CN109790523A

CN109790523A - 组合物及其用途

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Publication number: CN109790523A
Application number: CN201780022703.6A
Authority: CN
Inventors: 希尔马·M·瓦雷纽斯
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-02-10
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2019-05-21
Also published as: US20190046600A1; CA3012239A1; JP2019512462A; EP3414326A1; WO2017137761A1; AU2017217330A8; GB201602409D0; RU2018131821A; AU2017217330A1; RU2018131821A3

Abstract

本发明涉及能够调节聚(ADP‑核糖)聚合酶1(PARP‑1)和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性的化合物及其用途。

Description

组合物及其用途

技术领域

本发明涉及可用于治疗癌症的组合物，特别是涉及选择性地引起伴随有ATP耗竭的癌细胞坏死的化合物。

背景技术

目前抗癌药物开发的主要推动力来自于细胞表面受体以及阳性和阴性信号转导因子知识的爆炸性增长，最近还进一步由几种常见人类癌症的基因组研究所推动。[Pleasance et al.Nature(2009)463：191-196；et al.Science(2006)314：268-274；Greenman et al.Nature(2007)446：153-158；Jones et al.Science(2008)321：1801-1806；Gerlinger et al.(2012)366：883-892]。这些研究已经揭示了大量的基因突变，其中有数百种被认为是涉及有助于自主癌细胞增殖的进化的信号转导通路上的关键蛋白质的驱动突变。

通过这种途径揭示了多种潜在的药物靶标，以及更多数量的潜在治疗剂，因为几种不同的药物可能显示出针对任何一种靶标的活性。

本发明的抗癌治疗范例基于个别选定的癌症的基因组突变模式设想了针对所述癌症的定制药物治疗的进展。所得到的治疗剂被快速引入到临床中。然而，这些新药物通常具有较差的单一药物疗效，几乎没有完全肿瘤应答，并且在大多数情形中，中位应答持续时间少于一年。

因此，需要更多的全身性抗癌治疗剂。

与突变衍生的信号转导靶标的多重性和异质性相反，多年来在癌细胞中已经观察到某些一般性异常，例如有氧糖酵解和非整倍体。这些变化仍然是治疗开发的潜在全身性“阿喀琉斯之踵”。

有氧糖酵解首先由Otto Warburg[Warburg et al..J Gen Physiol(1927)8：519-530]描述为癌细胞和正常细胞之间的一般差异。他发现葡萄糖的摄取增加和乳酸的产生是癌细胞中有氧糖酵解的特征，即使在存在足够氧时也是如此。这一发现(该发现表明与正常相比，癌细胞中碳水化合物代谢异常)可以提供全身性抗癌靶标，并继续被积极地研究。[Reviewed by Dang et al.J Mol Med(2011)89：205-212]。

其中癌细胞内的碳水化合物代谢可以被治疗性靶向的两个关键分子位点是酶己糖激酶2和乳酸脱氢酶。

己糖激酶2在通过细胞膜摄取葡萄糖后将其磷酸化，从而将葡萄糖困在细胞内用于糖酵解。己糖激酶2(HK2)作为潜在选择性全身性癌症靶标的重要性，最近已在小鼠Hk2缺失实验中突显[Ros and Schulze Cancer Discov；(2013)3：1105-1107]。已经尝试在小鼠异种移植模型中体内抑制己糖激酶2作为抗癌治疗[Xu et al.Cancer Res；(2005)65：613-621]。虽然2-脱氧葡萄糖自身是弱肿瘤抑制剂，但已证明其与二甲双胍结合使用时在广谱临床前癌症模型中是有效的[Cheong et al.Mol Cancer Ther(2011)10：2350-2362]。己糖激酶2的另一种癌症治疗性抑制剂是3-溴丙酮酸[Ko et al.Cancer Lett(2001)173：83-91]，但是其有对正常组织毒性的问题。

多年来已知乳酸脱氢酶A(LDHA)在肿瘤中增加，并且已经被鉴定为c-Myc致癌转录因子的直接靶标[Le et al.PNAS(2010)107：2037-2042]。将LDHA抑制剂设计为抗癌治疗剂的药物化学程序目前正在进行[Granchi et al.J.Med Chem(2011)54：1599-1612]。

除了紊乱的糖酵解之外，癌细胞中的能量水平也受聚-ADP-核糖聚合酶的活性的影响。

聚(ADP-核糖)聚合酶-1[PARP-1]是具有聚(ADP-核糖基化)催化活性的酶家族的主要成员(Munoz-Gamez et al.，Biochem J(2005)；386：119-125)。它由三个保守的主要结构域组成：含有三个锌指的NH2端DNA-损伤感应和结合结构域、自动修饰结构域和C端催化结构域(Javle and Curtin，Brit J Cancer(2011)：105：114-122)。

PARP-1是染色质相关的保守核蛋白(Cherney et al.；Proc.NatlAcad.Sci.USA.1987；84：8370-8374)，其具有快速且直接地结合至单链和双链DNA断裂的能力。两种类型的DNA断裂均可激活酶的催化能力，该酶随之通过共价连接ADP-核糖部分的支链来调节广泛范围的核蛋白的活性(Munoz-Gamez et al..，Biochem J(2005)；386：119-125)。聚ADP-核糖链的主要功能是向修复酶提示DNA损伤位点。

当PARP-1被DNA断裂所激活时，该PARP-1切割NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)以产生烟酰胺和ADP-核糖，该ADP-核糖形成连接至链断裂附近的DNA的链(Javle and Curtin，Brit J Cancer(2011)105：114-122)。通过PARP切割NAD⁺以在DNA上形成ADP-核糖链，使得可用于产生ATP的NAD⁺减少，其中ATP是细胞的基本能量来源。因此，PARP活性可导致细胞ATP水平的下降。

细胞凋亡是活跃的“细胞自杀”，是一种能量依赖性过程。PARP活性导致的ATP耗竭可使细胞丧失进行细胞凋亡所必需的能量。因此成功的凋亡过程的重要组成是切割PARP以防止ATP耗竭。切割使聚-(ADP-核糖基化)失活，并由几种半胱天冬酶(特别是半胱天冬酶-3)进行(Herceg and Wang，Mol Cell Biol(1999)；19：5124-5133)。半胱天冬酶-3在Asp214和Gly 215氨基酸之间的DEVD位点[Gly-Asp-Glu-Val-Asp₂₁₄-Gly₂₁₅(SEQ ID NO：1)]切割113-kDa PARP蛋白，产生两个片段，即89-kDa多肽和24-kDa多肽。

来自PARP的切割片段似乎有助于抑制PARP活性，因为p89和p24分别抑制完整PARP的同源结合和DNA结合(Graziani and Szabo 2005，Pharmacol Res.(2005)；52：109-118)。

高水平的ATP能使细胞经历凋亡，低水平的ATP则将细胞从凋亡(apoptosis)转移到坏死(necrosis)(Eguchi Y，Shimizu S，Tsujimoto Y，Cancer Res(1997)；57：1835-1840)。PARP已证实介导了小鼠成纤维细胞中ATP耗竭引起的坏死死亡。来自PARP缺陷小鼠(PARP-/-)的成纤维细胞受到保护而免受ATP耗竭和坏死死亡(Ha and Snyder 1999，ProcNatl Acad Sci(1999)：96：13978-13982)。

总之，PARP是113-kDa蛋白，其用聚ADP-核糖链标记DNA断裂以被修复酶识别。聚ADP-核糖通过NAD分解形成，NAD可以导致细胞凋亡所必需的ATP耗竭并且可能导致细胞坏死死亡。

非整倍体是另一种全身性变化，它是癌细胞的特征并且在正常细胞中不存在[Duesberg and Rasnik.Cell Motility and the Cytoskeleton(2000)47：81-107]。非整倍体的严格定义为偏离正常细胞中存在的染色体的单倍体数的倍数的异常染色体数[Holland and Cleveland EMBO reports(2012)13：501-514]。

针对非整倍体是正常细胞的恶性转化的原因的内在因素、还是非整倍体是经常伴随这种恶性变化的遗传不稳定性的结果的问题，已经有了大量研究[Li PNAS(2000)97：3236-3241；Knaus and Klein J Biosci(2012)37：211-220]。但关键点在于，非整倍体是在癌细胞中发现的已标记的DNA损伤的一种表现，是非整倍体之前的异常有丝分裂[Ganemand Pellman J Cell Biol(2012)199：871-881]或非整倍体染色体的分离错误[Jenssenet al.Science 92011)333：1895-1898]引起的平行结果。

癌细胞和正常细胞之间的明显差异在于，具有严重受损基因组的癌细胞对DNA修复的需求比正常细胞要大得多。DNA修复过程的主要因素是聚(ADP-核糖)聚合酶-1[PARP-1]对DNA损伤的“标记”。

因此，不令人惊讶的是，已在广泛的不同人类癌症中观察到，与产生癌症的正常组织相比，所述癌症中PARP活性增加(通过mRNA表达进行测量)[Ossovskaya et al.Genesand Cancer(2010)1：812-821]。

因此，作为紊乱的碳水化合物代谢和重复细胞倍增及修复其大量DNA损伤所需的高能量需求的结果，癌细胞是在与正常细胞相比为能量短缺的情况下运作的。此外，可以预见，完成每个重复的癌细胞分裂所需的能量将对该能量短缺造成进一步的负担。

对于能够对存在于癌细胞中但不存在于正常细胞中的上述全身性能量短缺靶标加以利用的抗癌治疗剂，存在尚未填补的需要。

已经证实，增加的PARP活性会导致抗坏血酸/甲萘醌诱导的氧化应激，在K562细胞[Verrax et al..Int J Cancer(2007)120：1192-1197]中和氰化物中毒的CX细胞中(其中用zVAD-fmk抑制半胱天冬酶级联，[Prabhakaran et al..Toxicology and AppliedPharmacology(2004)195：194-202])引起DNA损伤，随后导致细胞坏死。然而，在这些情形中，除了维持PARP功能之外，还需要DNA损伤或氧化应激才会发生细胞坏死。半胱天冬酶抑制剂zVAD-fmk单独不会引起坏死。类似地，其他半胱天冬酶抑制剂如存活蛋白[Hensley etal.Biol Chem(2013)394：831-843]和DEVD-CHO[Coelho et al.Brit J Cancer(2000)83：642-629]单独不会引起坏死。此外，XIAP半胱天冬酶抑制剂的小分子拮抗剂刺激半胱天冬酶活性，但诱导凋亡而不是坏死[Schimmer et al.Cancer Cell 92004)5：25-35]。

因此，PARP激动剂，例如半胱天冬酶抑制剂，尽管保持活性PARP，但其本身似乎不诱导细胞坏死。此外，通过点突变使PARP对DEVD位点的半胱天冬酶切割不敏感，本身不会引起坏死。坏死仅在加入TNF-α时发生[Herceg和Wang Molec Cell Biol(1999)219：5124-5133]。

总之，已经描述了许多PARP激动剂，其中没有一种能单独引起细胞坏死，但可以与其它药剂组合引起坏死。在这里，首次描述了可以通过ATP耗竭单独(而不需要第二种药剂)引起癌细胞死亡的PARP激动剂。

在治疗上开发PARP功能的当前尝试，集中于开发能够阻止聚(ADP-核糖基化)并由此增强DNA损伤性治疗剂效果的PARP抑制剂，其导致凋亡而不是坏死(Munoz-Gamez etal.，Biochem J(2005)；386：119-125；Plummer，Curr.Opin.Pharmacol.(2005)；6：364-368；Graziani and Szabo，Pharmacol Res.(2005)；52：109-118)。

最先商业化的PARP抑制剂之一是奥拉帕尼(Olaparib，AZD 2281)(4-[3-(4-环丙烷羰基哌嗪-1-羰基)-4-氟苄基]-2H-酞嗪-1-酮)，Menear et al.，Journal of MedicinalChemistry(2008)；51：6581-91)。Olaparib已在临床前和临床上作为DNA损伤药物替莫唑胺(Temozolomide)的潜在增强剂得到了研究(Khan et al.，British Journal of Cancer(2011)；104：750-755)。

在小肽中包含SEQ ID NO：2(PRGPRP)已证实对广泛的人体外癌细胞系具有选择性杀癌作用，但对正常二倍体人角质形成细胞、成纤维细胞或永生化MRC5-hTERT细胞则没有(Warenius et al.Molecular Cancer(2011)；10：72-88 and WO/2009/112536)。

据报告，这些环肽普遍存在的选择性抗癌活性，高度依赖于六肽序列内的精氨酸，因为氨基酸序列改变为SEQ ID NO：3(Pro-Arg-Arg-Pro-Gly-Pro)会失去杀癌能力，这和将任一精氨酸取代为L-NG-单甲基精氨酸或谷氨酸一样。

考虑到蛋白质组中肽序列的多重性，序列PRGPRP(SEQ ID NO：2)或非常类似的序列不可能随机地出现在几种蛋白质的肽链内。例如，D-氨基酸序列PRKPRP(SEQ ID NO：5)可以在Jun结合肽(JBP)[US2007/0060514A1]中找到，六肽PRGPRP(SEQ ID NO：2)也可以在推导的bbc3基因的氨基酸序列[WO00/26228；Reimertz et al.Journal Cell Biology(2003)162：587-598]中找到。

