CN109789244A

CN109789244A - 多肽和透明质酸涂层

Info

Publication number: CN109789244A
Application number: CN201780026841.1A
Authority: CN
Inventors: 菲利普·拉瓦; 皮埃尔·沙夫; 尼哈尔·曾金·弗拉纳; 安吉拉·穆奇勒
Original assignee: PROTIP MEDICAL; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Strasbourg
Current assignee: PROTIP MEDICAL; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Strasbourg
Priority date: 2016-05-02
Filing date: 2017-05-02
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2037-05-02
Also published as: US10864296B2; JP6972017B2; EP3241570A1; JP2019515753A; CA3023273A1; WO2017191110A1; ES2903179T3; AU2017259878A1; US20180318472A1; US11471558B2; CN109789244B; US20190117832A1; EP3452118B1; EP3452118A1

Abstract

本发明涉及一种聚电解质涂层，所述涂层包括：至少一个聚阳离子层，其由至少一种聚阳离子组成，所述至少一种聚阳离子由具有式(1)的n个重复单元组成；以及至少一个聚阴离子层，其由透明质酸组成。所述聚电解质涂层具有杀生物活性，并且本发明因此进一步涉及所述聚电解质涂层用于生产包括所述聚电解质涂层的装置、具体地抑菌医疗装置、更具体地植入式装置的用途以及一种用于制备所述装置的方法和一种试剂盒。

Description

多肽和透明质酸涂层

作为工业化国家中的第四大病因，医院感染(也被称为医疗保健相关联的感染)是一个主要的健康问题。年复一年，假体和医疗装置的植入正在与日俱增。与此同时，文献中报告的与植入物相关的医院感染的患病率不断上升。已知全世界全部医院感染中有一半涉及医疗装置。因此，基于频率和潜在严重程度的最重要的医院获得性感染是与手术有关的感染，例如手术部位感染和医疗装置，包含导尿患者的尿路感染、呼吸机插管患者的肺炎以及与血管内导管使用有关的菌血症。

医疗装置相关感染增加的一些关键因素是：i)人口老龄化，ii)多种耐药性细菌，iii)所设计的新设计抗生素分子的不良发展。在像植入物这样的医疗装置的情况下，手术部位是病原体的有吸引力的目标并且导致早期并发症。为了防止与植入物相关联的这种感染，植入后最初6小时的局部治疗是特别令人感兴趣的。

迫切需要用于减少医院感染的创新的、具有生物活性的智能涂层和材料以减缓这种趋势。

聚阳离子和聚阴离子在基质上的交替沉积通常导致被称为聚电解质涂层的涂层的形成。那些聚电解质涂层由多层结构组成，并且所述聚电解质涂层的厚度随着沉积步骤的数目而增加。这些种类的涂层的潜在应用范围广泛，从储能装置到防起雾涂层和生物活性基质。在此后一个领域中，抗菌涂层由于其在抗击医院感染方面的重要性而受到广泛关注。

抗菌涂层的一种策略在于设计抗粘附涂层以抑制病原体在装置上的附着和生长。这些抗粘附涂层因此防止生物膜形成。然而，由于此方法不抑制病原体的生长，因此另一个周围部位的定殖风险很高，特别是在脆弱和免疫缺陷的人的情况下。

另一种策略在于设计杀菌涂层。这些涂层通常释放如抗生素等抗菌剂，所述抗菌剂在其积聚期间或在积聚后通过扩散在涂层中而结合在涂层结构中。活性化合物的释放可以例如通过涂层的酶促降解或通过pH变化来触发。其还可以由于膜组分之一的水解而自然发生。

这些都是有趣的方法；然而，应完全控制杀菌涂层的原位释放曲线以避免过剂量递送药物的副作用。此外，在大多数情况下，释放是被动的，这意味着在存在或不存在细菌的情况下递送抗菌剂。为了避免这些缺点，接触杀灭策略可能更有利并且在于仅在细菌与材料表面接触时才将其破坏。

本发明的发明人最近开发了使用聚-L-精氨酸(PAR)作为聚阳离子和透明质酸(HA)作为聚阴离子的聚电解质涂层。所述涂层用作具有抗菌特性和具有免疫调节特性的强力表面涂层(H.等人，2015年，《先进保健材料(Adv.Health.Mat)》，第4卷，第20126到22036页)。然而，在这个策略中，进一步添加了抗菌肽以高效地杀死伴随的细菌、酵母以及真菌。此外，所使用的聚-L-精氨酸不是单分散的，而是所使用的商业批次的聚-L-精氨酸由具有不同链长度和分子量大于70,000的聚合链构成(其对应于具有多于400个精氨酸残基的多肽链)。

与此相反，在本发明的上下文中，诸位发明人选择具有10个到200个残基的明确限定的聚-L-精氨酸、聚-L-赖氨酸或聚-L-鸟氨酸链以积聚具有HA作为聚阴离子的逐层涂层。

诸位发明人惊奇地证明，那些涂层示出了对例如金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的细菌生长的强烈抑制。这些结果是出乎意料且令人惊讶的，具体地说是因为这些聚合物中的一些在溶液中显示出了杀生物活性，而当所述聚合物在不存在聚阴离子HA的情况下用作涂层时，所述杀生物活性丧失。

因为藤黄微球菌是缺乏透明质酸酶，所以针对藤黄微球菌的杀生物活性(参见图5)是更加令人惊讶和出乎意料的。因此，诸位发明人证明，本发明的聚电解质涂层的杀生物活性与HA层的降解无关，这与需要降解HA层的现有技术涂层相反。

此外，与其它涂层相反，负责本发明涂层的杀生物活性的机理似乎是基于细菌与涂层的表面接触。

诸位发明人进一步证明，聚阳离子分子在涂层内扩散，并且杀生物活性似乎取决于聚阳离子分子的自由扩散，因为涂层的交联降低了其杀生物功能(参见图10和图11)。

发明内容

因此，本发明涉及一种聚电解质涂层，其包括：

(a)至少一个聚阳离子层，其由至少一种聚阳离子组成，所述至少一种聚阳离子由具有式(1)的n个重复单元组成，

其中

-n为介于11与100之间的整数；并且

-每个相同或不同的R基选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂，以及

(b)至少一个聚阴离子层，其由透明质酸组成。

具体地，本发明涉及一种聚电解质涂层，其包括：

(a)至少一个聚阳离子层，其由具有式(1)的n个重复单元组成，

其中

-n为介于11与100之间的整数；并且

-R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂，以及

(b)至少一个聚阴离子层，其由透明质酸组成。

本发明还涉及一种包括本发明的聚电解质涂层的装置。

本发明进一步涉及本发明的聚电解质涂层用于生产本发明的装置，具体地医疗装置，更具体地植入式装置的用途。

本发明进一步涉及一种用于制备包括本发明的聚电解质涂层的装置的方法，所述方法包括：

(a)提供装置；

(b1)在所述装置的表面上沉积

(i)至少一个聚阳离子层，其由至少一种聚阳离子组成，所述至少一种聚阳离子由具有式(1)的n个重复单元组成，

其中

-n为介于11与100之间的整数；并且

-每个相同或不同的R基选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂，并且然后沉积

ii)至少一个聚阴离子层，其由透明质酸组成，或者

(b2)在所述装置的表面上沉积如上所述的ii)并且然后沉积i)，

以及任选地重复步骤b1)和/或b2)。

具体地，本发明进一步涉及一种用于制备包括本发明的聚电解质涂层的装置的方法，所述方法包括：

(a)提供装置；

(b1)在所述装置的表面上沉积

(i)至少一个聚阳离子层，其由具有式(1)的n个重复单元组成，

其中

-n为介于11与100之间的整数；并且

-R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂，并且然后沉积ii)至少一个聚阴离子层，其由透明质酸组成，或者(b2)在所述装置的表面上沉积如上所述的ii)并且然后沉积i)，以及任选地重复步骤b1)和/或步骤b2)。

在另外的方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括

a)至少一种聚阳离子材料，其由具有式(1)的n个重复单元组成，

其中

-n为介于11与100之间的整数；并且

b)至少一种聚阴离子材料，其由透明质酸组成。

在具体的方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括

其中

-n为介于11与100之间的整数；并且

-R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂，以及

b)至少一种聚阴离子材料，其由透明质酸组成。

在另外的方面，本发明涉及一种防止经历植入式装置的植入的个体中的细菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：提供如下文所述的植入式装置；以及将所述植入式装置植入所述个体中，其中所述植入式装置防止细菌感染。

具体实施方式

聚电解质涂层

本发明的发明人已经证明，具有聚精氨酸、聚鸟氨酸或聚赖氨酸作为聚阳离子以及透明质酸(HA)作为聚阴离子的聚电解质涂层是具有杀生物特性的强力表面涂层。诸位发明人证明，具有聚-L-精氨酸(PAR)、聚-L-鸟氨酸(PLO)或聚-L-赖氨酸(PLL)，具体地分别具有30个精氨酸、鸟氨酸或赖氨酸残基，以及作为聚阴离子的透明质酸(HA)作为聚阴离子的聚电解质涂层具有很强的杀生物活性。

诸位发明人进一步证明，具有带有100个鸟氨酸残基的聚鸟氨酸以及透明质酸(HA)作为聚阴离子的聚电解质涂层具有很强的杀生物活性。

如所属领域的技术人员已知的，措辞“聚电解质”是指其重复单元带有电解质基团的聚合物。聚阳离子和聚阴离子均是聚电解质。因此，本发明的上下文中的聚阴离子层和聚阳离子层可以被称为聚电解质层。

式(1)的聚阳离子由n个重复单元组成，所述重复单元相同或不同。根据本发明，聚阳离子的重复单元具有式-NH-CH(CH₂-CH₂-CH₂-R)-C(＝O)。对于给定的重复单元，R的定义如上文所述，并且因此对于每个单元来说可以是不同的。

根据一个优选的实施例，式(1)的聚阳离子由n个重复单元组成，其中所有R基相同。

根据另外的实施例，式(1)的聚阳离子由n个重复单元组成，其中R基可以不同。

在所述n个单元中，聚阳离子可以包括式-NH-CH(CH₂-CH₂-CH₂-NH₂)-C(＝O)的i个单元、式-NH-CH(CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂)-C(＝O)的j个单元以及式-NH-CH(CH₂-CH₂-CH₂-NH-C(NH)-NH₂)-C(＝O)的k个单元，其中每个i、j和k包括在0与n之间，并且其中i+j+k＝n，具有随机单元分布或具有作为嵌段的分布。本文中“至少一种聚阳离子”中的“至少”一词是指由具有式(1)的n个重复单元组成的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个聚阳离子，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个聚阳离子，优选地由具有式(1)的n个重复单元组成的一个聚阳离子。

如本文所述的“由具有式(1)的n个重复单元组成的聚阳离子”或仅“具有式(1)的n 个重复单元”是带正电的聚合物并且也可以称为“聚阳离子材料”。因此，在一个实施例中，如本发明的上下文中限定的具有式(1)的n个重复单元的聚阳离子材料构成本发明的聚电解质涂层的至少一个聚阳离子层。

在一个实施例中，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，具有式(1)的n个重复单元的“n”为介于11与100之间的整数。

在另外的实施例中，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，优选地当R选自-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，更优选地当R为-NH-C(NH)-NH₂时，n为包括在11与99之间的整数，例如，n为包括在11与95之间、15与95之间、15与90之间、15与85之间、15与80之间、15与75之间、20与95之间、20与90之间、20与85之间、20与80之间、20与75之间、25与95之间、25与90之间、25与85之间、25与80之间、25与75之间、28与74之间、28与72之间、30与70之间之间的整数，如30、50和70。

在另外的实施例中，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，优选地当R选自-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，更优选地当R为-NH-C(NH)-NH₂时，n为包括在11与49之间的整数，例如，n为包括在11与45之间、15与45之间、20与40之间、21与39之间、22与38之间、23与37之间、24与36之间、25与35之间、26与34之间、27与33之间、28与32之间、29与31之间之间的整数。

在一个具体实施例中，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，优选地当R选自-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，更优选地当R为-NH-C(NH)-NH₂时，n为选自由以下组成的组的整数：11、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、47、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98，优选地，n为30、50或70。

在一个具体实施例中，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，优选地当R选自-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，更优选地当R为-NH-C(NH)-NH₂时，n为选自由以下组成的组的整数：11、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45以及49，优选地，n为30。

在一个具体实施例中，当R为-NH₂时，n为包括在11与150之间，例如11与140之间、11与130之间、11与120之间、11与120之间、15与110之间、15与100之间、20与100之间、22与95之间、24与90之间、26与80之间、26与75之间、26与70之间、26与65之间、26与55之间、26与50之间、26与45之间、26与40之间、26与35之间、26与34之间、27与33之间、28与32之间、29与31之间的整数。在一个实施例中，当R为-NH₂时，n为选自由以下组成的组的整数：11、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140，优选地，n为30或100。

在一个实施例中，n是如上文限定的整数，条件是：当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，优选地当R选自-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，更优选地当R为-NH-C(NH)-NH₂时，n不小于11并且n不大于49；优选地，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，优选地当R选自-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，更优选地当R为-NH-C(NH)-NH₂时，n不小于15、20或25并且n不大于45、40或35。

在一个具体实施例中，n是如上文限定的整数，条件是：当R为-NH-C(NH)-NH₂时，n不小于20或25并且n不大于95或100。

在一个具体实施例中，n是如上文限定的整数，条件是：当R为-NH-C(NH)-NH₂时，n不小于20或25并且n不大于45或40。

在一个另外的具体实施例中，n是如上文限定的整数，条件是：当R为-NH₂时，n不小于20或25并且n不大于45或40。

在一个另外的具体实施例中，n是如上文限定的整数，条件是：当R为-CH₂-NH₂时，n不小于20或25并且n不大于45或40。

式(1)的“重复单元”也可以被称为“结构单元”并且在本文中是指氨基酸或氨基酸残基，其中当R为-NH₂时，所述氨基酸是鸟氨酸；当R为-CH₂-NH₂时，所述氨基酸为赖氨酸；当R为-H-C(NH)-NH₂时所述氨基酸是精氨酸。因此，“式(1)的n个重复单元”也可以被称为“式(1)的n个氨基酸残基”，更确切地说，当R为-NH₂时，其被称为n个鸟氨酸残基；当R为-CH₂-NH₂时，其被称为n个赖氨酸残基；或当R为-H-C(NH)-NH₂时，其被称为n个精氨酸残基。

