蛋白质，并且主要结合位于蛋白质表面上的抗原位点。天然蛋白质结构的表面附近氨基酸的位置可以指导这些位点的鉴别和预测。我们使用限制性的蛋白水解来探测蛋白质的表面暴露和灵活性。这是通过控制温度、浓度和/或消化时间来限制蛋白酶的活性的方法。仅可以在局部展开并容纳蛋白酶的灵活区域、表面暴露区域和几乎没有局部相互作用(如氢键和二硫桥)的区域将在这种条件下被消化。我们一前一后地使用了若干种蛋白酶，以最大限度地一起提取结构信息。易被若干种蛋白酶消化的区域应位于蛋白质的最暴露、最易接近的区域，并且对于进一步的抗体开发具有高适应性。仅被单一蛋白酶消化的区域可能位于蛋白质的隐藏区域并且不太可接近。能够达到和消化这些区域的蛋白酶的物理化学特性可能在这种情况下潜在地指导抗体开发。我们基于消化的容易程度将消化的肽排序，这取决于哪些参数用于限制性蛋白水解。这可能是它们被消化的时间点、使用的浓度或温度。然后将由每个蛋白酶消化的肽彼此相关联，以便找到起源于蛋白质最易接近区域的那些肽。
在常规抗体开发过程期间，通常在抗体和抗原之间确认阳性结合后测试生物学功效。我们认为抗体开发将受益于早期机制驱动的方法，通过将免疫接种集中在生物活性位点上或其附近的可接近位点，而不是产生靶向所有可能的抗原位点的抗体。这最小化筛选程序连同优化对远离生物活性位点的区域具有高结合亲和力的抗体的风险。我们想找到对靶蛋白具有功能重要性的可接近表位。这是通过将限制性蛋白水解的排序肽与生物信息学数据进行比较来完成的。
我们展示了使用人类TRPV1离子通道作为模型蛋白的机制驱动方法。TRPV1是对例如低pH、高温(T>42℃)、辣椒素、和若干种炎症介质的有害刺激物敏感的离子通道。TRPV1离子通道主要位于周围神经系统的伤害感受神经元中，并且以四聚体构象排列。TRPV1的四个单体中的每一个由六个跨膜区组成，其中N-末端和C-末端都面向质膜的细胞内侧。孔区由第5和第6跨膜区组成。TRPV1的细胞内部分容纳许多对热激活、致敏和脱敏重要的调节区。
表位产生
包含TRPV1的蛋白质脂质体来源于CHO细胞，并且分别使用胰蛋白酶和Asp-N，在LPI流动细胞内对包含TRPV1的蛋白质脂质体进行限制性的蛋白水解。蛋白酶的活性被限制到以下程度，直到通过使用室温和低浓度只有少数肽被消化。然后用串联质谱(LC-MS/MS)的液相色谱检测消化的肽。在用Asp-N蛋白水解后，用胰蛋白酶和一个肽进行蛋白水解后检测到三种肽。将这些肽与已知功能数据和与表1中列出的功能重要区域相关的若干肽进行比较。选择两种肽用于进一步抗体开发，aa96-117和aa785-799，分别命名为OTV1和OTV2。TRPV1结构内表位的可视化可以在图4和图5中看到。OTV1的肽序列包括arg115(arg114针对rTRPV1)，arg115已被示出对于用辣椒素或质子的激活是重要的。在该氨基酸附近的两种蛋白酶消化区域，增加了这是三级蛋白质结构中暴露区域的可能性。针对OTV2的肽序列包括钙调素结合位点aa786-aa798(aa785-aa797针对rTRPV1)，并且仅用胰蛋白酶消化。在这一部分TRPV1中，没有Asp-N的消化位点，Asp-N在N-末端侧切割Asp和Cys。aa96-117和aa785-799的合成肽与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)连接，并且进一步用于在注射KLH连接的肽之后，通过免疫兔产生多克隆抗体。所产生的抗体显示在冷冻期间和溶液中随时间聚集的趋势。结果，新鲜解冻的抗体在使用之前进行端超声(tip-sonicated)处理，所有实验在尖端超声处理的30分钟内进行。
表1-用Asp-N和胰蛋白酶消化的肽及其生物相关性
免疫细胞化学
进行免疫细胞化学以便可视化表达TRPV1的CHO细胞内的抗体分布(图6)。非诱导细胞用作非特异性结合的对照。将细胞固定并用OTV1抑或OTV2，然后使用山羊抗兔Alexa488第二抗体染色。对于OTV1和OTV2两者，仅在诱导细胞中观察到可见的质膜中的清晰染色。第二抗体的非特异性结合是可忽略的(数据未显示)。
电生理学
使用内面向外膜片钳记录评估OTV1对辣椒素诱导的TRPV1活性的功能效应连同OTV2对钙调素//Ca2+依赖性脱敏的影响。从CHO细胞切下包含若干个离子通道的膜片，使抗体能够暴露于TRPV1的细胞内区域。对于OTV1，用辣椒素激活TRPV1，然后用OTV1处理，随后在OTV1存在下用辣椒素激活。对照用辣椒素激活，用缓冲液处理，并且再次用辣椒素激活。当将用OTV1处理和仅用缓冲液处理进行比较时，观察到辣椒素介导的电流降低50％(图7)。测试OTV2的干扰钙调素/Ca2+依赖性脱敏的能力。用辣椒素激活TRPV1，然后用钙调素、Ca2+和OTV2处理，随后在钙调素、Ca2++和OTV2存在下用辣椒素激活。用辣椒素激活对照，用钙调素和Ca2+处理，并在钙调素和Ca2+存在下用辣椒素激活。在钙的存在下钙调素使TRPV1脱敏。用OTV2处理减少了45％的这一效果(图7)。
TRPV1介导的YO-PRO摄取测定
使用电穿孔作为递送方法测试全细胞内抗体的功效，随后用激光扫描共聚焦显微镜测量TRPV1介导的YO-PRO摄取。在OTV1、OTV2或缓冲液存在下，使用Neon转染系统(生命技术公司(Life Technologies))对细胞进行电穿孔。将用OTV1或缓冲液电穿孔的细胞在包含钙螯合剂的PBS中经受辣椒素和YO-PRO。随后监测由TRPV1介导的YO-PRO摄取引起的荧光的细胞内增加。可以在最初12秒观察到OTV1处理的细胞摄取率降低60％，在20秒之后可以观察到OTV1处理的细胞的最高摄取率，与对照组的8秒相比(图8)。用OTV2或缓冲液电穿孔的细胞在包含钙的PBS中经受辣椒素和YO-PRO，依赖由施用的钙触发的内源性钙调素脱敏。在OTV2处理的细胞激活15秒后，可以观察到摄取率增加80％。使用免疫细胞化学验证了抗体与电穿孔的内化(图9)。
我们已经开发了用于抗体产生(位于靶蛋白的功能重要区域内和/或附近的暴露和可接近的抗原位点)的微流体方法。在LPI流动细胞内使用动力学限制的蛋白水解来探测可接近区域。靶蛋白保持在其天然状态，而其环境的复杂性可以被小心地控制(例如，通过允许协同因素存在)。与使用纯化的蛋白质的结合测定相比，这可以更好地了解抗原位点的可接近性。该方法非常适用于不需要洗涤剂的另外难以纯化和用于结合测定的跨膜靶标。可以使用这种方法靶向细胞内和细胞外结构域二者。
了解抗原位点的位置及其生物功能对于预测和评价与其他蛋白质的非特异性结合和交叉反应性非常重要。位于非常保守区域的表位可以从潜在的表位候选物的分析中排除，以使交叉反应性最小化。
尽管不是用整个蛋白质免疫产生的，本文开发的抗体是多克隆抗体。我们的方法与用于使用杂交瘤和随后的筛选程序生产单克隆抗体的常规方案相容。使用多克隆抗体作为第一步骤来实验验证若干种有希望的表位候选物的生物学功效，然后使用最佳一个或多个表位来生产单克隆抗体，以及高结合亲和力的筛选方法，组合两种中最好的一个。
验证抗体内化
在电穿孔后24小时后，用免疫细胞化学验证用电穿孔的抗体的内化。在PBS中0.14mg/ml OTV1或0.27mg/ml OTV2的存在下电穿孔细胞。然后将电穿孔的细胞在玻璃底培养皿(Willco wells)中培养24小时。做了两个不同的对照。一组未经电穿孔、但以其他等同方式处理并经受相同抗体溶液，另一组未经受OTV1和OTV2。后者用于定量第二抗体的非特异性结合。培养24小时后，用PBS小心清洗细胞以除去任何残留抗体，否则这些抗体在固定期间可能进入细胞。然后使用固定/透化试剂盒(英杰公司(Invitrogen))将细胞固定并透化。将固定和透化细胞与山羊抗兔Alexa488第二抗体(英杰公司)在室温下孵育30min。在最后的洗涤步骤之后可视化细胞，并且在电穿孔细胞、非电穿孔细胞和只进行第二抗体的细胞之间比较荧光强度(图9)。观察到电穿孔和非电穿孔细胞之间强度值的明显差异。用学生t检验进行统计学分析，并且p<0.05被认为具有统计学意义。在非电穿孔的细胞中发现低水平第一抗体，这可能是在固定和透化过程中进入的残留抗体。
我们在此提供了一种用于利用微流体和限制性蛋白水解的组合产生高亲和力、生物活性抗体的方法。该方法使用人TRPV1离子通道进行验证，并开发了两种抗体。基于它们各自的表位区域的功能重要性，两种抗体引起TRPV1应答的预测改变。
材料与方法
化学品