然而，肽序列在蛋白质内的存在并不意味着是这条与肽或蛋白质内的其它氨基酸序列不同的特定序列负责着整个蛋白质的特定功能活性。特定氨基酸序列的功能需要被证明而不是被假设。在位于蛋白质外环上的CDK4中的六肽PRGPRP(SEQ ID NO：2)的情形中，所述功能是通过坏死来选择性地杀伤癌细胞，并且所述活性通过PRGPRP(SEQ.ID NO：2)中的特定改变或通过在任一精氨酸的胍区域中进行N-单甲基化而除去，所述特定改变例如将序列改变为PRRPGP(SEQ ID NO：3)。然而，对于JBP的PRKPRP(SEQ ID NO：5)区或BBC3的PRGPRP(SEQ ID NO：2)区，没有其功能性的具体实验证据。此外，整个JPB分子保护正常神经元细胞免受缺血性坏死。这是与产生坏死的、CDK4衍生的基于PRGPRP的环肽相反的活性。此外，尽管BBC3含有PRGPRP序列(SEQ ID NO：2)，但是整个蛋白通过干扰BCL抗凋亡蛋白家族成员的功能而在正常神经元中引起凋亡。尽管它们含有与PRGPRP(SEQ ID NO：2)紧密同源或相同的序列，JBP和BBC3都没有显示出引起癌细胞与正常细胞相比的选择性坏死。

先前描述的环肽(WO/2009/112536)由活性PRGPRP位点(SEQ ID NO：2)(“弹头(warhead)”)和“骨架(backbone)”组成，该骨架形成16-18氨基酸环肽，其与包含PRGPRP氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的CDK4的外部化环的大小相似。

该PRGPRP(SEQ ID NO：1)“弹头”本身是两亲性的。如果与“骨架”中的非两亲性氨基酸序列组合在环肽中，则所得环肽是无活性的[Warenius et al.Molecular Cancer(2011)；10：72-88]，即：

相比之下，引入两亲性ALKLALKLAL“骨架”(SEQ ID NO：10)，成功产生了活性PRGPRP环肽。

然而，两亲性“骨架”的长度和组成的小差异可能导致生物活性的大区别。因此，关于杀死NCI-H460人非小细胞肺癌细胞，非常相似的环肽显示出相反的活性。亦即：

SEQ ID NO：11：Cyc-[PRGPRPVKLALKLALKLAL](“THR52”)无活性

SEQ ID NO：12：Cyc-[PRGPRPVKLALKLALKFP](“THR53”)活性

SEQ ID NO：13：Cyc-[PRGPRPVALKLALKLAL](“THR54”)活性

不受理论的约束，可能的是，两亲性“骨架”的螺旋结构将“弹头”约束在生物活性优化构象中。此外，“骨架”和“弹头”中的氨基酸序列的精确组合，可以影响整个肽的生物活性。因此，可以预期，优化的“骨架”/“弹头”组合，使得本申请所述的化合物作为整体环肽最有效地发挥作用。

环状肽THR53、其类似物THR54(本申请也称为HILR-001)和THR79(Cyc-[PRGPRPvalklalkalal](SEQ ID NO：14)[Warenius et al.Molecular Cancer(2011)；10：72-88和WO/2009/112536]选择性地杀死众多种类的人癌细胞系，但是却有低比活性的问题，其IC₅₀在100-200μM范围内。尽管在体外表现出令人鼓舞的抗癌治疗潜力，所述低比活性阻碍了对异种移植人类癌症的体内测试，因为所需的全身剂量将高于小鼠可耐受的剂量。

因此，需要一种能够保留THR53和THR54的选择性癌细胞杀伤能力且具有更高比活性的新环肽。还需要其它活性肽部分。

公开号为2007/0060514的美国专利申请公开了蛋白激酶抑制剂，更具体地，公开了蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶的抑制剂。

公开号为2006/078503的国际专利申请公开了用于筛选PARP激活剂的方法。

公开号为2009/112536的国际专利申请公开了包含CDK4肽区和细胞穿透区的环肽。

文献[Warenius et al.(Molecular Cancer 2011，10-72)]公开了具有与周期蛋白依赖性激酶4的非激酶结构域的序列同源性的六肽的选择性抗癌活性。

文献[Liu et al.(Neuropathology and Applied Neurobiology(2010)，36，211-224)]陈述了成年大鼠脑缺血后，c-JunN末端激酶(JNK)抑制剂XG-102增强了高压氧的神经保护作用。

文献[Herceg and Wang(Molecular and Cellular Biology，July 1999，pp.5124-5133)]陈述了半胱天冬酶对聚(ADP-核糖)聚合酶的切割失败，诱导了坏死并增加了细胞凋亡。

公开号为99/18998的国际专利申请公开了包装水不溶性物质例如药物或其它治疗剂或诊断剂的方法。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供一种能够调节聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性的化合物，其中，所述化合物包括根据式1的部分或其盐、衍生物、前药或模拟物：

式1：[X1-X2-X3-X4-X3-X4-X3-]

其中，X1是能够抑制PARP-1切割的肽部分。

其中，X2可以不存在或存在；当X2存在时，X2选自Val或Ser；

其中，X3和X4中的一个选自Trp-Trp和Ar1-Ar2；

其中，X3和X4中的另一个选自Arg-Arg、Gpa-Gpa、Hca-Hca和Ar3-Ar4；且

其中

Hca表示同型半胱氨酸的氨基酸残基；

Gpa表示胍基苯丙氨酸的氨基酸残基；

Ar1、Ar2、Ar3和Ar4各自表示具有芳基侧链的氨基酸残基，其中所述芳基侧链独立地选自任选取代的萘基、任选取代的1，2-二氢萘基和任选取代的1，2，3，4-四氢萘基；和

Aza表示叠氮基-高丙氨酸的氨基酸残基。

所述化合物包含至少一个标记部分。

所述化合物中，X1选自SEQ ID NO：21(式2)、SEQ ID NO：22(式3)、SEQ ID NO：23(式4)和SEQ ID NO：24(式5)：

SEQ ID NO：21(式2)：-Pro-X5-X6-Pro-X7-Pro-

其中X5和X7都是带有酸性侧链的氨基酸残基，或其中X5和X7都是带有碱性侧链的氨基酸残基；

其中所述带有酸性侧链的氨基酸残基各自独立地选自Glu、Aza和Hca；

其中X6选自Gly、Ala、MeGly和(CH₂)₃；

SEQ ID NO：22(式3)：-Pro-X8-Gly-Pro-X9-Pro-

其中X8和X9各自独立地选自Asp和Glu；

SEQ ID NO：23(式4)：-Pro-Arg-Lys-Pro-Arg-Pro-；

SEQ ID NO：24(式5)：-Gly-X11-Glu-Val-X12-X13-

其中X11选自Asp和Glu；

其中X12选自Asp、N-烷基天冬氨酸残基、N-芳基天冬氨酸残基Glu、N-烷基谷氨酸残基和N-芳基谷氨酸残基；

其中X13选自Gly、N-烷基甘氨酸残基和N-芳基甘氨酸残基；

附带条件是如果X12是Asp，则X13是N-烷基谷氨酸残基或N-芳基谷氨酸残基。

X1可以是SEQ ID NO：21(式2)。

X5可以是Glu或Hca和/或X7是Glu或Hca。

X1可以选自：

i.SEQ ID NO：2-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Pro-；

ii.SEQ ID NO：4-Pro-Glu-Gly-Pro-Glu-Pro-；

iii. SEQ ID NO：25-Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro-；

iv.SEQ ID NO：26-Pto-Hca-MeGly-Pro-Hca-Pro-；

v.SEQ ID NO：27-Pro-Aza-MeGly-Pro-Aza-Pro-；

vi.SEQ ID NO：28-Pro-Hca-Gly-Pro-Aza-Pro-；

vii.SEQ ID NO：41-Pro-Aza-Gly-Pro-Hca-Pro-；和

viii.SEQ ID NO：42-Pro-Aza-Gly-Pro-Aza-Pro。

X1可以是SEQ ID NO：22(式3)，X8是Asp，X9是Asp；或其中X1是SEQ ID NO：24(式5)。

X1可以是SEQ ID NO：24(式5)，X11是Asp，X12是Asp或N-烷基天冬氨酸残基。

X1可以是-Gly-Asp-Glu-Val-NMeAsp-MeGly-Val(SEQ ID NO：29)，并且其中NMeAsp是N-甲基天冬氨酸残基。

X2可以存在，并且其中X2是Val。

X3可以选自Trp-Trp和Ar1-Ar2，并且其中X4选自Arg-Arg、Gpa-Gpa和Hca-Hca。

Ar1和/或Ar2可包含任选取代的萘基。

Ar1和/或Ar2可以是谷氨酸-γ-[2-(1-磺酰基-5-萘基)-氨基乙基酰胺(“Eda”)的氨基酸残基。

X4可以是Arg-Arg、Gpa-Gpa或Hca-Hca。

X3可以是Ar1-Ar2，X4是Ar3-Ar4。

Ar1和Ar2各自可以为Eda，并且其中Ar3和Ar4各自为Nap，其中“Nap”表示3-氨基-3-(-2-萘基)-丙酸的氨基酸残基。

根据本发明的另一个方面，提供一种用于调节聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性的化合物，该化合物包含根据式6的部分：

式6：-Pro-X14-X15-Pro-X16-Pro-

其中X14和X16各自独立地选自带有侧链的氨基酸残基、带有取代基的萘基、带有取代基的1，2-二氢萘基、带有取代基的1，2，3，4-四氢萘基和带有取代基的丙基，其中每个侧链或取代基均包含酸性官能团；和

其中X15选自Gly、Ala、MeGly和(CH₂)₃。

X14和X16可各自为氨基酸残基。

X14和X16中的至少一个可以是Asp。

X14和/或X16可包含磺酸基。

所述化合物可以是包含总共16至18个单元的肽化合物，其中各单元是氨基酸残基、任选取代的萘基，任选取代的1，2-二氢萘基、和任选取代的1，2，3，4-四氢萘基或任选取代的丙基。

所述化合物包含根据式8的结构：

式8：[X17-X2-X3-X4-X3-X4-X3]

其中X17是根据式6的部分；和

其中X2，X3和X4如权利要求1中所定义，并且任选地，其中X3和X4如前面根据本发明的第一方面所定义。

所述化合物可以包含标记部分。

根据本发明的另一个方面，提供一种基本如上所述的、包含阴离子部分的化合物，所述阴离子部分能够调节聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性。

根据本发明的又一方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含如上所述的化合物，和药物载体、稀释剂或赋形剂。

所述药物组合物可以包含另外的治疗剂。

所述另外的治疗剂可以是有氧糖酵解抑制剂。这种有氧糖酵解抑制剂可以是2-脱氧葡萄糖。

上述化合物或药物组合物可用于医药。

所述化合物或组合物可用于治疗癌症。

所述化合物或组合物可以与另外的治疗剂一起给药。

所述另外的治疗剂可以是有氧糖酵解抑制剂。

所述化合物或药物组合物可以用于还包括使用放射疗法和/或手术的治疗方案中。

根据本发明的另一方面，提供了一种如上所述的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

根据本发明的又一方面，提供了一种如上所述的化合物在体外调节聚(ADP-核糖)聚合酶和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性的用途。

根据本发明的另一方面，提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括给患者施用如上所述的化合物或药物组合物。

所述方法还包括给患者施用有氧糖酵解抑制剂。

所述方法还包括使用化学疗法、放射疗法和手术中的一种或多种。

所述方法可以还包括使用具有标记部分的化合物，并且其中所述方法包括检测所述化合物的步骤。

根据本发明的又一方面，提供了一种分析方法，该方法包括：

i.使细胞与如上所述的化合物接触；和

ii.检测所述化合物。

所述细胞可以包含至少一种癌细胞。所述方法包括Western印迹分析。步骤(ii)可以包括荧光检测。

根据本发明的另一个方面，提供一种能够调节聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性的化合物，其中，所述化合物包括根据式1的部分或其盐、衍生物、前药或模拟物：

式1：[X1-X2-X3-X4-X3-X4-X3-]

其中X1是能够抑制PARP-1切割的部分；

其中，X2可以不存在或存在；当X2存在时，X2选自Val或Ser；

其中，X3和X4中的一个选自Trp-Trp和Ar1-Ar2；

其中，X3和X4中的另一个选自Arg-Arg、Gpa-Gpa、Hca-Hca和Ar3-Ar4；和

其中

Hca表示同型半胱氨酸的氨基酸残基；

Gpa表示胍基苯丙氨酸的氨基酸残基；

Ar1、Ar2、Ar3和Ar4各自表示具有芳基侧链的氨基酸残基，其中芳基侧链独立地选自任选取代的萘基、任选取代的1，2-二氢萘基和任选取代的1，2，3，4-四氢萘基；

Aza表示叠氮基-高丙氨酸的氨基酸残基；和

其中X1具有以下任一结构或者是以下任一结构的衍生物：

a)

或

b)

所述化合物包含至少一个标记部分。该至少一个标记部分可包含荧光标记。

所述化合物可以是由以下组成的化合物：

环-[X1-X2-X3-X4-X3-X4-X3]，

或是其盐、衍生物、前药或模拟物。

所述化合物可以是一模拟物，在该模拟物中，一个或多个肽键的NH基团被CH2基团替代。

所述化合物可以是一模拟物，在该模拟物中，一个或多个氨基酸残基被芳基替代。所述芳基可以是萘基。

所述化合物可以是模拟物，在该模拟物中，一个或多个氨基酸残基被如下基团替代：任选取代的萘基、任选取代的1，2-二氢萘基、任选取代的带有取代基的1，2，3，4-四氢萘基或任选取代的丙基。

所述化合物可以是包含取代基的模拟化合物，所述取代基选自形成23种蛋白氨基酸中的任一种蛋白氨基酸的侧链的基团。

所述化合物可以是模拟化合物，该模拟化合物中50％或更少的氨基酸残基被所述基团替代。

所述化合物可以还包含有氧糖酵解抑制剂。所述有氧糖酵解抑制剂可以是2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。