在一个实施例中，式(1)的n个重复单元通过形成肽键而聚合。因此，具有式(1)的n个重复单元或式(1)的n个氨基酸残基可以被称为聚合物或多肽。

在一些实施例中，如上文所限定的i、j和k个单元通过形成肽键而聚合。因此，包括式-NH-CH(CH₂-CH₂-CH₂-NH₂)-C(＝O)的i个单元、式-NH-CH(CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂)-C(＝O)的j个单元以及式-NH-CH(CH₂-CH₂-CH₂-NH-C(NH)-NH₂)-C(＝O)的k个单元的聚阳离子材料可以被称为共聚物，其中每个i、j和k包括在0与n之间，并且其中i+j+k＝n，具有随机单元分布或具有作为嵌段的分布。

“肽键”，也被称为酰胺键，是在一个氨基酸的羧基(COOH)与另一个氨基酸的氨基(NH₂)之间形成的共价化学键，其中产生一个水分子。

根据上文，在一些实施例中，“具有式(1)的n个重复单元”可以在R为-NH₂时被称为“具有n个鸟氨酸残基的聚鸟氨酸”，在R为-CH₂-NH₂时被称为“具有n个赖氨酸残基的聚赖氨酸”，或者在R为-H-C(NH)-NH₂时被称为“具有n个精氨酸残基的聚精氨酸”。

“鸟氨酸”是在尿素循环中起作用的非蛋白原氨基酸。聚鸟氨酸是指结构单元鸟氨酸的聚合物。聚鸟氨酸是指聚-L-鸟氨酸、聚-D-鸟氨酸或聚-LD-鸟氨酸。在本发明的上下文中，聚鸟氨酸特指聚-L-鸟氨酸(PLO)。

“精氨酸”和“赖氨酸”是在蛋白质生物合成中使用的α-氨基酸。聚精氨酸和聚赖氨酸分别指结构单元精氨酸或结构单元赖氨酸的聚合物。聚精氨酸或聚赖氨酸是指聚-L-精氨酸或聚-L-赖氨酸、聚-D-精氨酸或聚-D-赖氨酸或聚-LD-精氨酸或聚-LD-赖氨酸。在本发明的上下文中，聚精氨酸或聚赖氨酸分别特指聚-L-精氨酸(PAR)和聚-L-赖氨酸(PLL)。

“聚-L-鸟氨酸”、“聚-L-赖氨酸”以及“聚-L-精氨酸”是带正电的合成聚合物(也被称为聚阳离子)并且以具有抗衡离子的盐的形式产生。抗衡离子可以选自但不限于盐酸盐、氢溴酸盐或三氟乙酸盐。

在一个实例中，聚精氨酸是具有CAS#26982-20-7的聚-L-精氨酸盐酸盐。

在一个实例中，聚鸟氨酸是具有CAS#27378-49-0的聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐或具有CAS#26982-21-8的聚-L-鸟氨酸盐酸盐。

在一个实例中，聚赖氨酸是聚-L-赖氨酸三氟乙酸盐，具有CAS#25988-63-0的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐或具有CAS#26124-78-7的聚-L-赖氨酸盐酸盐。

具有限定数目的氨基酸残基的聚-L-鸟氨酸、聚-L-赖氨酸和聚-L-精氨酸可以例如通过美国的Alamanda Polymers公司商购获得。

在一个实例中，聚-L-精氨酸(PAR)，如PAR10(10精氨酸(R)、Mw＝2.1kDa、PDI＝1)；PAR30(30R、Mw＝6.4kDa、PDI＝1.01)、PAR50(50精氨酸(R)、Mw＝9.6kDa、PDI＝1.03)；PAR70(70精氨酸(R)、Mw＝13.4kDa、PDI＝1.01)、PAR100(100R、Mw＝20.6kDa、PDI＝1.05)以及PAR200(200R、Mw＝40.8kDa、PDI＝1.06)购自美国Alamanda Polymers公司。

在另一个实例中，聚-L-鸟氨酸(PLO)，如PLO30(30R、Mw＝5.9kDa、PDI＝1.03)、PLO100(100R、Mw＝18.5kDa、PDI＝1.03)以及PLO250(250R、Mw＝44.7kDa、PDI＝1.02)是购自美国阿拉曼达聚合物(Alamanda Polymers)公司。

在另外的实例中，聚-L-赖氨酸(PLL)，如PLL10(10R、Mw＝1.6kDa)、PLL30(30R、Mw＝5.4kDa、PDI＝1.02)、PLL100(100R、Mw＝17.3kDa、PDI＝1.07)、PLL250(250R、Mw＝39.5kDa、PDI＝1.08)是购自美国阿拉曼达聚合物公司。

用于获得具有如聚精氨酸、聚赖氨酸或聚鸟氨酸等n个重复单元(其中例如n＝30)的多肽的方法对于所属领域的技术人员来说是已知的并且包含α-氨基酸N-羧酸酐(NCA)的开环聚合，然后是纯化。通常，在聚合后通过在水中沉淀或例如在有机非溶剂中沉淀并且在氨基酸侧链脱保护后通过透析纯化多肽。最后将所有水溶性聚合物冻干。

用于获得具有n个单元的共聚物的方法对于所属领域的技术人员来说也是已知的。

在一个优选的实施例中，具有式(1)的n个重复单元是单分散的，即，组成聚阳离子层的聚阳离子材料是单分散的。所属领域的技术人员将理解，如果组成聚阳离子层的聚阳离子材料是单分散的，则所述聚阳离子层也是单分散的。因此，在一个实施例中，本发明的上下文中的聚阳离子层是单分散的。

“单分散”在本文中是指聚合物由具有相同质量的相同分子组成。合成的单分散聚合物链可以例如通过如阴离子聚合——即一种使用阴离子催化剂来产生长度相似的链的方法——例如α-氨基酸N-羧酸酐(NCA)的开环聚合等过程制备。如果聚合物的样本是单分散的，则可以在多分散指数(PDI)的基础上得出结论。因此，在一个实施例中，使用多分散指数(PDI)表达单分散性。

在一些实施例中，当所述至少一种聚阳离子是多于一个聚阳离子时，则所述至少一种聚阳离子可以是多分散的，即，组成聚阳离子层的聚阳离子材料是不同聚阳离子的混合物并且可以是多分散的。所属领域的技术人员将理解，如果组成聚阳离子层的聚阳离子材料是多分散的，则所述聚阳离子层也是多分散的。因此，在一个实施例中，本发明的上下文中的聚阳离子层是多分散的。

“多分散”在本文中是指聚合物由具有不同质量的不同分子组成。

“多分散指数(PDI)”或“异质性指数”或简称“分散度”是给定聚合物样本中的分子量分布的量度。多分散指数(PDI)是通过将重均分子量(M_w)除以数均分子量(M_n)来计算的。PDI具有等于或大于1的值，但是当聚合物链接近均匀链长时，PDI接近1。

因此，在一个实施例中，多分散指数(PDI)小于1.5、小于1.4、小于1.3，具体地在1与1.2之间，优选地在1与1.1之间，例如在1与1.05之间。

在一个具体实施例中，具有式(1)的n个重复单元、聚阳离子材料或聚阳离子层的多分散指数(PDI)小于1.5、小于1.4、小于1.3，具体地在1与1.2之间，优选地在1与1.1之间，例如在1与1.05之间。

如所属领域的技术人员所知，PDI可以通过尺寸排除色谱法(SEC)、如动态光散射测量等光散射测量或如基质辅助激光解吸/电离(MALDI)或电喷雾电离质谱法(ESI-MS)等质谱法来测量。

在一个实例中，PDI在受保护的聚氨基酸上通常通过凝胶渗透色谱法(GPC)例如通常在60℃下在具有0.1M的LiBr的DMF中测量，或者在脱保护的多肽上通过例如GPC通常在水性缓冲液中测量，在两种情况下都使用由窄多分散性PEG标准物构建的校准曲线或TALLS的通用校准。通过TALLS或通过质子NMR光谱法使用氨基酸重复单元与所结合引发剂峰积分比提供平均分子量。

“透明质酸(HA)”，也被称为玻尿酸(Hyaluronan)，是线性(无支链)多糖或非硫酸化糖胺聚糖，其由N-乙酰基葡糖胺和葡萄糖醛酸脂的重复二糖单元(通过β1到3和β1到4糖苷键连接)构成。从而，透明质酸(HA)是带负电的聚合物(也被称为聚阴离子)，并且因而在本发明的上下文中，也被称为聚阴离子材料。因此，所述带负电的聚合物以盐的形式与抗衡离子共存。对于透明质酸钠，抗衡离子是钠。其作为细胞外基质的一部分广泛分布在结缔组织、上皮细胞组织以及神经组织内。在眼睛的玻璃体和房水、滑液、皮肤以及脐带(华尔通氏胶(Wharton jelly))中浓度很高。平均70公斤的男性体内约有15克玻尿酸，其中三分之一每天翻转(降解和合成)。其是一种进化上保守的分子，存在于A组和C组链球菌和多杀巴斯德氏菌以及鸟类、哺乳动物和其它动物种类中。在低浓度的中到高分子量(500,000Da到>300万Da)的溶液中，其对水溶液赋予相当大的粘度。透明质酸可以从透明质酸酶降解。玻尿酸的分子量(Mw)表示群体中所有分子的平均值并且因此表示分子质量平均值(分子量平均值)。在一个实例中，透明质酸具有150kDa的分子量并且以透明质酸钠的形式来自美国Lifecore Biomed公司。

“透明质酸酶”是降解玻尿酸的酶家族。所述酶存在于大多数动物物种和许多微生物中。存在具有不同特异性和动力学的许多不同类型的透明质酸酶。

在一个实施例中，聚电解质涂层可以进一步包括“药学活性药物”。

在本说明书的上下文中，术语“药学活性药物”是指改变、抑制、激活或以其它方式影响生物事件的化合物或实体。例如，所述药物包含但不限于：抗癌物质、抗炎剂、免疫抑制剂、细胞-细胞外基质相互作用的调节剂，包含细胞生长抑制剂、抗凝血剂、抗血栓形成剂、酶抑制剂、止痛剂、抗增殖剂、抗真菌剂、细胞抑制物质、生长因子、激素、类固醇、非甾体物质以及抗组胺药。适应症组的实例是但不限于：止痛物质、抗增殖物质、抗血栓形成物质、抗炎物质、抗真菌物质、抗生物质、细胞抑制物质、免疫抑制物质以及生长因子、激素、糖皮质激素、类固醇、非甾体物质、用于沉默和转染的遗传或代谢活性物质、抗体、肽、受体、配体及其任何药学上可接受的衍生物。上述组的具体实例是：紫杉醇、雌二醇、西罗莫司、红霉素、克拉霉素、多柔比星、伊立替康、庆大霉素、双氯西林、奎宁、吗啡、肝素、萘普生、泼尼松、地塞米松。

在一个实施例中，“药学活性药物”是如上文所定义的聚阳离子材料。

在一个实施例中，本发明的聚电解质涂层是生物相容的。

如在本发明的上下文中使用的术语“生物相容”旨在描述在体内不会引起实质上有害反应的涂层。

在一个实施例中，本发明的聚电解质涂层具有免疫调节特性。

“免疫调节特性”在本文中是指抑制促炎途径。

换句话说，在另外的实施例中，本发明的聚电解质涂层对促炎细胞因子的产生具有抑制作用。

“促炎细胞因子”主要由活化的巨噬细胞产生并且参与炎症反应的上调。与促进愈合和减少炎症的抗炎细胞因子相反，促炎细胞因子的作用是使疾病恶化。

因此，本发明的上下文中的促炎细胞因子由如巨噬细胞等免疫细胞释放，具体地由人原代巨噬细胞亚群释放。促炎细胞因子例如但不限于TNF-α、CCL18以及CD206。

巨噬细胞活化可以分为两类。M1巨噬细胞或经典活化的巨噬细胞，其在初始炎症期间具有活性，但其中其长期存在可能导致慢性炎症；以及M2巨噬细胞或替代性活化的巨噬细胞，其在组织重塑和愈合中具有显著作用。巨噬细胞的不平衡活化导致明显且延长的1型(M1)的发展。TNF-α是M1特异性细胞因子，CCL18和CD206是M2特异性细胞因子。

如上文所提及的，本发明的诸位发明人令人惊讶地证明，本发明的聚电解质涂层具有杀生物活性。

因此，在一个实施例中，本发明的聚电解质涂层具有杀生物活性。

“杀生物活性”在本文中是指破坏任何有害生物、阻止任何有害生物、使其无害或对其发挥控制作用。本文的杀生物活性是指例如抗菌活性。

“抗菌活性”在本文中是指防腐活性、抗生活性、抗菌活性、抗病毒活性、抗真菌活性、抗原虫活性和/或抗寄生虫活性，优选地抗菌活性。

因此，在一个实施例中，本发明的聚电解质涂层具有抗菌活性和/或抑菌活性。

在一个实施例中，抗菌活性和/或抑菌活性针对至少一种细菌。

“抑菌活性”在本文中是指阻止细菌繁殖，而不一定将其杀死，换句话说，本文中的抑菌活性是指抑制细菌的生长。因此，抑菌活性可以表示为例如至少一种细菌的生长抑制的％。

在本发明的上下文中的“至少一种细菌的生长抑制”可以大于70％，例如大于75％、大于80％、通常大于82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％。

因此，在一个实施例中，本发明的聚电解质涂层对至少一种细菌具有超过70％的生长抑制，更具体地，对至少一种细菌具有超过75％、超过80％、通常超过82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的生长抑制。

本文中的“至少一种细菌”是指至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种细菌。

在一个实施例中，至少一种细菌是ESKAPE病原体。

“ESKAPE病原体”是全世界医院感染的主要原因并且在例如2016年《国际生物医学研究(Biomed Res Int.)》，2016年，第2475067页中进行描述。在一个实施例中，术语“ESKAPE病原体”是指选自由以下构成的组的细菌：屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌以及肠杆菌属。

在一个实施例中，所述至少一种细菌是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌，优选地革兰氏阳性细菌。

在一个实施例中，革兰氏阴性细菌是铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属或军团菌，优选地，大肠杆菌或铜绿假单胞菌

在一个实施例中，革兰氏阳性细菌是葡萄球菌、微球菌或肠球菌细菌。

“葡萄球菌”属的细菌是以葡萄状簇聚集在一起的静止的、非孢子形成的、过氧化氢酶阳性的、氧化酶阴性的、革兰氏阳性的球菌。Pasteur于1879年在疖脓中观察到，葡萄球菌得名于Ogsten(1881)，其在急性慢性脓肿中分离葡萄球菌。“葡萄球菌”属的细菌，如，例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头葡萄球菌、山羊葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、路邓葡萄球菌、施氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌以及沃氏葡萄球菌是例如假体关节感染中的外来物质上的主要感染原。