细胞培养培养基(具有谷氨酰胺的DMEM/HamF12)、胎牛血清、和Accutase细胞消化液购自PAA。Zeocin(博来霉素)、Na4BAPTA、K4BAPTA和山羊抗兔Alexa488第二抗体购自英杰公司(invitrogen)。测序级修饰胰蛋白酶和测序级Asp-N购自普洛麦格公司(Promega)。所有其他化学品均购自西格玛公司(Sigma)。使用以下缓冲液：A：300mM NaCl、10mM Tris、pH8.0，B：20mM NH4HCO3、pH 8.0。C：140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、10mM HEPES、10mM D-葡萄糖、10mM Na4BAPTA、pH 7.4，D；140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、10mM K4BAPTA pH7.2、E：140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、pH 7.2。F：140mM NaCl、2.7mM KCl、10mMNa2HPO4、pH 7.4。G：120mM KCl、2mM MgCl2、10mM HEPES、10mM K4BAPTA、pH 8.0
细胞培养
在具有和不具有载玻片的培养瓶或培养皿(Nunc)中，在补充有10％胎牛血清、博来霉素(350μg/ml)和杀稻瘟菌素(5μg/ml)的培养基(具有谷氨酰胺的DMEM/F12)中培养具有四环素调节表达系统(T-REx)的粘附的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在使用前18-24小时，将细胞在补充有10％胎牛血清和多西环素(1μg/ml)的培养基(具有谷氨酰胺的DMEM/F12)中孵育以诱导人类TRPV1的表达。常规测试细胞系的支原体感染。
蛋白脂质体制备
在缓冲液A中如先前其他地方[1]制备蛋白脂质体。每种蛋白脂质体制剂来源于若干种不同的培养瓶。
消化方案
如其他地方[1]所述进行流动细胞内的单一消化。将5μg/ml胰蛋白酶和5μg/mlAsp-N分别溶于缓冲液G和B中。在室温下，在流动细胞内用每种蛋白酶进行5min的消化。通过添加甲酸至12％的终浓度抑制洗脱液中的进一步消化。
液相色谱与串联质谱法
如前所述[1]，在瑞典，哥德堡，哥德堡大学(Gothenburg University,Sweden)蛋白质组学核心设施(Proteomics Core Facility)分析了来自CHO蛋白脂质体的消化的肽样品。所有串联质谱均由MASCOT(英国伦敦的矩阵科学(Matrix Science，London，UK))针对2013_04发布的UniProtKB(人类，[智人])(用于用胰蛋白酶消化)和2015_06发布的UniProtKB((人类，[智人])(用于用Asp-N消化)进行检索。Thermo Proteome Discoverer1.3版本(赛默科技(Thermo Scientific))用于验证基于MS/MS的肽和蛋白质鉴别。使用肽水平的假发现率为0.01，并通过检索反向数据库来确定。
抗体开发
合成并纯化aa96-117和aa785-799的关于hTRPV1的氨基酸序列的合成肽，包括在N-末端侧的另外的半胱氨酸残基。然后将肽通过半胱氨酸残基连接至钥孔戚血蓝蛋白(KLH)，并且然后用于在注射KLH连接的肽后通过免疫特异性无病原体(SPF)兔来产生多克隆抗体。纯化抗体并使这些抗体经受ELISA试验。由Innovagen AB(瑞典，隆德(Lund，Sweden))进行合成肽和多克隆抗体两者的产生。
使用新鲜解冻的并在尖端超声处理30分钟内的抗体。使用来自超声材料公司(Sonics&Materials Inc)(美国康涅狄格牛顿(Newtown，CT，USA))的Vibra Cell VCX 600将抗体以14％振幅超声处理3次，间隔1分钟静息。总超声处理时间为40秒，其中有0.5s脉冲时间和0.5s静息时间，以减少探头的加热。
电生理学
使用用于膜片钳记录的微流体装置(Dynaflow公司，Cellectricon AB，瑞典哥德堡(Sweden))和HEKA EPC10(德国Heka Elektronik)膜片钳放大器进行内面向外记录。水浴和移液管溶液包含缓冲液C.膜片被夹紧在+60mV，并以20kHz的取样频率记录电流信号，并在5kHz下进行低通滤波。
对于OTV1，通过将包含若干个离子通道的膜片暴露于具有和不具有抗体的辣椒素来测量电流幅度。将对照在缓冲液D中暴露于1μM辣椒素30s，随后暴露于缓冲液D中70s，并且然后再在缓冲液D中暴露于1μM辣椒素30s。将OTV1处理的膜片在缓冲液D中暴露于1μM辣椒素30s，然后在缓冲液D中暴露于0.14mg/ml抗体70s，并且然后将1μM辣椒素与0.14mg/ml抗体在缓冲液D中一起暴露30s。对于OTV2，通过将膜片暴露于具有和不具有抗体和钙调蛋白/Ca2+的辣椒素中来测量当前幅度。将对照在缓冲液E中暴露于1μM辣椒素30s，随后在缓冲液E中暴露于0.5μM钙调素和50μM Ca2+70s，并且然后再在缓冲液E中暴露于1μM辣椒素30s。将抗体处理的膜片在缓冲液E中暴露于1μM辣椒素30s，然后在缓冲液E中暴露于0.14mg/ml抗体、0.5μM钙调素和50μM Ca2+70s，并且然后在缓冲液E中暴露于1μM辣椒素以及0.14mg/ml抗体、0.5μM钙调素和50μM Ca2+30s。处理后密封阻力发生很大变化的测量值被排除在进一步分析之外。
数据分析电生理学
对于所有测量，将抗体处理后的活性与仅暴露于缓冲液后的活性进行比较，以排除由于重复激活引起的脱敏或增强的任何作用。对于包含电流迹线的数据，使用Fitmaster(德国HEKA Elektronik)和Matlab(美国马萨诸塞州矩阵实验室(Mathworks，MA，USA))计算电流-时间积分面积，用于在OTV1的应用和去除之间、以及OTV2的完全激活和去除之间每次用辣椒素的激活。计算第二和第一电流的积分面积之间的比率，并且在处理之间进行比较。对于OTV2，由于作用的时间依赖性降低，数据点分为两类(尖端超声后<15min，和尖端超声后<30min)。
使用单因素方差分析进行统计分析，结合Dunnett的事后检验和学生t检验(适用时)。P<0.05被认为具有统计学意义。数据呈现为平均值±SEM。
电穿孔
使用Neon转染系统(生命技术公司(Life Technologies))进行细胞溶质抗体递送。使用Accutase细胞消化液分离粘附的CHO细胞，并用缓冲液F进行洗涤。将105个细胞沉淀并重新悬浮于缓冲液F、，缓冲液F中0.14mg/ml OTV1、抑或0.27mg/ml OTV2中。将10μl的细胞/抗体悬浮液使用氖管移液管移液，并在系统移液管站中经受电穿孔。使用针对抗体递送优化的方案[5]，其中细胞在10ms期间暴露于1550 V并且持续3个脉冲。将电穿孔细胞转移到玻璃底培养皿(Willco wells)
成像
使用来自荧光显微照片的感兴趣区域(ROI)测量来对通过免疫细胞化学和TRPV1介导的YO-PRO摄取的抗体位置进行测量。使用Thorlabs CLS系统形成显微照片，该系统装备有Galor：Resonant扫描仪和高敏感性GaAsP PMT(记录入ThorImageLS软件(美国新泽西州的Thorlabs公司(Thorlabs Inc，New Jersey，U.S.A))。将扫描仪装置安装在配有油浸63×NA 1.47 Leica HCX PL APO物镜的Leica DMIRB显微镜上。使用Coherent Sapphire 488LP激光(美国加利福尼亚州的相干公司(Coherent Inc.，CA，U.S.A.)在488nm的激发下从单个细胞测量荧光检测，并在500-550nm之间收集发射。使用Image J和Matlab(美国马萨诸塞州矩阵实验室(Mathworks，MA，USA))分析ROI数据。
免疫细胞化学
将细胞培养在玻璃底培养皿(Willco wells)上，并在使用前18-24小时在一些培养皿中诱导TRPV1表达。将包含表达TRPV1的细胞和非诱导细胞的两个培养皿用缓冲液F洗涤，并且然后使用固定/透化试剂盒(英杰公司(invitrogen))进行固定和透化。将固定的和透化的细胞在缓冲液F中在37℃下经受25μg/ml抗体30min，然后用缓冲液F洗涤，随后在室温下与山羊抗兔Alexa488第二抗体孵育30。在最后的洗涤步骤之后可视化细胞，并比较诱导的和未诱导的细胞之间的抗体分布。
TRPV1介导YO-PRO摄取
将包含10μl的电穿孔细胞的玻璃底培养皿安装在显微镜上。以0.5Hz的速率初始化记录。对于OTV1，将缓冲液F中包含辣椒素、YO-PRO和K4BAPTA的20μl液滴小心地移液到电穿孔的细胞上，以使分离最小化，导致最终浓度为1μM的辣椒素、1μM的YO-PRO和10mM的K4BAPTA。对于OTV2，将缓冲液F中包含辣椒素、YO-PRO和Ca2+的20μl液滴类似地移液到电穿孔的细胞上，导致最终浓度为1μM的辣椒素、1μM的YO-PRO和50μM的Ca2+。