如上所述的化合物可用于医药。

所述组合物可用于治疗癌症。

根据本发明的另一方面，提供一种用于治疗癌症的化合物，该化合物包含聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)激动剂和乳酸脱氢酶A(LDHA)抑制剂。

所述PARP-1激动剂和LDHA抑制剂可以是单一治疗剂。

所述化合物能够与PARP-1的DEVD或GDEVDG区域结合和/或保护PARP-1的DEVD或GDEVDG区域免受切割。

所述化合物可以包含具有16至18个氨基酸的肽或其盐、衍生物、前药或模拟物。

所述化合物包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。

如果所述化合物是肽，则所述肽可以包含4至6个氨基酸序列，所述氨基酸序列与PARP-1的DEVD或GDEVDG区域结合和/或抑制PARP切割。

所述化合物可以是根据前述各个方面的、如上所述的化合物。

所述化合物可以包含或还包含有氧糖酵解抑制剂。这种有氧糖酵解抑制剂可以包括2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。

所述化合物可以还包含药物载体、稀释剂或赋形剂。

所述化合物可以用于还包括使用放射疗法和/或手术的治疗方案中。

所述癌症可以包括以下中的一种或多种：乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、恶性黑素瘤、成神经细胞瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤或神经胶质瘤。

所述癌症包括多种癌症或转移性癌症。

根据另一方面，提供了所述化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

根据又一方面，提供了一种用于治疗癌症的治疗剂组合，该治疗剂组合包含第一治疗剂和第二治疗剂，所述第一治疗剂包含聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)激动剂和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)抑制剂，所述第二治疗剂包含有氧糖酵解抑制剂。

所述第一治疗剂和第二治疗剂可以用于共同给药。

所述化合物可以包含具有16至18个氨基酸的肽或其盐、衍生物、前药或模拟物。所述化合物可以包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：30的氨基酸序列。所述肽可以包含4至6个氨基酸序列，所述氨基酸序列与PARP-1的DEVD或GDEVDG区域结合和/或抑制PARP切割。

所述组合可以包含根据前述各方面的、如上所述的化合物。

所述有氧糖酵解抑制剂可以包括2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。

所述第一治疗剂和第二治疗剂可以还包含药物载体、稀释剂或赋形剂。

所述组合可以用于还包括使用放射疗法和/或手术的治疗方案中。

所述癌症包括以下中的一种或多种：乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、恶性黑素瘤、成神经细胞瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤或神经胶质瘤。

所述癌症包括多种癌症或转移性癌症。

根据本发明的又一方面，提供了一种所述组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

根据本发明的又一方面，提供了一种用于治疗癌症的化合物，该化合物包含聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)激动剂或PARP-1蛋白酶竞争性抑制剂，所述化合物包含总共5或6个氨基酸残基的部分或其盐、衍生物、前药或模拟物，其中所述部分具有以下中的任一个：

i.第二和第五氨基酸残基位置，该位置包含具有在生理pH下能够带正电荷的侧链的任何碱性天然或非天然氨基酸残基；或

ii.第二和第五氨基酸残基位置，该位置包含具有在生理pH下能够带负电荷的侧链的任何酸性天然或非天然氨基酸残基。

i.中的所述第二和/或第五氨基酸残基位置可以包含Arg。ii.中的所述第二和/或第五氨基酸残基位置可以包含Asp。ii.中的所述第二和/或第五氨基酸残基位置包含Glx和/或Hca。所述化合物能够与PARP-1的DEVD或GDEVDG区域结合和/或保护PARP-1的DEVD或GDEVDG区域免于切割或模拟PARP-1的DEVD或GDEVDG区域。所述化合物可以包含具有16至18个氨基酸的肽或其盐、衍生物、前药或模拟物。PARP-1蛋白酶可包含半胱天冬酶。所述半胱天冬酶可以是半胱天冬酶-3。

所述化合物可以包含或还包含有氧糖酵解抑制剂。所述有氧糖酵解抑制剂可以包括2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。

所述化合物可以还包含药物载体、稀释剂或赋形剂。

所述癌症包括以下中的一种或多种：乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、成神经细胞瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤或神经胶质瘤。

所述癌症可以包括多种癌症或转移性癌症。

根据又一方面，提供了一种如上所述的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

从下文提供的具体实施方式部分中，本发明的其它应用领域将变得显而易见。具体实施方式部分和具体示例所表明的是本发明的优选实施例。

附图说明

通过具体实施方式部分和附图，能够更充分地理解本发明，其中：

图1显示了用于通过自动化肽合成而加入到肽中的、受保护的胍基苯丙氨酸(Gpa)和同型半胱氨酸(Hca)的结构；

图2显示了用于通过自动肽合成而加入到环肽中的、受保护的叠氮高丙氨酸(azidohomoalanine)和3-氨基-3-(-2-萘基)-丙酸的结构；

图3显示了HILR-001(SEQ ID NO：13)、HILR-025(SEQ ID NO：15)和HILR-030(SEQID NO：16)的IC50曲线(对照％相对于Log[M]的关系曲线)，展示了：包含WWRRWWRRWW两亲性盒(SEQ ID NO：17)的HILR-025序列(SEQ ID NO：15)的活性相对于HILR-001增加，以及具有Trp-Trp-Gpa-Gpa-Trp-Trp-Gpa-Gpa-Trp-Trp(SEQ ID NO：18)盒的HILR-030的活性相对于HILR-025(SEQ ID NO：15)进一步增加，并且图3还展示了HILR-D-08(SEQ ID NO：31)的IC50曲线；

图 4显示了HILR-D-02(Cyc-[Pro-Glu-Gly-Pro-Glu-Pro-Val-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp](SEQ ID NO：19)和HILR-D-06(Cyc-[Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro-Val-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp])(SEQ ID NO：20)的IC50曲线(对照％相对于Log[M]的关系曲线)，其证明“弹头”中的阴离子基团是有效的；

图5是PARP标准活性曲线(光输出相对于纯化的PARP酶单位的关系曲线)；

图6显示了Olaparib和3-氨基苯甲酰胺对PARP活性的影响；

图7显示了不同浓度的Olaparib在96小时时间中对PARP活性的影响；

图8显示了对Olaparib和紫杉醇的IC₅₀分析；

图9显示了在96小时时间中，HILR-001与PARP抑制剂Olaparib结合起来对NCl-NCI-H460细胞的作用。Olaparib部分地逆转了HILR-001诱导的ATP下降，从而降低了癌细胞坏死的程度；

图10显示了半胱天冬酶-3对Ac-DEVD-CHO的剂量反应；

图11显示了Ac-DEVD-CHO和HILR-030对半胱天冬酶-3活性的影响；

图12进一步说明了Ac-DEVD-CHO和HILR-030对半胱天冬酶-3活性的影响；

图13显示了CDK4外部环的PRGPRP(SEQ ID NO：2)区和PARP的DEVD区的比对，以及GDEVDG同源物(HILR-D-01)对NCI-H460细胞轻度但显著的杀伤；

图14显示了所述环肽的肽模拟物同源物；

图15显示了根据本发明所述的环状化合物和2-脱氧葡萄糖(2-DOG)共同施用的效果；

图16显示了用HILR-025、HILR-D-07或DMSO对照处理后的NC1 H460人非小细胞肺癌细胞的形态学变化；

图17显示了在24小时和96小时，HILR-025和HILR-030的IC₅₀剂量对LDH活性的抑制作用；和

图18是细胞呼吸的简化示意图，其中显示了HILR化合物的推定作用位点。伴随着对PARP的激动作用的LDHA抑制可以产生细胞ATP水平的减少。通过6脱氧葡萄糖抑制己糖激酶将额外增强HILR环肽的使ATP降低的活性。

序列表自由文本

SEQ ID NO：2、21、22、23、24、25、26、27、28、29、37、41和42是杀癌基团。

SEQ ID NO：3和4是比较肽。

SEQ ID NO：5是Jun结合肽的部分序列。

SEQ ID NO：6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、19、20、30、31、32、33、34、35、36、39和43～48是环肽。

SEQ ID NO：10、17、18、38和39是盒。

一些附加序列包含非标准非天然氨基酸残基。在序列表中所列举的非天然氨基酸残基是：胍基苯丙氨酸、同型半胱氨酸、叠氮基高丙氨酸、N-甲基天冬氨酸、3-氨基-3-(2-萘基)-丙酸残基，和谷氨酸-γ-[2-(1-磺酰基-5-萘基)-氨基乙酰胺残基。

参考SEQ ID NO：21，上述描述位置(2)的自由文本规定“碱性残基或选自同型半胱氨酸、叠氮基高丙氨酸和谷氨酸的酸性残基”。描述位置(3)的自由文本规定“选自Gly、Ala、MeGly和(CH₂)₃”。描述位置(5)的自由文本规定“如果残基2是酸性的，则是选自谷氨酸和同型半胱氨酸的酸性残基。如果残基2是碱性的，则是碱性残基”。

参考SEQ ID NO：24，描述位置(2)的自由文本规定“选自Asp和Glu”。描述位置(5)的自由文本规定“选自Asp、N-烷基Asp、N-芳基Asp、Glu、N-烷基Glu、N-芳基Glu“。描述位置(6)的自由文本规定“选自Gly、N-烷基Gly、N-芳基Gly”。

参考SEQ ID NO：37，描述位置(2)的自由文本规定“带有酸性侧链的任何天然或非天然氨基酸”。描述位置(3)的自由文本规定“选自Gly、Ala、MeGly和(CH₂)₃”。描述位置(5)的自由文本表明“带有酸性侧链的任何天然或非天然氨基酸”。

具体实施方式

本公开提供了能够调节聚(ADP-核糖)聚合酶1的活性的化合物。所述化合物可以增加给定细胞内的整个整体聚(ADP-核糖)聚合酶1活性。所述化合物可以防止半胱天冬酶、特别是半胱天冬酶3对PARP-1的切割。如实施例中更详细讨论的，本发明提供的化合物也被认为抑制癌细胞中的有氧糖酵解。与先前的环肽相比，根据本发明的环状化合物显示出提高的比活性。

本发明提供了一种能够调节聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)的活性的环状化合物，其中，所述化合物包括根据式1的部分或其盐、衍生物、前药或模拟物：

式1[X1-X2-X3-X4-X3-X4-X3-]

其中，X1是能够抑制PARP-1切割的肽部分；

其中，X2可以不存在或存在；当X2存在时，X2选自Val或Ser；

其中，X3和X4中的一个选自Trp-Trp和Ar1-Ar2；

其中，X3和X4中的另一个选自Arg-Arg、Gpa-Gpa、Hca-Hca和Ar3-Ar4；

其中

Hca表示同型半胱氨酸的氨基酸残基；

Gpa表示胍基苯丙氨酸的氨基酸残基；

Ar1和Ar2各自表示具有芳基侧链的氨基酸残基，其中每个芳基侧链独立地选自任选取代的萘基、任选取代的1，2-二氢萘基和任选取代的1，2，3，4-四氢萘基；和

Aza表示叠氮基-高丙氨酸的氨基酸残基。

尤为优选地，X3选自Trp-Trp和Ar1-Ar2，X4选自Arg-Arg-、Gpa-Gpa、Hca-Hca和Ar3-Ar4。

在本公开全文中，缩写“Hca”是指同型半胱氨酸的氨基酸残基。缩写“Gpa”是指胍基苯丙氨酸的氨基酸残基。“Aza”是指叠氮基高丙氨酸。“Nap”表示3-氨基-3-(-2-萘基)-丙酸的氨基酸残基。“Eda”表示以下氨基酸残基：

即谷氨酸-γ-[2-(1-磺酰基-5-萘基)-氨基乙酰胺的残基。

Hca、Gpa和Aza以及带有芳基侧链的氨基酸残基(例如Nap和Eda)在本申请中称为非天然氨基酸。优选在本公开的化合物中包括至少一种非天然氨基酸。这是因为包含非天然氨基酸的化合物通常比由天然氨基酸组成的化合物更耐酶降解。

优选地，环状化合物由环-[X1-X2-X3-X4-X3-X4-X3]组成或为其盐、其衍生物、其前药或其模拟物。

环状化合物可以包含标记部分。该标记部分可以是荧光标记。

该标记部分允许检测环状化合物。标记部分的示例包括荧光标记、放射性标记、质量标记和生物素。合适的标记部分包括蛋白质和肽的常规标记。本领域技术人员熟悉用于蛋白质和肽的标记。

该标记部分可以根据待使用的期望检测方法来选择。例如，如果要在ELISA(酶联免疫吸附测定)中检测环状化合物，则标记部分宜为包括生物素。在另一种方案中，如果要以蛋白质印迹测定、凝胶电泳测定等检测环状化合物，则标记部分宜为荧光标记。本申请还涵盖其它类别的标记和其它测定类型。

在环状化合物包含Ar1-Ar2和/或Ar3-Ar4的方案中，一个或多个芳基侧链可以包含取代基，该取代基是选自荧光标记、放射性标记、质量标记和生物素的标记。可选地，一个或多个所述芳基侧链可包含使得芳基侧链起荧光标记作用的选定取代基。在该方案中，取代基可以是磺酸基。包含芳基侧链的荧光非天然氨基酸的一个示例是Eda。

“在化合物中包含标记部分”可以允许化合物被待分析的细胞摄取。“包含标记部分”还可以允许更详细地阐明化合物的作用机制。“对与标记化合物接触的细胞的分析”还可以允许添加剂、赋形剂、共活性剂、剂量和剂型包含在含有待优化化合物的制剂中。