因此，在一个实施例中，葡萄球菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头葡萄球菌、山羊葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、路邓葡萄球菌、施氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌以及沃氏葡萄球菌，优选地金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，更优选地金黄色葡萄球菌。

“微球菌”属的细菌通常被认为是腐生生物或共生生物，尽管其可能是机会致病菌，特别是在如HIV患者等免疫系统受损的宿主中。微球菌通常存在于皮肤微生物群落中，并且所述属很少与疾病相关。然而，在极少数情况下，免疫受损患者的死亡是由微球菌引发的肺部感染引起的。微球菌可能参与其它感染，包含复发性菌血症、脓毒性休克、化脓性关节炎、心内膜炎、脑膜炎以及空洞性肺炎，特别是免疫抑制患者中。

在一个实施例中，微球菌是藤黄微球菌细菌。

“肠球菌”属的细菌是重要临床感染的原因，如尿路感染、菌血症、细菌性心内膜炎、憩室炎以及脑膜炎。

在一个实施例中，肠球菌是耐万古霉素的肠球菌，如粪肠球菌或屎肠球菌。

抑菌活性或生长抑制％可以例如在如下文中的“方法”部分中描述的抗菌测定中展示。可以在这种抗菌测定中使用的菌株可以是例如藤黄微球菌或金黄色葡萄球菌。

如上文引言中所提及的，在一种典型应用中，本发明的聚电解质涂层特别旨在预防与植入物和医疗装置相关的医院感染。在所述背景下，植入后6小时内感染的风险特别高。

因此，在一个实施例中，本发明的聚电解质涂层在植入后的最初24小时内具有抑菌活性，例如在植入后的最初12小时内、最初9小时内、最初6小时内。

如在引言中进一步提及的，抗菌涂层具有宽泛的应用领域。因此，在一个实施例中，本发明的聚电解质涂层具有防污损活性。

“污损”或“生物污损(Biofouling或biological fouling)”在本文中是指微生物在湿润表面上积累。

因此，“防污损”是指抑制微生物在湿润表面上积累。

本发明的聚电解质涂层通常使用如下文的“用于制备装置的方法”部分中进一步描述的逐层(LbL)沉积技术构建。基于逐层结构，聚电解质涂层也可以被称为“聚电解质多层(PEM)”、“聚电解质膜”或“聚电解质基质”。

聚电解质层中的每一个具有其给定的电荷。聚阳离子层和聚阴离子层均形成聚电解质网络或聚电解质骨架。聚电解质层通过静电相互作用彼此吸引。其它吸引力基于疏水相互作用、范德华力相互作用和氢结合相互作用。

通常，在LbL沉积期间，将装置、如例如医疗装置或植入式装置在带正电的聚电解质溶液与带负电的聚电解质溶液的稀释浴之间来回浸渍。在每次浸渍期间，少量聚电解质被吸附并且表面电荷吸附，从而允许静电交联的聚阳离子-聚阴离子层的逐渐且受控的积聚。可以将这种涂层的厚度向下控制到单纳米级。

因此，本发明的聚电解质涂层通常包含交替带电的聚电解质层的基本上有序的聚电解质层。

在一个实施例中，如一个聚阳离子层或聚阴离子层等单个聚电解质层具有1nm到10nm的厚度。聚阳离子层和/或聚阴离子层的厚度取决于涂覆条件和所使用的聚电解质材料。

在一个实施例中，聚电解质涂层的厚度通常比聚电解质涂层的单个聚电解质层的厚度厚得多。在一个实施例中，聚电解质涂层可以具有约10nm到约100000nm的厚度。聚电解质涂层的厚度取决于聚电解质层的涂覆条件、聚电解质层的数目以及用于聚电解质层的聚电解质材料。

可以例如使用共聚焦显微镜检查评估所获得的聚电解质涂层的厚度。因此，例如，100μL的PLL-FITC(用异硫氰酸荧光素——一种绿色荧光探针——标记的聚-L-赖氨酸)(在Tris-NaCl缓冲液中，通常0.5mg.mL^-1)沉积在聚电解质涂层例如(PAR30/HA)₂₄聚电解质涂层的顶部。5分钟后并且在PLL-FITC扩散通过整个聚电解质涂层之后，通常用Tris-NaCl缓冲液执行冲洗步骤。可以使用共聚焦显微镜如蔡司(Zeiss)LSM 710显微镜(德国海德堡)、使用20x物镜(蔡司平面复消色差物镜(Plan Apochromat))进行涂层观察。

如上文所描述，聚电解质涂层可以以自组装的方式形成以产生逐层(LbL)结构。

本文中的“聚阳离子层”或“聚阴离子层”中的术语“层”是指某个量的如上文所定义的例如沉积在例如装置表面上的聚阳离子或聚阴离子，其中所述装置的定义如下文“装置”部分所述并且可以优选地是医疗装置或植入式装置。如所属领域的技术人员将理解的，在本发明的上下文中，一个聚阳离子层可以由若干层相同的聚阳离子材料组成，并且一个聚阴离子层可以由若干层相同的聚阴离子材料组成。

在一些实施例中，本发明的上下文中的“至少一个聚阳离子层”和/或“至少一个聚阴离子层”是指至少1个、5个、10个、15个、18个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个聚阳离子层和/或聚阴离子层。

在一些实施例中，本发明的上下文中的“至少一个聚阳离子层”和/或“至少一个聚阴离子层”是指至少1个、5个、10个、15个、18个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个聚阳离子层和/或聚阴离子层。

在一些实施例中，“至少一个聚阳离子层”和/或“至少一个聚阴离子层”是指1个到500个聚阳离子层和/或聚阴离子层，例如1个到400个、1个到300个、1个到200个、1个到100个、1个到90个、1个到80个、1个到70个、1个到60个、5个到60个、10个到60个、20个到60个、优选地21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、52个、54个、56个、58个、60个层。

在一些实施例中，“至少一个聚阳离子层”和/或“至少一个聚阴离子层”是指1个到100个聚阳离子层和/或聚阴离子层，例如1个到90个、1个到80个、1个到70个、1个到60个、1个到50个、1个到40个、1个到35个、1个到30个、如5个到40个、10个到40个、15个到40个、20个到40个层、优选地21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个层。

在某些实施例中，聚阳离子层的数目和聚阴离子层的数目相同。

在某些实施例中，聚阳离子层和聚阴离子层是交替层，具体地交替带电的聚电解质层。

因此，在一个实施例中，聚电解质涂层包括1个到60个聚阳离子层和/或1个到60个聚阴离子层。

在具体实施例中，聚电解质涂层包括18个到60个聚阳离子层和/或18个到60个聚阴离子层，更优选地聚电解质涂层包括18个到50个聚阳离子层和/或18个到50个聚阴离子层。

在具体实施例中，聚电解质涂层包括18个到60个聚阳离子层和/或18个到60个聚阴离子层，更优选地聚电解质涂层包括18个到40个聚阳离子层和/或18个到40个聚阴离子层。

在一个实例中，如下文进一步描述的，可以用一个聚阳离子层覆盖物体的表面以洗涤物体并且再次用一个聚阳离子层覆盖物体。这些步骤可以重复若干次，以便获得特定厚度的、因此由若干聚阳离子层组成的一个聚阳离子层。如所属领域的技术人员将理解的，此程序也可以用于获得一定厚度的、因此由若干聚阴离子层构成的一个聚阴离子层。

在一个实例中，聚电解质涂层由24层具有30个精氨酸残基(PAR30)的聚精氨酸和24层HA组成，因此所述涂层将在本文中被称为(PAR30/HA)₂₄。在相同的实例中，第一层是由PAR30组成的聚阳离子层，然后是第一层聚阴离子HA，然后是由PAR30组成的第二聚阳离子层，并且然后是由HA组成的第二聚阴离子层。这些层交替，直到由PAR30组成的第24聚阳离子层和由HA组成的第24聚阴离子层。

在另一个实例中，聚电解质涂层由48层具有30个精氨酸残基(PAR30)的聚精氨酸和24层HA组成，因此所述涂层将在本文中被称为(PAR30/HA)₄₈。在相同的实例中，第一层是由PAR30组成的聚阳离子层，然后是第一层聚阴离子HA，然后是由PAR30组成的第二聚阳离子层，并且然后是由HA组成的第二聚阴离子层。这些层交替，直到由PAR30组成的第48聚阳离子层和由HA组成的第48聚阴离子层。

在本发明的另外方面，聚电解质涂层还可以例如以物体表面上的聚阴离子层开始并且以聚阴离子层结束，在这种情况下，聚阳离子层和聚阴离子层的数目不同。优选地，当物体表面带正电时，聚电解质涂层以聚阴离子层开始。

在本发明的另一个方面，聚电解质涂层还可以例如以物体表面上的聚阳离子层开始并且以聚阳离子层结束；在这种情况下，聚阳离子层和聚阴离子层的数目也不同。因此，在某些实施例中，聚阳离子层的数目和聚阴离子层的数目不同。优选地，当物体表面带负电时，聚电解质涂层以聚阳离子层开始。

在一个实例中，聚电解质涂层由25层具有30个精氨酸残基的聚精氨酸和24层HA组成，因此所述涂层将被称为(PAR30/HA)₂₄-PAR30。

在某些实施例中，不同的聚电解质层由如本文定义的相同的聚阳离子材料或不同的聚阳离子材料组成。例如，聚电解质涂层可以包括由具有30个精氨酸残基的聚精氨酸组成的12层，和由具有30个鸟氨酸残基的聚鸟氨酸组成的12层，以及由HA组成的24层。

本发明的诸位发明人使用石英晶体微量天平(QCM)观察到，归一化频率随着用PAR30、PAR100或PAR200以及HA积聚聚电解质涂层的沉积步骤的数目呈指数增长，如在实例和图1中进一步解释的。诸位发明人进一步证明，厚度随着沉积步骤的数目呈指数增加与构成多层的至少一种聚电解质扩散进入和离开整个涂层有关。诸位发明人使用漂白实验进一步证明，涂层中含有的聚阳离子聚合物是可移动的并且因此扩散在整个涂层内部，如图14所示。

因此，在一个实施例中，本发明的聚电解质涂层提高了归一化频率随着沉积步骤的数目呈现的如文献中所述的“指数增长”。

在另外的实施例中，具有如上文所定义的式(1)的n个重复单元在聚电解质涂层内是可移动的和/或在其内扩散。

诸位发明人已经表明，所述至少两个带相反电荷的聚电解质层的共价偶联降低了涂层的抑菌活性。

因此，在一个实施例中，所述至少一个聚阳离子层和所述至少一个聚阴离子层不共价偶联。

装置

外来物质上的葡萄球菌感染与常规感染的不同之处在于呈生物膜形式的细菌布置。

“生物膜”是复杂的三维结构，其连接到外来物质并且细菌细胞在其中嵌入被称为粘液或糖萼的多糖细胞外基质中。此特定结构可以由相同物种或不同物种的细菌形成。与其游离(或“浮游”)形式的活体同源物相比，这些细菌处于通过低代谢活性水平指示的静止状态。由于代谢活性降低，生物膜形式的细菌例如对任何抗菌治疗更具抗性。

生物膜的问题不限于医学领域。生物膜无处不在，出现于水生系统和工业用水系统以及大量环境中。生物膜可以在各种各样的家居用品如厨房和浴室中的抽水马桶、水槽、玩具、砧板以及台面上大量定殖。生物膜还可能出现在食品生产行业中，在罐中或者在与生产线一起使用的机器上。在水和污水处理设施处，生物膜(生物污损)也存在问题：所述生物膜例如针对厨房和浴室中的板和台面引起金属腐蚀、产品污染风险增加、水质下降以及热交换效率降低。

因此，抗菌涂层对于许多不同应用中的装置来说是有利的。

如上文所描述的，本发明的诸位发明人开发了具有杀生物活性的聚电解质涂层，具体地在与含有细菌的溶液接触的最初72小时内、具体地在与含有细菌的溶液接触的最初48小时内、更优选地在与含有细菌的溶液接触的最初24小时内、最初12小时内、最初6小时内具有杀生物活性。因此，本发明的聚电解质涂层抑制细菌的生长并且由此防止细菌形成包括本发明的聚电解质涂层的装置表面的生物膜。

诸位发明人证明，例如，用PAR30、PAR50、PAR100以及PAR30构建的(PAR/HA)24涂层在孵育24小时/48小时或72小时后显示出对显示了3天内的效率和三次连续污染的细菌的完全抑制。诸位发明人进一步发现，本发明的涂层的杀生物活性的时间段随着层数目而增加。因此，本发明的涂层的杀生物活性的时间段随着所使用的层的数目而增加。

诸位发明人进一步证明，对本发明的涂层的干燥和灭菌均不会更改涂层的抗菌活性。因此，即使在灭菌后，也测量不到总杀菌剂活性的变化。

因此，所属领域的技术人员将理解，由于本发明的聚电解质涂层的抑菌活性，所述聚电解质涂层特别适合于生产包括所述聚电解质涂层的装置。

因此，本发明进一步涉及一种包括本发明的聚电解质涂层的装置。

本文的“装置”是指包括至少一个表面的物体。

在一个实施例中，聚电解质涂层覆盖所述装置的表面的至少一部分。

在一个实施例中，本发明的装置的表面包括如钛等金属、如硅酮等塑料、陶瓷或如木材等其它材料，由其组成或至少部分地由其组成。

在另外的实施例中，取决于所使用的材料，本发明的装置的表面以任何种类的架构存在，因此，所属领域的技术人员将理解，表面可以是平坦表面或不平坦表面，如例如在通常如泡沫或纤维等多孔材料的表面上存在的不平坦表面。在一些实例中，表面还可包括微米或纳米颗粒或由微粒或纳米颗粒或由其组成。

由于所述装置包括本发明的聚电解质涂层，因而所属领域的技术人员将理解，与上文“聚电解质涂层”部分中进一步定义的所述聚电解质涂层相关联的特征也指所述装置。

因此，在一个实施例中，本发明的装置具有杀生物活性，其中杀生物活性的定义如上文“聚电解质涂层”部分中所述。

在本发明的一个方面，本发明的装置对至少一种细菌具有超过70％的生长抑制，更具体地，对至少一种细菌具有超过75％、超过80％、通常超过82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的生长抑制。至少一种细菌的％生长抑制的定义如上文“聚电解质涂层”部分中所述。