上述实施例将被理解为本发明的几个说明性实例。本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对实施例进行不同修改、组合和改变。具体地，不同实施例中的不同部分解决方案可以在技术上可能的其他构型中组合。
参考文献
1 Jansson,E.T.等人，Anal.Chem.[分析化学]2012,84:5582-5588
2国际申请号WO2006/068619
3欧洲专利申请号EP2174908
4 Trkulja,C.L.等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2014,136:14875-14882
5 Freund,G.等人，MAbs,2013,5:518-522
实例3
通过使用多种蛋白酶在CHO细胞中表达的离子通道TRPV1的限制性消化和质谱的肽鉴别
这一实例描述了并行地使用多种蛋白酶以鉴别来自TRPV1的肽的蛋白酶特异性集合。本实例中使用的蛋白酶是胰蛋白酶、Asp-N、胃蛋白酶、蛋白酶K和糜蛋白酶。当彼此进行比较时，肽的蛋白酶特异性集合可以是重叠的、互补的或独特的。通过使用不同的蛋白酶浓度，并且在几个实例中通过使用不同的孵育时间来实现不同的蛋白水解活性。
材料与方法
细胞培养
简言之，根据Trkulja等人(J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2014,136,14875-14882)培养CHO细胞。简言之，在T175或T500培养瓶(Nunc)或玻璃培养皿中，在补充有10％FBS、博来霉素(350μg/ml)和杀稻瘟菌素(5μg/ml)的培养基(具有谷氨酰胺的DMEM/F12)中培养具有四环素调节表达系统(T-REx)的粘附的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在使用前(18-24小时)，将细胞在补充有10％FBS和多西环素(1μg/ml)的培养基(具有谷氨酰胺的DMEM/F12)中孵育以诱导人类TRPV1的表达。常规测试细胞系的支原体感染。细胞收获后，将细胞冷冻并储存在-80度。将细胞进一步如下所述进行处理。
细胞裂解和匀浆
将细胞悬浮液离心580×g3分钟。丢弃上清液，并且小心地用4ml的冰冷的PBS填充管。将细胞沉淀小心地重新悬浮，并且然后用冰冷的PBS将管加满至14ml。将细胞悬浮液再次离心(580xg，3分钟)，并且重复该过程两次。
将细胞沉淀物(大约800μl体积)重新悬浮在大约6ml的裂解缓冲液(10mM NaHCO3，pH7.4)中，并保持在冰上10分钟。
然后将裂解缓冲液中的细胞转移到Dounce匀浆器(7ml)中，每个细胞悬浮液对应一个。然后用紧杵(tight pestle)使细胞匀浆20次。匀浆后，将裂解的细胞进行离心步骤(580xg，3分钟)。收集上清液，并且弃去细胞沉淀物。将上清液经受第二离心步骤(580xg，3分钟)，并且然后弃去细胞沉淀物(小)。
将上清液汇集并转移到Beckman离心管(50ml)中，并且然后添加裂解缓冲液至20ml。将上清液以7300xg离心10分钟以除去线粒体和细胞碎片。将上清液分到两个Falcon管(每个10ml)，并在-80冰箱中冷冻以进一步处理。
超速离心法
将上清液在冰上解冻并转移到两个Beckman透明超速离心管(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，商品编号344057)。用冰冷的缓冲液(10mM Tris，300mM NaCl，pH 8)将管加满，并且小心地平衡后使用SW55 Ti转子(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))以100,000xg(32900rpm)离心45分钟。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮在冰冷的缓冲液(10mMTris，300mM NaCl，pH 8)中，并再次用相同的冰冷缓冲液加满管。小心平衡并且以100,000xg(32900rpm)离心45分钟后，弃去上清液，并且将沉淀物重新悬浮在冰冷的缓冲液(10mM Tris，300mM NaCl，pH8)中，大约800μl/沉淀物。总共收集大约1.6ml的膜制剂，并在-80度冷冻。
尖端超声
将冷冻的膜制剂在冰上解冻并汇集在一起，然后使用超声波仪(Vibracell)在冰冷的锥形瓶中进行超声处理。首先用冰冷的缓冲液(10mM Tris，300mM NaCl，pH 8)将膜制剂稀释至4ml，并使用15％振幅、0.5秒脉冲/静息循环进行超声处理30秒。然后将锥形瓶和膜制剂在冰上冷却几分钟，并且然后使用15％振幅、0.5秒脉冲/静息30秒钟的另一个循环进行膜制备，并再次重复。将所得的膜制剂(蛋白脂质体)在-80度下、310μl等分试样中冷冻。
蛋白酶
所有蛋白酶均购自普洛麦格公司(Promega)。所有溶液都是用来自飞世尔科技(Fisher Scientific)的LC-MS级水制成的。
目录号V1621
Asp-N，测序等级，2μg
目录号V1959
胃蛋白酶，250mg
目录号V3021
蛋白酶K，100mg
目录号V1062
糜蛋白酶，测序等级，25μg
目录号V5111
测序等级修饰的胰蛋白酶，20μg
胰蛋白酶
将胰蛋白酶溶于100mM的碳酸氢铵(Ambic公司，pH 8)
Asp-N
将Asp-N溶解在100mM的碳酸氢铵(Ambic公司，pH 8)
胃蛋白酶
将胃蛋白酶溶于100mM碳酸氢铵(Ambic公司，pH 8)
蛋白酶K
将蛋白酶K溶于100mM碳酸氢铵(Ambic公司，pH 8)
糜蛋白酶
将糜蛋白酶溶于100mM Tris-HCl、10mM CaCl2，pH 8中。
LPI处理
实验使用LPI HexaLane芯片进行以用于消化每个芯片内的一条泳道用于一次消化。简言之，将等分的蛋白脂质体解冻至室温，用100μl移液管手动注入泳道并固定1小时。
还使用100μl移液管手动进行泳道的洗涤。每个孔用200μl洗涤缓冲液(与消化缓冲液相同，除了胃蛋白酶消化方案，其中使用100mM Ambic pH 8作为洗涤缓冲液,这是为了避免在流动细胞中低pH持续长时间)洗涤。然后使用100μl移液管用4×100μl洗涤缓冲液洗涤泳道。
然后将蛋白酶注射到泳道中，并根据以下规格进行孵育。孵育(消化)在室温下进行，使用200μl的消化缓冲液(2×100μl)从泳道洗脱肽。通过添加4μl甲酸，通过将所得肽溶液酸化至约pH 2来终止蛋白酶活性。对除了胃蛋白酶之外的所有样品进行这个操作，在胃蛋白酶中添加16μl氨溶液(25％)作为替代以使溶液呈碱性(pH 9)。
进行以下消化条件，每条泳道一个：
胰蛋白酶：
0.5μg/ml，2.5分钟
0.5μg/ml，5分钟
2μg/ml，5分钟
5μg/ml，5分钟
10μg/ml，5分钟
20μg/ml，5分钟
Asp-N
20μg/ml，5分钟
2μg/ml，24小时
糜蛋白酶
5μg/ml，5分钟
10μg/ml，5分钟
20μg/ml，5分钟
蛋白酶K
5μg/ml，5分钟
10μg/ml，5分钟
20μg/ml，5分钟
胃蛋白酶
2μg/ml，5分钟
5μg/ml，5分钟
10μg/ml，5分钟
20μg/ml，5分钟
将样品标记并在-80℃下冷冻。
MS分析
根据制造商的指导在PepClean C18旋转柱(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific，Inc.)，沃尔瑟姆(Waltham)，美国马萨诸塞州(MA，USA))上将胰蛋白酶肽脱盐、干燥并用15微升的0.1％甲酸复水(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，圣路易斯市，密苏里州(St Louis，MO))(在3％梯度乙腈(默克集团(Merck KGaA)，德国达姆施塔特(Darmstadt，Germany))中)。使用Easy-nLC自动进样器(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific，Inc.)，沃尔瑟姆(Waltham)，美国马萨诸塞州(MA，USA))进行两次微升样品注射，并用互动式Q Exactive混合质谱仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)进行分析。将肽捕获在预柱(45x0.075mm i.d.)上并在反相柱(200x0.075mm)上分离，该反相柱在内部装入3μm的Reprosil-Pur C18-AQ颗粒(德国阿梅尔布迈克公司(Dr.Maisch,Ammerbuch,Germany))。nanoLC(液相色谱)梯度以200nl/min运行，以在0.2％甲酸中的7％乙腈(ACN)开始，在25min内增加至27％ACN，然后在5min内增加至40％，最后5min内达到80％ACN，并保持10分钟的80％ACN。