本申请公开的环状化合物包含活性序列(通常称为“弹头”)和用于将弹头递送至细胞的盒(cassette)。

X1表示活性序列，其是能够抑制PARP-1切割的肽部分。如本申请所用，术语“肽部分”指肽和肽模拟部分。优选地，X1是肽部分。据信本申请定义的活性序列X1要么结合PARP并防止其切割，或者要么竞争性抑制切割PARP的蛋白酶。PARP参与DNA修复途径。PARP的作用机制消耗NAD，导致ATP耗竭。癌细胞具有大量DNA损伤，需要向上调节的PARP活性。对癌细胞中PARP失活的防止耗尽了细胞的ATP，导致坏死。对PARP失活的防止不会耗竭正常细胞的ATP，因为正常细胞没有或几乎没有DNA损伤。不受理论束缚地，本发明人已经发现，根据本发明所述的化合物通过调节PARP的活性而选择性地引起癌细胞的坏死。据信，所述化合物还可通过另外的机制引起癌细胞应激，进一步促进坏死。不希望受理论束缚地，实施例中提供的证据表明，该另外的机制可能涉及癌细胞中的碳水化合物代谢途径，特别是有氧糖酵解途径。

X1宜为能够结合PARP的DEVD区域的部分。在该方案中，X1可以是包含总共五个或六个氨基酸残基(优选6个氨基酸残基)的肽部分。序列中的第二个和第五个氨基酸残基可以是碱性氨基酸残基。该碱性氨基酸残基可以是具有在生理pH下能够带正电荷的侧链的任何天然或非天然氨基酸。优选的碱性氨基酸是精氨酸。不希望受理论束缚地，据信将带正电荷的氨基酸包含在序列中作为第二个和第五个氨基酸，使得该部分能够结合至PARP-1的DEVD区域，如图13所示。

合适的Xl部分包括在WO2009/112536中描述为CDK4肽区域的那些部分。

可选地，X1可以是阴离子活性部分。阴离子活性部分可以包含总共5至6个氨基酸残基，优选总共6个氨基酸残基。第二个和第五个氨基酸残基可以是酸性的。据信，阴离子活性部分作为切割PARP的蛋白酶(例如半胱天冬酶-3)的竞争性抑制剂起作用。

X1可以表示包含总共6个氨基酸残基的肽部分，其中第二和第五个氨基酸残基是均为碱性或均为酸性的。本领域技术人员熟悉用于在活性剂存在下测定酶活性的常规测定法。X1部分将有效杀死癌细胞。因此，可以使用细胞活力测定来鉴定具有合适活性的X1基团。测量细胞活力的方法包括使用具有荧光检测的细胞活力试剂(LifeTechnologies，Inc.)(刃天青)。典型的实验方案将在下面的实施例中详述。通过比较每种试剂的半数最大抑制浓度(IC₅₀)值来测定癌细胞杀伤比活性(参见图3和4)。所述环状化合物可以具有75μM或更小、或50μM或更小、或30μM或更小、或15μM或更小、或10μM或更小的IC₅₀。

优选地，X1选自：SEQ ID NO：21(式2)、SEQ ID NO：22(式3)、SEQ ID NO：23(式4)和SEQ ID NO：24(式5)：

SEQ ID NO：21(式2)：-Pro-X5-X6-Pro-X7-Pro-

其中X5和X7均为带有酸性侧链的氨基酸残基，或者其中X5和X7均为带有碱性侧链的氨基酸残基；

和

其中X6选自Gly、Ala、MeGly和(CH₂)₃；

SEQ ID NO：22(式3)：-Pro-X8-Gly-Pro-X9-Pro-

其中X8和X9各自独立地选自Asp和Glu；

SEQ ID NO：23(式4)：-Pro-Arg-Lys-Pro-Arg-Pro-；

SEQ ID NO：24(式5)：-Gly-X11-Glu-Val-X12-X13-；

其中X11选自Asp和Glu；

其中X12选自Asp、N-烷基天冬氨酸残基、N-芳基天冬氨酸残基、Glu、N-烷基谷氨酸残基和N-芳基谷氨酸残基；

其中X13选自Gly、N-烷基甘氨酸残基和N-芳基甘氨酸残基；

附带条件是，如果X12是Asp，则X13是N-烷基谷氨酸残基或N-芳基谷氨酸残基。

尤其优选根据式2所示的X1部分。

在式2所示的部分中，X5和X7优选为各自独立地选自Glu和Hca。在一种方案中，X5是Glu，X7是Glu。在另一种方案中，X5是Glu，X7是Hca。在又一个方案中，X5是Hca，X7是Glu。在再又一种方案中，X5是Hca或Aza，X7是Hca或Aza。

在一个可选的方案中，X5和X7都是具有碱性侧链的氨基酸残基。碱性氨基酸的实例包括Arg、Lys和His。在该方案中，X5和X7优选为Arg。X6优选为甘氨酸残基或肌氨酸(N-甲基甘氨酸)残基。最优选地，X6是Gly。

根据式2所示的特定X1部分包括：-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Pro-(SEQ ID No：2)、-Pro-Glu-Gly-Pro-Glu-Pro-(SEQ ID No：4)、-Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro-(SEQ ID NO：25)、-Pro-Hca-MeGly-Pro-Hca-Pro-(SEQ ID NO：26)、-Pro-Aza-MeGly-Pro-Aza-Pro-(SEQID NO：27)、-Pro-Hca-Gly-Pro-Aza-Pro-(SEQ ID NO：28)、-Pro-Aza-Gly-Pro-Hca-Pro-(SEQ ID NO：41)和-Pro-Aza-Gly-Pro-Aza-Pro(SEQ ID NO：42)。在这些部分中，优选-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Pro-(SEQ ID NO：2)和-Pro-Glu-Gly-Pro-Glu-Pro-(SEQ ID NO：4)，特别优选Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro(SEQ ID NO：25)。

可选地，X1部分可以是根据式3(SEQ ID NO：22)所示的部分：

式3：-Pro-X8-Gly-Pro-X9-Pro-

X8和X9独立地选自Asp和Glu，优选为Asp。

可选地，X1部分可以是根据式5所示的部分(SEQ ID NO：25)：

-Gly-X11-Glu-Val-X12-X13-

氨基酸残基X12和X13中的至少一个必须包括一化学修饰，该化学修饰防止或减少半胱天冬酶1切割X12-X13肽键。因此，如果X12是Asp，则X13是N-烷基谷氨酸酸残基或N-芳基谷氨酸酸残基。可存在于X12或X13残基中的合适N-烷基包括C1至C6直链或支链烷基和C4至C6环烷基。优选地，N-烷基是C1-C3直链烷基，最优选甲基。

优选地，X11是Asp，X12是Asp或N-甲基Asp。最优选地，根据式5所示的部分是-Gly-Asp-Glu-Val-NMeAsp-MeGly-Val-(SEQ ID NO：29)。

在另一个可选的方案中，X1是如下在本公开的第二方面的讨论中所述的式6所示的部分。

根据式1所示的部分可选地包含X2基团。该X2基团被认为起衔接子的作用。X2基团(如果存在)宜为选自Val或Ser。优选存在X2基团并且优选为Val。在根据式1所示的部分的衍生物中，如果存在X2，则X2可以是任何氨基酸残基。

式1中所列的序列X3-X4-X3-X4-X3代表所述盒(cassette)。所述盒可以提高细胞的化合物摄取和/或将弹头约束在生物活性最优构型中。该盒宜为是两亲的。该盒期望具有足够的亲水性以允许环状化合物溶于水，同时具有足够的亲脂性以允许细胞摄取环状化合物。

X3和X4中的一个选自Trp-Trp和Arl-Ar2。X3和X4中的另一个选自Arg-Arg、Gpa-Gpa、Hca-Hca和Ar3-Ar4。

尽管下面描述了X3和X4的具体方案，但是可以理解，可以通过交换X3和X4来简单地得到所有所述方案的替代方案。为了简洁起见，通过交换X3和X4可获得的可选方案没有在下面全部阐述。但是，它们仍形成本公开的一部分。作为举例说明，在特别优选的方案中，X3选自Trp-Trp和Arl-Ar2，并且X4选自Arg-Arg、Gpa-Gpa和Hca-Hca。X4也可以是Ar3-Ar4。在与所述方案互补的交换方案中，X3反过来选自Arg-Arg、Gpa-Gpa、Hca-Hca和Ar3-Ar4；并且X4反过来选自Trp-Trp和Arl-Ar2。

Arl，Ar2，Ar3和Ar4各自表示带有芳基侧链的非天然氨基酸残基。每个芳基侧链可以独立地选自任选取代的萘基、任选取代的1，2-二氢萘基和任选取代的1，2，3，4-四氢萘基。优选的芳基是任选取代的萘基。一个或多个芳基侧链可以可选地配置为充当标记部分。

Ar1、Ar2、Ar3和Ar4可以选自3-氨基-3-芳基-丙酸或2-氨基-2-芳基乙酸的氨基酸残基。替代性氨基酸残基包括具有以下结构的谷氨酸衍生物：

其中R选自任选取代的萘基、任选取代的1，2-二氢萘基和任选取代的1，2，3，4-四氢萘基。

通常，如果芳基包含取代基，则优选为亲脂取代基。亲脂性取代基的示例包括烷基、烯基和炔基。这些基团可以例如包含总共1至5个碳原子，并且可以是直链或支链的。极性或带电荷的取代基是容许的，但它们可能降低细胞摄取化合物的速率。通常，极性或带电荷的侧链仅包括在将芳基侧链用作标记部分的方案中。

在化合物包含标记部分的方案中，如果存在取代基，则取代基可以配置为使得芳基侧链充当标记部分。在该方案中，芳基侧链优选配置为作用荧光标记。例如，Ar1和/或Ar2可以是Eda残基。Eda残基是荧光的。

优选地，Ar1和Ar2是3-氨基-3-芳基-丙酸的氨基酸残基。最优选地，Ar1和Ar2是3-氨基-3-(-2-萘基)-丙酸(“Nap”)的氨基酸残基。具有萘基侧链的市售Fmoc保护的非天然氨基酸的结构显示于图2中。

在一种方案中，X3是Arl-Ar2，X4是Ar3-Ar4，Ar1和Ar2分别是Eda，Ar3和Ar4分别是Nap。

在一种方案中，X3是Trp-Trp，X4选自Arg-Arg、Gpa-Gpa和Hca-Hca。在该方案中，X4优选为Arg-Arg或Gpa-Gpa。

在特别优选的方案中，X3是Nap-Nap，X4是Arg-Arg。

包含式1的部分的环状化合物宜为总共包含小于或等于100个氨基酸残基，优选为小于或等于50个氨基酸残基，更优选为小于或等于25个氨基酸残基。甚至更优选地，所述环状化合物包含总共16至18个氨基酸残基。环状化合物可以由环-[X1-X2-X3-X4-X3-X4-X3]组成。优选化合物的示例如下：

环-[Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Pro-Val-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp](SEQ ID NO：15)；

环-[Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Pro-Val-Trp-Trp-Gpa-Gpa-Trp-Trp-Gpa-Gpa-Trp-Trp](SEQ ID NO：16)；

环-[Pto-Glu-Gly-Pro-Glu-Pro-Val-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp](SEQ ID NO：19)；

环-[Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro-Val-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp](SEQ ID NO：20)；

环-[Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro-Val-Trp-Trp-Gpa-Gpa-Trp-Trp-Gpa-Gpa-Trp-Trp](SEQ ID NO：30)；

环-[Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro-Ser-Nap-Nap-Arg-Arg-Nap-Nap-Arg-Arg-Nap-Nap](SEQ ID NO：31)；

环-[Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Pro-Val-Eda-Eda-Arg-Arg-Eda-Eda-Arg-Arg-Eda-Eda](SEQ ID NO：32)；

环-[Pro-Hca-Gly-Pro-Aza-Pro-Val-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp](SEQ ID NO：33)；

环-[Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro-Val-Nap-Nap-Hca-Hca-Nap-Nap-Hca-Hca-Nap-Nap](SEQ ID NO：34)；

环-[Pro-Hca-Gly-Pro-Aza-Pro-Val-Nap-Nap-Hca-Hca-Nap-Nap-Hca-Hca-Nap-Nap](SEQ ID NO：35)；

环-[Pro-Aza-MeGly-Pro-Aza-Pro-Val-Nap-Nap-Hca-Hca-Nap-Nap-Hca-Hca-Nap-Nap](SEQ ID NO：361；和

环-[Gly-Asp-Glu-Val-MeAsp-MeGly-Val-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp](SEQ ID NO：40)。

优选化合物的其他示例如下：

环-[Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro-Val-Arg-Arg-Nap-Nap-Arg-Arg-Nap-Nap-Arg-Arg](SEQ ID NO：43)；

环-[Pro-Aza-Gly-Pro-Aza-Pro-Ser-Arg-Arg-Nap-Nap-Arg-Arg-Nap-Nap-Arg-Arg](SEQ ID NO：44)；

环-[Pro-Aza-Gly-Pro-Aza-Pro-Ser-Gpa-Gpa-Nap-Nap-Gpa-Gpa-Nap-Nap-Gpa-Gpa](SEQ ID NO：45)；

环-[Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro-Ser-Eda-Eda-Nap-Nap-Eda-Eda-Nap-Nap-Eda-Eda](SEQ ID NO：46)；

环-[Pro-Aza-Gly-Pro-Aza-Pro-Ser-Eda-Eda-Nap-Nap-Eda-Eda-Nap-Nap-Eda-Eda](SEQ ID NO：47)；和