在另外的实施例中，本发明的装置在植入后的最初72小时内，例如在植入后的最初48小时内、最初24小时内、最初12小时内、最初9小时内以及最初6小时内具有抑菌活性。

在优选的实施例中，本发明的装置在植入后的最初24小时内，例如在植入后的最初12小时内、最初9小时内以及最初6小时内具有抑菌活性。

此外，在一个实施例中，本发明的装置具有抗污损活性。在另外的实施例中，本发明的装置具有抗菌活性和/或抑菌活性。

因此，在一个实施例中，包括本发明的聚电解质涂层的装置是抑菌装置和/或防污损装置。抑菌的定义如上文“聚电解质涂层”部分中所述。

本发明的聚电解质涂层和本发明的装置可以容易地灭菌和储存，而不会对涂层及其特性产生不利影响。

所属领域的技术人员将进一步理解，由于本发明的聚电解质涂层的抑菌活性，所述聚电解质涂层在一个实施例中特别适合于生产医疗装置，优选地植入式装置。

本文的“医疗装置”是指包含组成部分或附件的仪器、设备、器具、机器、发明物、植入物、体外试剂或其它类似或相关物品，其例如旨在用于疾病或其它病况的诊断，或用于治愈、缓解、治疗或预防疾病，用于在下文定义的个体中或者旨在影响个体的身体的结构或任何功能，并且不通过人或其它动物的身体内或身体上的化学作用实现其任何主要预期目的，并且不依赖于被代谢而实现其任何主要预期目的。在一个实例中，医疗装置是指如绷带等用于伤口愈合的装置，例如胶布绷带或敷料。在另一个实例中，医疗装置是指卫生制品。

本文的医疗装置可以旨在用于个体。

术语“个体”、“患者”或“受试者”是指人类或非人哺乳动物，优选地小鼠、猫、狗、猴、马、牛(即，奶牛、绵羊、山羊、水牛)，包含男性、女性、成人和儿童。

因此，在一个实施例中，本发明的上下文中的医疗装置可以是医疗器械。

在一个实施例中，医疗器械可以选自由以下组成的组：叩诊锤、叩诊板、温度计、异物检测器、听诊器、诊视镜、镊子、耳镜或其任何附件、探针、牵开器、手术刀、手术剪、骨器械、锐匙、缝合针以及伤口夹。

在一个实施例中，医疗装置是植入式装置。

本发明的“植入式装置”是指放置在个体的身体内部以实现特殊目的或执行特殊功能的一件设备或机构。

在本发明的上下文中，植入式装置可以是例如假体装置，或者例如植入以递送药物、营养或氧气、监测身体功能或为器官和组织提供支撑的装置。可以永久放置植入式装置，或者一旦不再需要就可以将其移除。例如，支架或髋关节植入物旨在是永久性的。但是，化疗端口或用于修复断骨的螺钉可以在不再需要时被移除。

在一个实施例中，植入式装置选自包括以下的组：导管、动静脉分流器、乳房植入物、心脏监护仪和其它监护仪、耳蜗植入物、除颤器、牙科植入物、颌面植入物、中耳植入物、神经刺激器、矫形装置、起搏器和导线、阴茎植入物、假体装置、置换关节、脊柱植入物、声音假体、人工心脏、隐形眼镜、骨折固定装置、输液泵、颅内压装置、人工晶体、子宫内装置、关节假体、假体瓣膜、矫形装置、缝合材料、尿路支架、血管辅助装置、血管移植物、血管分流器和血管支架以及永久或暂时类型的人造血管。

在优选的实施例中，植入式装置选自包括以下的组：导管、除颤器、假体装置、假体瓣膜、置换关节、矫形装置、起搏器、血管移植物、血管分流器、血管支架以及子宫内装置、优选地导管、矫形装置、起搏器以及假体装置。

本文的“导管”是指用于插入管道、血管、通道或体腔中的管状医疗装置，其用于诊断或治疗目的、用于流体和药物并且还用于如下：排出如尿液或腹液等体液；血管成形术、血管造影术以及导管消融术；施用如氧气等气体和挥发性麻醉剂以及血液透析。

“分流器”通常是指将血液从一个部分转移到另一个部分的窄金属管或塑料管。

“支架”通常是指常常呈网格形式的短窄金属管或塑料管，其作为动脉或胆管插入解剖血管的内腔中尤其是以使先前阻塞的通道保持打开。

“假体瓣膜”是例如假体心脏瓣膜。

用于制备本发明的装置的方法

本发明进一步涉及一种用于制备本发明的装置的方法，本文中简称为本发明的方法。

本发明的装置可以包括如上文所述的不同材料，因此待用聚电解质涂层覆盖的装置的至少一个表面可以包括如上文所述的不同材料。所属领域的技术人员将理解，所述材料的不同之处在于其表面电荷。带正电的表面是例如由基于胺基的聚合物组成的表面。带负电的表面是例如由基于羧基的聚合物组成的表面。所属领域的技术人员将进一步理解，带正电的表面将首先用聚阴离子层覆盖，并且然后用聚阳离子层覆盖，其中带负电的表面将首先用聚阳离子层覆盖，并且然后用聚阴离子层覆盖。然后可以根据所需频率重复所述两个连续的沉积步骤。

在一个实例中，本发明的装置通过如下制备：使用例如自动浸渍机器人如德国柏林Riegler&Kirstein GmbH公司的自动浸渍机器人在其Si0₂表面上沉积24个PAR/HA(PAR30/HA)₂₄双层。因此，通常首先用例如2％的II溶液、H20以及乙醇来洗涤装置的表面并且用空气流动对其进行干燥。通过以下制备如PAR和HA等聚电解质的溶液：以通常0.5mg.mL^-1将PAR和HA溶解于通常含有150mM的NaCl和例如通常pH 7.4的10mM的三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS，德国Merck公司)的无菌缓冲液中。将装置的表面交替浸入聚阳离子溶液和聚阴离子溶液中，并且在每个步骤之间在NaCl-Tris缓冲液中对其进行充分冲洗。制备后，通常用空气流动干燥涂层，并且然后在使用前，将其浸没在NaCl-Tris缓冲液中并且在4℃下储存。

本文的步骤b1)i)和ii)或b2)ii)和i)中的措辞“在所述装置的表面上沉积至少一个聚阳离子层”和“在所述装置的表面上沉积至少一个聚阴离子层”是指在步骤b1)i)或b2i)的情况下使所述装置的表面与聚阳离子溶液接触，或者在步骤b1)ii)或b2ii)的情况下使所述装置的表面与聚阴离子溶液接触。

本文的“所述装置的表面”是指至少一个表面，所述至少一个表面可以部分地被本发明的聚电解质涂层覆盖。至少一个表面优选地是一个表面。

本文的“聚阳离子溶液”或“聚阴离子溶液”是指包括如上文“聚电解质涂层”部分中所定义的聚阳离子材料或聚阴离子材料的溶液。在本发明的上下文中，通常“聚阳离子溶液”和“聚阴离子溶液”可以被称为聚电解质溶液。

如本文所使用的“接触”通常是指喷雾、浸泡、浸渍或倾倒。

因此，在一个实施例中，对于“根据步骤(b1)和/或(b2)的沉积聚电解质层”，可以例如将聚电解质溶液喷涂到装置的、聚电解质涂层将形成于其上的表面上。

可替代地或组合地，可以将所述装置的表面浸泡或浸渍到聚电解质溶液中，或者可以将聚电解质溶液倾倒到基质的表面上。

因此，在一个实施例中，在步骤b1)i)中通过使所述装置的表面与包括具有如本文所定义的式(1)的n个重复单元的聚阳离子溶液接触来将所述至少一个聚阳离子层沉积在装置的表面上。

因此，在一个实施例中，在步骤b1)ii)中通过使所述装置的表面与包括HA的聚阴离子溶液接触来将至少一个聚阴离子层沉积在装置的表面上。

应当理解，所属领域的技术人员可以根据所需频率重复步骤b1)和/或b2)，以便获得包括具有如上文“聚电解质涂层”部分中所定义的多个聚电解质层、具体地交替的聚阳离子层和聚阴离子层的聚电解质涂层的装置。所属领域的技术人员将清楚，聚电解质的沉积可能受pH的影响。

因此，在一个实施例中，本发明的上下文中的所述“聚阳离子溶液”和/或“聚阴离子溶液”可以进一步包括缓冲溶液。

“缓冲溶液”是由弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸的混合物组成的水溶液。当向所述缓冲液中加入少量强酸或强碱时，其pH变化非常小，并且因此所述缓冲液用于防止溶液pH的变化。缓冲溶液用作在各种各样的化学应用中使pH保持处于几乎恒定值的手段。在本发明的上下文中使用的缓冲液可以是例如PBS(磷酸盐缓冲盐水)或TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷))。

在一个实施例中，在本发明的上下文中的所述“聚阳离子溶液”和/或“聚阴离子溶液”具有范围为4到9的pH，优选地为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，并且通常具有范围为5到8、5.5到8、6到8、6.5到8、7到8，优选地7到8的pH，具体地为7、7.2、7.4、7.6、7.8、8，例如7.4。

所属领域的技术人员将进一步清楚，聚电解质的沉积可能受带电聚电解质与聚电解质将沉积在其上的带电表面之间的相互作用以及带电聚电解质彼此之间的相互作用的影响。这些相互作用可以至少部分地通过溶液的离子强度控制。

因此，在一些实施例中，在本发明的方法的步骤(b1)或(b2)中使用的聚电解质溶液的离子强度在某些实施例中被调节以增加所沉积聚电解质的量。

因此，在一个实施例中，本发明的上下文中的所述“聚阳离子溶液”和/或“聚阴离子溶液”可以进一步包括离子。

“离子”是原子或分子，其中电子总数不等于质子总数，从而使原子或分子具有净正电荷(阳离子)电荷或净负电荷(阴离子)。由单个原子组成的离子是原子离子或单原子离子；如果离子由两个或更多个原子组成，则其是分子或多原子离子。离子的另外不同之处在于其携带的电荷。因此，离子可以是一价离子或二价离子(有时称为二阶离子)或多价离子。离子可以是但不限于F^-、Cl^-、l^-、NH₄ ⁺、S0₄ ²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺。

通常，离子可以以如上文所定义的缓冲液的形式添加，或以如例如NaCl等盐的形式添加。

例如，通常通过以下制备如PAR和HA等聚电解质的溶液：以通常0.5mg.mL-1将PAR和HA溶解于含有150mM的NaCl和例如通常pH 7.4的10mM的三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS，德国Merck公司)的无菌缓冲液中。

在聚电解质层的沉积之间，可以在没有聚电解质的溶液中进行至少一次洗涤或也被称作冲洗步骤，以去除未组装的聚电解质材料。

因此，在一个实施例中，本发明的方法进一步包括在b1)或b2)的步骤步骤i)和/或ii)之后的至少一个洗涤步骤。

在一个实施例中，对于洗涤，可以使用不含聚电解质的溶液。所述溶液可以是水或对于所属领域的技术人员来说看似适当的任何其它溶液。在一个实施例中，使用缓冲液(例如，NaCl-Tris缓冲液)执行洗涤。在一个实例中，所述NaCl-Tris缓冲液包括150mM的NaCl和pH 7.4的10mM的Tris。

可替代地或除此之外，在一个实施例中，可以执行一个或多个干燥步骤。

因此，在一个实施例中，本发明的方法进一步包括在b1)或b2)的步骤i)和/或ii)和/或权利要求的洗涤步骤之后的至少一个干燥步骤。

“干燥”可以通过所属领域的技术人员已知的任何方法执行，如空气加热、自然空气干燥、介电干燥、空气流动，优选地空气流动。在一个实例中，空气流动是指用氮气吹扫。

在一个实施例中，在干燥步骤之后，可以将紧接着在干燥步骤之前使用的相同聚电解质溶液再次沉积在表面上，由于干燥可能导致下面的聚电解质层的结合侧或电荷的部分暴露，所以所述干燥步骤因此也可以被称为中间干燥步骤。通过应用这种顺序，可以进一步增加特定聚电解质的负载。

因此，在一个实施例中，当本发明的方法进一步包括至少一个干燥步骤时，可以重复b1)或b2)的前一步骤i)或ii)和/或洗涤步骤。

通常，使聚电解质溶液与表面接触，并且使用氮气使表面在给定时间例如10秒到60秒内通过例如吹扫干燥。随后，再次使相同的聚电解质溶液与表面接触。

在某些实施例中，在两个连续的沉积步骤之间进行至少一个洗涤和/或干燥步骤。

因此，在一个实施例中，本发明的方法不含有用于将所述至少一个聚阳离子层与所述至少一个聚阴离子层共价偶联的步骤。

在一个实施例中，本发明的方法进一步包括步骤(c)，其中在如上文所述的方法的步骤(a)和步骤(b1)或(b2)中获得的聚电解质涂层可以进一步用药学活性药物浸泡。药物的定义如上文“聚电解质涂层”部分中所述。

在一个具体实施例中，用于制备装置的方法是一种用于制备植入式装置的方法。

因此，在一个实施例中，本发明涉及一种用于制备包括聚电解质涂层的植入式装置的方法，所述方法包括：

(a)提供植入式装置；

(b1)在所述植入式装置的表面上沉积

其中

-n为介于11与100之间的整数；并且

ii)至少一个聚阴离子层，其由透明质酸组成，或者

(b2)在所述植入式装置的表面上沉积如上所述的ii)并且然后沉积i)，

以及任选地重复步骤b1)和/或b2)。

因此，在具体实施例中，本发明涉及一种用于制备包括聚电解质涂层的植入式装置的方法，所述方法包括：

(a)提供植入式装置；

(b1)在所述植入式装置的表面上沉积

(i)至少一个聚阳离子层，其由具有式(1)的n个重复单元组成，

其中

-n为介于11与100之间的整数；并且

-R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂，以及然后沉积

ii)至少一个聚阴离子层，其由透明质酸组成，或者(b2)在所述植入式装置的表面上沉积如上所述的ii)并且然后沉积i)，以及任选地重复步骤b1)和/或步骤b2)。

如上文在“装置”部分中所描述的，本发明的装置的表面包括如钛等金属、如硅酮等塑料、陶瓷或如木材等其它材料，由其组成或至少部分地由其组成。这些表面可以带电，如带正电或带负电。因此，所属领域的技术人员将因此理解，可以首先用阳离子层覆盖包括例如带负电的表面的装置。