在数据依赖的正离子模式下，在1.8kV的电压和320℃的毛细管温度下，产生离子并喷射到质谱仪中。在轨道阱中，在400-1,600的m/z范围内获得全扫描(MS1)光谱，电荷范围为2-6，分辨率为70,000，直到AGC靶值为1e6，最大值为250ms。对于十个最大丰度的母体离子，使用更高的能量碰撞解离(HCD)获得MS/MS光谱，其中30％来自m/z110，分辨率为35,000，使用2 Da的前体隔离窗(precursor isolation window)，直到在110ms的注射时间内AGC靶值为1e5。MS/MS选择后30秒内的动态排除使得能够允许检测尽可能多的前体。
结果概述
图10显示了通过胰蛋白酶限制性蛋白水解后,检测到的肽的TRPV1在3D模型上的位置。通过胰蛋白酶限制性蛋白水解后,检测到的肽的序列如下表2所示。首先显示了用0.5μg/ml胰蛋白酶消化2.5min的肽。已经将分别用0.5μg/ml胰蛋白酶消化5min、2μg/ml胰蛋白酶消化5min、5μg/ml胰蛋白酶消化5min、10μg/ml胰蛋白酶消化5min和20μg/ml胰蛋白酶消化5min的肽汇集，以用于展示目的，并且其次显示。
表2
图11显示了通过Asp-N限制性蛋白水解后检测到的肽的TRPV1在3D模型上的位置。通过Asp-N限制性蛋白水解后检测到的肽的序列如下表3所示。首先显示了用20μg/ml的Asp-N消化5min的肽。其次显示了用2μg/ml的Asp-N消化24小时的肽。
表3
图12显示了通过糜蛋白酶限制性蛋白水解后检测到的肽的TRPV1在3D模型上的位置。通过糜蛋白酶限制性蛋白水解后检测到的肽的序列如下表4所示。首先显示了用5μg/ml糜蛋白酶消化5min的肽。已经将分别用10μg/ml糜蛋白酶消化5min和20μg/ml糜蛋白酶消化5min的肽汇集，以用于展示目的，并且其次显示。
表4
图13显示了通过胃蛋白酶限制性蛋白水解后检测到的肽的TRPV1在3D模型上的位置。通过胃蛋白酶限制性蛋白水解后检测到的肽的序列如下表5所示。首先显示了用2μg/ml胃蛋白酶消化5min的肽。将分别用5μg/ml胃蛋白酶消化5min、10μg/ml胃蛋白酶消化5min和20μg/ml胃蛋白酶消化5min的肽汇集，以用于展示目的，并且其次显示。
表5
图14显示了通过蛋白酶K限制性蛋白水解后检测到的肽的TRPV1在3D模型上的位置。通过蛋白酶K限制性蛋白水解后检测到的肽的序列如下表6所示。首先显示了用5μg/ml蛋白酶K消化5min的肽。已经将分别用10μg/ml蛋白酶K消化5min和20μg/ml蛋白酶K消化5min的肽汇集，以用于展示目的，并且其次显示。
表6
在表2、3、4、5和6中，术语“起始”和“结束”是指TRPV1序列中的氨基酸残基的位置。
在评估数据期间，0.01的Mascot显著性阈值(Mascot Significance Threshold)已在结果过滤器(Results Filters)(肽)下进行了设置。
随着蛋白酶浓度增加，胰蛋白酶产生增加数量的肽和增加的置信度。
胃蛋白酶和糜蛋白酶均在低浓度和更高浓度下产生许多肽。
序列表
<110> 欧比力克治疗公司（Oblique Therapeutics AB）
<120> 鉴别表位的方法
<130> 69.15.130148/01
<150> GB1614884.3
<151> 2016-09-01
<160> 81
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 839
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Lys Lys Trp Ser Ser Thr Asp Leu Gly Ala Ala Ala Asp Pro Leu
1 5 10 15
Gln Lys Asp Thr Cys Pro Asp Pro Leu Asp Gly Asp Pro Asn Ser Arg
20 25 30
Pro Pro Pro Ala Lys Pro Gln Leu Ser Thr Ala Lys Ser Arg Thr Arg
35 40 45
Leu Phe Gly Lys Gly Asp Ser Glu Glu Ala Phe Pro Val Asp Cys Pro
50 55 60
His Glu Glu Gly Glu Leu Asp Ser Cys Pro Thr Ile Thr Val Ser Pro
65 70 75 80
Val Ile Thr Ile Gln Arg Pro Gly Asp Gly Pro Thr Gly Ala Arg Leu
85 90 95
Leu Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys Thr Leu Arg Leu
100 105 110
Tyr Asp Arg Arg Ser Ile Phe Glu Ala Val Ala Gln Asn Asn Cys Gln
115 120 125
Asp Leu Glu Ser Leu Leu Leu Phe Leu Gln Lys Ser Lys Lys His Leu
130 135 140
Thr Asp Asn Glu Phe Lys Asp Pro Glu Thr Gly Lys Thr Cys Leu Leu
145 150 155 160
Lys Ala Met Leu Asn Leu His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Ile Pro Leu
165 170 175
Leu Leu Glu Ile Ala Arg Gln Thr Asp Ser Leu Lys Glu Leu Val Asn
180 185 190
Ala Ser Tyr Thr Asp Ser Tyr Tyr Lys Gly Gln Thr Ala Leu His Ile
195 200 205
Ala Ile Glu Arg Arg Asn Met Ala Leu Val Thr Leu Leu Val Glu Asn
210 215 220
Gly Ala Asp Val Gln Ala Ala Ala His Gly Asp Phe Phe Lys Lys Thr
225 230 235 240
Lys Gly Arg Pro Gly Phe Tyr Phe Gly Glu Leu Pro Leu Ser Leu Ala
245 250 255
Ala Cys Thr Asn Gln Leu Gly Ile Val Lys Phe Leu Leu Gln Asn Ser
260 265 270
Trp Gln Thr Ala Asp Ile Ser Ala Arg Asp Ser Val Gly Asn Thr Val
275 280 285
Leu His Ala Leu Val Glu Val Ala Asp Asn Thr Ala Asp Asn Thr Lys
290 295 300
Phe Val Thr Ser Met Tyr Asn Glu Ile Leu Met Leu Gly Ala Lys Leu
305 310 315 320
His Pro Thr Leu Lys Leu Glu Glu Leu Thr Asn Lys Lys Gly Met Thr
325 330 335
Pro Leu Ala Leu Ala Ala Gly Thr Gly Lys Ile Gly Val Leu Ala Tyr
340 345 350
Ile Leu Gln Arg Glu Ile Gln Glu Pro Glu Cys Arg His Leu Ser Arg
355 360 365
Lys Phe Thr Glu Trp Ala Tyr Gly Pro Val His Ser Ser Leu Tyr Asp
370 375 380
Leu Ser Cys Ile Asp Thr Cys Glu Lys Asn Ser Val Leu Glu Val Ile
385 390 395 400
Ala Tyr Ser Ser Ser Glu Thr Pro Asn Arg His Asp Met Leu Leu Val
405 410 415
Glu Pro Leu Asn Arg Leu Leu Gln Asp Lys Trp Asp Arg Phe Val Lys
420 425 430