环-[Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Pro-Ser-Eda-Eda-Nap-Nap-Eda-Eda-Nap-Nap-Eda-Eda](SEQ ID NO：48)。

本申请还涵盖的化合物为本申请定义的环状化合物的盐、衍生物、前药或模拟物。

当环状化合物包含可离子化的官能团时，化合物可以提供为与合适的抗衡离子形成的盐的形式。抗衡离子优选是药学上可接受的抗衡离子。本领域技术人员熟悉盐的制备。

如果化合物包含酸性官能团，则抗衡离子可以是例如碱金属或碱土金属离子。酸性化合物的优选抗衡离子是钠。

如果环状化合物包含碱性氨基酸残基，则可以用强酸或弱酸形成盐。例如，化合物可以提供为盐酸盐、柠檬酸氢盐、甲苯磺酸氢盐等。

本申请还涵盖所述化合物的衍生物。

衍生物是具有与本申请定义的化合物基本相似的结构和功能，但是例如通过包括一个或多个保护基和/或添加、省略或取代至多两个氨基酸残基，使得与所定义的结构略有不同的化合物。

如本申请所用，术语“衍生物”包括的化合物为，所述化合物中存在的氨基酸侧链提供为被保护的氨基酸侧链。本领域技术人员熟悉保护基的使用。

衍生物还包括：与本申请定义的化合物具有大于87％、88％、93％、94％或99％序列同源性的化合物。为了形成本申请定义的化合物的衍生物，可以省略、替换或插入一个氨基酸残基。两个氨基酸残基可以被省略、替换或插入。

本申请定义的一些化合物包含具有N-烷基和/或N-芳基的氨基酸残基。衍生物包括含有一个或多个被修饰的N-烷基或N-芳基的化合物。N-芳基或N-烷基可以被修饰为包括杂原子(例如通过用醚氧代替烷基-CH₂-)或取代基(例如卤素或羟基，如通过用-CHCl-替代烷基-CH₂-)。

本申请还涵盖环状化合物的前药。前药是在体内代谢产生环状化合物的化合物。本领域技术人员熟悉前药的制备。

本申请还涵盖肽模拟物。肽模拟物是具有与本申请定义的化合物类似的几何形状和极性的有机化合物，且其具有基本相似的功能。模拟物可以是其中一个或多个肽键的NH基团被CH₂基团替代的化合物。模拟物可以是其中一个或多个氨基酸残基被芳基替代的化合物，所述芳基例如萘基。

通常，肽模拟物可以被认为是肽的衍生物，其中一个或多个氨基酸残基被任选取代的萘基、任选取代的1，2-二氢萘基、任选取代的带有取代基的1，2，3，4-四氢萘基或任选取代的丙基所替代。如果存在取代基的话，取代基通常选自形成23个蛋白质氨基酸中任一个的侧链的那些基团。宜为令50％或更少(优选为25％或更少)的氨基酸残基被这些基团替代。

X1基团的模拟物的示例如图13所示。

在第二方面中，本发明提供一种能够调节聚(ADP-核糖)聚合酶1的活性的化合物，所述化合物包含根据式6所述的部分：

式6：-Pro-X14-X15-Pro-X16-Pro-

其中X14和X16各自独立地选自带有侧链的氨基酸残基、带有取代基的萘基、带有取代基的1，2-二氢萘基、带有取代基的1，2，3，4-四氢萘基和带有取代基的丙基，其中每个侧链或取代基包含酸性官能团；且其中X15选自Gly、Ala、MeGly和(CH₂)₃。

根据式6所示的部分是阴离子弹头部分，即，式6的部分可以调节聚(ADP-核糖)聚合酶1的活性。不希望受理论束缚地，据信阴离子弹头部分充当切割PARP的蛋白酶的竞争性抑制剂。令人惊奇的是，已经发现阴离子弹头基团显示出有用的活性。

优选地，X14、X15和X16分别是氨基酸残基。在该方案中，式6表示SEQ ID NO：37。X14和X16可以例如独立地选自Asp、Glu和Hca。优选地，当X15是Gly时，X14和X16中的一个或多个不是Glu。

X14和X16中的一个或多个可以包含磺酸基。已经发现包含磺酸基团的化合物是特别有效的。包含磺酸基的氨基酸残基的示例是Hca。

可选地，磺酸基可以作为萘基、1，2-二氢萘基、1，2，3，4-四氢萘基或丙基上的取代基存在。

在一些方案中，式6所示的部分在主链上包含一个或多个带有取代基的萘基、带有取代基的1，2-二氢萘基、带有取代基的1，2，3，4-四氢萘基和带有取代基的丙基，则所得化合物可以被认为是肽模拟物。

该化合物可以是包含总共16至18个单元的环状化合物，其中每个单元是氨基酸残基，任选取代的萘基、1，2-二氢萘基或1，2，3，4-四氢萘基，或任选取代的丙基。优选地，化合物中的每个单元是氨基酸残基。最优选地，该化合物如式8所示：

式8：环-[X17-X2-X3-X4-X3-X4-X3]

其中X17是根据式6所示的部分，且X2、X3和X4如上所定义。

还提供了包含式6所示部分的环状化合物的盐、衍生物、前药和模拟物。

在第三方面，本公开提供了包含本申请定义的化合物的药物组合物。该药物组合物还包含药物载体、稀释剂或赋形剂。本领域技术人员熟悉药物组合物的配方。可以使用任何适当的载体、稀释剂或赋形剂。可以使用载体、稀释剂和赋形剂的组合。

组合物可被配制用于任何所需的给药方法，例如用于口服给药或肠胃外给药。

在一种方案中，组合物可包含赋形剂，其是如美国专利申请公开号2003/0161883中所定义的递送组分。

可选地，药物组合物包含另外的治疗剂。优选地，所述另外的治疗剂是有氧糖酵解抑制剂。本公开的组合物与有氧糖酵解抑制剂的共同给药，当用于治疗癌症时产生添加或协同效应。优选的有氧糖酵解抑制剂是2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。2-脱氧葡萄糖通常体内耐受性良好。2-脱氧葡萄糖与本公开的组合物组合施用，可以让本公开化合物的剂量降低。

优选地，本公开的化合物和药物组合物用于医药用途。优选地，所述化合物和组合物用于治疗癌症的方法中，所述方法包括对患者施用所述化合物或组合物。该方法还可包括使用常规方法治疗癌症，例如使用放射疗法和/或手术。本发明的化合物和组合物可以配制为，作为包括使用其它化疗剂的方法的一部分来给药。

如下更详细讨论的本公开化合物的推定作用机制，表明所述化合物可用于治疗各种癌症。因此，所述化合物可用于治疗患有多种癌症或转移性癌症的患者。

由于本公开的化合物调节PARP-1的活性，本公开的化合物和组合物特别好地适用于治疗包含这样的癌细胞的癌症：在该癌细胞中，PARP-1相对于非癌细胞被向上调节。其中PARP-1可被向上的癌症包括乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、直肠癌、胃癌、甲状腺癌和睾丸癌。

本公开的化合物和组合物可用于治疗患有癌症的患者，其中所述癌症包括以下一种或多种：乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、恶性黑素瘤、成神经细胞瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤或神经胶质瘤。优选地，所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、直肠癌、胃癌、甲状腺癌和睾丸癌。

本申请还提供本申请定义的化合物在体外调节PARP-1活性的用途。所述用途可以包括，例如，使细胞培养物或组织样品与本申请定义的化合物接触。细胞培养物或组织样品可以包含永生化人细胞，可选地为癌细胞。组织样品可以是例如来自癌症患者的活体组织切片。

在另一方面，本发明提供了一种分析方法，该方法包括使细胞与本公开的化合物接触并检测该化合物。所述化合物宜为包含标记部分。

细胞可以与添加剂、赋形剂或共活性剂接触。这可以允许添加剂、赋形剂和共活性剂作用于，例如，待研究的细胞的化合物摄取。

可以适当地选择检测方法。当化合物包含标记部分时，根据该部分的性质选择合适的检测方法。当然，该方法可以包括另外的中间步骤。分析方法可以包括，例如，用于研究细胞的常规测定法中用到的步骤。在一种方案中，所述方法包括免疫印迹分析。

用于检测化合物的示例性方法是荧光检测。在该方案中，化合物宜为包含荧光标记部分。色氨酸残基也能够发出荧光。

通常，分析方法在体外进行。样品可以是细胞培养物。样品可以是从患者获得的活体组织切片或源于此活体组织切片。在从患者获得细胞的方案中，分析可以用于诊断应用。

不受理论的束缚地，提出以以下机理解释本发明化合物的作用模式。

正常细胞中的PRGPRP功能：

Cdk4及其周期蛋白D伴侣启动了通过磷酸化成视网膜细胞瘤蛋白(pRb)和相关pRb家族成员开始细胞分裂的分子过程(Harbour et al.Cell(1999)；98：859-869)，导致参与诱导用于DNA合成的相关酶的E2F-1和相关蛋白的释放(Classon and Harlow；NatureReviews Cancer(2002)2：910-917)。然而，除了促进细胞增殖之外，E2F还可以诱导凋亡(Nevins et al.，Hum Mol Genet.(2001)；10：699-703)。

由此推导，在正常二倍体细胞中，当Cdk4的激酶区磷酸化Rb蛋白和相关家族成员时，Cdk4的PRGPRP区(SEQ ID NO：2)阻止E2F-1引起的凋亡。通过PRGPRP(SEQ ID NO：2)与PARP(SEQ ID NO：1)的DEVD区域结合，从而阻止半胱天冬酶-3(和其他)在该位点结合，使得PARP不被切割，从而防止凋亡。半胱天冬酶对PARP-1的切割被认为是凋亡的标志[KaufmannSH，et al：Specific proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose)polymerase：an earlymarker of chemotherapy-induced apoptosis.Cancer Res 1993，53：3976-3985.TewariM，et al.Yama/CPP32 beta，a mammalian homolog of CED-3，is a CrmA inhibitableprotease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose)polymerase.Cell1995，81：801-809]。因此，通过对PARP切割“踩刹车”，CDK4的PRGPRP结构域介导对抗过度凋亡。

在正常细胞中没有或几乎没有DNA损伤，因此极少有聚(ADP-核糖基化)，并且PRGPRP保护的未切割PARP不会耗竭NAD+，NAD+将保持在足够高水平。

PRGPRP在早期多阶段致癌作用中的功能：

若干报告表明，与Cdk2或Cdk6相反，Cdk4似乎是其功能性存在对于成功的肿瘤发生必不可少的唯一周期蛋白依赖性激酶(Warenius et al.，MolecularCancer(2011)；10：72-88.)。

总之：在小鼠中完全敲除Cdk4基因(尽管Cdk2和Cdk6继续存在)能够完全消除化学诱导的表皮癌变(Rodriguez-Puebla et al..2002；Am J Pathol(2002)；161∶405-411.)，而对正常皮肤角质形成细胞增殖没有影响。另外，消除CDK4(Miliani de Marval et al..；Mol Cell Biol.(2004)；24：7538-7547)而不是CDK2(Macias et al..2007；Cancer Res2007，67：9713-9720)抑制了myc介导的口腔肿瘤的发生。此外，Cdk4过表达而不是周期蛋白D1过表达促进了小鼠皮肤致癌作用(Rodriguez-Puebla et al..1999；Cell GrowthDiffer 1999，10：467-472.)，而Cdk2活性升高并不具有致瘤性，尽管其诱导角质形成细胞增殖(Macias et al..2008)。

多发性癌的发生，是细胞增殖和细胞存活均失调的结果(Evan and Vousden2001；Nature(2001)；411：342-348)。活化突变发生在促进细胞分裂的基因中，失活突变发生在肿瘤抑制基因中。然而，能够激活导致E2F因子失调的通路并促进细胞增殖的突变，也可以促进细胞凋亡(Quin et al..1994；Proc.Natl Acad.Sci.USA(1994)；91：10918-10922，Shan et al..1994；Mol.Cell.Biol(1994)；14：8166-8173)。为了使致癌作用成功进行，细胞必须能够使增殖最大化同时避免凋亡(Lowe and Lin 2000；Carcinogenesis(2000)；21：485-495)。

对上述发现的解释可以是：在致癌作用期间，细胞凋亡以及细胞增殖的可能性增加。通过结合DEVD和防止PARP切割，PRGPRP基序抑制了凋亡，让肿瘤形成。在不存在PRGPRP的情形中，增加细胞凋亡将阻止肿瘤形成。在致癌作用早期，DNA损伤最小，细胞分裂不是不受限制的，并且细胞运作不在有氧糖酵解下进行，因此阻止PARP切割不可能引起坏死。

因此，对Cdk4的存在似乎是成功致癌作用的强制要求这一观察结果，其解释不是在于Cdk4的激酶活性，而是在于包含PRGPRP基序的外部化环的活性，所述外部化环结合PARP的DEVD区，最小化细胞凋亡并允许增加的细胞增殖继续进行。

在不存在Cdk4及其PRGPRP(SEQ ID NO：2)位点的情形中，致癌过程的结局可能是细胞凋亡而不是细胞永生化。

CDK4的PRGPRP区在完全发育的癌细胞中的作用：

在过去十年中变得越来越明显的是，已建立的癌细胞的DNA被大规模损伤(Warenius；Anticancer Res.(2002)；22：2651-2656)。这种高水平DNA损伤不是早期致癌作用的特征，但已经在广泛的临床癌症中观察到(et al..，Science(2006)：314：268-274；Greenman et al..，2007；Jones et al..，Science(2008)；321：1801-1806；Gerlingeret al..，N Engl J Med(2012)；366：883-892)。在HilRos研究中使用的细胞系来自类似的晚期癌症，因此也将表现出类似的大规模DNA损伤。