在一些实施例中，所述装置可以在用于制备植入式装置的方法之前经历表面处理以便具有带电表面。

因此，步骤a)中提供的装置的表面可以带电，如带正电或带负电，其中表面的定义如上文“装置”部分中所述。

可替代地，在一些实施例中，用于制备植入式装置的方法可以包括使所述植入式装置的表面带电的步骤(a2)。

所属领域的技术人员知道用于使装置的表面带电的方法，这种方法包含离子吸附、质子化/去质子化以及施加外部电场。例如，所属领域的技术人员进一步知道，例如，当装置表面置于流体中时，表面电荷实际上总是出现在装置表面上。大多数流体含有离子、阳离子(正离子)以及阴离子(负离子)。这些离子与装置表面相互作用。这种相互作用可能导致它们中的一些吸附在表面上。如果所吸附的阳离子的数目超过所吸附的阴离子的数目，则表面将具有净正电荷，并且如果所吸附的阴离子的数目超过所吸附的阳离子的数目，则表面将具有净负电荷。

用途

在一个实施例中，本发明涉及本发明的聚电解质涂层用于生产本发明的装置，具体地防污损装置和/或抑菌装置的用途。

在另外的实施例中，本发明涉及本发明的聚电解质涂层用于生产医疗装置或植入式装置的用途。

试剂盒

本发明进一步提供了一种试剂盒，其包括

其中

-n为介于11与100之间的整数；并且

b)至少一种聚阴离子材料，其由透明质酸组成。

具体地，本发明进一步提供了一种试剂盒，其包括

其中

-n为介于11与100之间的整数；并且

R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂，以及

b)至少一种聚阴离子材料，其由透明质酸组成。

在一个实施例中，所述试剂盒进一步包括关于聚阳离子材料和聚阴离子材料的使用的说明。这些说明可以例如描述一种用于制备如上文所定义的植入式装置的方法。

“n”、“R”以及“具有式(1)的重复单元”的定义如上文“聚阴离子涂层”部分中所述。

本文中的“至少一种聚阳离子材料”或“至少一种聚阴离子材料”中的措辞“至少”是指至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种聚阳离子材料。

在一个实施例中，所述试剂盒包括

a)至少一种聚阳离子材料，其由具有11个到95个、15个到95个、15个到90个、15个到85个、15个到80个、15个到75个、20个到95个、20个到90个、20个到85个、20个到80、20个到75个、25个到95个、25个到90个、25个到85个、25个到80个、25个到75个、28个到74个、28个到72个、30个到70个精氨酸残基的聚精氨酸组成，优选地聚-L-精氨酸，更优选地具有30个L-精氨酸残基、50个L-精氨酸残基或70个L-精氨酸残基的聚-L-精氨酸，和/或

b)至少一种聚阳离子材料，其由具有11个到99个精氨酸残基，优选地具有11个到95个、15个到90个、20个到85个、20个到80个、25个到75个、25个到70个、25个到65个、25个到60个、25个到55个、25个到50个、25个到40个、25个到35个的聚赖氨酸组成，优选地聚-L-赖氨酸，更优选地具有30个L-赖氨酸残基的聚-L-赖氨酸，和/或

c)至少一种聚阳离子材料，其由具有11个到150个鸟氨酸残基，优选地具有11个到140个、11个到130个、11个到120个、11个到120个、15个到110个、15个到100个、15个到95个、15个到90个、15个到80个、15个到75个、20个到70个、10个到65个、20个到55个、20个到50个、20个到45个鸟氨酸残基的聚鸟氨酸组成，优选地聚-L-鸟氨酸，更优选地具有30个L-赖氨酸残基的聚-L-鸟氨酸，以及

d)至少一种聚阴离子材料，其由透明质酸组成。

在一个实施例中，所述试剂盒包括

a)聚阳离子材料，其由具有15个到45个精氨酸残基的聚精氨酸组成，优选地聚-L-精氨酸，更优选地具有30个L-精氨酸残基的聚-L-精氨酸，和/或

b)聚阳离子材料，其由具有15个到45个赖氨酸残基的聚赖氨酸组成，优选地聚-L-赖氨酸，更优选地具有30个L-赖氨酸残基的聚-L-赖氨酸，和/或

c)聚阳离子材料，其由具有15个到120个鸟氨酸残基的聚鸟氨酸组成，优选地聚-L-鸟氨酸，更优选地具有30个L-赖氨酸残基的聚-L-鸟氨酸，以及至少一种聚阴离子材料，其由透明质酸组成。

治疗方法和用途

外来物质上的如葡萄球菌感染等与生物膜形成相关联的感染具有将其与常规组织感染完全区分开的许多特征。这些感染最经常是含菌少的感染(具有很少细菌)以及很容易涉及多种微生物的感染。细菌具有非常缓慢的代谢，这使其保持处于接近休眠的状态，并且所述细菌表达的基因与以浮游形式活化的基因不同。细菌的休眠状态和生物膜的存在显著减少了感染部位处的炎症反应和免疫细胞的吸引力。最后，出于相同的原因，细菌在很大程度上不受抗生素作用的影响。因此，重要的是，防止例如在植入之后具体地在个体体内进行所述生物膜形成。

在本发明的上下文中的聚电解质涂层或植入式装置具有杀生物活性，具体地在植入后的最初72小时内，具体地在植入后的最初48小时内，更优选地在植入后的最初24小时内、最初12小时内、最初6小时内。因此，本发明的上下文中的聚电解质涂层或植入式装置抑制细菌的生长，并且由此防止它们形成所述涂层或植入式装置的表面的生物膜，并且由此防止细菌感染。

因此，在一个实施例中，本发明涉及一种防止经历植入式装置的植入的个体中的细菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：提供如上文所述的植入式装置；以及将所述植入式装置植入所述个体中，其中所述植入式装置防止细菌感染。

在一个实施例中，提供植入式装置是指根据本发明的方法制备植入式装置。

个体的定义如上文“装置”部分中所述。

在一个实施例中，细菌感染是医院感染。

本文中也被称为医院获得性感染(HAI)的“医院感染”是指从医疗机构的环境或工作人员处获得的感染。所述感染在临床环境中通过许多手段，具体地通过植入式装置传播给易感患者。参与“医院感染”的革兰氏阳性细菌是例如金黄色葡萄球菌。参与“医院感染”的革兰氏阴性细菌是例如铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、大肠杆菌、军团菌。

因此，在一个实施例中，医院感染是由如上文“聚电解质涂层”部分中所定义的至少一种细菌引起的感染。

如在“装置”部分中进一步说明的，生物膜形式的细菌感染不同于常规感染。

因此，在一个实施例中，细菌感染是生物膜感染。

本文中的“生物膜感染”是指由生物膜形成细菌引起的细菌感染。生物膜形成细菌例如但不限于如葡萄球菌等革兰氏阳性细菌，以及如大肠杆菌或铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌。

上文实施例的任何组合构成本发明的一部分。在整个本申请中，术语“包括”应被解释为涵盖所有具体提到的特征以及任选的、附加的、未指定的特征。如本文所使用的，对术语“包括”的使用还公开了其中不存在除特别提及的特征之外的特征(即，“由…组成”)的实施例。不定冠词“一个/一种(a或an)”不排除多个。仅有的事实是，在相互不同的从属权利要求中引证的某些措施并不表明这些措施的组合不能用来产生优点。

现在将参考以下实例更详细地描述本发明。本文引用的所有文献和专利文件均通过引用结合在此。虽然已经在前面的描述中详细说明和描述了本发明，但是实例应被视为是说明性的或示例性的而非限制性的。

实例

1.实例1

1.1材料

已经用以下聚电解质构建了聚电解质多层涂层。聚(l-精氨酸盐酸盐)(PAR)的聚阳离子购自美国阿拉曼达聚合物公司。所使用的不同PAR聚合物与每个链的精氨酸的数目不同：PAR10 10精氨酸(R)、Mw＝2.1kDa、PDI＝1)；PAR30(30R、Mw＝6.4kDa、PDI＝1.01)、PAR100(100R、Mw＝20.6kDa、PDI＝1.05)以及PAR200(200R、Mw＝40.8kDa、PDI＝1.06)。聚(L-鸟氨酸盐酸盐)(PLO)购自美国阿拉曼达聚合物公司。所使用的不同PLO聚合物与每个链的鸟氨酸的数目不同：PLO30(30R、Mw＝5.9kDa、PDI＝1.03)、PLO100(100R、Mw＝18.5kDa、PDI＝1.03)以及PLO250(250R、Mw＝44.7kDa、PDI＝1.02)。如PLL30(30R、Mw＝5.4kDa、PDI＝1.02)等聚(L-赖氨酸盐酸盐)(PLL)购自美国阿拉曼达聚合物公司。

用作聚阴离子的透明质酸(HA，Mw＝150kDa)来自美国Lifecore Biomed公司。

1.2方法

监测多层涂层的积聚：使用原位石英晶体微量天平(瑞典Q-Sense QCM-D，E1)跟踪涂层或膜的积聚。在石英晶体的基频(约5MHz)下以及在第三泛音、第五泛音和第七泛音(分别由对应于15MHz、25MHz以及35MHz的v＝3、v＝5、v＝7表示)下将其激发。在这四个频率下测量谐振频率的变化(△f)。△f/v的增加通常关联于与石英偶联的质量增加有关。以0.5mg.mL^-1将PAR(即，PAR10、PAR30,PAR50、PAR100或PAR200)和HA溶解于含有150mM的NaCl和pH 7.4的10mM的三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS，德国Merck公司)的无菌缓冲液中。将聚电解质溶液依次注入含有石英晶体的QCM池中，并且PAR是第一个沉积的聚电解质。将它们吸附8分钟，并且然后用NaCl-Tris缓冲液执行5分钟的冲洗步骤。

使用浸渍机器人积聚(PAR/HA)₂₄：为了构建24个PAR/HA双层((PAR30/HA)₂₄)，使用了自动浸渍机器人(德国柏林Riegler&Kirstein GmbH)。首先用2％的II溶液、H₂0以及乙醇洗涤载玻片(直径12mm)并且用空气流动对其进行干燥。如上文所描述的那样制备聚电解质溶液用于QCM实验。将载玻片交替浸入聚阳离子和聚阴离子溶液中，并且在每个步骤之间在NaCl-Tris缓冲液中充分冲洗。构建后，用空气流动干燥涂层，并且然后在使用前，将其浸没在NaCl-Tris缓冲液中并且在4℃下储存。通过在PAR/HA多层涂层上沉积100μL的PLL-FITC(用异硫氰酸荧光素——一种绿色荧光探针——标记的聚-L-赖氨酸)(在Tris-NaCl缓冲液中，0.5mg.mL^-1)来评估所获得涂层的厚度。5分钟后并且在PLL-FITC扩散通过整个涂层之后，用Tris-NaCl缓冲液执行冲洗步骤。使用共聚焦显微镜蔡司LSM 710显微镜(德国海德堡)、使用20x物镜(蔡司平面复消色差物镜)进行涂层观察。

以类似方式制备24个PLL/HA双层(PLL30/HA)₂₄和24个PLO/HA双层(即，(PLO30/HA)₂₄、(PLO100/HA)₂₄以及(PLO250/HA)₂₄)，其中以0.5mg.mL^-1将PLO或PLL溶解于含有150mM的NaCl和pH 7.4的10mM的三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS，德国Merck公司)无菌缓冲液中。

抗菌测定：

-金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌，ATCC 25923)菌株用于评估测试样本的抗菌特性。在37℃下、在pH 7.4的缪勒-辛顿肉汤(Mueller Hinton Broth)(MHB)培养基(德国Merck公司)中有氧培养菌株。将一个菌落转移到10mL的MHB培养基并且在37℃下孵育20小时，以提供10⁶CFU.mL^-1的最终密度。为了获得对数生长中期的细菌，将隔夜培养物在620nm处的吸光度调节为0.001。

通过使用UV光在15分钟内对涂覆有具有PAR10、PAR30、PAR100的(PAR/HA)₂₄的载玻片进行灭菌，然后用NaCl-Tris缓冲液对其进行洗涤。洗涤后，将每个载玻片沉积在具有300μl的金黄色葡萄球菌，A₆₂₀＝0.001的24孔板中，并且在37℃下对其进行孵育24小时。

对于阴性对照，使用类似方法将未涂覆的载玻片直接与金黄色葡萄球菌一起孵育。

对于阳性对照，将四环素(10μg.mL^-1)和头孢噻肟(0.1μg.mL^-1)添加在金黄色葡萄球菌溶液中，与未涂覆的载玻片接触。

为了在24小时后量化细菌生长或抑制，测量了上清液在620nm处的吸光度。

对于涂覆有(PLL30/HA)₂₄、(PLO30/HA)₂₄、(PLO100/HA)₂₄以及(PLO250/HA)₂₄的载玻片，以类似方式执行测定。

以类似于针对上文所述的金黄色葡萄球菌而描述的细菌测定的方式执行针对藤黄微球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌的抗菌测定。

细菌存活死亡测定：为了评估表面上的细菌的健康，使用了BacLight^TMRedoxSensor^TMCTC活力试剂盒(法国赛墨菲舍尔科学公司(ThermoFischerScientific Inc.))。此试剂盒提供了用于评估细菌健康和活力的有效试剂。所述试剂盒含有5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四唑(CTC)，所述CTC已经被用于评估金黄色葡萄球菌的呼吸活性。实际上，健康的细菌将吸收CTC并且将其还原为不溶的红色荧光甲臜产物。死亡或呼吸活性缓慢的细菌不会还原CTC，并且因此将不会产生红色荧光产物。最后，此试剂盒给出了健康细菌与不健康细菌的半定量估计。将24绿色荧光核酸染色剂(法国赛墨菲舍尔科学公司)用于对所有细菌进行计数。制备50mM的CTC和0.001mM的Syto 24在纯水中的溶液。用pH＝7.4的磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)洗涤每个载玻片，然后添加270μl的PBS和30μL的CTC/Syto 24溶液。在37℃下远离光将板孵育30分钟。用共聚焦显微镜检查(德国海德堡蔡司LSM 710显微镜)、使用63x物镜观察浸没在油中的每个表面。染色剂的激发/发射波长对于CTC来说为450/630nm，并且对于Syto 24来说为490/515nm。