Arg Ile Phe Tyr Phe Asn Phe Leu Val Tyr Cys Leu Tyr Met Ile Ile
435 440 445
Phe Thr Met Ala Ala Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gly Leu Pro Pro Phe
450 455 460
Lys Met Glu Lys Thr Gly Asp Tyr Phe Arg Val Thr Gly Glu Ile Leu
465 470 475 480
Ser Val Leu Gly Gly Val Tyr Phe Phe Phe Arg Gly Ile Gln Tyr Phe
485 490 495
Leu Gln Arg Arg Pro Ser Met Lys Thr Leu Phe Val Asp Ser Tyr Ser
500 505 510
Glu Met Leu Phe Phe Leu Gln Ser Leu Phe Met Leu Ala Thr Val Val
515 520 525
Leu Tyr Phe Ser His Leu Lys Glu Tyr Val Ala Ser Met Val Phe Ser
530 535 540
Leu Ala Leu Gly Trp Thr Asn Met Leu Tyr Tyr Thr Arg Gly Phe Gln
545 550 555 560
Gln Met Gly Ile Tyr Ala Val Met Ile Glu Lys Met Ile Leu Arg Asp
565 570 575
Leu Cys Arg Phe Met Phe Val Tyr Ile Val Phe Leu Phe Gly Phe Ser
580 585 590
Thr Ala Val Val Thr Leu Ile Glu Asp Gly Lys Asn Asp Ser Leu Pro
595 600 605
Ser Glu Ser Thr Ser His Arg Trp Arg Gly Pro Ala Cys Arg Pro Pro
610 615 620
Asp Ser Ser Tyr Asn Ser Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Glu Leu Phe Lys
625 630 635 640
Phe Thr Ile Gly Met Gly Asp Leu Glu Phe Thr Glu Asn Tyr Asp Phe
645 650 655
Lys Ala Val Phe Ile Ile Leu Leu Leu Ala Tyr Val Ile Leu Thr Tyr
660 665 670
Ile Leu Leu Leu Asn Met Leu Ile Ala Leu Met Gly Glu Thr Val Asn
675 680 685
Lys Ile Ala Gln Glu Ser Lys Asn Ile Trp Lys Leu Gln Arg Ala Ile
690 695 700
Thr Ile Leu Asp Thr Glu Lys Ser Phe Leu Lys Cys Met Arg Lys Ala
705 710 715 720
Phe Arg Ser Gly Lys Leu Leu Gln Val Gly Tyr Thr Pro Asp Gly Lys
725 730 735
Asp Asp Tyr Arg Trp Cys Phe Arg Val Asp Glu Val Asn Trp Thr Thr
740 745 750
Trp Asn Thr Asn Val Gly Ile Ile Asn Glu Asp Pro Gly Asn Cys Glu
755 760 765
Gly Val Lys Arg Thr Leu Ser Phe Ser Leu Arg Ser Ser Arg Val Ser
770 775 780
Gly Arg His Trp Lys Asn Phe Ala Leu Val Pro Leu Leu Arg Glu Ala
785 790 795 800
Ser Ala Arg Asp Arg Gln Ser Ala Gln Pro Glu Glu Val Tyr Leu Arg
805 810 815
Gln Phe Ser Gly Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Glu Val Phe Lys Ser
820 825 830
Pro Ala Ala Ser Gly Glu Lys
835
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 2
Leu Leu Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 3
Leu Leu Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys Thr Leu Arg
1 5 10 15
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 4
Gln Phe Ser Gly Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Glu Val Phe Lys Ser
1 5 10 15
Pro Ala Ala Ser Gly Glu Lys
20
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 5
Leu Leu Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys Thr Leu Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Asp Arg Arg Ser
20
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 6
Gly Arg His Trp Lys Asn Phe Ala Leu Val Pro Leu Leu Arg Glu
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 7
Leu Val Glu Asn Gly Ala Asp Val Gln Ala Ala Ala His Gly Asp Phe
1 5 10 15
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 8
Asp Gly Pro Thr Gly Ala Arg Leu Leu Ser Gln
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 9
Asp Ala Glu Val Phe Lys Ser Pro Ala Ala Ser Gly Glu Lys
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 10
Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys Thr Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 11
Ser Gly Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Glu Val Phe
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 12
Val Ser Pro Val Ile Thr Ile Gln Arg Pro Gly Asp
1 5 10
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 13
Val Ser Pro Val Ile Thr Ile Gln Arg Pro Gly Asp Gly Pro Thr Gly
1 5 10 15
Ala
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 14
Leu Asn Leu His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Ile Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 15
Tyr Thr Asp Ser Tyr Tyr Lys Gly Gln