可以预期，显著的DNA损伤将刺激PARP在多个位点进行聚(ADP-核糖基化)，用尽可用的NAD+。已经在许多肿瘤类型中描述了PARP-1的向上调节，所述肿瘤类型包括乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、直肠胃癌、甲状腺和睾丸癌(Ossovskaya et al.Genes and Cancer(2010)；1：812-821)。细胞还通过激活凋亡途径来响应DNA损伤，所述凋亡途径涉及半胱天冬酶在DEVD位点对PARP进行切割，因此使聚(ADP-核糖基化)失活，并且允许足够的NAD+产生凋亡所必需的ATP。因此，这种晚期癌细胞的存活依赖于凋亡性死亡或坏死性死亡的趋势之间的平衡。

此外，与正常细胞相反，癌细胞的无限制分裂，需要增加能量以合成新的细胞大分子和实现有丝分裂。

最后，癌细胞中的Warburg效应使它们比起线粒体ATP产生来说更多地依赖于有氧糖酵解(其可以增加多达200倍)。

通过抑制PARP切割，本公开的化合物对细胞能量供应施加压力。然而，PARP激动剂(和半胱天冬酶抑制剂)不引起在本发明化合物中所观察到的癌细胞坏死。要发生坏死，需要进一步的压力。因此，本公开的肽可能具有另外的PARP靶标，例如乳酸脱氢酶(LDH)，其涉及癌细胞的有氧糖酵解特征。

在癌细胞中，转换为有氧糖酵解，使其能量系统非常依赖于由LDH活性产生的NAD供应[参见图18]。在这种情形中，癌细胞对于用于聚-ADP-核糖基化的NAD的向上调节、活性PARP的竞争性需求是敏感的。作用类似于本申请所述HILR环肽的化合物，通过在抑制LDH和降低NAD可用性的同时，激动PARP并增加其NAD利用率，而可能对癌细胞具有选择性毒性，导致用于从葡萄糖-6-磷酸到丙酮酸的糖酵解Embden-Meyerhof途径的NAD不足。

不受理论的束缚，本公开的肽可能可以通过攻击癌细胞的全身性弱点中的两个来杀死癌细胞：即需要修复大量DNA损伤和转换为有氧糖酵解。

实施例

现在将参考以下说明性实施例，更详细地描述本发明。

实施例1：提高的比活性

使用常规自动肽合成技术制备纯度>95％的三种环肽(HILR-001(SEQ ID NO：13)、HILR-025(SEQ ID NO：15)和HILR-030(SEQ ID NO：16))。HILR-001(SEQ ID NO：13)是根据文献[Warenius et al，Molecular Cancer(2011)；10：72-88.]制备的比较化合物。HILR-025(SEQ ID NO：15)和HILR-030(SEQ ID NO：16)是包含(Trp-Trp-Arg-Arg)或(Trp-Trp-Gpa-Gpa)重复序列的环状化合物。化合物的活性按如下测试：

1)NCI-H460细胞在补充有10％FBS的Ham′s F12培养基中生长。

2)收获细胞并以500个细胞/孔接种到96孔板中。

3)由储备溶液制备化合物，并从200μM开始以两倍稀释度直接加入细胞。最终DMSO浓度为0.2％。

4)使细胞与化合物在37℃，5％CO₂下，在潮湿气氛中生长96小时。

5)然后加入10％(v/v)的刃天青染料组合物(细胞活力试剂(LifeTechnologies，Inc。))并培养另外4小时，使用BMG FLUOstar读板器检测荧光产物。

6)使用GraphPad Prism中的4-参数逻辑方程分析数据之前，减去仅有培养基的背景读数。结果显示于图11中。HILR-30的IC₅₀测定为6μM。

如图3所示，将新的“骨架”序列WWRRWWRRWW(SEQ ID NO：17)与PRGPRP(SEQ ID NO：2)一起插入到环状HILR-025中，与THR54(HILR-001)相比，增加了比活性，IC₅₀剂量从98μM下降到15μM。进一步修饰以通过胍基-苯丙氨酸取代精氨酸使得“骨架”更亲脂，产生HILR-030，进一步提高比活性，得到6.0μM的IC₅₀。

由精氨酸和色氨酸组成的寡聚线性序列已经被描述为曾具有成功的细胞摄取性质。即：RRWRRWWRRWWRRWRR(SEQ ID NO：38)[Derossi et al.Trends in Cell Biol(1998)8：84-87]。还有文献描述了环精氨酸/色氨酸肽细胞作为增强细胞摄取乘客肽(passengerpeptide)的手段：[Cyc-(WRWRWRWR)(SEQ ID NO：39)Shirazi et al.Mol Pharmaceutics(2013)10：2008-2020]。

然而，文献并未讲明精氨酸和色氨酸的何种序列对于提高细胞摄取最为有效。虽然Derossi et al.(上文)描述了在线性细胞内化肽中的精氨酸二聚体与单体或二聚体色氨酸交替，Sherazi et al.描述的环状(WR)₄肽交替的则是单精氨酸和色氨酸。没有先验或明显的实验原因可以解释为什么在“骨架”中具有(WWRR)_x序列的环肽比那些具有ALKL序列的环肽更具活性。

此外，PRGPRP“弹头”(SEQ ID NO：2)与半胱天冬酶-1的DEVD区域的结合，依赖于精氨酸残基的定位，如图13所示。最初认为在骨架中存在的精氨酸残基可以完成或干扰PRGPRP弹头(SEQ ID NO：2)与其生物学靶标的结合。令人惊讶的是，情况并非如此。

实施例2：PARP依赖性细胞毒性

本发明人假设PRGPRP环肽对PARP活性的调节，可能至少部分地导致人类非小细胞肺癌中的ATP下降和随后的坏死。因此HILRa环肽可能是PARP依赖性的。如果是，则假定其应该被PARP抑制剂如Olaparib逆转。

在这种情形中，Olaparib将减少/防止由HILRa环肽诱导的细胞死亡。

因此进行了一项研究以检查在HILR-001[cyc-(Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Pro-Val-Ala-Lue-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu](SEQ ID NO：13)(PolypeptideLaboratories，France，SAS，7 Rue de Boulogne，67100，Strasbourg，France)](单独或与Olaparib共培养)下暴露72小时和96小时，对NCI-H460人非小细胞肺癌细胞的ATP水平和细胞死亡的影响。

最初产生体外PARP标准曲线[图5]。

实验方案：

1)NCI-H460细胞在补充有10％FBS的Ham′s F12培养基中生长。

2)收获细胞并以1x10⁶个细胞/培养皿接种到10cm培养皿中。

3)从储备溶液制备Olaparib并直接加入细胞中，得到图上所示的终浓度。DMSO含量保持恒定浓度为0.1％。

4)将细胞与Olaparib或载体对照在37℃，5％CO₂下培养4小时、24小时、48小时或96小时。

5)在不同的时间点收获细胞，并将细胞沉淀储存在-80℃，直到时间进程完成。

6)将细胞沉淀解冻并在50μl PARP裂解缓冲液中裂解。

7)通过BCA测定法定量样品中的蛋白质浓度。

8)然后使用来自Trevigen(Cat#4676-096-K)的组蛋白涂覆Strip Well通用化学发光PARP测定试剂盒(Universal Chemiluminescent PARP Assay Kit with Histone-Coated Strip Wells)，按照制造商对细胞和组织提取物中的PARP活性的说明，一式两份测定40μg样品。

9)使用上述试剂盒，按照制造商对PARP抑制剂测定方案的说明，在体外测定中一式两份测定Olaparib的4个测试浓度和3-氨基苯甲酰胺的2个浓度。

10)使用BMG FLUOstar读板器检测发光产物。

将产生超过90％PARP抑制所需的Olaparib最小浓度与3-氨基苯甲酰胺进行比较[图6]，并绘制了Olaparib对PARP抑制的时间进程(图7)。

然后测试Olaparib本身对NCI-H460人非小细胞癌的体外细胞毒性[图8]。

实验方案：

1)在补充有10％FBS的Ham′s F12培养基中培养NCI-H460细胞。

2)收获细胞并以500个细胞/孔接种到96孔板中。

3)由储备溶液制备Olaparib，并将其从30μM开始以半对数稀释度直接加入细胞中。

最终DMSO浓度为0.3％。

4)将细胞与化合物在37℃，5％CO₂下，在潮湿气氛条件下培养96小时。

5)然后加入10％(v/v)的细胞活力试剂(Life Technologies，Inc.)，再培养4小时，使用BMG FLUOstar读板器检测荧光产物。

6)使用GraphPad Prism中的4-参数逻辑方程分析数据。

发现30nM的Olaparib剂量对NCI-H460细胞无毒，并且显示出大于80％的细胞PARP活性抑制。选择该剂量的Olaparib用于与HILR-001测定共培养96小时。

测试了四种浓度的Olaparib，在所有时间点均观察到具有剂量依赖性的细胞PARP活性降低。在使用纯化PARP酶的体外测定中，测试了Olaparib的4个测试浓度和对照化合物3-氨基苯甲酰胺的2个浓度。该测定与细胞PARP测定平行进行，以充当阳性对照。

Olaparib对由HILR-030介导的、NCI-H460中的ATP耗竭和坏死的影响：

在存在或不存在30nM Olaparib的情形中，测试四种浓度的HILR-001；

在每个时间点上，通过两个测定读数(和CellTiter-Glo)测量细胞活力。转化为荧光产物来作为细胞代谢活性的读数，而CellTiter-Glo则基于对存在的ATP的定量。

实验方案：

1)NCI-H460细胞在补充有10％FBS的Ham′s F12培养基中生长。

2)收获细胞并以500个细胞/孔接种到96孔板中。

3)从10mM储备溶液制备HILR-001，并将其从200μM开始以两倍稀释度直接加入到细胞中。从10mM储备溶液制备Olaparib，并将其以30nM直接加入细胞中。总的最终DMSO浓度为0.25％。

4)使细胞与化合物在37℃，5％CO₂的条件和潮湿气氛下生长24、48、72或96小时。

5)然后加入10％(v/v)并再培养4小时，使用BMG FLUOstar读板器检测荧光产物。

6)在一式两份的平板上，从细胞中取出培养基，用PBS将CellTiter-Glo稀释(1∶10)，取100μl加入到细胞中。

7)将板在定轨振荡器上混合2分钟，再室温培养10分钟。然后使用BMG FLUOstar读板器测量发光信号。

当将HILR-001作为单一试剂进行测试时，观察到代谢活性的剂量依赖性降低这在此后的时间点上特别明显，并且与先前发表的结果一致(Warenius etal..Molecular Cancer(2011)；10：72-88)。

30nM Olaparib部分地恢复了ATP水平(Cell Titre Glo)并逆转了50μM HILR-001介导的细胞死亡(图9)，证明其活性在该剂量水平上是PARP依赖性的。在较高剂量的HILR-001(100μM和200μM)下，Olaparib不影响ATP水平或癌细胞死亡，表明HILR-001的杀癌作用可能仅部分地通过其对PARP功能的作用机制解释。

上述实验证明了一个惊人的发现，即PARP活性在PRGPRP肽引起癌细胞坏死的机制中起着重要作用，并且该活性可以被特异性PARP抑制剂部分地逆转。因此，PRGPRP肽与PARP的相互作用是癌细胞坏死的必要但不充分的要求。

实施例3：DEVD的竞争性抑制

PARP活性受DEVD位点是否存在切割的控制。切割的PARP就其聚(ADP-核糖)磷酸化活性而言是失活的。预期聚(ADP-核糖)磷酸化抑制剂如olaparib对切割的PARP没有任何影响。因此，可能PRGPRP(SEQ ID NO：2)作用于具有完整DEVD区的完整PARP。此外，推导HILR-001的活性可以通过与PARP的DEVD区结合的PRGPRP(SEQ ID NO：2)来解释，并因此保护该区域免受半胱天冬酶结合和蛋白水解切割。

不考虑一般的肽区域的二级和三级构象取向，值得注意的是，PARP(SEQ ID NO：1)的GDEVDG区域中的天冬氨酸阴离子的线性排列与阳离子精氨酸在比对中非常接近[图13]，并且这些精氨酸已证实对PRGPRP(SEQ ID NO：2)的抗癌作用是关键的(Warenius etal..Molecular Cancer(2011)；10：72-88)。

如果DEVD是PRGPRP(SEQ ID NO：2)的下游靶标，那么PRGPRP不相关分子(可能可以保护在DEVD位点处的PARP切割)也可能促进了NCI-H460细胞的细胞毒性。

设计了环肽，其可以通过与GDEVDG(SEQ ID NO：1)同源性，与在DEVD位点[Gly-Asp-Glu-Val-Asp214-Gly215](SEQ ID NO：1)切割PARP的半胱天冬酶和相关分子竞争性结合。切割发生在Asp 214和Gly 215氨基酸之间，产生两个片段，即89-kDa多肽和24-kDa多肽。

因此，在切割位点用甲基酰胺键构建GDEVDG六肽HILR-D-01(Cyc-[Gly-Asp-Glu-Val-NMeAsp-Sarc-Val-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp](SEQ ID No：40)，并将其插入到较早发现的提高PRGPRP比活性的改良盒中(实施例1)，代替PRGPRP(SEQ ID NO：1)。