细胞毒性试验：将人成纤维细胞(来自法国ATCC/LGC标准公司的CRL-2522)在37℃下在伊格尔极限必需培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM，ACC/LGC)中与10％胎的牛血清(FBS，法国吉布科/赛墨菲舍尔科学公司(Gibco/ThermoFicherScientific Inc.))和1％的青霉素链霉素(Pen Strep，法国生命科技/赛墨菲舍尔科学公司(Life Technologies/ThermoFicher Scientific Inc.))一起培养。在24小时内，在24孔板的每个孔中孵育50,000个细胞。将涂覆有(PAR/HA)₂₄的载玻片在含有1mL培养基的6孔板中同时孵育。24小时后，去除含有细胞的孔的培养基，并且用与多层接触24小时的上清液将其代替。将人成纤维细胞在37℃下孵育24小时。然后，去除上清液并且与10％的阿尔玛蓝(AlamarBlue)(法国赛墨菲舍尔科学公司)一起孵育2小时。通过测量所产生的resofurin的荧光(激发/发射波长＝560/590nm)来确定细胞活力。用PBS洗涤细胞两次，并且用PFA4％溶液固定10分钟，并且然后再次用PBS洗涤两次。在具有1％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中制备鬼笔环肽的溶液。将染色溶液在室温下置于固定的细胞上30分钟，并且用PBS缓冲液洗涤两次。制备DAPI溶液并且在与先前相同的条件下置于细胞上。使用配备有尼康(Nikon)数码相机(具有NIS-元素(NIS-Elements)软件的DS-Q11MC，法国尼康)的63x PLAPO(1.4NA)物镜的尼康Elipse Ti-S捕获荧光图像，并且用图像J(ImageJ)(http://rsb.info.nih.gov/ij/)处理。罗丹明标记鬼笔环肽的激发/发射波长为540/565nm，并且DAPI的激发/发射波长为350/470nm。

时差显微镜检查(Time-lapse microscopy)：通过使用UV光对涂覆有(PAR/HA)₂₄的载玻片进行灭菌15分钟，然后用NaCl-Tris缓冲液洗涤。洗涤后，将在培养期间染色有Syto24的每个载玻片安装在37℃、5％的C0₂、具有1mLμl金黄色葡萄球菌(如前述那样使用，其中，A₆₂₀＝0.001)的Ludin Chamber(瑞士生活影像服务(Life Imaging Services公司))中。使用配备有60x PL Apo油(1.4NA)物镜的尼康TIE显微镜执行时差序列(time-lapsesequence)24小时，并且Andor Zyla sCMOS相机(英国安多科技有限公司(AndorTechnology LtD.))与尼康NIS-元素Ar软件(法国尼康)一起使用。在24小时内每5分钟获取相衬和荧光图像。用图像J处理图像。

圆二色性：使用Jasco J-810分光偏振计(英国雅诗科公司(Jasco Corporation))记录圆二色性(CD)光谱作为在22℃下、从180nm到300nm使用0.1mm路径长度的石英比色皿(其中，数据间距(pitch)为0.1nm并且扫描速度为20nm/分钟)获得的3次扫描的平均值。通过减去缓冲光谱来校正所有光谱。在NaCl-Tris缓冲液中以2mg.mL^-1的浓度获得每种PAR的光谱。将所有CD数据表示为平均残基椭圆率。

PAR的荧光标记：为了标记PAR链，将PAR(在pH 8.3的100mM NaHC0₃缓冲液中，15mg.mL^-1)与异硫氰酸荧光素(FITC，法国西格玛阿尔德里奇(Sigma Aldrich)公司)在室温下以1:2的PAR/FITC摩尔比孵育3小时。使用Slide-A-Lyser透析卡(Dialysis Cassette)(美国赛墨菲舍尔科学公司)将此溶液在4℃下用1L水透析，截留值＝3500MWCO。然后产生PAR-FITC并且以2mL(在NaCl-Tris缓冲液中，0.5mg.mL^-1)的等分试样储存。

释放实验：对于第一实验，通过使用PAR-FITC构建多层涂层(PAR30/HA)₂₄。在存在MHB培养基或金黄色葡萄球菌/MHB溶液(A₆₂₀＝0.001)的情况下在37℃执行释放实验24小时。在上清液的顶部添加300μL矿物油以防止在监测期间的任何蒸发。通过随时间的推移用激发/发射波长为488/517nm的分光荧光计(摩纳哥SAFAS Genius XC分光荧光计)测量上清液的荧光来执行PAR-FITC在溶液中的释放。针对每种条件研究了三个样本。

对于第二实验，将多层膜(PAR30/HA)₂₄在37℃下在两种条件下孵育：A)与A620＝0.001的300μl金黄色葡萄球菌溶液一起孵育和B)仅与300μl的MHB一起孵育。24小时后，取出与LbL接触的上清液，并且与新的金黄色葡萄球菌溶液一起孵育以获得最终的A620＝0.001。在37℃下24小时后，测量620nm处的吸光度。针对每种条件研究了三个样本。

光漂白后荧光恢复(FRAP)实验：通过执行光漂白实验(FRAP，光漂白后荧光恢复)来测量含有PAR-FITC的(PAR/HA)₂₄多层的扩散系数D和可移动分子比例p。

将涂覆有多层的载玻片引入自制样本架中并且浸没在200μl的Tris-NaCl缓冲液中。将一个圆形区域(半径为4.4μm，在35μm x 35μm或半径为10.6μm的图像中被称为“R4”，并且在85μm x 85μm的图像中被称为“R10”)曝光于设定处于最大功率的激光(A＝488nm)700毫秒。然后，随时间观察漂白区域中的荧光恢复。用蔡司LSM 710显微镜(德国海德堡)、使用20x物镜(蔡司平面复消色差物镜)进行观察。

(PAR30/HA)24的交联：在4℃下通过将(PAR30/HA)24膜浸没在含有EDC(100mM)和N-羟基琥珀酰亚胺(10mM)的NaCl(0.15M)溶液中来执行交联15小时。用NaCl(0.15M)溶液冲洗膜2次。在4℃下将膜浸没在乙醇胺(1M)的溶液中40分钟以中和所有未反应的羧酸盐官能团。用NaCl溶液冲洗膜，并且将NaCl-Tris缓冲溶液用于最后的冲洗步骤。

1.3结果

为了测试PAR/HA涂层的积聚，使用了石英晶体微量天平(QCM)。图1与用QCM监测的各种分子量的PAR(10个、30个、100个或200个残基分别与符号PAR10、PAR30、PAR100或PAR200相对应)的逐层沉积相对应。在第一近似法中，已知的是，归一化频率的增加可能与沉积质量或厚度(REF)的增加有关。对于积聚有PAR30、PAR100或PAR200的涂层，观察到归一化频率随沉积步骤的数目呈指数增长。对较大的PAR链监测到最重要的生长。在PAR₁₀的情况下，归一化频率随沉积数目的增量较弱，然而已经观察到指数增长(图1)。最后，尽管此多肽的长度短，但逐层生长是有效的。

对于积聚有具有各种MW的壳聚糖的壳聚糖/HA的多层涂层，之前展示了相反的行为(里歇特(Richert)，2004年，《朗缪尔(Langmuir)》)。对于所使用的所有MW的壳聚糖，观察到涂层的指数生长，然而当壳聚糖链的质量较小时，涂层积聚较快。这种行为与涂层中的壳聚糖链的扩散特性有关：较短的链应当更多地扩散通过涂层，这应当导致在每次层沉积之后质量增量中的更高增加。然而，在本研究中，因为选择均聚肽而不是多糖作为聚阳离子并且它们的链长范围较小，所以实验条件不同。

然后，用共聚焦显微镜检查观察到具有24个双层((PAR/HA)₂₄)的涂层。为了对涂层进行荧光标记，了添加聚(赖氨酸)-FITC作为涂层顶部的最后一层。具有不同残留数目的PAR的涂层积聚的横截面图像描绘了在整个涂层截面具有绿色标记的厚带(图2)。这表明，所产生的涂层在所有条件下均匀地沉积在表面上(对于具有10个到200个残基的PAR)。

接下来，针对不同残基数目的PAR评估了(PAR/HA)24多层的抗菌特性。针对革兰氏阳性细菌——即，金黄色葡萄球菌，其是众所周知与医院感染并且更特别地与植入物相关感染相关联的一种菌株——而对膜进行了测试。例如，在矫形植入物的情况下，金黄色葡萄球菌连同表皮葡萄球菌参与70％的感染(《生物材料(biomaterials)》，第84卷，2016年，第301页)。在37℃下、在存在MHB培养基的情况下、在(PAR/HA)24涂层上将金黄色葡萄球菌孵育24小时。在37℃下、在存在MHB培养基的情况下在表面上以高密度将细菌孵育24小时。通过将在存在多层膜的情况下在620nm处的吸光度与阳性对照(不具有多层膜并且在培养基中存在抗生素)和阴性对照(不具有多层膜并且在培养基中不存在抗生素)相比较来估计病原体的归一化生长(％)。对于建立有PAR10、PAR50、PAR100以及PAR200的膜来说，未观察到明显的抑制。然而，对于PAR30(30个残基)，在24小时后观察到超过95％的细菌生长抑制。这表明，PAR30强烈影响金黄色葡萄球菌的活力。必须指出的是，分子量效应极其明显，并且到目前为止，无论多层膜功能如何，从未观察到对所述功能的这种影响(见图3)。

为了更准确地评估与表面接触的细菌的健康，使用5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四唑(CTC)监测了金黄色葡萄球菌的呼吸活性。健康的细菌将吸收CTC并且将其还原为不溶的红色荧光甲臜产物，并且死亡的细菌将不还原CTC并且因此将不产生荧光产物(数据未显示)。清楚地观察到对(PAR30/HA)表面上细菌的完全抑制，并且极少发现细菌很少的区域(数据未显示)。相比之下，PAR10、PAR100或PAR200表面并不防止细菌粘附和生长，发现了与未处理表面上相似的健康细菌的密度。此显著结果与上文所描述的上清液中的生长抑制完全相关，其中PAR30还是唯一能强有效抵抗细菌的涂层。

为了阐明(PAR/HA)₂₄涂层的细菌生长抑制是否仅限于金黄色葡萄球菌，针对其它革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌进一步测试了(PAR30/HA)₂₄的细菌生长抑制。因此，针对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌菌株、藤黄微球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌评估了(PAR30/HA)₂₄多层的抗菌特性。

图16中所示的结果证明，涂层对不同的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌具有抗菌活性。

在这种背景下，诸位发明人感兴趣的是抗菌活性是否限于本文所描述的(PAR/HA)多层涂层，或者包括另一种多肽作为聚阳离子的涂层是否也将表现出相同的抗菌活性。本发明的诸位发明人针对不同残基数目的PLL和PLO进一步评估了(PLL/HA)₂₄和(PLO/HA)₂₄。令人惊讶的是，从图4、图6、图9、图10以及图17可以得出结论，(PLL/HA)₂₄和(PLO/HA)₂₄多层还显示出对金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的高生长抑制。

在下文中，本发明的诸位发明人希望进一步阐明在表面上和上清液中对本发明的涂层赋予强抑制特性的基本机制。作为实例，进一步研究了(PAR30/HA)₂₄涂层。因此，使用如实验部分所述的细菌测定确定了PAR在溶液中的最小抑制浓度(MIC)。对于高达0.04mg.mL^-1的浓度，所有PAR(PAR10、PAR30、PAR100或PAR200)完全抑制金黄色葡萄球菌生长(图11)。然而，当PAR浓度降低时，观察到PAR之间的差异：对于浓度为0.03mg.mL^-1的所有PAR(除了较长的一种，即PAR200，其中仅测量到部分抑制(约45％))，监测到对金黄色葡萄球菌生长的完全抑制。最后，对于浓度为0.01mg.mL^-1的PAR，仅PAR₃₀显示出100％的抑制。更长或更短的PAR链(PAR10、PAR100或PAR200)仅部分抑制金黄色葡萄球菌生长(小于40％)。这表明PAR30在溶液中更有效。当PAR浓度值以质量表示(mg.mL^-1)时，这种推理是有效的，因此其与精氨酸单体的数目有关。然而，当使用以μM表示的浓度(并且因此与链数目成比例)绘制曲线图时，这意味着浓度与链的数目有关，可以进行不同的解释。在低浓度下，较长的链条更有效：在1μM下，PAR100和PAR200完全抑制细菌生长，而PAR30需要是约2μM以达到类似的效果。最后，诸位发明人根据这些结果得出结论，所有PAR链在溶液中都有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。对于给定质量的PAR，PAR30是最有效的。此外，针对PAR30、PAR100或PAR200获得的MIC100值在非常低的浓度(在1μM与2μM之间)下变动，与众所周知的抗菌肽相比，这是显著的(例如，对于cateslytin与金黄色葡萄球菌，30μM，参见《先进功能材料(Adv.Funct.Mater.)》，2013年，第23卷，第4801到4809页)。因此，PAR是对抗金黄色葡萄球菌的有力候选者。然而，即使不同长度的PAR的MIC存在差异，所述MIC也不会有数量级的差异，并且因此似乎不是，至少仅是在PAR/HA多层上观察到的显著分子量效应的原由。

为了解决PAR链的构象并且检查PAR30链是否具有可以解释其与较长链或较短链相比较的特定抑制特性的二级结构，进行了圆二色性(CD)实验。首先，PAR链的二级结构在NaCl/TRIS缓冲溶液(150mM NaCl、10mM Tris，pH7.4)中(数据未显示)。PAR链(PAR10、PAR30、PAR100以及PAR200)的所有CD光谱在溶液中的无规卷曲构象特有的约200nm处显示出独特的负最小值。在第二步中，监测PAR/HA多层涂层中的PAR构象(数据未显示)。令人惊讶的是，涂层的光谱描绘了完全不同的曲线：在200nm处未观察到更多的最小值，然而，监测在约10nm处监测到一个最小值并且在约222nm处监测到另一个最小值，除了(PAR10/HA)24之外，其在200nm处呈现独特的负最小值(无规线圈)。这些最小值可能不归因于HA链，因为已知的是，在pH 7.4的溶液中，HA链具有无序构象(Zahouani，《ACS应用材料(ACS AppliedMaterials)》，2016年，印刷中)。此外，PAR/HA光谱更可能与以这两个最小值为特征的α-螺旋构象中的链相对应。这表明，PAR链应当从溶液中的线圈构象变为涂层中的α-螺旋。先前针对具有聚赖氨酸和聚(谷氨酸)的LbL积聚观察到相似行为(Boulmedais F.等人，《朗缪尔(Langmuir)》，2002年，第18卷，第4523页)。有趣的是，已知无序抗菌肽在与细菌薄膜相互作用时采用α-螺旋构象，并且这种机制是其作用机制的关键点(Porcellini F.等人，2008年，《生物化学(Biochemistry)》，第47卷，第5565页以及Lugardon K.等人，2001年，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第276卷，第38期，第35875页)。在此，在聚电解质多层涂层中，PAR链已经采用α-螺旋构象，这最可能是由于PAR与HA之间的相互作用以及PAR的局部高浓度。这种机制可能有助于更快地且以更高效的方式对抗入侵细菌。