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 16
Ser Leu Pro Ser Glu Ser Thr Ser His
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 17
Glu Asp Pro Gly Asn Cys Glu Gly Val Lys Arg
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 18
Asp Arg Gln Ser Ala Gln Pro Glu Glu Val Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 19
Gln Ser Ala Gln Pro Glu Glu Val Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 20
Phe Ala Pro Gln Ile Arg Val Asn Leu Asn Tyr Arg Lys Gly Thr Gly
1 5 10 15
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 21
Ala Ser Gln Pro Asp Pro Asn Arg Phe Asp Arg Asp Arg
1 5 10
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 22
Leu Asn Leu Lys Asp Gly Val Asn Ala Cys Ile Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 23
Cys Thr Asp Asp Tyr Tyr Arg Gly His
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 24
Leu Val Glu Asn Gly Ala Asn Val His Ala Arg Ala Cys Gly Arg Phe
1 5 10 15
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 25
Glu Asp Pro Ser Gly Ala Gly Val Pro Arg
1 5 10
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 26
Gly Ala Ser Glu Glu Asn Tyr Val Pro Val Gln Leu Leu Gln Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 27
Trp Ser Ser Thr Asp Leu Gly Ala Ala Ala Asp Pro Leu Gln Lys
1 5 10 15
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 28
Leu Leu Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys
1 5 10
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 29
Leu Leu Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys Thr Leu Arg
1 5 10 15
<210> 30
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 30
Ala Met Leu Asn Leu His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Ile Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ile Ala Arg
20
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 31
Gln Thr Asp Ser Leu Lys Glu Leu Val Asn Ala Ser Tyr Thr Asp Ser
1 5 10 15
Tyr Tyr Lys
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 32
Gly Gln Thr Ala Leu His Ile Ala Ile Glu Arg
1 5 10
<210> 33
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 33
Asn Met Ala Leu Val Thr Leu Leu Val Glu Asn Gly Ala Asp Val Gln
1 5 10 15
Ala Ala Ala His Gly Asp Phe Phe Lys Lys
20 25
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 34
Phe Leu Leu Gln Asn Ser Trp Gln Thr Ala Asp Ile Ser Ala Arg
1 5 10 15
<210> 35
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 35
Asp Ser Val Gly Asn Thr Val Leu His Ala Leu Val Glu Val Ala Asp
1 5 10 15
Asn Thr Ala Asp Asn Thr Lys
20
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 36
Leu His Pro Thr Leu Lys Leu Glu Glu Leu Thr Asn Lys
1 5 10
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 37
Lys Gly Met Thr Pro Leu Ala Leu Ala Ala Gly Thr Gly Lys
1 5 10
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 38
Gly Met Thr Pro Leu Ala Leu Ala Ala Gly Thr Gly Lys
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 39
Ile Gly Val Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Arg
1 5 10
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 40
Ala Ile Thr Ile Leu Asp Thr Glu Lys
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 41
Thr Leu Ser Phe Ser Leu Arg
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 42
Asn Phe Ala Leu Val Pro Leu Leu Arg
1 5
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 43
Glu Ala Ser Ala Arg Asp Arg Gln Ser Ala Gln Pro Glu Glu Val Tyr
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 44
Asp Arg Gln Ser Ala Gln Pro Glu Glu Val Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 45
Gln Ser Ala Gln Pro Glu Glu Val Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 46
Gln Phe Ser Gly Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Glu Val Phe Lys
1 5 10 15
<210> 47
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 47