HILR-D-01显示出弱但显著的剂量相关细胞杀伤，表明阻断PARP切割可以有助于诱导癌细胞坏死[图13]。

实施例4：半胱天冬酶抑制

进一步检测HILR-肽的PARP依赖性是否是由于通过抑制PARP切割而维持PARP活性，使用来自Promega的Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7试剂，在一系列剂量的HILR-030的存在下进行测定。DEVD-CHO用作阳性对照。

Promega试剂盒由支持半胱天冬酶3/7酶活性的缓冲液和半胱天冬酶-3/7底物罗丹明110组成，双-(N-CBZL-天冬氨酰基-L-谷氨酰基-L-缬氨酰-L-天冬氨酸酰胺；Z-DEVD-R110)Z-DEVD-R110在测定前作为前荧光底物存在；在半胱天冬酶-3/7活性和499nm激发下连续切割和去除DEVD肽时，罗丹明110脱离基团产生荧光。据报告，产生的荧光产物的量与样品中发生的半胱天冬酶-3/7切割的量成比例。(试剂来源是Enzo Life Sciences，目录号：BML-SE169-5000)；Homogeneous Caspase-3/7 Assay(Promega目录号：G7790)；对照化合物Ac-DEVD-CHO Sigma目录号：A0835)。

使用384孔板形式，在所用的所有读板器增益设置下均可检测到酶反应；当10U酶存在于反应中时，在1000的增益设置下超过了最大可检测信号。在所用的最高增益设置下，当在反应中对半胱天冬酶-3使用0.01-10单位时，观察到荧光信号随时间增加。在该范围内，初始反应速率与反应中存在的酶总量成正比。使用1000的读板器增益设置对0.3U、0.1U和0.03U酶进行下一个优化阶段。

通过滴定测定了最佳重组人半胱天冬酶3酶活性，展示了酶剂量为0.03-0.30单位之间时初始重组酶动力学的线性。在该范围内，初始反应速率与反应中存在的酶总量成正比。还进行了DMSO耐受性测定，其显示：在最终测定中高于1％的DMSO浓度似乎降低了初始反应速率；然而，速率在50分钟时间内保持线性。

在这些参数内，荧光信号在大约50分钟内保持线性增加，允许用强相关系数计算初始速率，同时保持所用酶的用量节约。

Ac-DEVD-CHO以剂量依赖性方式抑制半胱天冬酶-3的活性，产生了在根据抑制剂规格表[图10]所示的预期范围内的IC₅₀。当针对0.1或0.3U酶进行测定时，获得了类似的抑制剂IC₅₀。在所有后续实验中，使用0.1U酶，并将读板器设置调整为在2小时内每隔5分钟读取。

根据下表中的方案，将DEVD-CHO对照或HILR-030与底物或人重组半胱天冬酶-3共培养2小时。

DEVD-CHO和HILR-030以剂量依赖性方式抑制半胱天冬酶-3活性[图11、12]

实施例5：阴离子/阳离子“弹头”

HILR-D-02(Cyc-[Pro-Glu-Gly-Pro-Glu-Pro-Val-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Arg-Trp-Trp])(SEQ ID NO：19)被设计为HILR-025的阴性对照，并在NCI-H460人非小细胞癌细胞上进行体外测试。

令人惊讶的是，HILR-D-02对NCI-H460细胞具有细胞毒性，IC₅₀为38μM[图4A]。为了证实用精氨酸的高电荷阳离子胍基团取代阴离子基团通常也可以产生杀癌分子，通过用同型半胱氨酸残基替代HILR-025的精氨酸，合成具有磺酸基团而不是胍基团的另一HILR-025环肽阳离子类似物。该环肽HILR-D-06比HILR-D-02更有效地杀死NCI-H460细胞，IC₅₀为25μM[图4B]。因此似乎是这样的情况，即在环肽内的相同位点中的阴离子基团和阳离子基团两者都可以在体外引起癌细胞杀伤。

该结果是令人惊讶的，因为阴离子六肽PEGPEP(SEQ ID NO：4)先前报告为无活性[Warenius et al.Molecular Cancer(2011)10：72-88]。在早期研究中没有观察到活性阴离子基团的活性，认为是因为阴离子六肽与癌细胞之间的接触持续时间不足，且因为所用的PEGPEP(SEQ ID NO：4)的浓度不足。通常，当使用短线性肽时需要高剂量。据信，包含在本公开的环肽中的盒序列，能增强活性部分向细胞的递送，允许使用较低剂量。

不受理论的束缚，推导这些环肽通过静电结合到其推定靶上而相互作用，并且可以通过竞争性抑制或“诱饵”机制起作用，从而解释阴离子和阳离子“弹头”的类似效果。

HILR环肽可能与PARP的DEVD区域相互作用，保护其不被切割并保持PARP活性。这对于这些试剂的癌细胞坏死活性是必要的，但不足以解释它们的完整作用机制。这些HILR肽是部分PARP激动剂的推导与先前已报告的其它PARP激动剂(见上文)一致。因此，HILR环肽似乎对a)PARP和b)对细胞ATP水平的非PARP效应物具有潜在的双重活性。不受理论的束缚，用于这种额外PARP活性的两种可能的候选物可以是酶乳酸脱氢酶(其中精氨酸在将乙酰CoA结合在活性酶促位点内起重要作用)和己糖激酶2。

实施例6：本发明化合物与2-脱氧葡萄糖组合的效果

由于根据本发明所述的化合物似乎是通过NAD/ATP耗竭导致坏死而引起细胞死亡，因此假设它们的活性可以通过施用所述化合物连同糖酵解抑制剂来进行加强。因此在糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-DOG)的存在和不存在下，测定HILR-025(SEQ ID NO：15)和HILR-D-07钠盐(SEQ ID NO：30)的细胞杀伤能力。

HILR-025(SEQ ID NO：15)包含阳离子PRGPRGP(SEQ ID NO：2)弹头，而HILR-D-07(SEQ ID NO：30)具有阴离子弹头。

使NCI-H460人非小细胞肺癌细胞与HILR-025或HILR-D-07单独接触，或与HILR-025或HILR-D-07和3.125mmol 2-DOG组合接触，并根据制造商的说明书、使用细胞活力试剂(Life Technologies，Inc.)确定细胞存活。这些研究的结果显示在图15中。

发现HILR-025和HILR-D07的细胞杀伤能力通过与2-DOG共同施用而得到增强。2-DOG在体内耐受性良好，可用于增强本申请公开的环肽的活性。对于HILR-025和HILR-D-07获得了类似结果，暗示这些肽具有相关的作用机制。

为了进一步研究阴离子弹头的作用机制，将NCI H460人非小细胞肺癌的培养物暴露于HILR-025和HILR-D-07下，并使用光学显微镜观察。用DMSO处理比较细胞培养物，以提供阴性对照。细胞培养物的光学显微照片示于图16中。

根据本公开，在暴露于环状化合物下的细胞培养物中观察到标记的形态学改变。观察到的环形形态与Warenius et al，Molecular Cancer(2011)，10：72-88中报告的由THR53引起的形态相仿。这表明THR53、HILR-025和HILR-D-07可能具有相关的作用机制。

实施例7.THR环肽HILR-025和HILR-030对乳酸脱氢酶A[LDHA]的活性的影响。

LDHA将丙酮酸转化为乳酸，并产生一分子NAD(参见图18)。该NAD在产生ATP的甘油醛磷酸脱氢酶步骤中，重新进入Embden/Meyrhof途径。没有NAD的话，这一步骤在厌氧糖酵解途径中不能发生，而极大地依赖于该途径的癌细胞则被剥夺了富含能量的ATP分子。为此，研究了两种环肽HILR-025和HILR-030作为LDH活性的可能抑制剂。

对来自以2种测试化合物(HILR-025和HILR-030)处理24小时或96小时的NCI-H460细胞的样品进行LDH活性测定。在较高浓度的测试化合物下观察到显著的细胞死亡，特别是在较晚的时间点。因此，进行BCA测定以估计每种LDH测定裂解物中存在的蛋白质的总量，并将其用于归一化酶活性数据。作为细胞活力的指示，还在两个时间点均进行Alamar蓝测定，以用作额外的参考点。

使用以下实验方案：

1)NCI-H460细胞在补充有10％FBS的Ham′s F12培养基中生长。

2)收获细胞，并以500个细胞/孔(对于96小时时间点)或5000个细胞/孔(对于24小时的时间点)接种到96孔板中。

3)由DMSO储备溶液制备Hilros化合物，并将其以40、20、10、5和2.5μM的浓度直接加入到细胞。

4)设置平行板：

●对于LDH测定，每个测定浓度使用10个重复孔。

●用于Alamar Blue分析的孔为一式三份。

●所有孔中的最终DMSO浓度为0.2％。

5)细胞与化合物在37℃，5％CO₂下、潮湿气氛中生长24或96小时。

6)在测定结束时(24或96小时)，将Alamar蓝10％(v/v)加入一组板中，再培养4小时，使用BMG FLUOstar读板器检测荧光产物。

7)对于LDH测定，通过胰蛋白酶消化从每个孔收获细胞，合并来自重复孔的细胞，然后通过离心沉淀。

8)用冰冷PBS冲洗细胞沉淀，重悬于150μlLDH测定缓冲液(试剂盒中提供)中，并在液氮中快速冷冻以促进细胞裂解。

9)将样品快速解冻，并在4℃下10000xg离心10分钟来澄清细胞裂解物。

10)使用LDH活性试剂盒(Abcam，ab102526)在澄清的裂解物中测量LDH活性。

11)在制备LDH活性测定反应后，根据制造商的说明书，在初始时间测量450nm处的吸光度，以确定(A450)_初始。

12)以3分钟间隔获取更多吸光度读数，持续最多15分钟。

13)用于计算酶活性的最终测量[(A450)_最终]取自最活跃样品超过标准曲线的线性范围时的倒数第二个时间点。

14)计算每个样品从T_初始到T_最终的测量值变化：I1A450＝(A450)_最终-(A450)_初始。

15)使用NADH标准曲线来内插每个样品的11A450，以确定在T_初始和T_最终之间的激酶测定产生的NADH的量(B)。

16)每个样品的LDH活性通过以下等式确定：

B＝T_初始和T_最终之间产生的NADH量(nmole)

反应时间＝T_最终-T_初始(分钟)

v＝孔中加入的样品体积(mL)

a.使用BCA测定(ThermoScientific)确定剩余澄清裂解物中的蛋白质含量。

b.使用GraphPad Prism分析数据。

上述测定的结果显示在图17中。数据显示HILR-025和HILR-030有效抑制LDH的活性，其中HILR-025具有16μM的IC₅₀，HILR-030具有22μM的IC₅₀。这表明本发明的环肽还靶向了癌细胞的厌氧糖酵解途径。

LDH活性通常以毫单位/ml表示。一个LDH活性单位定义为在37℃下催化乳酸转化为丙酮酸以每分钟产生1.0μmole NADH的酶量，因此1mU/ml＝1nmole/min/ml。来自本研究的LDH活性数据以mU/ml形式表示，并且相对于每种裂解物的总蛋白浓度(mU/mg)进行归一化。使用Alamar Blue平行监测细胞活力。

Claims

1.一种能够调节聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性的化合物，其中所述化合物包括根据式1所示的部分或其盐、衍生物、前药或模拟物：

式1：[X1-X2-X3-X4-X3-X4-X3-]

其中，X1是能够抑制PARP-1切割的肽部分。

其中，X2可以不存在或存在；当X2存在时，X2选自Val或Ser；

其中，X3和X4中的一个选自Trp-Trp和Ar1-Ar2；

其中

Hca表示同型半胱氨酸的氨基酸残基；

Gpa表示胍基苯丙氨酸的氨基酸残基；

Ar1、Ar2、Ar3和Ar4各自表示具有芳基侧链的氨基酸残基，其中所示芳基侧链独立地选自任选取代的萘基、任选取代的1,2-二氢萘基和任选取代的1,2,3,4-四氢萘基；且

Aza表示叠氮基-高丙氨酸的氨基酸残基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，包含至少一个标记部分。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，

X1选自SEQ ID NO：21(式2)、SEQ ID NO：22(式3)、SEQ ID NO：23(式4)和SEQ ID NO：24(式5)：

SEQ ID NO：21(式2)：-Pro-X5-X6-Pro-X7-Pro-

其中所示带有酸性侧链的氨基酸残基各自独立地选自Glu、Aza和Hca；且

其中X6选自Gly、Ala、MeGly和(CH₂)₃。

SEQ ID NO：22(式3)：-Pro-X8-Gly-Pro-X9-Pro-

其中X8和X9各自独立地选自Asp和Glu；

SEQ ID NO：23(式4)：-Pro-Arg-Lys-Pro-Arg-Pro-；

SEQ ID NO：24(式5)：-Gly-X11-Glu-Val-X12-X13-

其中X11选自Asp和Glu；

其中X13选自Gly、N-烷基甘氨酸残基和N-芳基甘氨酸残基；

4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于，X1是SEQ ID NO：21(式2)。

5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于，X5是Glu或Hca，和/或X7是Glu或Hca。

6.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于，X1选自：

i.SEQ ID NO：2-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Pro-；

ii.SEQ ID NO：4-Pro-Glu-Gly-Pro-Glu-Pro-；

iii.SEQ ID NO：25-Pro-Hca-Gly-Pro-Hca-Pro-；

iv.SEQ ID NO：26-Pro-Hca-MeGly-Pro-Hca-Pro-；

v.SEQ ID NO：27-Pro-Aza-MeGly-Pro-Aza-Pro-；

vi.SEQ ID NO：28-Pro-Hca-Gly-Pro-Aza-Pro-；

vii.SEQ ID NO：41-Pro-Aza-Gly-Pro-Hca-Pro-；和

viii.SEQ ID NO：42-Pro-Aza-Gly-Pro-Aza-Pro。

7.根据权利要求6所述的化合物，其特征在于，X1是SEQ ID NO：22(式3)，X8是Asp，X9是Asp；或其中X1是SEQ ID NO：24(式5)。

8.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于，X1是SEQ ID NO：24(式5)，X11是Asp，X12是Asp或N-烷基天冬氨酸残基。