但是，由于使用不同PAR链长度构建的膜呈现相似的光谱，所以PAR链的二级结构无法解释对PAR30/HA膜的杀菌特性的显著分子量效应。

鉴于与较短或较长的PAR链相比，PAR30在溶液中不存在特定特性，PAR30/HA膜的抗菌能力本身应当与膜特性相关。在这种背景下，我们研究了膜的杀菌特性是否是由于PAR30链从多层释放到溶液中或者细菌是否需要与膜接触以被杀死。为此目的，执行了两种类型的实验。使用荧光标记的PAR30链，我们首先确定了，在具有和不具有金黄色葡萄球菌的情况下，PAR30链释放到仅含有MH培养基的溶液中。图13示出了典型的释放动力学曲线。实际上，在大约24小时的时间尺度内观察到缓慢释放过程，但是明显的结果是，即使在24小时后，溶液中达到的PAR30浓度显著低于对应的MIC浓度：24小时后所释放的PAR30为约0.18μM，而MIC90为约2μM。此外，在上清液与膜接触24小时后使其与含有最终浓度与之前的时延相同的细菌的悬浮液接触时，绝对没有观察到细菌生长抑制，从而证实上清液中未达到MIC(图15)。最后，我们还执行了一项实验，其中使细菌与(PAR30/HA)24膜接触24小时。细菌生长得到完全抑制。去除此实验的上清液并且使其与新鲜的细菌悬浮液接触。此处，再次，细菌生长未得到进一步抑制(数据未显示)。这些结果证明，PAR30链从膜释放到上清液中不能成为杀菌作用的原由。最后，我们可以假设杀菌效果与细菌和充当接触杀死多层的PAR30/HA膜的接触直接相关。

然后，诸位发明人研究了PAR30/HA多层的杀菌活性是否与膜中这些链的移动性有关。实际上，已知的是，多层的指数特性与在每个沉积步骤期间进入和离开膜的其成分中的至少一种的扩散能力有关。他们首先使用FRAP方法确定了(PAR/HA)24多层中的不同链PAR10、PAR30、PAR100以及PAR200的移动性。图14示出了作为时间的平方根的函数的、漂白区域中的归一化荧光的演变。可以根据这些曲线推导出在实验的时间尺度内的固定链的百分比。显然，超过80％的PAR10链和PAR30链是可移动的，并且只有分别60％和20％的PAR100和PAR200是可移动的(数据未显示)。当链长从30个残基增加到100个残基或200个残基时，可移动链的比例急剧下降。

诸位发明人还在胺基与羧基之间使用标准EDC-NHS交联方法使PAR30/HA多层交联。在交联后，我们发现，通过FRAP测量的固定链的比例增加(数据未显示)。当这种膜与金黄色葡萄球菌接触时，在接触24小时后仅观察到30％的细菌生长抑制。这些结果表明，多层中的移动PAR链的百分比是控制膜的其杀菌特性的重要参数(图11)。

最后，使用共聚焦显微镜检查，诸位发明人还研究了与细菌接触24小时后膜的结构(数据未显示)。为此目的，通过结合荧光标记的PAR30链构建膜。经发现，在接触24小时后，膜不再均匀，而是出现非荧光区域。因为这些区域具有光滑的形状，所以所述区域暗示了膜的重组。在不存在细菌的情况下，其中膜保持均匀，未观察到这种行为。这种重组可以与膜中的PAR链减少连续，并且暗示以下杀菌机制：当细菌与多层接触时，阴性细菌薄膜充当PAR链的强吸引表面。移动PAR链因此通过细菌薄膜浸泡出所述膜并且使所述细菌薄膜不稳定。相比较小分子量链，大分子量的链具有更强的薄膜去稳定能力，因为所述大分子量链从在溶液中确定的MIC中出来。PAR10链的活性比PAR100或PAR200链低10倍，但PAR30链的活性仅比PAR100或PAR200链低2倍。然而，在膜中，可以假设精氨酸单体的浓度与PAR链的分子量完全不相关。因此，当聚电解质的分子量增加时，链的浓度降低。例如，膜中的PAR30链的浓度应当比PAR100的浓度高3倍。另外，大约90％的PAR10链是可移动的，而只有70％的PAR100链是可移动的。这导致膜中的PAR10链的数目是PAR100的4倍。可能存在其它因素来解释用PAR30构建的膜，即PAR/HA膜具有较强的杀菌作用，但链移动性无疑是一个重要的因素。

总之，本发明的诸位发明人已经发现，包括PAR、PLL或PLO作为聚阳离子和HA作为聚阴离子的多层涂层对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌具有很强的抗菌作用。这种作用显著地取决于多肽链的分子量。这种作用通过多层中可移动物的浓度及其作为分子量的函数的细菌杀死能力来解释。这些结果为聚电解质多层的新型应用开辟了途径，特别是抗菌多层的新型应用，其中功能可以通过聚电解质的分子量来调整。

2.实例2

2.1材料

已经使用上文1.1部分中所描述的聚电解质积聚了聚电解质多层涂层。另外，使用了以下聚电解质：聚(l-精氨酸盐酸盐)(PAR)的聚阳离子购自美国阿拉曼达聚合物公司。所使用的不同PAR聚合物与每个链的精氨酸的数目不同：PAR50 50精氨酸(R)、Mw＝9.6kDa、PDI＝1.03)；PAR70(70精氨酸(R)、Mw＝13.4kDa、PDI＝1.01)、PAR150(150精氨酸(R)、Mw＝29kDa、PDI＝1.04)。

2.2方法

所使用的方法如上文段落1.2下的对应部分所述。

2.3结果

2.3.1精氨酸残基的数目对PAR/HA抗菌活性的影响：孵育24小时后的具有PAR30、PAR50、PAR70、PAR100以及PAR150的涂层

已经测试了具有30个残基、50个残基、100个残基以及150个残基的PAR以确认先前的结果并且获得补充结果。使用涂覆有(PAR/HA)₂₄(即，24个PAR层与24个HA层交替)的载玻片执行测量并且将其置于如前所述的24孔板中(《化学材料(Chem.Mater.)，2016年，第28卷，第8700页)。将浓度为8.105CFU.mL^-1的300μL金黄色葡萄球菌沉积在每个孔中并且在37℃下孵育24小时。然后，测量上清液在620nm处的吸光度。

具有24个双层的PAR50/HA与PAR30/HA

用24个双层积聚的PAR50/HA膜显示出对细菌的完全杀菌作用(图19和图20)。此外，使用共聚焦显微镜、用CTC/Syto24标记进行的观察主要显示出在涂层上没有细菌(数据未显示)。

具有48个双层的PAR50/HA与PAR30/HA

将双层数目从24增加到48显示出类似的结果：对于基于PAR50或PAR30的涂层，对金黄色葡萄球菌生长的抑制是完全的(图21和图22)。通过用共聚焦显微镜检查进行的观察证实了这些结果：在PAR50/HA涂层或PAR30/HA涂层上未观察到细菌。

具有24个双层的PAR100/HA和PAR150/HA与PAR30/HA

用24个双层构建的PAR100/HA涂层描绘了完全抗菌活性(图23)。另一方面，PAR150/HA涂层并不抑制细菌，涂层根本无效。共聚焦显微镜检查观察证实了这些结果，在PAR100/HA和PAR30/HA涂层上未观察到细菌，但是在PAR150/HA涂层上可以看到许多细菌。

具有24个双层的PAR10/HA与PAR30/HA

具有24个双层的PAR10/HA涂层完全抑制上清液中的细菌(图24)。作为对照，PAR50/HA和PAR30/HA涂层证实了它们的抗菌活性，如上所述。根据用共聚焦显微镜检查进行的表面观察可以得出类似的结果。

具有24个双层的PAR70/HA与PAR30/HA

放置PAR70/HA涂层的上清液中的细菌得到完全抑制(图25)。通过共聚焦实验证实了这一点。

2.3.2.PAR/HA涂层的长期抗菌活性：孵育24/48小时或72小时后的PAR10、PAR30、PAR50、PAR100以及POR30

孵育24/48或72小时后的具有24个双层的PAR30/HA与POR30/HA

当使用(PAR30/HA)₂₄或(POR30/HA)₂₄涂层时，24小时、48小时或72小时后在上清液中未监测到细菌(图26到图28)。当用共聚焦显微镜观察表面时，可以得出类似的结论。

孵育24/48小时或72小时后的具有24个双层的PAR10/HA、PAR50/HA以及PAR100/HA

用PAR10/HA、PAR50/HA以及PAR100/HA涂层执行类似的实验。24小时后，对于两种涂层，在上清液中均未测量到细菌(图29)。在48小时时的PAR50/HA涂层或PAR100/HA涂层以及PAR10/HA涂层不再有效，金黄色葡萄球菌的生长处于与没有涂层的表面相当的水平(图30)。在72小时时获得了类似的结果，其中在PAR10/HA涂层的情况下，细菌存活，但是在PAR50/HA或PAR100/HA涂层的情况下，细菌死亡(图31)。用共聚焦显微镜观察证实了所有这些结果。

2.3.3PAR/HA涂层的储存和灭菌

PAR/HA涂层的储存

为了检查PAR/HA涂层的干燥程序和储存是否允许保持抗菌活性，在对(PAR30/HA)24进行干燥(用纯水冲洗并且在环境温度下干燥)后对其进行测试并且在4℃下储存1天或7天(图32和图33)。在这两个过程之后未观察到抗菌活性的变化，绝对没有细菌能够在含有所述涂层的孔的上清液中生长。这表明，在干燥程序后，膜很可能是稳定的，并且几天的储存没有改变其特性。

PAR/HA涂层的灭菌

在用于医疗装置的灭菌的规律循环(在121℃下循环30分钟)后进行干燥程序和高压灭菌，然后测试(PAR30/HA)₂₄涂层的活性(图34)。此灭菌方案并未更改涂层的抗菌活性；未测量到总杀菌活性的变化。

2.4.结论

最后，根据这些研究可以得出几个结论：

-用PAR10、PAR30、PAR50、PAR70、PAR100构建的(PAR/HA)₂₄涂层在接种24小时后显示出对金黄色葡萄球菌的完全抗菌活性。然而，在我们之前的初步研究中，PAR10和PAR100并不总是活跃24小时。这很可能是因为PAR10和PAR100与有效的极限值的链长相对应。相反，PAR30和PAR50在我们的实验中总是显示出完全的抗菌活性(至少已经实现了针对两者的超过10项单独的实验)。(PAR150/HA)₂₄涂层孵育24小时后从显示出对金黄色葡萄球菌的一些抗菌活性。

-用PAR30、PAR50、PAR100以及PAR30构建的(PAR/HA)24涂层在孵育24小时/48小时或72小时后显示出对显示了3天内的效率和三次连续污染的细菌的完全抑制。相反，PAR10在第三次接种后(72小时)不再活跃。

-(PAR/HA)24涂层可以在干燥后在4℃下储存数天，其活性没有任何损失。此外，用于医疗装置的标准灭菌方案的应用可以适用于(PAR/HA)24涂层，将保持涂层活性的抗菌特性。

附图说明

图1：展示了通过QCM跟踪的(PAR/HA)多层涂层在Si0₂涂覆的晶体上的积聚的曲线图。各种分子量的PAR(10个、30个、100个或200个残基分别与符号PAR10、PAR30、PAR100或PAR200相对应)与HA结合使用。归一化频率-△fv/v(其中，v＝3)随所吸附的层的数目演变。对于积聚有PAR30、PAR100或PAR200的涂层，观察到归一化频率随沉积步骤的数目呈指数增长。对较大的PAR链监测到最重要的生长。在PAR10的情况下，归一化频率随沉积数目的增量较弱，然而已经观察到指数增长。

图2：示出了PAR/HA涂层区段(x,z)的共聚焦显微镜检查图像的图像。通过共聚焦显微镜检查观察PAR/HA涂层区段(x,z)以发现针对通过QCM跟踪的(PAR/HA)多层涂层在Si0₂涂覆的晶体上的PAR/HA涂层积聚。比较了具有各种分子量的PAR，即PAR10、PAR30、PAR100或PAR200的(PAR/HA)多层涂层的积聚。此图像表明，所获得的涂层在所有条件下均匀地沉积在表面上(对于具有10个到200个残基的PAR)。

图3：展示了使用本发明的PAR涂层对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。示出了在与由具有不同数目的残基的聚-L-精氨酸构成的(PAR/HA)₂₄多层涂层接触24小时后，在上清液中获得的归一化金黄色葡萄球菌生长(％)。每个值与3项实验的平均值相对应，并且误差条与标准偏差相对应。对于(PAR10/HA)₂₄，金黄色葡萄球菌的生长为约80％、对于(PAR100/HA)₂₄为75％、对于(PAR200/HA)₂₄为约90％，并且对于(PAR30/HA)₂₄为低于5％，由此显示出(PAR30/HA)₂₄的超过95％的强生长抑制。

图4：展示了使用本发明的PLL涂层对金黄色葡萄球菌的生长抑制的曲线图。示出了在与(PLL30/HA)₂₄多层涂层接触后24小时(J+1)、2天以及3天后在上清液中获得的归一化金黄色葡萄球菌生长(％)。每24小时后使涂层与金黄色葡萄球菌的新鲜悬浮液接触。每个值与3项实验的平均值相对应，并且误差条与标准偏差相对应。对于(PLL30/HA)₂₄来说，在1天和两天后，金黄色葡萄球菌的生长小于5％，由此显示(PLL30/HA)₂₄在最初48小时内超过95％的强生长抑制。

图5：展示了使用涂层(PAR30/HA)₂₄对藤黄微球菌进行的生长抑制的曲线图。示出了与(PAR30/HA)₂₄多层涂层接触20小时后，在上清液中观察到的归一化藤黄微球菌生长(％)。每个值与3项实验的平均值相对应，并且误差条与标准偏差相对应。对于(PAR30/HA)₂₄，藤黄微球菌的生长小于2％，由此显示(PAR30/HA)₂₄超过98％的强生长抑制。