Gln Phe Ser Gly Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Glu Val Phe Lys Ser
1 5 10 15
Pro Ala Ala Ser Gly Glu Lys
20
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 48
Asp Gly Pro Thr Gly Ala Arg Leu Leu Ser Gln
1 5 10
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 49
Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys Thr Leu Arg Leu Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 50
Asp Gly Gln Asn Thr Thr Ile Pro Leu Leu Leu Glu Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 51
Asp Ser Leu Lys Glu Leu Val Asn Ala Ser Tyr Thr
1 5 10
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 52
Asp Ser Val Gly Asn Thr Val Leu His Ala Leu Val Glu Val Ala
1 5 10 15
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 53
Asp Ala Glu Val Phe Lys Ser Pro Ala Ala Ser Gly Glu Lys
1 5 10
<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 54
Leu Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys Thr Leu
1 5 10
<210> 55
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 55
Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys Thr Leu
1 5 10
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 56
Ser Gln Asp Ser Val Ala Ala Ser Thr Glu Lys Thr Leu Arg Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 57
Asn Leu His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Ile Pro Leu
1 5 10
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 58
Leu Val Glu Asn Gly Ala Asp Val Gln Ala Ala Ala His Gly Asp Phe
1 5 10 15
Phe
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 59
Gln Thr Ala Asp Ile Ser Ala Arg Asp Ser Val Gly Asn Thr Val Leu
1 5 10 15
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 60
His Ala Leu Val Glu Val Ala Asp Asn Thr Ala Asp Asn Thr Lys Phe
1 5 10 15
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 61
Ala Ala Gly Thr Gly Lys Ile Gly Val Leu Ala Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 62
Ser Gly Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Glu Val Phe
1 5 10
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 63
Phe Gly Lys Gly Asp Ser Glu Glu Ala Phe
1 5 10
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 64
His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Ile Pro Leu Leu
1 5 10
<210> 65
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 65
Leu Val Glu Asn Gly Ala Asp Val Gln Ala Ala Ala His Gly Asp Phe
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 66
Val Glu Asn Gly Ala Asp Val Gln Ala Ala Ala His Gly Asp Phe
1 5 10 15
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 67
Val Glu Asn Gly Ala Asp Val Gln Ala Ala Ala His Gly Asp Phe
1 5 10 15
<210> 68
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 68
His Ala Leu Val Glu Val Ala Asp Asn Thr Ala Asp Asn Thr Lys Phe
1 5 10 15
<210> 69
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 69
Val Glu Val Ala Asp Asn Thr Ala Asp Asn Thr Lys Phe
1 5 10
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 70
Glu Val Ile Ala Tyr Ser Ser Ser Glu Thr Pro Asn Arg His Asp Met
1 5 10 15
Leu
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 71
Val Ser Pro Val Ile Thr Ile Gln Arg Pro Gly Asp Gly Pro Thr Gly
1 5 10 15
Ala
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 72
Ile Gln Arg Pro Gly Asp Gly Pro Thr Gly Ala Arg
1 5 10
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 73
Arg Pro Gly Asp Gly Pro Thr Gly Ala Arg Leu Leu
1 5 10
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 74
Leu Asn Leu His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Ile Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 75
Asp Thr Glu Lys Ser Phe Leu Lys
1 5
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 76
Glu Asp Pro Gly Asn Cys Glu Gly Val Lys Arg
1 5 10
<210> 77
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 77