9.根据权利要求8所述的化合物，其特征在于，X1是-Gly-Asp-Glu-Val-NMeAsp-MeGly-Val(SEQ ID NO：29)，其中NMeAsp是N-甲基天冬氨酸残基。

10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，存在X2且X2为Val。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其特征在于，X3选自Trp-Trp和Ar1-Ar2，并且X4选自Arg-Arg、Gpa-Gpa和Hca-Hca。

12.根据权利要求11所述的化合物，其特征在于，Ar1和/或Ar2包含任选取代的萘基。

13.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，Ar1和/或Ar2是谷氨酸-γ-[2-(1-磺酰基-5-萘基)-氨基乙酰胺(“Eda”)的氨基酸残基。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的化合物，其特征在于，X4是Arg-Arg、Gpa-Gpa或Hca-Hca。

15.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其特征在于，X3是Ar1-Ar2，X4是Ar3-Ar4。

16.根据权利要求15所述的化合物，其特征在于，Ar1和Ar2各自为Eda，并且其中Ar3和Ar4各自为Nap，其中“Nap”表示3-氨基-3-(-2-萘基)-丙酸的氨基酸残基。

17.一种用于调节聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性的化合物，该化合物包含根据式6所示的部分：

式6：-Pro-X14-X15-Pro-X16-Pro-

其中X14和X16各自独立地选自带有侧链的氨基酸残基、带有取代基的萘基、带有取代基的1,2-二氢萘基、带有取代基的1,2,3,4-四氢萘基和带有取代基的丙基，其中每个侧链或取代基均包含酸性官能团；和

其中X15选自Gly、Ala、MeGly和(CH₂)₃。

18.根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，X14和X16各自为氨基酸残基。

19.根据权利要求18所述的化合物，其特征在于，X14和X16中的至少一个是Asp。

20.根据权利要求19所述的化合物，其特征在于，X14和/或X16包含磺酸基。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物是包含总共16至18个单元的肽化合物，其中各单元是氨基酸残基、任选取代的萘基，任选取代的1,2-二氢萘基、任选取代的1,2,3,4-四氢萘基或任选取代的丙基。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的化合物，其特征在于，其包含根据式8所示的结构：

式8：[X17-X2-X3-X4-X3-X4-X3]

其中X17是根据式6所示的部分；和

其中X2、X3和X4如权利要求1中所定义，并且可选地，其中X3和X4如权利要求11中所定义。

23.根据权利要求17至22中任一项所述的化合物，其特征在于，其包含标记部分。

24.一种化合物，其包含基本上如上所述的、能够调节聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性的阴离子部分。

25.一种药物组合物，其包含权利要求1至24中任一项所定义的化合物，和药物载体、稀释剂或赋形剂。

26.根据权利要求25所述的药物组合物，其特征在于，包含另外的治疗剂。

27.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述另外的治疗剂是有氧糖酵解抑制剂。

28.根据权利要求27所述的药物组合物，其特征在于，所述有氧糖酵解抑制剂是2-脱氧葡萄糖。

29.根据权利要求1至24中任一项所述的化合物或根据权利要求25至28中任一项所述的药物组合物，其用于医药用途。

30.根据权利要求29所述用途的化合物或药物组合物，其特征在于，所述化合物或组合物用于治疗癌症。

31.根据权利要求30所述用途的化合物或药物组合物，其特征在于，所述化合物或组合物与另外的治疗剂一起施用。

32.根据权利要求31所述用途的化合物或药物组合物，其特征在于，所述另外的治疗剂是有氧糖酵解抑制剂。

33.根据权利要求30至32中任一项所述用途的化合物或药物组合物，其特征在于，所述化合物或组合物用在还包括使用放射疗法和/或手术的治疗方案中。

34.根据权利要求1至24中任一项所述的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

35.根据权利要求1至24中任一项所述的化合物用于体外调节聚(ADP-核糖)聚合酶和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性的用途。

36.一种治疗癌症的方法，所述方法包括对患者施用根据权利要求1至4中任一项所述的化合物或根据权利要求25至28中任一项所述的药物组合物。

37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，还包括给患者施用有氧糖酵解抑制剂。

38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其特征在于，还包括使用化学疗法、放射疗法和手术中的一种或多种。

39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物包含标记部分，并且所述方法包括检测所述化合物的步骤。

40.一种分析方法，所述方法包括：

i.使细胞与权利要求1至23中任一项所述的化合物接触；和

ii.检测所述化合物。

41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述细胞包含至少一种癌细胞。

42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其特征在于，所述方法包括Western印迹分析。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)包括荧光检测。

44.一种能够调节聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)的活性的化合物，其中所述化合物包括根据式1所示的部分或其盐、衍生物、前药或模拟物：

式1：[X1-X2-X3-X4-X3-X4-X3-]

其中X1是能够抑制PARP-1切割的部分；

其中X2可以不存在或存在；当X2存在时，X2选自Val或Ser；

其中X3和X4中的一个选自Trp-Trp和Ar1-Ar2；

其中X3和X4中的另一个选自Arg-Arg、Gpa-Gpa、Hca-Hca和Ar3-Ar4；和

其中

Hca表示同型半胱氨酸的氨基酸残基；

Gpa表示胍基苯丙氨酸的氨基酸残基；

Ar1、Ar2、Ar3和Ar4各自表示具有芳基侧链的氨基酸残基，其中所述芳基侧链独立地选自任选取代的萘基、任选取代的1,2-二氢萘基和任选取代的1,2,3,4-四氢萘基；

Aza表示叠氮基-高丙氨酸的氨基酸残基；和

其中X1具有以下任一结构或是以下任一结构的衍生物：

a)

或

b)

45.根据权利要求44所述的化合物，其特征在于，包含至少一个标记部分。

46.根据权利要求45所述的化合物，其特征在于，所述至少一个标记部分包含荧光标记。

47.根据权利要求44至46中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物是由下式组成的化合物：

环-[X1-X2-X3-X4-X3-X4-X3]，

或其盐、衍生物、前药或模拟物。

48.根据权利要求44至47中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物是其中一个或多个肽键的NH基团被CH₂基团替代的模拟物。

49.根据权利要求44至48中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物是其中一个或多个氨基酸残基被芳基替代的模拟物。

50.根据权利要求49所述的化合物，其特征在于，所述芳基是萘基。

51.根据权利要求44至50中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物是模拟物，且在所述模拟物中，一个或多个氨基酸残基被任选取代的萘基、任选取代的1,2-二氢萘基、带有取代基的任选取代的1,2,3,4-四氢萘基或任选取代的丙基所替代。

52.根据权利要求44至51中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物是包含取代基的模拟化合物，所述取代基选自形成23个蛋白氨基酸中的任一种蛋白氨基酸的侧链的基团。

53.根据权利要求52所述的化合物，其特征在于，所述化合物是50％或更少的氨基酸残基被所述基团所替代的模拟化合物。

54.根据权利要求43至53中任一项所述的化合物，其特征在于，还包含有氧糖酵解抑制剂。

55.根据权利要求54所述的化合物，其特征在于，所述有氧糖酵解抑制剂是2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。

56.根据权利要求43至55中任一项所述的化合物，其用于医药用途。

57.根据权利要求56所述的化合物，其特征在于，所述组合物用于治疗癌症。

58.一种用于治疗癌症的化合物，其包含聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)激动剂和乳酸脱氢酶A(LDHA)抑制剂。

59.根据权利要求58所述的化合物，其特征在于，所述PARP-1激动剂和LDHA抑制剂是单一治疗剂。

60.根据权利要求58或59所述的化合物，其特征在于，所述化合物能够与PARP-1的DEVD或GDEVDG区域结合和/或保护PARP-1的DEVD或GDEVDG区域免受切割。

61.根据权利要求58至60中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包含具有16至18个氨基酸的肽或其盐、衍生物、前药或模拟物。

62.根据权利要求61所述的化合物，其特征在于，包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。

63.根据权利要求61或62所述的化合物，其特征在于，所述肽包含4至6个氨基酸序列，所述氨基酸序列与PARP-1的DEVD或GDEVDG区域结合和/或抑制PARP切割。

64.根据权利要求58至63中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物是如权利要求1至23和权利要求44至53所述的化合物。

65.根据权利要求58至64中任一项所述的化合物，其特征在于，包含或还包含有氧糖酵解抑制剂。

66.根据权利要求65所述的化合物，其特征在于，所述有氧糖酵解抑制剂包括2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。

67.根据权利要求58至66所述的化合物，其特征在于，还包含药物载体、稀释剂或赋形剂。

68.根据权利要求58至67中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物用于还包括使用放射疗法和/或手术的治疗方案中。

69.根据权利要求58至68中任一项所述的化合物，其特征在于，所述癌症包括以下中的一种或多种：乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、恶性黑素瘤、成神经细胞瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤或神经胶质瘤。

70.根据权利要求58至69中任一项所述的化合物，其特征在于，所述癌症包括多种癌症或转移性癌症。

71.根据权利要求58至70中任一项所述的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

72.一种用于治疗癌症的治疗剂组合，其包含第一治疗剂和第二治疗剂，所述第一治疗剂包含聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)激动剂和/或乳酸脱氢酶A(LDHA)抑制剂，所述第二治疗剂包含有氧糖酵解抑制剂。

73.根据权利要求72所述的组合，其特征在于，所述第一治疗剂和第二治疗剂用于共同施用。

74.根据权利要求72或73所述的组合，其特征在于，所述化合物能够与PARP-1的DEVD或GDEVDG区域结合和/或保护PARP-1的DEVD或GDEVDG区域免受切割。

75.根据权利要求72至74中任一项所述的组合，其特征在于，所述化合物包含具有16至18个氨基酸的肽或其盐、衍生物、前药或模拟物。

76.根据权利要求75所述的组合，其特征在于，包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：30的氨基酸序列。

77.根据权利要求75或76所述的组合，其特征在于，所述肽包含4至6个氨基酸序列，所述氨基酸序列与PARP-1的DEVD或GDEVDG区域结合和/或抑制PARP切割。

78.根据权利要求72至77中任一项所述的组合，其特征在于，所述组合包含如权利要求1至23和权利要求44至53所述的化合物。

79.根据权利要求72至78所述的组合，其特征在于，所述有氧糖酵解抑制剂包括2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。

80.根据权利要求72至79所述的组合，其特征在于，所述第一治疗剂和第二治疗剂还包含药物载体、稀释剂或赋形剂。

81.根据权利要求72至80中任一项所述的组合，其特征在于，所述组合用于还包括使用放射疗法和/或手术的治疗方案中。

82.根据权利要求72至81中任一项所述的组合，其特征在于，所述癌症包括以下中的一种或多种：乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、恶性黑素瘤、成神经细胞瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤或神经胶质瘤。

83.根据权利要求72至84中任一项所述的组合，其特征在于，所述癌症包括多种癌症或转移性癌症。

84.根据权利要求72至83中任一项所述的组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

85.一种用于治疗癌症的化合物，其包含聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)激动剂或PARP-1蛋白酶竞争性抑制剂，该化合物包含总共5或6个氨基酸残基的部分或其盐、衍生物、前药或模拟物，其中所述部分具有以下i和ii中的任一个：

i.第二和第五氨基酸残基位置，该位置包含具有在生理pH下能够带正电荷的侧链的任何碱性天然或非天然氨基酸残基；

86.根据权利要求85所述的化合物，其特征在于，i的第二和/或第五氨基酸残基位置包含Arg。

87.根据权利要求85或86所述的化合物，其特征在于，ii的第二和/或第五氨基酸残基位置包含Asp。

88.根据权利要求85或86所述的化合物，其特征在于，ii的第二和/或第五氨基酸残基位置包含Glx和/或Hca。

89.根据权利要求85至88中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物能够与PARP-1的DEVD或GDEVDG区域结合和/或保护PARP-1的DEVD或GDEVDG区域免于分割或模拟PARP-1的DEVD或GDEVDG区域。

90.根据权利要求85至89中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包含具有16至18个氨基酸的肽或其盐、衍生物、前药或模拟物。

91.根据权利要求85至90中任一项所述的化合物，其特征在于，PARP-1蛋白酶包含半胱天冬酶。

92.根据权利要求91所述的化合物，其特征在于，所述半胱天冬酶是半胱天冬酶-3。

93.根据权利要求85至90中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物是如权利要求1至23和权利要求44至53所述的化合物。

94.根据权利要求85至83中任一项所述的化合物，其特征在于，包含或还包含有氧糖酵解抑制剂。

95.根据权利要求84所述的化合物，其特征在于，所述有氧糖酵解抑制剂包括2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。

96.根据权利要求85至95所述的化合物，其特征在于，还包含药物载体、稀释剂或赋形剂。

97.根据权利要求85至96中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物用在还包括使用放射疗法和/或手术的治疗方案中。

98.根据权利要求85至96中任一项所述的化合物，其特征在于，所述癌症包括以下的一种或多种：乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、成神经细胞瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤或神经胶质瘤。

99.根据权利要求85至98中任一项所述的化合物，其特征在于，所述癌症包括多种癌症或转移性癌症。

100.根据权利要求85至99中任一项所述的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。