图6：展示了在不存在聚阴离子HA的情况下使用PAR30或PLL30涂层对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。示出了在不存在聚阴离子层HA的情况下，在与PLL30或PAR30的聚阳离子层接触24小时后，在上清液中获得的归一化金黄色葡萄球菌生长(％)。使涂层与金黄色葡萄球菌的新鲜悬浮液接触24小时。每个值与3项实验的平均值相对应，并且误差条与标准偏差相对应。对于PLL30，金黄色葡萄球菌的生长为约65％，并且对于PAR30为约100％，由此显示出PLL30的仅35％的轻微生长抑制以及PAR30的无生长抑制。

图7：展示了使用本发明的(PAR200/HA)₂₄-PAR30对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。在多层涂层(PAR200/HA)₂₄上添加最终层PAR30，从而产生多层涂层PAR200/HA)₂₄-PAR30。示出了与(PAR200/HA)₂₄-PAR30多层涂层接触24小时后，在上清液中获得的归一化金黄色葡萄球菌生长(％)。每个值与3项实验的平均值相对应，并且误差条与标准偏差相对应。对于(PAR200/HA)₂₄-PAR30，金黄色葡萄球菌的生长小于1％，从而显示出(PAR200/HA)₂₄-PAR30超过99％的强生长抑制。

图8：展示了使用本发明的(PAR200/HA)₂₄-PAR30对藤黄微球菌进行的生长抑制的曲线图。在多层涂层(PAR200/HA)₂₄上添加最终层PAR30，从而产生多层涂层(PAR₂₀₀/HA)₂₄-PAR30。示出了与PAR200/HA)24-PAR30多层涂层接触24小时后，在上清液中观察到的归一化藤黄微球菌生长(％)。每个值与3项实验的平均值相对应，并且误差条与标准偏差相对应。对于(PAR200/HA)₂₄-PAR30，藤黄微球菌的生长小于1％，从而显示出(PAR200/HA)₂₄-PAR30超过99％的强生长抑制。

图9：展示了使用本发明的PLO涂层对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。示出了在与由具有不同数目的残基的聚-L-鸟氨酸构成的(PLO/HA)₂₄多层涂层(即，(PLO30/HA)₂₄和(PLO100/HA)₂₄)接触24小时后，在上清液中获得的归一化金黄色葡萄球菌生长(％)。每个值与3项实验的平均值相对应，并且误差条与标准偏差相对应。对于(PLO250/HA)₂₄，金黄色葡萄球菌的生长为约80％、对于(PLO100/HA)₂₄为低于5％并且对于(PLO30/HA)₂₄为低于3％，从而显示出(PLO100/HA)₂₄和(PLO30/HA)₂₄超过95％的强生长抑制。

图10：展示了使用(PLL₃₀/HA)₂₄或交联(PLL₃₀/HA)₂₄对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。使用EDC/NHS将(PLL30/HA)₂₄与0.5M EDO以及0.1M NHS在4℃下交联15小时。使用乙醇胺中和未反应的羧基。在与(PLL₃₀/HA)₂₄或交联(PLL₃₀/HA)24多层涂层接触24小时后，在上清液中测量归一化金黄色葡萄球菌生长(％)。对于交联(PLL₃₀/HA)₂₄，金黄色葡萄球菌的生长为约65％，并且对于(PLL30/HA)₂₄为低于18％，从而显示出交联大大地降低了涂层的杀生物活性。

图11：展示了使用(PAR₃₀/HA)₂₄或交联(PAR₃₀/HA)₂₄对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。使用EDC/NHS将(PAR30/HA)₂₄与0.5M EDO以及0.1M NHS在4℃下交联15小时。使用乙醇胺中和未反应的羧基。在与(PAR₃₀/HA)₂₄或交联(PAR₃₀/HA)24多层涂层接触24小时后，在上清液中测量归一化金黄色葡萄球菌生长(％)。对于交联(PAR₃₀/HA)₂₄，金黄色葡萄球菌的生长为约65％，并且对于(PLL30/HA)₂₄为低于5％，从而显示出交联降低了涂层的杀生物活性。

图12：具有10个、30个、100个或200个精氨酸残基的可溶性PAR的最小抑制浓度(MIC₁₀₀)的曲线图。在溶液中测量导致金黄色葡萄球菌的100％抑制的最小抑制浓度(MIC₁₀₀)。测试具有10个、30个、100个或200个精氨酸残基的PAR。对于高达0.04mg.mL^-1的浓度，所有PAR(PAR₁₀、PAR₃₀、PAR₁₀₀或PAR₂₀₀)完全抑制金黄色葡萄球菌生长。

图13：示出了释放实验的结果的曲线图。如上文“释放实验”部分中所描述的那样执行释放实验。然后，使具有PAR-FITC的多层涂层(PAR30FITC/HA)₂₄与MHB培养基或金黄色葡萄球菌/MHB溶液(A₆₂₀＝0.001)接触。随着时间的推移监测PAR-FITC的释放。针对每种条件研究了三个样本。

图14：展示了根据MW的(PAR/HA)₂₄涂层中的可移动PAR的比例(％)的曲线图。通过执行如上文“光漂白后荧光恢复(FRAP)实验”部分中所描述的光漂白实验(FRAP，光漂白后荧光恢复)来测量含有PAR-FITC的(PAR/HA)24多层的扩散系数D和可移动分子比例p。

图15：展示了从涂层扩散到溶液中的PAR30的浓度不足以有效抑制金黄色葡萄球菌的生长的曲线图。在与多层膜(PAR30/HA)₂₄一起孵育的培养基接触24小时后的金黄色葡萄球菌的归一化生长。培养基A)具有300μl的金黄色葡萄球菌溶液，A620＝0.001；以及B)仅300μl的MHB。未观察到细菌生长抑制。

图16：展示了使用(PAR₃₀/HA)₂₄对不同细菌进行的生长抑制的曲线图。与覆盖有涂层(PAR30/HA)₂₄的玻璃接触24小时后的细菌的归一化生长。对于金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌，细菌生长被抑制超过90％。

图17：展示了使用本发明的PLL涂层对金黄色葡萄球菌的生长抑制的曲线图。示出了在与由具有不同数目的残基的聚-L-赖氨酸构成的(PLL/HA)₂₄多层涂层(即，(PLL10/HA)₂₄、(PLL30/HA)₂₄、(PLL100/HA)₂₄和(PLO250/HA)₂₄)接触24小时后，在上清液中获得的归一化金黄色葡萄球菌生长(％)。每个值与3项实验的平均值相对应，并且误差条与标准偏差相对应。对于玻璃和抗生素的组合，金黄色葡萄球菌的生长小于3％，对于(PLL30/HA)₂₄小于6％，而对于(PLO250/HA)₂₄，细菌生长大为约75％；对于(PLL100/HA)₂₄为约85％，并且对于(PLL10/HA)₂₄为约90％。

图18：展示了使用(PAR30/HA)24随时间的推移对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制。示出了在与(PAR30/HA)₂₄多层涂层接触1天、2天和三天后，在上清液中获得的归一化金黄色葡萄球菌生长(％)。每24小时后使涂层与金黄色葡萄球菌的新鲜悬浮液接触。每个值与3项实验的平均值相对应，并且误差条与标准偏差相对应。对于(PAR30/HA)₂₄来说，在1天和2天后，金黄色葡萄球菌的生长小于5％，由此显示(PAR30/HA)₂₄在最初48小时内超过95％的强生长抑制。3天后，抑制活性降低。

图19和图20：展示了使用本发明的PAR涂层对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。评估(PAR50/HA)₂₄涂层的上清液中的抗菌活性，并且与(PAR30/HA)₂₄和对照(不具有涂层的玻璃被标记为“玻璃”或“玻璃+抗生素”)进行比较。用3个载玻片进行每项实验，a)和b)与2项类似的独立实验相对应。“培养基”条件是指不具有细菌的孔，仅测量培养基的OD。误差条与标准偏差相对应。

图20和图21：展示了使用本发明的PAR涂层对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。评估(PAR50/HA)48涂层的上清液中的抗菌活性，并且与(PAR30/HA)48和对照(没有涂层的玻璃称为“玻璃”或“玻璃+抗生素”)进行比较。用3个载玻片进行每项实验，a)和b)与2项类似的独立实验相对应。“培养基”条件是指不具有细菌的孔，仅测量培养基的OD。误差条与标准偏差相对应。

图23：展示了使用本发明的PAR涂层对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。评估(PAR100/HA)₂₄、(PAR150/HA)₂₄涂层的上清液中的抗菌活性，并且与(PAR30/HA)₂₄和对照(不具有涂层的玻璃被标记为“玻璃”或“玻璃+抗生素”)进行比较。用3个载玻片进行每项实验。“培养基”条件是指不具有细菌的孔，仅测量培养基的OD。误差条与标准偏差相对应。

图24：展示了使用本发明的PAR涂层对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。评估(PAR10/HA)₂₄涂层的上清液中的抗菌活性，并且与(PAR50/HA)₂₄和(PAR30/HA)₂₄和对照(不具有涂层的玻璃被标记为“玻璃”或“玻璃+抗生素”)进行比较。用3个载玻片进行每项实验。“培养基”条件是指不具有细菌的孔，仅测量培养基的OD。误差条与标准偏差相对应。

图25：展示了使用本发明的PAR涂层对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。评估(PAR70/HA)₂₄涂层的上清液中的抗菌活性，并且与对照(不具有涂层的玻璃被标记为“玻璃”或“玻璃+抗生素”)进行比较。用3个载玻片进行每项实验。“培养基”条件是指不具有细菌的孔，仅测量培养基的OD。误差条与标准偏差相对应。

图26、图27和图28：展示了使用本发明的PAR涂层随着时间的推移对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。评估(PAR30/HA)24、(POR30/HA)24涂层的上清液中的抗菌活性，并且在金黄色葡萄球菌孵育24小时、48小时或72小时后，与对照(不具有涂层的玻璃被标记为“玻璃”或“玻璃+抗生素”)进行比较。在t＝0小时、24小时和48小时，执行新的细菌接种。用3个载玻片进行每项实验。“培养基”条件是指不具有细菌的孔，仅测量培养基的OD。误差条与标准偏差相对应。

图29、图30和图31：展示了使用本发明的PAR涂层随着时间的推移对金黄色葡萄球菌进行的生长抑制的曲线图。评估(PAR10/HA)₂₄、(PAR50/HA)₂₄、(PAR100/HA)₂₄涂层的上清液中的抗菌活性，并且在金黄色葡萄球菌孵育24小时、48小时或72小时后，与对照(不具有涂层的玻璃被标记为“玻璃”或“玻璃+抗生素”)进行比较。在t＝0小时、24小时和48小时，执行新的细菌接种。用3个载玻片进行每项实验。“培养基”条件是指不具有细菌的孔，仅测量培养基的OD。误差条与标准偏差相对应。

图32和图33：展示了在将本发明的PAR涂层暴露于不同的储存条件后对金黄色葡萄球菌的生长抑制的曲线图。评估预先干燥并且在4℃下储存1天(a)或7天的(PAR30/HA)₂₄涂层上清液中的抗菌活性，并且与对照(不具有涂层的玻璃被标记为“玻璃”或“玻璃+抗生素”)进行比较。用3个载玻片进行每项实验。“培养基”条件是指不具有细菌的孔，仅测量培养基的OD。误差条与标准偏差相对应。

图34：展示了在将本发明的PAR涂层暴露于不同的储存条件后对金黄色葡萄球菌的生长抑制的曲线图。评估预先通过高压灭菌进行灭菌的(PAR30/HA)₂₄涂层上清液中的抗菌活性，并且与对照(不具有涂层的玻璃被标记为“玻璃”或“玻璃+抗生素”)进行比较。用3个载玻片进行每项实验。“培养基”条件是指不具有细菌的孔，仅测量培养基的OD。误差条与标准偏差相对应。

Claims

1.一种聚电解质涂层，所述涂层包括：

其中

n为介于11与100之间的整数；并且

每个相同或不同的R基选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂，以及

(b)至少一个聚阴离子层，其由透明质酸组成。

2.根据权利要求1所述的聚电解质涂层，其中所述至少一个聚阳离子层由具有式(1)的n个重复单元组成，

其中

n为介于11与100之间的整数；并且

R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂。

3.根据权利要求1或2所述的聚电解质涂层，其中式(1)的R为-NH-C(NH)-NH₂。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的聚电解质涂层，其中n为15到95，优选地15到75。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的聚电解质涂层，其包括1个到500个聚阳离子层，优选地1个到60个聚阳离子层。

6.根据权利要求1到5中任一项所述的聚电解质涂层，其包括1个到500个聚阴离子层，优选地1个到60个聚阴离子层。

7.一种装置，其包括根据权利要求1到6中任一项所述的聚电解质涂层。

8.根据权利要求7所述的装置，其中所述聚电解质涂层覆盖所述装置的表面的至少一部分。

9.根据权利要求8所述的装置，其中所述装置是植入式装置。

10.根据权利要求8到9中任一项所述的植入式装置，其中所述植入式装置选自包括以下的组：导管、动静脉分流器、乳房植入物、心脏监护仪和其它监护仪、耳蜗植入物、除颤器、牙科植入物、颌面植入物、中耳植入物、神经刺激器、矫形装置、起搏器和导线、阴茎植入物、假体装置、置换关节、脊柱植入物、声音假体、人工心脏、隐形眼镜、骨折固定装置、输液泵、颅内压装置、人工晶体、子宫内装置、关节假体、机械心脏瓣膜、矫形装置、缝合材料、尿路支架、血管辅助装置、血管移植物、血管分流器和血管支架以及永久或暂时类型的人造血管。

11.一种用于制备包括聚电解质涂层的装置的方法，所述方法包括：

(a)提供装置；

(b1)在所述装置的表面上沉积

其中

n为介于11与100之间的整数；并且

每个相同或不同的R基选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂，并且然后沉积

ii)至少一个聚阴离子层，其由透明质酸组成，或者

(b2)在所述装置的表面上沉积如上所定义的ii)并且然后沉积i)，

以及任选地重复步骤b1)和/或b2)。

12.根据权利要求11所述的用于制备装置的方法，其进一步包括在b1)或b2)的步骤步骤i)和/或ii)之后的至少一个洗涤步骤。

13.根据权利要求10或11所述的用于制备装置的方法，进一步包括在b1)或b2)的步骤i)和/或ii)和/或根据权利要求12所述的洗涤步骤之后的至少一个干燥步骤。

14.一种根据权利要求1到6所述的聚电解质涂层用于生产根据权利要求7到10所述的装置的用途。

15.一种试剂盒，其包括：

其中

n为介于11与100之间的整数；并且

b)至少一种聚阴离子材料，其由透明质酸组成。