Glu Asp Pro Gly Asn Cys Glu Gly Val Lys Arg Thr
1 5 10
<210> 78
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 78
Glu Asp Pro Gly Asn Cys Glu Gly Val Lys Arg Thr Leu
1 5 10
<210> 79
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 79
Ser Ala Arg Asp Arg Gln Ser Ala Gln Pro Glu Glu Val Tyr Leu Arg
1 5 10 15
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 80
Asp Arg Gln Ser Ala Gln Pro Glu Glu Val Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 81
Gln Ser Ala Gln Pro Glu Glu Val Tyr Leu Arg
1 5 10

Claims (28)

1.一种鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：
(i)用一种或多种蛋白酶执行所述蛋白质的计算机模拟蛋白酶消化，以鉴别蛋白质上被预测为被所述一种或者多种蛋白酶切割的位点；
(ii)在体外用一种或多种蛋白酶进行所述蛋白质的限制性或约束性蛋白水解；
(iii)通过步骤(ii)的体外蛋白酶消化鉴别从所述蛋白质释放的肽，从而鉴别切割位点；
(iv)将步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的切割位点与步骤(iii)中鉴别的切割位点进行比较；
(v)探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域包含或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，但不是步骤(iii)中用一种或者多种抗体鉴别的切割位点；和
(vi)鉴别所述一种或多种抗体是否与所述一种或多种表位结合，从而鉴别可被抗体结合的蛋白质上的表位。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括进行蛋白质同源建模以预测哪些计算机模拟预测的蛋白酶切割位点可能被暴露。
3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括进行抗体片段或蛋白酶的计算机模拟对接以预测哪些计算机模拟预测的切割位点可能在体外被切割。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中使用单一蛋白酶。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中使用多种蛋白酶。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中所述蛋白酶选自：胰蛋白酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰内肽酶、Lys-C、Lys-N、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、肠激酶、因子Xa、颗粒酶B、中性白细胞弹性蛋白酶、脯氨酸-内肽酶、葡萄球菌肽酶I和凝血酶。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中所述蛋白酶选自：胰蛋白酶、Asp-N内肽酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中所述蛋白质是存在于衍生自细胞的蛋白脂质体中的膜蛋白质。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白脂质体固定在流动池中以产生膜蛋白的固定相。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中通过步骤(ii)的体外蛋白酶消化鉴别从所述蛋白质中释放的肽，从而鉴别切割位点，通过质谱法进行。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(v)之前生成一个或多个分离的表位的步骤，所述分离的表位具有对应于所述蛋白质上的一个或多个表位的序列，所述一个或多个表位位于含有或侧接切割位点的蛋白质区域中，所述切割位点是步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，而不是步骤(iii)中鉴别的切割位点，和产生与所述分离的表位结合的抗体，和在步骤(v)中使用所述抗体探测所述蛋白质的所述一个或多个表位。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中探测多个表位。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中所述表位在所述切割位点的20个氨基酸内，所述切割位点是步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，而不是步骤(iii)中鉴别的切割位点。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其中探测多个表位，并且所述多个表位是一组表位，其中所述组中每个表位的序列相对于所述组中的另一个表位偏移1、2或3个氨基酸。
15.一种鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：
(i)在将所述蛋白质暴露于通过一种或多种蛋白酶的限制性或约束性蛋白水解后，鉴别所述一种或多种蛋白酶切割所述蛋白质的位点；和
(ii)探测所述蛋白质上的多个表位，所述表位位于切割位点之间、与切割位点重叠或位于侧接具有针对所述表位的抗体的切割位点的区域中，从而鉴别可以由抗体结合的一个或多个表位。
16.根据权利要求15的方法，其中使用单一蛋白酶。
17.根据权利要求15的方法，其中使用多种蛋白酶。
18.根据权利要求15-17中任意一项所述的方法，其中所述蛋白酶选自：胰蛋白酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰内肽酶、Lys-C、Lys-N、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、肠激酶、因子Xa、颗粒酶B、中性白细胞弹性蛋白酶、脯氨酸-内肽酶、葡萄球菌肽酶I和凝血酶。
19.根据权利要求15-18中任意一项所述的方法，其中所述蛋白酶选自：胰蛋白酶、Asp-N内肽酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K。
20.根据权利要求15-19中任意一项所述的方法，其中所述蛋白质是存在于衍生自细胞的蛋白脂质体中的膜蛋白质。
21.根据权利要求20的方法，其中所述蛋白脂质体固定在流动池中以产生膜蛋白的固定相。
22.根据权利要求15-21中任意一项所述的方法，其中使用质谱法鉴别一种或多种蛋白酶切割所述蛋白质的所述位点。
23.根据权利要求15-22中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括步骤(ii)之前产生多个分离的表位的步骤，所述分离的表位具有对应于所述蛋白质上表位的序列，所述表位位于切割位点之间、与切割位点重叠或位于侧接切割位点的区域中，和产生与所述分离的表位结合的抗体，和在步骤(ii)中使用所述抗体探测所述蛋白质上的所述多个表位。
24.根据权利要求15-23中任意一项所述的方法，其中所述表位在所述切割位点的20个氨基酸内。
25.根据权利要求15-24中任意一项所述的方法，其中所述多个表位是一组表位，其中所述组中每个表位的序列相对于所述组中的另一个表位偏移1、2或3个氨基酸。
26.根据权利要求1至25中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括产生针对由权利要求1至25中任意一项鉴别的表位的抗体的步骤。
27.通过权利要求1至25中任意一项所述的方法鉴别的表位。
28.一种结合权利要求27所述的表位的抗体。
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